cAMP對大腸桿菌ompA mRNA穩定性之研究

國立交通大學

生物科技研究所

碩士論文

cAMP 對大腸桿菌

ompA

mRNA 穩定性之研究

Study the effect of cAMP on the stability of

ompA

expression in

Escherichia coli

             

研究生：徐其正

指導教授：曾慶平 博士

中華民國九十八年七月

 

cAMP 對大腸桿菌

ompA

mRNA 穩定性之研究

Study the effect of cAMP on the stability of

ompA

expression

in

Escherichia coli

研究生：徐其正 Student: Hsu Chi-Cheng

指導教授：曾慶平 博士 Advisor: Dr. Ching-Ping Tseng

國立交通大學

生物科技研究所

碩士論文

A Thesis

Submitted to Institute of Biological Science and Technology

National Chiao Tung University

In partial Fulfillment of the Requirements

For the Degree of Master of Science

in

Biological Science and Technology

Jul. 2009

Hsinchu,Taiwan,Republic of China

 

目錄

頁次 中文摘要...i 英文摘要...ii  表目錄...iii 圖目錄...iv     一、緒 論 與 研 究 目 的 ...1 二、文獻回顧...3 2.1 外 膜 蛋 白 A 的 結 構 ...3 2.2 外 膜 蛋 白 質 A (ompA)之 基 因 的 表 現 ...4 2.3 ompA mRNA 在 細 胞 中 的 穩 定 性 ...4 2.4 OmpA 主 要 的 功 能 ...6 2.5 cAMP 的 特 性 ...6

2.6 cAMP receptor protein (CRP)...7

2.7 cAMP-CRP 活 化 基 因 表 現 的 調 控 機 制 ...9

2.8 大 腸 桿 菌 small RNA(sRNA)...10

2.9 大 腸 桿 菌 small RNA 功 能 ...11

2.10 Small RNA 藉 由 序 列 互 補 (basepairing)的 調 控 機 制 ...12

2.11 大 腸 桿 菌 RNA 伴 隨 蛋 白 (RNA chaperone)： Hfq...14

2.12 Hfq 的 功 能 ...15

三 、 材 料 方 法 與 原 理 ...17

3.1 材 料 ...17

3.1.1 菌 種 ...17

3.2 原 理 ...22

3.2.1 批 次 式 培 養 (batch culture)大 腸 桿 菌 生 長 模 式 ...22

3.2.2 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Polymerase chain reaction， PCR)之 原 理 ...23

3.2.3 mRNA 半 衰 期 計 算 原 理 ...23 3.2.4 反 轉 錄 RNA 成 cDNA 原 理 ...24 3.2.5 同 步 定 量 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Real-time quantitative PCR)原 理 ....25 3.2.6 基 因 敲 除 (Gene knockout)原 理 ...25 3.3 方 法 ...26 3.3.1 大 腸 桿 菌 生 長 條 件 控 制 與 培 養 方 法 ...26 3.3.2 mRNA 穩 定 性 測 定 方 法 ...26 3.3.3 大 腸 桿 菌 總 RNA 製 備 方 法 ...27 3.3.4 北 方 墨 點 法 (Northern blot)分 析 ...27 3.3.5 Genomic DNA 抽 取 製 備 方 法 ...32

3.3.6 質 體 DNA 微 量 抽 取 製 備 方 法 (Plasmid DNA miniprep purification)...33

3.3.7 DNA 洋 菜 膠 體 電 泳 法 (Agarose gel electrophoresis)...34

3.3.8 電 泳 膠 體 中 回 收 DNA 片 段 (Elution)...34

3.3.9 基 因 敲 除 (Gene Knockout)方 法 ...35

3.3.10 總 RNA 樣 品 去 除 殘 留 DNA 方 法 ...41

3.3.11 反 轉 錄 (reverse transcription)第 一 股 合 成 cDNA 方 法 ...42

3.3.12 Real-time quantitative PCR(Q-PCR)方 法 ...42

四、結果...44

4.1 轉 錄 層 次 (transcription level)上 cAMP 影 響 ompA 基 因 表 現 ...44

4.2 轉 錄 後 層 次 (post-transcription level)上 cAMP 影 響 ompA mRNA 穩 定 性 .45 4.3 Small RNA 影 響 ompA mRNA 穩 定 性 篩 選 ...46

4.4 RseX sRNA 影 響 ompA mRNA 穩 定 性 ...47

4.5 DsrA sRNA 影 響 ompA mRNA 穩 定 性 ...47

4.6 轉 錄 層 次 (transcription level)上 dsrA small RNA 影 響 ompA 基 因 表 現 .48 4.7 cAMP 影 響 dsrA small RNA 基 因 的 表 現 ...48

