行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
左歸丸對實驗性氣喘小鼠核轉錄因子與免疫調節之探討
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC92-2320-B-039-035- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 中國醫藥大學中國醫學研究所 計畫主持人： 高尚德 共同主持人： 王志堯，李妙蓉 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 93 年 12 月 22 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
; 成 果 報 告
□期中進度報告
左歸丸對實驗性小鼠核轉錄因子與免疫調節之探討
計畫類別：; 個別型計畫 □ 整合型計畫
計畫編號：NSC 92－2320－B－039－35－
執行期間：92 年 08 月 1 日至 93 年 07 月 31 日
計畫主持人：高尚德
共同主持人：王志堯、李妙蓉
計畫參與人員：
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執行單位：中國醫藥大學
中 華 民 國 9 3 年 1 2 月 2 2 日
一、中文摘要 中醫古典醫籍中，對於氣喘之病機、症狀早已有詳細記載，並累積豐富的臨床經驗， 左歸丸是明•張景岳《景岳全書》著名調理氣喘的方劑。在天竺鼠氣喘動物模式中，我們 發現在緩解期餵食左歸丸可降低立即性及遲發性反應，本研究擬利用純化塵璊萃取液誘發 BALB/c小鼠氣喘動物模式，研究BALB/c小鼠氣喘模型在緩解期以左歸丸治療後其呼吸道發 炎細胞、T細胞與化學趨化因子(chemokine)、細胞激素、血清IgE、血清抗原特異性抗體 (IgG1、IgG2a/2b)、轉錄因子NFκB、GATA-3及TLR2、TLR4之變化，以了解左歸丸對致敏 氣喘小鼠氣喘再激發時之影響。 研究結果顯示左歸丸：(1)能明顯降低肺泡沖洗液發炎細胞總數。(2)能顯著減少肺泡 沖洗液中嗜酸性白血球比例，(3)對肺泡沖洗液中CD4+-T細胞無影響。(4)對血清total IgE、抗原特異性IgG1及IgG2a/2b無影響。(5)對肺組織中TLR2、TLR4、eotaxin、RANTES、 TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-10無影響。 (6)可輕微抑制肺組織中NFκB之活性及明顯抑制 GATA-3之活性。 綜合以上結果我們認為在氣喘緩解期餵食左歸丸可降低氣喘再激發作時呼吸道嗜酸 性白血球之浸潤，輕微抑制NFκB之活性，並明顯抑制GATA-3之活性，其降低呼吸道阻力之 機轉仍待進一步探討。 關鍵詞：左歸丸,氣喘,發炎細胞,細胞激素,轉錄因子。
二、英文摘要
Abstract
In this research, we used Dermatophagoides pteronyssinus as a allergen to sensitized BALB/c to establish asthmatic animal model, and we evaluate the change of inflammatory cell infiltration, CD4+ Tcell and the expression of TLR2､TLR4､eotaxin､RANTES､TNF-α､
TGF-β､IL-1β､IL-10､NFκB､GATA-3 of the airway, and the change of the serum total IgE , Der P specific IgG1, Der P specific IgG2a/2b of sensitized BALB/c after Zo-Qui-Wan(ZQW) treatment to understand the effect of ZQW in murine asthma model.
The result show:
1. ZQW significantly reduced the total number of inflammatory cell in bronchoalveolar fluid (BALF) in BALB/c mice asthma model.
2. ZQW significantly decreased the eosinophil infiltration in BALF.
3. ZQW had no effect in serum total IgE, Der P specific IgG1 and Der P specific IgG2a/2b. 4. ZQW didn’t change the expression of TLR2､TLR4､eotaxin､RANTES､TNF-α､TGF-β､
IL-1β and IL-10 in lung of BALB/c mice asthma model.
5. ZQW slightly decreased the expression of NFκB in lung of BALB/c mice asthma model: 6. ZQW obviously decreased the expression of GATA-3 in lung of BALB/c mice asthma model.
These data suggested ZQW could decreased the eosinophil infiltration and the GATA-3 activation in lung of BALB/c mice asthma model. However, the precise mechanism of action of ZQW in asthma remains to be elucidated.
