拉針器與斷燒器將顯微注射 holding pipette 製作成外徑約 130 μm，內徑約 20 μm，injection pipette 內徑約 8 μm。設定完成後便進行注射的動作，將精 液與 PVP 注射液（附錄 9）混合，最終精子濃度為 1×105cell/ml， 以 injection pipette 吸取精子，使用壓電脈衝顯微操作儀（piezo micro meter PMAS-CT150, Prime Tech, Japan）將精子注射入成熟卵母細胞的細胞質。注射完成後，將 已注射的卵母細胞置於胚培養液中培養 16 小時。
六、 卵母細胞的形態學觀察
觀察卵母細胞形態學變化使用兩種染劑，分別是 Hoechst 33258 與 Lacmoid。
（一）Hoechst 33258 螢光染色
Hoechst 33258（Sigma b-2883）激發波長為 365 nm，放射波長為 465 00 μg/ml（溶於 PBS），Hoechst 33258 能將染
色質或染色體染色，可判斷卵母細胞的發育情形。進行卵母細胞染色前，
先將10 μl濃縮液加到 990 μlPBS中，於 39 ℃ 二氧化碳培養箱下回溫，回 溫後將其滴在培養皿上，每滴50 μl，並蓋上礦物油。將欲染色的卵母細胞 取出，於解剖顯微鏡下操作，將其置於 50 μlHoechst 33258 培養液，一滴 放十顆卵母細胞，並於 39 ℃ 5 ％ CO2 二氧化碳培養箱內培養 15 分鐘， 滅菌水，蓋上錶玻璃，用加熱攪拌器（Stirrer/Hot Plat, Corning, U.S.A.）加 熱，煮沸 30 分鐘後，等待冷卻，用濾紙過濾，最後置於棕色瓶內保存，即
七、 RNA 萃取
（一）藥品配製 1. Denature solution
將 250 g Guanidine thiocyanate 溶於 293 ml DEPC（diethylpyrocarbonate）
水中，加入 17.6 ml 之 0.75 M Sodium citrate(pH7.0)、26.4 ml 10%sarcosyl，
之後於 60~65℃水浴槽中加熱攪拌待其溶解，即得 pre-denaturing sol. (可在 室溫中保存半年) 。取 50ml 分裝成一管，保存於室溫中，使用前每管添加 0.36 ml 14.4 M 2-mercaptoethanol，即得 Denature solution。
2. 2M Sodium acetate pH4.0(2M NaOAC)
取 16.42 g Sodium acetate 1H‧ 2O 加入 40 ml DEPC 水，加入 35 ml Glaciail acetic acid(冰醋酸 99.8%)，使用 pH 測定儀（PH Meter F-51, Horiba, Japan）
調整 pH 值到 4.0，最後加 DEPC 水至 100 ml 再高壓滅菌。 機（High speed Refrigerated Centrifuge 6500, Kubota, Japan）4℃離心 12000 rpm 25 分鐘。取上層液 100 μl放入另一新 1.5 ml 離心管，加入 100 μl
5 μlglycogen（20 mg/ml），混勻後存放於－20℃待 30 分鐘，
之後 4℃離心 12000 rpm 30 分鐘，去除上清液留下沉澱物，加入 100 μl75
％酒精，4℃離心 12000 rpm 20 分鐘，去除上清液留下沉澱物，加入 100 μl 75％酒精，4℃離心 12000 rpm 10 分鐘，最後將上清液去除，沉澱物風乾後 儲存於－80℃，或加入適量 DEPC 水進行逆轉錄（reverse transcription, RT）
作用。 cDNA。將其存放於－20℃冰箱或直接進行 PCR 或即時定量反應。
（二） 即時定量 PCR（realtime PCR）
本試驗使用相對定量的方式來比較試驗組與對照組之間 c-mos 基因表 現量的差別，使用的引子分別從 c-mos 與 β-actin 的基因序列中選取，β-actin 基因乃是要當作基因表現量的基準值，俾能測得實驗組與對照組之間 c-mos 基因表現量的差別。β-actin 的基因序列是從美國國家衛生研究院 NCBI 網 站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜尋而來， 其序號為 AJ312193，片段長