4.8 Real-time PCR cAMP 影 響 dsrA small RNA 基 因 的 表 現 ...49

4.9 Real-time PCR cAMP 影 響 gcvB, ryhA small RNA 基 因 與 hfq 基 因 的 表 現 .50 4.10 cAMP 影 響 hfq 基 因 的 表 現 ...51

4.11 GcvB sRNA 影 響 ompA mRNA 穩 定 性 ...52

五、討論...53

5.1 轉 錄 層 次 上 cAMP 影 響 ompA基 因 的 表 現 ...53

5.2 轉 錄 後 層 次 上 cAMP 影 響 ompA mRNA 穩 定 性 ...53

5.3 早 期 對 數 生 長 期 (OD 0.3)small RNA 影 響 ompA mRNA 穩 定 性 ...55

5.4 早 期 對 數 生 長 期 (OD 0.3)， cAMP 影 響 hfq 基 因 表 現 ...59 六、結論...62 6.1 結 論 表 歸 納 本 實 驗 總 結 果 ...62 6.2 結 論 圖 ...64 七、論文圖表...65  八、參考文獻...86 九、附錄...91                         

 i

中文摘要

   

    大 腸 桿 菌 之 small RNA(sRNA)藉 由 序 列 互 補 的 方 式 ， 與 Hfq 協 同 結 合 到 messenger RNA 上 ， 可 調 控 messenger RNAs 穩 定 性 與 轉 譯。先 前 研 究 指 出 cAMP-CRP 活 化 一 些 sRNA 基 因 表 現，例 如 Spot42 與 RyeE， 並 藉 由 結 合 到 sRNA promoter 區 域 來 調 控 。 cAMP-CRP 在 大 腸 桿 菌 又 扮 演 transcriptional activator 角 色， 藉 由 結 合 到 promoter，增 加 與 RNA polymerase 之 間 的 交 互 作 用， 活 化 基 因 的 表 現 。

本 研 究 將 大 腸 桿 菌 野 生 菌 株 與

cya

基 因 突 變 菌 株 ， 分 別 培 養 在 LB 與 LB 加 glucose 培 養 液 ， 結 果 發 現 當 glucose 存 在 或

cya

基 因 突 變 下 ，

ompA

mRNA 的 表 現 量 明 顯 下 降 ， 結 果 顯 示 cAMP 可 調 控

ompA

基 因 的 表 現，我 們 更 進 一 步 分 析

ompA

mRNA 在 early log-phase 與 log-phase 的 穩 定 性，發 現 當 cAMP 不 存 在 時，

ompA

mRNA 穩 定 性 下 降 快 速 ， 結 果 說 明 了 cAMP 可 增 加

ompA

mRNA 的 穩 定 性 。

迄 今 cAMP 影 響 mRNA 穩 定 性 的 機 制 並 不 清 楚，我 們 推 測

ompA

mRNA 在 post transcription 層 次 上 的 穩 定 性 並 非 藉 由 cAMP 直 接 的 影 響 。 根 據 northern 實 驗 分 析 野 生 菌 株 與

cya

突 變 菌 株 ， 結 果 顯 示

hfq

基 因 表 現 受 cAMP 所 影 響 。 但 並 未 找 到 會 影 響

ompA

mRNA 穩 定 性 並 且 是 藉 由 cAMP 調 控 的 sRNA，因 此 我 們 認 為 Hfq 可 能 是 參 與 調 控

ompA

mRNA 穩 定 性 機 制 中 的 主 要 者 。

先 前 研 究 已 證 實

ompA

mRNA 穩 定 性 會 受 Hfq 所 降 解 ， 由 於 我 們 發 現 cAMP 的 存 在 確 實 降 低 了

hfq

mRNA 的 量 。 因 此 推 測 增 加

 ii

ABSTRACT 

 

 

In  E.  coli,  small  RNAs  primarily  serve  as  regulators  with  Hfq  to  modulate  messenger  RNA  stability  and  translation  efficiency  by  base‐pairing  with  target  messenger  RNAs.  Previous  studies  have  reported  that  cAMP‐CRP  regulates  small  RNA  expression  by  modifying promoter activity, such as spot42 and ryeE gene. As far as  we  know, the  cAMP‐CRP acts as  a transcriptional  activator  in  E. coli,  by  binding  to  promoters  and  enhancing  the  interaction  with  RNA  polymerase. 

