蝴蝶蘭基因體研究計畫─以核糖體RNA基因為蝴蝶蘭屬植物的分子標誌

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

以核糖體 RNA 基因為蝴蝶蘭屬植物的分子標誌

計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC92-2317-B-002-021- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 94 年 01 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學分子與細胞生物學研究所 計畫主持人： 高燕玉 共同主持人： 楊堯文 計畫參與人員： 高玉馨、蘇玟&#29641； 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 4 月 25 日

蝴蝶蘭基因體研究計畫─

以核糖體

RNA 基因為蝴蝶蘭屬植物的分子標誌

【中文摘要】 核糖體 RNA 基因包括 18S-5.8S-26S rDNA （即 45S rDNA）與5S rDNA 兩種，均為聚集 型的重複性序列，此兩種基因的重複單位皆 包含轉錄區及基因間間隔區(IGS)，其中 18S 與5.8S 間及 5.8S 與 26S 間又被內部轉錄間隔 區(ITS)隔開，分別為 ITS1 和 ITS2。ITS 和 IGS 之序列及長度在物種間的差異很大，因此常 用於親緣關係較近物種間的分析。本實驗以 Phalaenopsis aphrodite 之 5S rDNA 的基因轉 錄區設計一對專一性的引子，利用聚合酵素 連鎖反應（PCR）擴增28 種蝴蝶蘭及 1 種朵 麗蘭植物之 IGS 序列，做親緣關係樹的分 析，可將28 種蝴蝶蘭分成 7 群。此結果與過 去利用 ITS 序列分析的結果相比較，共有四 群植物相吻合，同時IGS 序列分析的結果， 與傳統依植物形態分類的結果較為一致。 關鍵詞： 蝴蝶蘭、基因間間隔區、親緣關係 【Abstract】

18S-5.8S-26S (45S) and 5S rDNAs are organized into clusters of tandem repeat with each repeat consisting of a transcribed region, and an intergenic spacer (IGS). In the transcribed region of 45S rDNA, on either side of 5.8S rDNA are found internal transcribed spacers (ITS), described as ITS1 and ITS2. The ITS and IGS have sequences diverged more than the transcribed region, and the presence of highly conserved sequences flanking each of ITS and IGS make them easy to amplify and useful for phylogenetic analyses of interspecies. In this study, the IGS sequences of 28 Phalaenopsis species and one Doritis species were amplified by the polymerase chain reaction (PCR) which used specific primers devised by 5S rDNA transcribed region of P. aphrodite. The neighbor-joining tree constructed from IGS consensus sequences divides the 28 Phalaenopsis species into seven

groups. The species from four groups coincided with the results from the IGS and ITS sequences analyses. Additionally, species in IGS phylogenetic tree were in agreement with traditional taxonomic status.

Keywords:

Phalaenopsis, IGS, phylogeny 壹、前言 蝴蝶蘭屬於蘭科(Orchidaceae)之蝴蝶蘭 屬（Phalaenopsis），依植物外部形態的特徵， Sweet (1980)將其分成九個節(section)，包括 43 個 原 生 種 和 4 個 天 然 雜 交 種 (natural hybrid)；Christenson (2001)則將 63 個原生種 分在五個亞屬(subgenus)和八個節。過去傳統 上 研 究 物 種 間 的 親 緣 關 係(phylogenetic relationships)主要是依據形態(morphology)和 交配能力(crossability)等性狀。近年來由於生 物 技 術 的 發 展 ， 以 分 子 標 誌(molecular markers)進行親緣關係分析已廣為分類學家 所使用。 核 糖 體 RNA 基 因 包 括 18S-5.8S-26S rDNA（即 45S rDNA）和 5S rDNA 兩種，均 為頭尾相接排列(tandem)的重複性序列，其重 複 的 單 位 (repeating unit) 包 含 轉 錄 區 (transcribed region) 和 基 因 間 間 隔 區 (intergenic spacer；簡稱 IGS)。在植物中，45S rDNA 的拷貝數(copy numbers)為 600 至 8500 個，其轉錄區域具高度保留性(conserved)序 列，而 IGS 的序列及長度在物種間的差異很 大(Long and Dawid,1980)，又 45S rDNA 的轉 錄區域內尚有兩個內部轉錄間隔區(internal transcribed spacers；簡稱 ITS)，分別為 ITS1 和ITS2，在物種間亦有差異；而 5S rDNA 的 拷貝數為1000 至 50000 個，含 120 bp 保留 性序列的轉錄區域，其 IGS 的序列及長度在 物種間的差異亦很大(Sastri et al., 1992)，因 此45S rDNA 的 ITS 序列以及 5S rDNA 的 IGS 序列，常被用來探究物種親緣關係及演化的

重要依據(Udovicic et al., 1995; Cronn et al., 1996; Cox et al., 1997)。

本 實 驗 依 據 李 文 靜(2002) 從 蝴 蝶 蘭 Phalaenopsis aphrodite 分離到的 5S rDNA 選 殖體，根據轉錄區序列設計一對專一性的引 子(primers)，以 28 種蝴蝶蘭及 1 種朵麗蘭植 物之基因組 DNA 為模板(template)，利用聚 合酵素連鎖反應（polymerase chain reaction, 簡稱PCR）擴增 IGS 序列，經選殖與定序後， 做親緣關係樹的分析，以了解這些蝴蝶蘭屬 植物在演化上的親緣關係。 貳、材料與方法 1. 植物材料 本實驗所使用的植物材料包括 28 種蝴蝶 蘭及1 種朵麗蘭。 2. 植物總 DNA 的抽取

