工程科技與教育學刊 第 10 卷 第 3 期 第 253～261 頁 民國 102 年 9 月
Journal of Engineering Technology and Education, ISSN 1813-3851
以亞胺基硫烷鹽定量超順磁性奈米粒子表面一級胺基含量
邱勝暉、鍾霈諭、陳樹人* 國立高雄應用科技大學 化學工程與材料工程系 *通訊作者電子郵件：E-mail: biochen@kuas.edu.tw摘 要
為提高磁性材料表面一級胺官能基定量的準確性，本研究簡化了磁性材料表面一級胺官能基含量的試 劑配方，並且探討影響一級胺官能基定量的反應條件。研究發現影響定量磁性奈米粒子表面一級胺含量準 確度的因素有：胺基與亞胺基硫烷鹽（iminothiolane, ITL）的反應時間、反應溶液的工作體積、磁性奈米粒 子分散性、磁性奈米粒子用量等。根據上述發現，最適化的分析流程為：將 12.5 或 25 mg 的胺基修飾磁性 奈米粒子分散於 4 ml ITL 溶液（0.8 Mm），在 22°C 下反應 10 h 後加入 bicinchoninic acid（BCA）進行呈色 反應，呈色反應時間為 1 h，藉由 BCA 定量殘餘的 ITL 濃度，進而推算胺基修飾磁性奈米粒子表面的一級 胺含量。 關鍵詞：一級胺、四氧化三鐵、亞胺基硫烷鹽、二氧化矽、超順磁性1. 前 言
室溫下的超順磁性奈米粒子（superparamagnetic nanoparticles）在無外加磁場下，沒有自發性磁偶極， 不具磁性；在外加磁場的作用下，粒子的磁矩將沿著磁場的方向排列，因而產生磁偶極；所以，經由施加 磁場可以使超順磁性奈米粒子產生磁性而聚集，移除外加磁場後，粒子的磁性消失，又可以再度重新分散。 基於本身特殊的磁性質，超順磁性奈米粒子在生化分離[1]或是藥物傳輸[2]上極具應用潛力。在食品科技的 應用上，超順磁性奈米粒子材料可用胺基（—NH3+）、羥基（—OH）或是羧基（—COO–）等活性官能基進 行表面修飾，使其成為分離純化程序的吸附介質；粒子表面也能夠進一步以共價鍵結合酵素與蛋白質分子， 成為固定化的載體或是親和性吸附介質，應用於酵素與細胞固定化、生物分子之純化、生化與食品檢驗分 析。這些官能基裏，胺基是最常被用於修飾粒子表面的官能基，原因是胺基具有高化學活性，可進一步與 其他官能基進行縮合或偶合反應，使得奈米粒子具有更多元的應用性。 超順磁性奈米粒子表面胺基的多寡將顯著地影響後續材料表面改質的成效，因此，精確地定量奈米粒 子表面胺基含量是材料表面性質分析的重要項目。常用於奈米粒子表面胺基定量的方法有紫外光-可見光光 譜法[3, 4]、螢光光譜法[5]、滴定法[6]、X-射線光電子光譜法[7]、熱重分析法[8]、元素分析法[9, 10]等。熱 重分析與元素分析法屬於總體分析法，只能定量胺基總量，無法辨別胺基類型（一級胺、二級胺、三級胺 等）；X-射線光電子光譜法操作成本高，不適合分析大量樣品；滴定法的誤差較大，精確度不高；紫外光-可見光光譜法以及螢光光譜法原理類似，是目前最常使用的定量胺基方法，其粒子標記及偵測方法可分為 二種：(1)直接標記與偵測：先將材料表面胺基反應成另一種活性基團，再與呈色劑進行呈色反應，藉由顏 色深淺的變化或是螢光強度的變化定量胺基含量；(2)間接標記與偵測：粒子表面的胺基先與呈色劑進行可 逆反應，再分析從粒子表面釋放的標記物，藉以進行間接定量[11]。然而，紫外光－可見光光譜法與螢光法 的分析過程需要經過 2 次非均勻相反應，也需要多次清洗粒子，以便去除過量的反應試劑，對於奈米粒子 而言，多次的清洗步驟將會相當花費時間，且易流失些許粒子[12]。另外，粒子與試劑或有機溶劑的不相容邱勝暉、鍾霈諭、陳樹人
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性、粒子團聚現象以及非均勻相反應之效率不高等因素都將導致定量胺基的誤差[11, 12]。
為了避免有機溶劑與粒子的不相容性，Kakabakos 等人以水作為溶劑，利用 bicinchoninic acid（BCA） 與 2-iminothiolane（ITL）定量固態材料表面的一級胺，稱為 ITL/BCA method [13]，此方法是藉由粒子表面 一級胺與 ITL 反應形成硫醇基（—SH）標記物，再與 BCA 於 60°C 下反應 1 h，測其波長 562 nm 下吸收度 即可推算胺基含量。但此方法在 60°C 下反應 1 h 過程中，BCA 易受到粒子干擾，且仍须經過兩步驟的非均 勻相反應，導致定量一級胺的誤差。為了減少粒子與溶液非均勻相反應的影響與簡化定量胺基的程序，Qu 等 人 提 出操 作 步 驟簡 單 且僅 需 一 步驟 非 均 勻相 反 應 的 胺 基 定量 方 法 ，此 方 法稱 為 subtractive ITL/BCA method [12]，其原理如下：在室溫下，ITL 與 BCA 可在短時間內發生呈色反應；因此，加入 ITL 與材料表 面一級胺反應之後，可加入 BCA 與殘留的 ITL 進行呈色反應，測量波長 562 nm 下的吸收度可得知 ITL 的 殘留濃度，與不含奈米粒子的對照組相比較，從波長 562 nm 吸收度的差異即可推算奈米粒子表面的一級胺 含量。奈米粒子表面的一級胺是否完全地與 ITL 反應是決定 subtractive ITL/BCA method 分析準確度的關鍵， 其次，Qu 等人[12]提出的步驟中，需要添加界面活性劑 Triton X-100，然而，Triton X-100 容易使分析樣品 產生泡沫，吸取微量體積時很容易發生誤差。有鑑於此，本研究將探討簡化超順磁性奈米粒子表面胺基分 析步驟的策略，影響一級胺含量準確度的因素，包括：(1)分析試劑成分與穩定性、(2)奈米粒子與 ITL 反應 的時間、(3)BCA 呈色反應時間、(4)奈米粒子與 ITL 反應的攪拌方式、奈米粒子用量以及反應溶液工作體積 等。