In  this  research,  E.  coli  wild‐type  and  cya  mutant  strains  were  grown  in  LB  and  LB+Glc,  respectively.  We  found  that  the  amount  of 

ompA mRNA was down‐regulated when glucose was added or cya was 

mutated.  These  results  suggested  that  cAMP  played  a  regulatory  role  on ompA expression. Furthermore, we analyzed ompA mRNA stability  in  early  log‐phase  and  log‐phase.  When  cAMP  was  absent,  the  ompA  mRNA  was  degraded  rapidly.  This  result  indicated  that  the  stability  of ompA mRNA was elevated by cAMP. 

      So far, the medchanism of cAMP regulation of RNA stability is not  clear.  In  this  study,  we  propose  that  post‐transcription  of  ompA  mRNA  was  not  directly  affected  by  cAMP.  According  to  the  northern  blot analysis of wild type and cya mutant, the results showed that the  expression  of  hfq  encode  RNA  chaperone  was  affected  by  cya.  However,  sRNAs  were  not  found  to  involve  in  ompA  mRNA  stability.  Thus  we  suggested  that  Hfq  may  participate  in  regulation  of  ompA  mRNA stability.  The Hfq down‐regulates ompA mRNA stability which has been  demonstrated in previous studies. In this study, we found that the  amount of hfq mRNA was down‐regulated while cAMP was present.  Therefore, the stability of ompA mRNA may be increased by reducing  hfq gene expression.       

  iii

表目錄

結 論 表 、 歸 納 本 實 驗 總 結 果 ...62 表 一 、 本 實 驗 所 使 用 的 菌 株 與 質 體 ...65 表 二 、 可 能 影 響 本 實 驗

ompA

mRNA 穩 定 性 的 small RNA...66

  iv

圖目錄

結 論 圖 ...64 圖一、大腸桿菌編號 BW25113 野生菌株(wt)與 cAMP 基因突變菌株(△cya)生長曲 線...67  

圖二、(A)大腸桿菌野生株(wt)與cya突變菌(△cya)分別培養在 LB 與 LB 外加葡 萄糖下，生長至對數生長期時(OD 0.4)，停止培養並抽取總 RNA 進行 Northern， 觀察ompA mRNA 基因表現量的變化。(B)internal control 16S 與 23S rRNA 電 泳圖...68

圖三之一、大腸桿菌野生株(wt)與cya突變菌(△cya)分別培養在 LB 與 LB 外加 葡萄糖下，生長至早期對數生長期時(OD 0.3)，加入 Rifampin 停止培養，並在 往後 8 個時間點(0、2、4、8、12、16、20、26 分鐘)分別抽取總 RNA 進行 Northern blot 分析ompA mRNA 穩定性變化...69 圖三之二、Internal control RNA 電泳圖...70

圖四之一、大腸桿菌野生株(wt)與cya突變菌(△cya)分別培養在 LB 與 LB 外加 葡萄糖下，生長至對數生長期時(OD 0.5)，加入 Rifampin 停止培養，並在往後 8 個時間點(0、2、4、8、12、16、20、26 分鐘)分別抽取總 RNA 進行 Northern blot 分析ompA mRNA 穩定性變化...71 圖四之二、Internal control RNA 電泳圖...72

圖五、(A)確認rseX sRNA 基因敲除，利用 KT forwark 和 K2 reverse 引子，PCR Anti-Kanamycin(kan) gene marker 的電泳圖，共 486b.p。(1)為負 control 組 PCR 野生菌株 DNA，(2)為正 control 組 PCR 質體 pKD13，(3)~(5)為 PCR rseX sRNA 基因敲除菌株。(M)為 100b.p Marker。

(B) 確認rseX sRNA 基因敲除位置，利用基因外所設計的引子與 K2 引子形成一 對 Forward 和 Reverse 引子，PCR 的電泳圖，共 868b.p。(1)為負 control 組 PCR 野生菌株 DNA，(2)~(4)為 PCR rseX sRNA 基因敲除菌株。(M)為 100b.p

Marker...73

圖六之一、大腸桿菌野生株(wt)與rseX突變菌(△rseX)分別培養在 LB 與 LB 外 加葡萄糖下，生長至早期對數生長期時(OD 0.3)，加入 Rifampin 停止培養，並 在往後 8 個時間點(0、2、4、8、12、16、20、26 分鐘)分別抽取總 RNA 進行 Northern

 v

blot 分析ompA mRNA 穩定性變化...74 圖六之二、Internal control RNA 電泳圖...75

圖七、確認dsrA sRAN 基因敲除與敲除位置。(1)利用 KT forwark 和 K2 reverse 引子，PCR Anti-Kanamycin(kan) gene marker 的電泳圖，共 486b.p。(2)利用 基因外所設計的引子與 KT 引子形成一對 Reverse 和 Forward 引子，PCR 的電泳 圖，約 1.2Kb。(M)為 100b.p marker...76