植物總 DNA 的抽取係參考 Gawel 與 Jarret (1991)的方法。取 2 克植物葉片，加入液態 氮，快速磨成粉末，倒入離心管中，加15 ml CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) DNA 萃取緩衝液及 200µl β-mercaptoethnol， 混合均勻，放在650C 搖盪 1 小時。加入 15 ml chloroform 充分混合，離心取上清液，以 Miracloth 過濾，再加入 15 ml isopropanol， 輕緩混勻，離心沉澱DNA。加入 1 ml 1 M NaCl，置 65℃烘箱 30 min 溶解 DNA，然後 加入等量chloroform 與 DNA 混合，離心取上 清液，以2.5 倍體積的 99﹪酒精沉澱 DNA， 再以75﹪酒精洗兩次，待乾後，加 TE(10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0)緩衝液溶解， 置4℃冰箱保存。 3. IGS 序列的擴增、轉殖與定序 依 據 李 文 靜 (2002) 從 Phalaenopsis aphrodite 分離到的 5S rDNA 轉錄區序列設計 一 對 專 一 性 的 引 子 ， 分 別 為 5’-TTGGGAATTCCTCGTGTTGC-3’ 和 5’-CTGCGGAATTCCTGATGGGATCC-3’，以 不同蝴蝶蘭之DNA 為模板，利用聚合酵素連 鎖反應擴增IGS 序列。纯化後，裝載於 pUC18 載體，然後轉殖至大腸桿菌XL1-Blue 內，然 後 以 dideoxy chain termination 方 法 定 序 (Sanger, 1981)。

4. 親緣關係分析

以 Molecular Evolutionary Genetics

Analysis software (MEGA v. 2.0)軟體分析序 列間的親緣關係(Kumar et al., 2001)。再利用 neighbor-joining (NJ)(Saitou and Nei, 1987)的 方式轉化為親緣關係樹。 參、結果與討論 28 種蝴蝶蘭與一種朵麗蘭的 IGS 一 致性序列對齊排列後，以距離指數法做 neighbor-joining 樹(簡稱 IGS-NJ 樹)，可將 植物區分成 7 群(圖 1)。依 Sweet (1980)分 類系統，第一群蝴蝶蘭分散於3 個節，包 括 P. celebensis (Stauroglottis 節 ) 、 P.

micholitzii (Amboinenses 節)、P. mariae、 P. pallens、P. fasciata、P. lueddemanniana

和 P. pulchra (Zebrinae 節)；第二群蝴蝶蘭

分散於 2 個節，包括 P. amboinensis 和 P.

venosa (Amboinenses 節)、P. modesta 和 P. violacea (Zebrinae 節)；第三群蝴蝶蘭分散

於 2 個節，包括 P. sumatrana (Zebrinae

節)、P. cornu-cervi 和 P. mannii (Polychilos 節)；第四群蝴蝶蘭分散於 3 個節，包括

P. fuscata 和 P. viridis (Fuscatae 節)、P. gigantea (Amboinenses 節)及 P. maculata

(Zebrinae 節)；第五群蝴蝶蘭分散於 2 個 節，包括 P. equestris (Stauroglottis 節)、P.

amabilis、P. aphrodite、P. sanderiana、P. stuartiana 和 P. schilleriana (Phalaenopsis

節 ) ； 第 六 群 蝴 蝶 蘭 僅 P. lowii

(Proboscidioides 節)一種；第七群蝴蝶蘭

分 散 於 2 個 節 ， 包 括 P. stobartiana

(Aphyllae 節 ) 、 P. parishii 及 P. lobbii (Parishianae 節)。結果顯示，IGS 序列的 分析雖與 Sweet (1980)的分類系統有差 異，但與 Christenson (2001) 的分類結果 則相當一致。此外歸於同一群的三種蝴蝶 蘭 P. amboinensis 、 P. venosa 和 P. violacea，均包含大、中、小三型染色體 (Kao et al., 2001) ， 且 黃 (1999) 由 P. violacea 分離出的 Pvr I 重複性序列在此 三種蝴蝶蘭染色體的分佈模式相似，同時 利用 45S 與 5S rDNA 進行螢光原位雜交

亦得到非常類似的結果(李, 2002)，因此推 測三者的親緣關係應較為接近。

將 IGS 序列的分析與過去 ITS 序列的

分析結果(趙, 2003)相比較，吻合的植物共

有四群，包括：(a) P. pallens、P. fasciata

和 P. pulchra ； (b) P. amboinensis 、 P.

venosa、P. modesta 和 P. violacea；(c) P. cornu-cervi 和 P. mannii；(d) P. fuscata 和 P. viridis。 圖1. 28 種蝴蝶蘭屬植物 5S rDNA 之 IGS-NJ 樹，共分成7 群，分別以不同顏色代表。 肆、參考文獻 [1] 李文靜. 2002. 蝴蝶蘭屬植物核醣體 RNA 基因的選殖及實質定位. 國立台灣大學植 物學研究所碩士論文. [2] 黃建豪. 1999. 蝴蝶蘭兩種重複性 DNA 序 列的分離與定性. 國立台灣大學植物學研 究所碩士論文. [3] 趙芷瑩. 2003. 以 rDNA 之 ITS 序列探討蝴 蝶蘭屬植物之親緣關係. 國立台灣大學植 物學研究所碩士論文.

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伍、計畫成果自評

本研究內容與原計畫相符，已達成預定 成效。成果可發表於學術期刊，並可提供蝴 蝶蘭育種上之參考資訊。