1
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
台灣蜂膠之抗菌活性
Antimicrobial activity of Taiwanese propolis
計畫編號：NSC 90-2313-B-002-353
執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 10 月 31 日
主持人：周正俊 國立台灣大學食品科技研究所
一、中文摘要 蜂膠是蜜蜂蒐集特定植物樹皮或葉芽 所分泌的樹脂，混入蜜蜂分泌之酵素，並 結合蜂蠟及花粉所製成的膠狀物質。本研 究探討台灣不同地區 (北-台大，中-南投名 間鄉，南-屏東枋寮鄉)、不同季節 (六月、 八月、十~十一月) 所收集蜂膠之抗菌活 性。 結果發現，蜂膠之香膠 (balsam, 80% 酒精萃出物) 含量與抗菌效果因產地、產 季之不同而有差異。大致而言，無論其產 地，香膠含量以六月產者最高，十~十一月 產者最低。此外名間產者其香膠含量最高。 不同病原菌對蜂膠的敏感性也不同，Staphylococcus aureus 及 Listeria
monocytogenes 對 蜂 膠 較 為 敏 感 ， 而 對 Salmonella typhimurium 及 Escherichia coli
O157:H7 則否。大致而言，以六月產台灣 蜂膠之抗菌效果較佳。而在所有蜂膠樣品 中則以名間六月產蜂膠之抗菌活性最強。 進一步對 Sta. aureus 測試顯示，蜂膠 酒精萃出物在 37℃時所表現之抗菌效果比 在低溫時 (4、25℃) 佳。且其抗菌效果在 酸性環境下 (pH 5.0、6.0) 亦比在高 pH 環 境下 (pH 8.0、9.0) 強。菌齡影響 Sta. aureus 對蜂膠酒精萃出物之敏感性，其敏感性依 序為對數期中期、末期及定常期之菌體。 此外，蜂膠酒精萃出物會造成 Sta. aureus 胞內 260 nm 吸光物質 (核 酸、 DNA、 RNA) 的洩漏。蜂膠中的抗菌物質具有良 好的熱安定性。 關鍵字：蜂膠,季節,地區,抗菌活性 Abstract
Propolis is a resinous substance collected by honeybees from buds and leaves of trees and plants, mixing with pollen, bee wax as well as enzymes secreted by bees. In the present study, the antibacterial activities of Taiwanese propolis obtained from various regions (NTU, Mingchien and Fangliao) at different seasons (June, August, and October-November), was examined.
Results showed that the balsam content and antibacterial activities propolis varied with the harvesting regions and seasons. In general, the balsam content of propolis obtained in June was the highest, while those collected in October-November was the lowest, regardless of harvesting regions. The balsam content of propolis obtained from Mingchien in June was the highest.
The pathogens tested showed various extents of susceptibility to ethanolic extract of propolis (EEP). Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes were found susceptible while Salmonella typhimurium and Escherichia coli were resistant to propolis. The Taiwanese propolis collected in June possessed a higher antibacterial activity than those collected in other seasons, and the Mingchien propolis collected in June exhibited the highest antibacterial activity among all of Taiwanese propolis tested.
Further test on Sta. aureus revealed that EEP showed stronger antibacterial activity at 37 ℃ than at 4 ℃ or 25 ℃ , in acid environment (pH 5.0 and pH 6.0) than in higher pH environment (pH 8 and pH 9). Cell age also affected the susceptibility of Sta.
2
aureus to EEP. Cells in the mid-exponential
phase were most sensitive, followed by the late exponential phase cells and stationary phase cells. In addition, it was also noted that EEP caused the leakage of 260-nm-absorbing materials (nucleotide, DNA, RNA) from Sta.
aureus cells and possessed good thermal
stability.