2. 實驗材料與方法
2.1 超順磁性 Fe3O4@SiO2奈米粒子之製備首先以共沉澱法製備 Fe3O4奈米粒子，將 FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、油酸與去離子水，在 80°C 環境中
通入 N2，加入氨水（28%）後反應 35 min。反應結束後，加入去離子水配成 Fe3O4奈米粒子懸浮液。取適
量的 Fe3O4奈米粒子懸浮液，聯同 28 %氨水，注入經過 50°C 預熱的正己烷與界面活性劑 CO-520 有機相，
可形成逆微胞反應系統，隨後加入四乙氧基矽烷（tetraethyl orthosilicate, TEOS），在 50°C 下反應 4 h。反應 結束後，以釹鐵硼磁鐵收集產物，並用酒精清洗，即可獲得 Fe3O4@SiO2奈米粒子。本研究合成的 Fe3O4@SiO2
奈米粒子以超導量子干涉磁量儀（SQUID）鑑定，證實為超順磁性奈米粒子[14]。
2.2 胺基修飾之磁性二氧化矽粒子（Fe3O4@SiO2-NH2）之製備
將 Fe3O4@SiO2 分 散 於 乙 醇 溶 液 中 ， 加 入 3- 胺 丙 基 三 乙 氧 基 矽 烷 （ 3-aminopropyl triethoxysilane,
APTES），在超音波環境下進行反應。反應完成後，以乙醇清洗數次，去除氨水以及殘留的 APTES，即可收 集 Fe3O4@SiO2-NH2奈米粒子。
2.3 材料鑑定與分析
材料形貌與粒徑大小以 TEM 鑑定（JEOL JEM-1400）；材料表面官能基以 FTIR 鑑定（PerkiinElmer- Spectrum one）。材料表面電位以 zeta potential analyzer 分析（90 Plus Particle Size Analyzer）。
2.4 材料表面一級胺官能基含量分析
根據 subtractive ITL/BCA method [12]的原理，並簡化其流程。首先在小離心管（eppendorf tube）內放 入適量的 Fe3O4@SiO2-NH2 奈米粒子，先後以酒精與去離子水清洗 3 次，再加入 pH 7.96、0.1 M 磷酸緩衝
溶液。以超音波震盪分散粒子後，加入 ITL 溶液，以磁石攪拌子進行攪拌反應（溫度為 22°C）。反應 10 h 後，以離心沉降粒子並取出上清液，將上清液與等量的 BCA 進行呈色反應，呈色反應進行 1 h，溶液的顏 色由綠色變為紫色，在波長 562 nm 下量測吸收度，即可換算出溶液中 ITL 的濃度。不含奈米粒子的控制組
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實驗亦以上述步驟進行，比較實驗組與控制組吸收度的差異，即可推算奈米粒子表面的一級胺官能基含量。
3. 結果與討論
3.1 胺基修飾磁性二氧化矽奈米粒子之特性分析
超順磁性奈米粒子之形貌顯示於 Fig. 1，Fe3O4@SiO2粒子的粒徑約為 33 nm，經過不同的胺基修飾條件
製備得到的 Fe3O4@SiO2-NH2粒子，粒徑並沒有顯著地增加，粒子也沒有發生團聚現象，顯示本研究的修飾
反應條件可以避免偶合劑修飾之後，二氧化矽殼層或粒子表面厚度大幅增加的困擾，並能保持磁性二氧化 矽粒子的單分散性。此外，從圖 1(f) FTIR 光譜圖可以發現 Fe3O4@SiO2波數 1200-1000 cm-1有 SiO2的特徵
吸收峰，波數 805 cm-1為 Si-O-Si 的對稱性振動，在 1638 cm-1 為 O-H 與 H
2O 所造成；而接枝 APTES 後所
形成的 Fe3O4@SiO2-NH2出現在波數 2945 及 2985 cm-1的特徵吸收峰，為 APTES 中胺丙基所產生的-CH2伸
縮振動所致。
圖 1 Fe3O4@SiO2與不同反應條件合成的 Fe3O4@SiO2-NH2粒子之特性鑑定：(a) Fe3O4@SiO2之 TEM 影像；
(b) Fe3O4@SiO2-NH2（35°C & 1 h）之 TEM 影像；(c) Fe3O4@SiO2-NH2（50°C & 1 h）之 TEM 影像；(d)
Fe3O4@SiO2-NH2（50°C & 2 h）之 TEM 影像；(e) Fe3O4@SiO2-NH2（50°C & 4 h）之 TEM 影像；(f) 粒子
之 FTIR 光譜圖。
為確認粒子表面完成胺基改質，不同修飾條件的磁性粒子再以表面電位儀分析 zeta potential，從 zeta potential 分析圖（圖 2）可以發現：與 Fe3O4@SiO2相較之下，粒子在經由胺基修飾後，其表面電位有趨向
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量各種材料表面一級胺官能基的含量。
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