度為 601 bp，設計的引子位在 415~496 bp 之間，長度為 81 bp。至於 c-mos 引子位於其基因序列 767~838 bp 之間，長度為 71 bp。兩組引子取得後用滅 菌水稀釋，將引子濃度調整成1 μM。
realtime PCR 反應使用 Applied Biosystems SYBR green PCR Master Mix，取 20μlcDNA加到 realtime PCR 反應管（Applied Biosystems Optical Tubes）內，並加入 25 μlSYBR green PCR MasterMix、reverse primer 與 forward primer 各 2.5 μl，之後蓋上反應蓋（Applied Biosystems Optical Caps），置於即時定量聚合酶連鎖反應器（7300 Real-Time PCR System, Applied Biosystems, U.S.A.），反應條件為 94℃ 10分鐘，進入 40 次的循環
（94℃30秒→60 ℃ 1 分鐘），之後進行 Melting Curve（dissociation curve）
分析，此分析系統可藉由溫度的緩慢上升，產生雙股 DNA 裂解與結合的反 應，藉此得知產物的純淨度（degree of purity），分析反應產物是否為單一產 物或有其他片段干擾。完成後便可取得反應管內的螢光信號到達設定的閥 值時所經歷的循環數 - Ct（Threshold cycle）值，之後利用下列公式計算試 驗組與對照組的相對訂量比值。
1. △CtA＝（對照組 c-mos 基因表現量 Ct 值）－（對照組 β-actin 基因表現 量 Ct 值）
2. △CtB＝（試驗組 c-mos 基因表現量 Ct 值）－（試驗組 β-actin 基因表現 量 Ct 值）
3.△△ ＝Ct △CtA－△CtB 二部份試驗在於探討卵母細胞注射前，經由 cycloheximide 處理是否會增加 其存活率。第三部份則是將未成熟卵母細胞注射 c-mos siRNA，觀察對卵母 細胞成熟的影響。第四部份同樣是將 c-mos siRNA 注射到未成熟卵母細胞 卵母細胞萃取其 RNA，使用 realtime PCR（（SYBR Green ）技術觀察 c-mos mRNA 的表現量變化。同時每期所選取的卵母細胞用 lacmoid 或 Hoechst 33258 染色於螢光位相差顯微鏡下觀察其形態學的變化。試驗重複三次，形 態學變化採用卡方測驗及葉氏連續校正進行統計分析，至於 c-mos mRNA
表現量則採用 SAS 套裝軟體的 GLM（Generalized linear model procedure）
模式進行統計分析。
（二）cycloheximide 處理對穿刺卵母細胞存活率的影響
收 集 卵 丘 卵 母 細 胞 複 合 體 於 額 外 添 加 1 μg/ml 或 10 μg/ml cycloheximide 的 NCSU-23 成熟培養液培養 8 小時 ，之後使用顯微注射技 術進行卵母細胞的穿刺動作，並使用不含 cycloheximide 的成熟培養液繼續 培養 44 小時，最後固定並使用 lacmoid 染色或 Hoechst 33258 螢光染色，在 的卵母細胞，固定並使用 lacmoid 染色或 Hoechst 33258 螢光染色，在螢光 位相差顯微鏡下觀察其形態學變化。並選取注射後培養 12 小時及 44 小時 的卵母細胞，萃取 RNA，使用 realtime PCR（SYBR Green ）技術測量 c-mos（ mRNA 的表現量變化。以上試驗重複三次，形態學變化採用卡方測驗及葉
氏連續校正進行統計分析，至於 c-mos mRNA 表現量則採用 SAS 套裝軟體 的 GLM（Generalized linear model procedure）模式進行統計分析。
（四）注射 c-mos siRNA 對豬卵母細胞受精與發育的影響
收集卵丘卵母細胞複合體，用 cycloheximide 處理 8 小時，利用顯微操 作技術將 10 pl c-mos siRNAs mix 注射到卵母細胞細胞質中，之後成熟培養 44 小時，進行受精六小時，最後使用胚培養液將受精後的卵母細胞培養 7 日。選擇受精後培養期間 10 小時、2 日及 7 日，分別用 lacmoid 染色或 Hoechst 33258 螢光染色，並用螢光位相差顯微鏡觀察其受精、卵裂及分溝細胞數等 變化。以上試驗重複三次，形態學變化採用卡方測驗及葉氏連續校正進行 統計分析。