Keywords: propolis, region, season, antimicrobial activity 二、緣由與目的 蜂膠被應用於民俗醫藥中已有幾 千年之歷史 (Ghisalberti, 1979)，近年來 有關它生物特性之研究顯示它具有抗 細菌 (Amoros et al., 1992) 等作用。 蜂膠之化學成分相當複雜，蜜蜂從 不 同 之 樹 芽 (plant buds) 吸 取 蜂 膠 (Crane, 1997)，使得蜂膠的化學組成及 生物活性因而有所差異。 就蜂膠之抗菌作用而言已有許多 文獻報告，且蜂膠之抗菌活性與其成分 關係密切。Menezes et al. (1997)指出抗 菌活性之而與其化學組成有關。部分文 獻也顯示不同地區收集之蜂膠，其抗菌 活性亦有所不同(Koo et al., 2000; Park
et al., 1998; Kujumgiev et al., 1999;
Hegazi et al., 2000; Nieva Moreno et al., 1999)。 不同地區、季節因為蜜蜂所吸取膠 質樹源 (膠原植物) 之不同，因而蜂膠 之物化、生物特性亦會有所不同。目前 市面上已有多種型式的蜂膠產品，但所 使用的蜂膠仍以進口的巴西、大陸蜂膠 為主。台灣的蜂膠因未能有效量產，且 傳統的採膠法所得的蜂膠雜質甚多、品 質不佳，所以尚未有效的應用於商業製 造上。但在台大養蜂實驗室設計的採膠 器的研發成功後，已可有效提升台產蜂 膠的產能及品質，惟國產蜂膠在各項功 能性的相關資料仍尚為欠缺。而本研究 乃企圖以台灣不同地區、不同季節所收 集之蜂膠，對其抗菌活性進行探討，以 期有助於台灣產蜂膠產品在市場上之 開發。 三、結果與討論 1.不同來源蜂膠及其萃取液感官特性之差 異 大致而言，台灣六月產的蜂膠呈翠綠 色，8 月產的蜂膠呈棕綠色，而 10、11 月 產的蜂膠則呈深棕褐色。蜂膠經過萃取後 也發現萃取液的顏色因產季、產地有明顯 的差異。 2.不同季節產地蜂膠之酒精萃取率 本實驗以 80％乙醇溶液萃取蜂膠， 檢測蜂膠酒精萃取液中可溶性物質含量。 結果發現，季節對蜂膠樣品萃出物含量之 影響較明顯。蜂膠酒精萃取液中的萃出物 成分含量分布於 2.43％至 7.09％，依序為 名間 6 月 (7.09％)、枋寮 6 月 (5.68％)、 名間 8 月 (5.67％)、台大 6 月 (5.37％)、 名間 10 月 (4.96％)、大陸 (4.95％)、巴西 (4.52％)、枋寮 8 月 (4.27％)、枋寮 10 月 (3.73％)、台大 8 月 (3.14％) 及台大 11 月 (2.43％)。 3.不同病原菌對蜂膠酒精萃出物之敏感性 將蜂膠酒精萃取液添加於無菌水中觀 察 不 同 病 原 菌 對 蜂 膠 酒 精 萃 出 物 (ethanolic extract of propolis, EEP)之敏感 性，顯示 Staphylococcus aureus 及 Listeria
monocytogenes 對蜂膠較為敏感，經 6 小時 培養後，其菌數降低 (population reduction) 分 別 為 2.41-6.47 及 3.82-6.92 log CFU/mL。而蜂膠酒精萃出物在 7.5 μg/mL 的劑量下，對 Salmonella typhimurium 及 E. coli O157:H7 並無明顯的抗菌效果。 就不同蜂膠樣品對 Sta. aureus 之抗菌 作用而言，結果顯示六月份的蜂膠對於此 病原菌的抑制效果均顯著 (p<0.05) 優於 八月及十、十一月份產的蜂膠。而台灣產 的蜂膠相較於巴西及大陸產者對於 Sta. aureus 皆具較佳的抗菌效果。 4.蜂膠對金黃色葡萄球菌之最低抑菌濃對 及最低殺菌濃度 本實驗中定義各蜂膠樣品可完全抑制 Sta. aureus 生長亦而使終菌數低於接菌量 或與接菌量無顯著差異 (p<0.05) 之最低 劑量為該樣品之最低抑菌濃度 (minimum
3
inhibitory concentration, MIC)；若可減少 99.9%以上菌量之最低劑量則稱為該樣品 之 最 低 殺 菌 濃 度 (minimum bactericidal concentration, MBC)。 試驗結果發現除台大十一月產的蜂膠 外，台灣各地產蜂膠的 MIC 都在 15 μg/mL 以下，效果明顯優於巴西 (240 μg/mL) 及 大陸 (60 μg/mL)，而名間 6 月產 EEP 的抑 菌能力最強，僅需要 3.75 μg/mL 甚至更低 的劑量便可展現完全的抑菌效果；而 MBC 部分，同樣發現台灣蜂膠對 Sta. aureus 具 備優越的殺菌能力，所有台灣蜂膠的 MBC 值皆比巴西及大陸膠為低。 5.蜂膠酒精萃出物在不同條件下對金黃色 葡萄球菌之抑菌效果 在 過 去 有 關 蜂 膠 抗 菌 之 試 驗 報 告 上，主要偏於最小靜菌或殺菌劑量之探 討，殊少涉及在不同的條件下對蜂膠抗菌 效果之影響。因此進一步試著以 Sta. aureus 在不同條件下探討蜂膠之抗菌效果。 (1) 培養溫度 在控制組中 (未添加蜂膠酒精萃出液) Sta. aureus 在 37℃下生長最好，25℃次之， 於 4℃下，菌量則幾乎沒有變化。添加台大 六月產蜂膠酒精萃出物 (15 μg/mL) 的實 驗組中以在 37℃下的抗菌效果最好，經過 9 小時培養後，Sta. aureus 不但未生長，活 菌數約降低 2.0 log CFU/mL，且比控制組 低了約 5.0 log CFU/mL，在 25 及 4℃下， 蜂膠萃取液雖然沒有呈現殺菌之效應，但 卻完全抑制 Sta. aureus 生長，最終菌數也 相對比其控制組低。 (2) 菌齡 相對於控制組，添加 EEP 皆可有效的 抑制三種不同生長階段菌體的生長，其中 定常期的 Sta. aureus 菌體相對於對數中 期、末期的菌體對蜂膠具有較佳之忍受 性；而以對數期之菌體對蜂膠之酒精萃出 物最為敏感。 (3) pH pH 值會影響蜂膠對 Sta. aureus 生長所 呈現的抗菌作用。在 pH 5 及 6 下所添加之 EEP (15 μg/mL) 迅速造成 Sta. aureus 之 死亡，分別在培養 1.5 及 3 小時後即未測得 活菌之存在。在 pH 7.1，相同劑量之 EEP 則僅顯示些微的殺菌效果，經 9 小時培養 後仍有約 3.0 log CFU/mL 的菌量存活。相 反的，在 pH 8 及 9 下，添加 EEP 只呈現靜 菌作用。顯示蜂膠酒精萃出物在酸性環境 下對 Sta. aureus 較具抗菌效果，其所呈現 的抗菌效果隨著所試的 pH 上升而下降。 6.金黃色葡萄球菌經蜂膠酒精萃出物作用 後其細胞內 260 nm 吸光物質之洩漏 Takaisi-Kikuni and Schilcher (1994) 以 電子顯微鏡發現添加蜂膠萃取液會破壞菌 體細胞質、細胞質膜及細胞壁，產生溶菌 作用。添加 EEP 於含菌體之生理食鹽水一 段時間後，將菌液經離心所得的上清液進 行 260 nm 吸光值之測定。結果發現，相較 於控制組，Sta. aureus 之活菌數隨著作用時 間的延長而下降，所測得之 OD260 不但高 於控制組且隨著存活菌量之下降及作用時 間之延長而上升。顯示蜂膠酒精萃出物會 造成菌體細胞膜的傷害，使得細胞內的物 質洩漏至胞外，而造成菌體之死亡。 7.蜂膠酒精萃出物抑菌活性之熱穩定性 蜂膠之抗菌活性是否受熱影響目前尚 無相關之文獻。因此在本試驗中將蜂膠利 用水浴迴流的方式分別在 50、80 及 100℃ 下加熱 1 小時，以探討熱處理是否會影響 蜂膠的抑菌效果。結果發現，經過加熱處 理的蜂膠對試驗菌株生長之影響與添加未 經 加 熱 的 蜂 膠 者 並 無 顯 著 性 差 異 (p>0.05)，顯示 EEP 中具抗菌效果的物質乃 為熱安定者，在試驗條件下並不會受到熱 處理而破壞。 四、參考文獻
1. Amoros, M., Sauvager, F., Girre, L. and Cormier, M. 1992. In vitro antiviral activity of propolis. Apidologie 23: 231-240.
2. Crane, E. 1997. The past and present importance of bee products to man. Bee products : properties, applications, and apitherapy. New York: Plenum Press. p 1-14.
4
review. Bee World 60: 59-84.
4. Hegazi, A. G., Hady, F. K. A. E. and Allah, F. A. M. A. 2000. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Z. Naturforsch. 55c: 70-75.
5. Koo, H., Gomes, B. P. F. A., Rosalen, P. L., Ambrosano, G. M. B., Park, Y. K. and Cury, J. A. 2000. In vitro antimicrobial activity of propolis and Arnica montana against oral pathogen. Archives of Oral Biol. 45: 141-148.
6. Kujumgiev, A., Tsvetkova, I., Serkedjieva, Y., Bankova, V., Chrostov, R. and Popov, S. 1999. Antimicrobial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. J. Ethnopharmacol. 64: 235-240.
7. Menezes, H., Bacci, M. Jr., Oliveira, S. D. and Pagnocca, F. C. 1997. Antibacterial properties of propolis and products containing propolis from Brazil. Apidologie 28: 71-76.
8. Nieva Moreno, M. I., Isla, M. I., Cudmani, N. G., Vattunoe, M. A. and Samoietro, A. R. 1999. Screening of antibacterial activity of American del Valle (Tucumán Argentina) propolis. J. Ethnopharmacol. 68: 97-102.
9. Park, Y. K., Koo, M. H., Abreu, J, A. S., Ikegaki, M., Cury, J. A. and Rosalen, P. L. 1998. Antimicrobial activity of propolis on oral microorganisms. Current Microbial. 36: 24-28.
10. Takaisi-Kikuni, N. B. and Schilcher, H. 1994. Electron microscopic and microcalorimetric investigations of the possible mechanism of the antibacterial action of a defined propolis provenance. Planta Med. 60: 222-227.