一. 前 言 氣喘是全球性的重大公共衛生問題(1,2)，引發氣喘最重要的因子是過敏反應。台灣處於 亞熱帶地區，因氣候潮濕，罹患過敏性疾病甚多，其中以過敏性鼻炎與氣喘最為常見，近年 來，社會進步，工業發達，環境污染日益嚴重，過敏性疾病如支氣管氣喘、過敏性鼻炎，不 但沒有減少，反而有增加的趨勢(3,4)。 氣喘致病機轉中，T-淋巴球對氣喘之形成、調控及氣喘呼吸道慢性發炎反應均扮演重要 角色。Th2 分泌 IL-4、IL-13 能抑制 Th1 之活性，相對的，Th1 產生的 IFN-γ、IL-10 對 Th2 細胞亦具有負迴饋反應。研究顯示氣喘患者呈現 Th2 細胞增多的趨勢(5)，Th2 細胞可經由 IL-4、IL-5 協助 IgE 的形成及活化肥大細胞與嗜酸性白血球。因此，在暴露於過敏原後，過 敏性氣喘之呼吸道中 Th2 細胞在調節慢性發炎反應、維持呼吸道過度反應性和控制特異性 IgE 生成上扮演關鍵角色。 最近幾年，影響特異性免疫反應來調控 Th1 或 Th2 路徑的因子已廣泛被發現，Th1 及 Th2 細胞是由 T 輔助性前驅細胞(Th0)於抗原呈現時受其環境與遺傳雙重因素影響下發展而 來。研究證據顯示Th1 和 Th2 反應在體內是互相調節的，調節 Th1/Th2 平衡並使之趨向 Th1 優勢化，對以因Th2 細胞為主的氣喘之治療是合理的策略(6,7)，亦提供了免疫調節劑發展之 方向，尋找能調節Th1/Th2 平衡的口服藥物是現今之研究重點。 NFκB 是一蛋白質轉錄因子，它是很多前發炎分子轉錄所必需，這些發炎分子在產生發炎 中很重要，如黏附分子(ICAM-1)，特殊脢(iNOS、COX2)，細胞激素(IL-1β、TNF-α、IL-6) 和 chemokines(IL-8)(8-10)，而很多證據顯示 NFκB 在氣喘之病理形成中扮演重要角色，類 固醇在氣喘治療主要的抗發炎機轉即是抑制 NFκB 之活化。 左歸丸是明 張景岳《景岳全書》氣喘緩解期調整體質的名方，我們發現左歸丸能夠降 低塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus, Der p)誘發氣喘天竺鼠立即性與遲發性氣喘反
應，本研究以 50µl Der P 尾部皮下注射在 day0 及 day7 致敏 ALB/c 小鼠，day14 氣管內滴入
50µl DerP 激發小鼠，休息 7 天再餵食左歸丸 1g/kg 連續 7 天，於 day29 天以 50µl DerP 氣
管滴入再次激發，在 24 小時後犧牲小鼠。
利用上述BALB/c 小鼠氣喘模式繼續深入探討 (1)左歸丸對肺組織 NFκB、GATA-3 活性之
影響，(2) 左歸丸對肺泡沖洗液中 T 細胞族群之消長，(3) 左歸丸對肺組織化學趨化因子之
變化與肺泡沖洗液內細胞激素之變化，(4)左歸丸對血清 total IgE、抗原特異性抗體(IgG1、
二. 研究目的
1. 左歸丸對塵螨致敏小鼠支氣管上皮細胞 NFκB 與 GATA-3 活性之影響。
2. 左歸丸對塵螨致敏小鼠細胞激素與化學趨化因子變化之影響。 3. 左歸丸對塵螨致敏小鼠 Th1/Th2 之影響。
4. 左歸丸對塵螨致敏小鼠血清 total IgE、Der P-specific IgG1 及 IgG2a/2b 之影響。 5. 左歸丸對塵螨致敏小鼠肺組織 TLR2、TLR4 之影響。 6. 探討左歸丸在氣喘緩解期之免疫調節作用。 三. 研究方法 (一).左歸丸之組成與比例 熟地 10 山菜庚 3 山藥 5 懷牛膝 4 枸杞 5 菟絲子 5 鹿角膠 3 龜板膠 3 (二).動物模式之建立
BALB/c 小鼠(6-8 週)購自國科會動物中心，在 day0 及 day7 以 50µl 溶液，內含
50µg Der P(佐劑:IFA)尾部皮下注射致敏，在 day14 以 50µl Der P(1mg/ml in PBS) 氣管內滴注激發。
(三).實驗分組
實驗組在上述 BALB/c 小鼠動物模式中，day15 至 day21 休息七天，於 day22 至 day28 連續餵食 7 天左歸丸 1 克/公斤；對照組則於 day22 至 day28 餵食生理食鹽水，
二組於 day29 以 50µl Der P 再次激發，day30 小鼠犧牲，作各項檢測。
(四).T-細胞之分析