圖八之一、(A)(B)分別表示第一次實驗與第二次實驗結果。將大腸桿菌野生株(wt) 與dsrA突變菌(△dsrA)培養在 LB 培養液，生長至早期對數生長期時(OD 0.3)， 加入 Rifampin 停止培養，並在往後 8 個時間點(0、2、4、8、12、16、20、26 分鐘)分別抽取總 RNA 進行 Northern blot 分析ompA mRNA 穩定性變化...77 圖八之二、(A)(B)Internal control RNA 電泳圖...78

圖九、(A)大腸桿菌野生株(wt)與dsrA突變菌(△dsrA)分別培養在 LB 下，生長 至早期對數生長期時(OD 0.3)，停止培養並抽取總 RNA 進行 Northern，觀察ompA

mRNA 基因表現量的變化。(B)internal control 16S 與 23S rRNA 電泳圖...79

圖十、(A)Northern 分析 cAMP 影響dsrA基因的表現，(a)正對照組：野生株培 養 LB 於 20o

C，OD 0.3 時停止培養並抽取總 RNA，北方墨點法分析 dsrA sRNA。 (b)負對照組：dsrA突變菌培養 LB 於 20o

C，OD 0.3 時停止培養並抽取總 RNA， 北方墨點法分析 dsrA sRNA。(c) 野生株培養 LB 於 37o

C，OD 0.3 時停止培養並 抽取總 RNA，北方墨點法分析 dsrA sRNA。(d) 野生株培養 LB 外加葡萄糖培養液 於 37o

C，OD 0.3 時停止培養並抽取總 RNA，北方墨點法分析 dsrA sRNA。(e)cya

突變菌株培養 LB 於 37o

C，OD 0.3 時停止培養並抽取總 RNA，北方墨點法分析 dsrA sRNA。(f) cya突變菌株培養 LB 外加葡萄糖培養液於 37o

C，OD 0.3 時停止培養 並抽取總 RNA，北方墨點法分析 dsrA sRNA。F 表示 full length dsrA sRNA，T 表示 truncated forms dsrA sRNA(Repoila and Gottesman, 2001)。(B)Internal control 電泳圖...80

圖十一、Real-time PCR(Q-PCR) dsrA基因表現。大腸桿菌野生株(wt)與cya突 變菌(△cya)培養於 LB 培養液，生長至早期對數生長期時(OD 0.3)停止培養，抽 取總 RNA 並針對 dsrA sRAN 進行反轉錄成 dsrA cDNA，Q-PCR dsrA基因表現量。 野生株(wt)培養再 LB 培養液 dsrA sRNA 量換算成一倍。橫軸為相對比較數值 (relative fold)...81

圖十二、Real-time PCR(Q-PCR) gcvB、ryhA sRNA 與hfq基因表現。大腸桿菌 野生株(wt)與cya突變菌(△cya)培養在 LB 培養液，生長至早期對數生長期時(OD

  vi

0.3)停止培養，抽取總 RNA 並進行反轉錄成總 cDNA，Q-PCR gcvB、ryhA sRNA 與hfq基因表現量。野生株(wt)培養再 LB 培養液gcvB、ryhA sRNA 與hfq mRNA 量換算成一倍。橫軸為相對比較數值(relative fold)...82

圖十三、(A)大腸桿菌野生株(wt)與cya突變菌(△cya)分別培養在 LB 與 LB 外加 葡萄糖下，生長至早期對數生長期時(OD 0.3)，停止培養並抽取總 RNA 進行 Northern blot，觀察hfq mRNA 基因表現的變化。(B)internal control 23S 與 16S 電泳圖...83

圖十四、確認gcvB sRAN 基因敲除與敲除位置。(1)利用 KT forwark 和 K2 reverse 引子，PCR Anti-Kanamycin(kan) gene marker 的電泳圖，共 486b.p。(2)利用 基因外所設計的引子與 KT 引子形成一對 Reverse 和 Forward 引子，PCR 的電泳 圖，約 1.2Kb。(M)為 100b.p marker...84

圖十五、(A)將大腸桿菌野生株(wt)與gcvB基因突變菌(△gcvB)培養在 LB 培養 液，生長至早期對數生長期時(OD 0.3)，加入 Rifampin 停止培養，並在往後 8 個時間點(0、2、4、8、12、16、20、26 分鐘)分別抽取總 RNA 進行 Northern blot 分析ompA mRNA 穩定性變化。