（五）注射 c-mos siRNA 對豬卵母細胞精子顯微注射的影響
收集卵丘卵母細胞複合體，用 cycloheximide 處理 8 小時，利用顯微操 作技術將10 ρlc-mos siRNAs mix 注射到卵母細胞細胞質中，之後成熟培養 44 小時，進行精子顯微注射，繼續培養 16 小時，最後卵母細胞用 lacmoid 染色或 Hoechst 33258 螢光染色，並用螢光位相差顯微鏡觀察其受精。以上 試驗重複三次，形態學變化採用卡方測驗及葉氏連續校正進行統計分析。
肆、結果 或 Hoechst 33258 染色，於螢光位相差顯微鏡下觀察，判斷其核成熟情形，
即觀察卵母細胞的細胞核是否處於 GV、GVBD、MI 或 MII 等狀態，GV 時
A
B
圖 8. 生發泡期豬卵母細胞細胞核的形態學。用 Hoechst 33258 (A)或 Lacmoid(B)染色。
Fig. 8. Nuclear morphology of pig oocytes in stage of germinal vesicle. Oocytes panel A were stained with Hoechst33258, and Lacmoid(B).
A
B
圖 9. 生發泡瓦解期豬卵母細胞細胞核的形態學。用 Hoechst 33258 (A)或 Lacmoid(B)染色。
Fig. 9. Nuclear morphology of pig oocytes in stage of germinal vesicle breakdown. Oocytes panel A were stained with Hoechst33258, and Lacmoid(B).
A
B
圖 10. 第一次減數分裂中期豬卵母細胞細胞核的形態學。用 Hoechst 33258 (A)或 Lacmoid(B)染色。
Fig. 10. Nuclear morphology of pig oocytes in stage of metaphase I. Oocytes panel A were stained with Hoechst33258, and Lacmoid(B).
A
B
圖 11. 第二次減數分裂中期豬卵母細胞細胞核的形態學。用 Hoechst 33258 (A)或 Lacmoid(B)染色。
Fig. 11. Nuclear morphology of pig oocytes in stege of metaphase II. Oocytes panel A were stained with Hoechst33258, and Lacmoid(B).
卵母細胞到達 MII 期，培養 44 小時，有 76.37％的卵母細胞到達 MII 期。 增幅結束後執行 Melting Curve（dissociation curve）分析是必要的。圖 13 與圖 14 分別為 c-mos 與 β-actin 增幅後之增幅曲線與裂解曲線圖，可看出
圖 12. 豬卵母細胞 0–44 小時培養期間細胞核的成熟。
Fig. 12. Nuclear maturation of pig oocytes cultured for 0-44 h.
A
B
圖 13. 即時定量 RT-PCR β-actin 的增幅曲線(A)與裂解曲線(B)。
Fig. 13. Amplification(A) and melting(B) curve profileofβ-actin in real time RT-PCR.
A
B
圖 14. 即時定量 RT-PCR c-mos 的增幅曲線(A)與裂解曲線(B)。
Fig. 14. Amplification(A) and melting(B) curve profile of c-mos in real time RT-PCR.
圖 15. 卵母細胞成熟期間 c-mos 基因的 mRNA 表現量。
Fig. 15. Quantitative analysis of c-mos gene expression in pig oocytes during maturation.