以流式細胞儀檢測帶免疫螢光之單株抗體來分析 CD3/CD4 及 CD3/CD8。 (五).血清中之免疫球蛋白之分型與定量
以 ELISA 檢測血清中之 total IgE、DerP-specific IgG1 及 IgG2a/2b。 (六).semiquantitation RT-PCR
利用 RT-PCR 檢測肺組織中 TLR2、TLR4、eotaxin、RANTES、TNF-α、TGF-β、IL-1β、 IL-10 RNA 之表達。
(七).Nuclear extracts and EMSA
檢測肺組織中 NFκB 之表達。 (八).Western Blot 分析 檢測肺組織中 GATA-3 之表達。 (九).統計分析 以 one-way ANOVA 分析各組間之差異。 四. 結果與討論 (一) 支氣管肺泡沖洗液之分析 1. 左歸丸降低 Der P 再次激發後，BALB/c 小鼠肺泡沖洗液發炎細胞總數。(圖一) 2. 左歸丸降低 Der P 再次激發後，BALB/c 小鼠肺泡沖洗液中之嗜酸性白血球浸潤。 (表一)
3. 左歸丸對 Der P 再次激發後，BALB/c 小鼠肺泡沖洗液 CD4+Tcell 無影響。
(二) 左歸丸對 Der P 再次激發後，BALB/c 小鼠血清 Der p 特異性 IgG1及IgG2a/2b 無影響。 (圖二、圖三)
(三) 左歸丸對 Der P 再次激發後，BALB/c 小鼠血清 total IgE 無影響。(圖四)
(四) 左歸丸對 Der P 再次激發後肺組織中之 TLR2、TLR4、eotaxin、RANTES、TNF-α、
(五) 左歸丸輕微抑制 Der P 再次激發後 BALB/c 小鼠肺組織中 NFκB 活性(圖六)、及能明 顯抑制 GATA-3 之活性(圖七)。 我們在 Der P 誘發天竺鼠氣喘動物模式中發現左歸丸能降低 Der P 再次激發時之 立即性與遲發性氣喘反應，本研究利用BALB/c 小鼠氣喘動物模式探討其降低呼吸道 阻力之可能機轉，研究顯示左歸丸能較輕微抑制 NFκB 之活性，NFκB 在氣喘病理形成 中佔有一重要角色，氣喘患者呼吸道中具有活化的 NFκB，與氣喘惡化有密切相關的過 敏原及病毒感染皆能刺激 NFκB 之活化，氣喘中特殊之指標 RANTES 及 eotaxin 是 NFκB 依賴性的化學趨化因子(11)，臨床治療氣喘最有效的藥物-類固醇即是一很強的 NFκB 之活化抑制劑(12)，本研究中左歸丸呈現些較輕微抑制 NFκB 之表現變化，但肺組織
中 RANTES 與 eotaxin 之表現並未受影響。GATA-3 選擇性表現在 Th2 而非 Th1 細胞， 在 T 細胞中細胞激素基因表達上佔一非常重要角色(13-16)，尤其是 GATA-3 在 T 細胞 上 IL-5 表達(15-16)，臨床上亦發現氣喘患者呼吸道 GATA-3 mRNA 表達增加(17)，動 物氣喘模式中，呼吸道 GATA-3 明顯增加，若局部以 GATA-3； antisense
olgonuclieotides 治療，發現可成功的調降 Th2 所誘發之肺部發炎及呼吸道過度反應 (18)。研究顯示左歸丸在 GATA-3 方面有較明顯之抑制作用，關於其治療氣喘之作用 機轉有待更進一步的探討。
五. 參考文獻
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表一:各組肺泡沖洗液發炎細胞浸潤情形
發炎細胞 組別
Total cell counts (x104/ml)
Macrophages(%) Lymphocytes(%) Neutrophils(%) Eosinophils(%)
Basic group 8.38±7.18 5.90±3.45 0.24±0.22 0.05±0.06 0.00±0.00 Control group 64.29±19.21 18.71±6.56 4.70±2.15 40.50±12.51 4.59±1.47 ZQW group 42.00±8.23*
17.14±1.59 5.33±1.22 18.42±7.90*
1.11±0.60* ZQW group 與 Control group 比較。*: P＜0.05
圖一:各組肺泡沖洗液發炎細胞總數 ZQW 組與對照組比較，*:P＜0.05
圖二:各組血清抗原特異性 IgG1
圖四:各組血清 IgE
圖六:各組肺組織 NFκB 之表達