下降，44 小時表現量達到最低。
二、被穿刺卵母細胞存活率提升試驗
未成熟卵母細胞直接進行顯微注射，穿刺的動作會造成卵母細胞的死 亡，卵母細胞死亡時細胞質有空洞化、瓦解的現象，螢光染色時會發現整 個細胞質都被染色，有時發現染色體會濃縮在一起(圖 16)。本試驗之目的 在於卵母細胞穿刺前，先經由 cycloheximide 處理，探討是否能提升卵母細 胞的存活率。本試驗分成兩部份，第一部份探討 cycloheximide 的添加對於 卵母細胞成熟的影響，而第二部份實地的對卵母細胞做穿刺的動作，探討 cycloheximide 的處理對被穿刺卵母細胞存活率與成熟率的影響。
結果如圖 17-A、C 所示，其分別為 cycloheximide 的添加對於卵母細胞 存活或成熟的影響，未經 cycloheximide 處理的卵母細胞(N)，其存活率為 94.3 ％，而經 1μg/ml(1C)或 10 μg/mlcycloheximide(10C)處理者的存活率分 cycloheximide 處理 8 小時再換到不含 cycloheximide 的成熟培養液中，仍然 造成大部分的卵母細胞停頓在 GV 期（data not show）。
A
B
圖 16. 死亡豬卵母細胞以 Hoechst 33258(A)或 lacmoid(B)染色的影像。
Fig. 16. Photomicrograph of dead pig oocyte stained with Hoechst 33258(A), and lacmoid(B).
A C
B D
圖 17. cycloheximide 的處理對卵母細胞存活與成熟的影響。
Fig. 17. Effect of cycloheximide treatment on the rate of survival and matured pig oocytes cultured for 44 hrs.
當進一步對經 cycloheximide 處理後的卵母細胞進行穿刺動作，並繼續 培養 44 小時，結果如圖 17-B、D 所示，分別為 cycloheximide 的處理對被 穿刺卵母細胞存活或成熟的影響，未經 cycloheximide 處理且未經穿刺動作 的卵母細胞(N)(對照組)存活率為 100 ％，顯著地高於另外三組穿刺的卵母 細胞，惟卵母細胞在穿刺前先經1 μg/ml cycloheximide處理者(1CI)，其存 活率為 78.5 ％，顯著地高於 10 μg/mlcycloheximide 處理者(10CI)(42.3 ％) 與未經 cycloheximide 處理者(I)(36.9 ％)，顯然被穿刺卵母細胞若預先經適 量 cycloheximide 處理，可以降低穿刺動作對卵母細胞的傷害。上述處理的 卵母細胞進一步成熟培養，對照組卵母細胞的成熟率為 82.5 ％，顯著地高 於預先經 10 μg/ml cycloheximide處理者（56.3 ％） ，惟與經 1 μg/ml cycloheximide 處理者（88.5 ％）或未經 cycloheximide 處理，僅穿刺動作者
（68.1 ％）比較，並無顯著差異，可見過量的 cycloheximide 會影響被穿刺 卵的成熟率，而穿刺的卵母細胞先前未經 cycloheximide 處理成熟率也有略 為降低的現象，但是並沒有顯著差異。因此穿刺前以 1 μg/mlcycloheximide 處理卵母細胞 8 小時，會提升存活率，而且不會影響卵母細胞的成熟。
三、注射 c-mos siRNA 對豬卵母細胞成熟的影響
使用 siRNA construction kit 合成四組 siRNA，圖 18 所示為 siRNA 合成 後之產物電泳圖，M 為 marker，A、B、C、D 為四組 c-mos siRNA，合成
使用 siRNA construction kit 合成四組 siRNA，圖 18 所示為 siRNA 合成 後之產物電泳圖，M 為 marker，A、B、C、D 為四組 c-mos siRNA，合成