行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
樟芝的活性成分研究(2/3)
計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC93-2321-B-002-007- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學化學系暨研究所 計畫主持人： 郭悅雄 計畫參與人員： 林睿達 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 94 年 5 月 24 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
樟芝的活性成分研究
Studies on the active principles from Antrodia camphorata
Chang-Chih
計畫編號：NSC 92－2321－B－002－006
執行期限：93 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 日
主持人：郭悅雄 國立台灣大學化學系
計畫參與人員：林睿達（助理）
一、中文摘要 三種不同品系的樟芝分別以甲醇作萃 取，萃取物用分配分離法，作成乙酸乙酯、 正丁醇及水可溶部。每部分做不同的活性 測試，如抗氧化、抗發炎、免疫調節等確 認哪種品系確實有生理活性，再從事其有 效成分的分離與確認，將來再推行有用品 系為健康食品，而有效成分作為製藥的目 的. 關鍵詞：樟芝、活性成分、抗氧化、免疫 調節、抗發炎 Abstract
Three different varieties of Antrodia camphorata (Chang-Chih) are extracted with methanol, respectively. The extracts are
portioned as EtOAc, n-BuOH and H2O
soluble fractions. Every fraction is tested for biological activities as antioxidation, anti-inflammatory, immune modulation, etc. The active fractions are separated and purified to give pure component and identify the structure. The active variety is introduced to serve as health food. And the active principle is developed as new drug.
Keywords: Antrodia camphorata
(Chang-Chih); Active principle; Antioxidation; Immune modulation; Anti-inflammatory 二、Purpose of Project 本研究計畫之總目標為開發台灣特有 藥用菇類樟芝，完成樟芝優良品系之篩選 及進行一系列的化學及生物活性研究，供 做開發樟芝成為多元化保健產品的依據。 樟芝自古以來為原住民著名的強身救命 丹，在民間 被認為具有祛風行氣、化瘀 活血、解毒消腫、抗菌、抗病毒及抗腫瘤 等功效。至今有關樟芝現代科學之藥理活 性尚少，初步的研究報告證實了樟芝具有 抗炎、保肝、抗癌、免疫調節、降血糖、 降血脂及抗氧化等活性。 三、Content of Project 樟芝子實體共 3 種分別是 No. 1、No. 2 及 No. 5。另外有菌絲體的乾燥物。3 種子 實體及菌絲體的分配分離如下執行。四種 sample 以甲醇萃取。 四種甲醇萃取物 懸浮於水層 EA 層 水層 n-butanol 層 水層 EA/水, 作分配 n-butanol/ 水, 作分配
四種 sample 其分成 12 個 fraction， 每個 fraction 經三個 cell lines PLC/PRF/5, HepG2, Hep3B 的測試，以 Sample 2 之
EtOAc 層表示最好的活性，其 IC50 分別為 65.5 µg/mL, 68.6 µg/mL 及 95.7 µg/mL，故 用 sample 2 之 EtOAc 可溶層作為分析材 料。 Sample 2 (由 1.2 kg 粉末, 共萃出其 EA 層可溶部 150 g) SiO2 (C. C), HPLC (SiO2) E/H 5% 16-51 E/H 10% 52-89 E/H 20% 90-116 E/H 30% 117-181 E/H 50% 182-196 E/H 70% 197-211 E 100% 212-235 M/E 10% 236-242 M/E 30% 243-266 H 1-15
H: Hexane, E: EtOAc, M: MeOH
1~266 為分離瓶數 共分離 266 瓶 (每瓶收 1000 mL)。 取 17 瓶分別以 20 µg/mL 作 HepG2, Hep3B 及 PLC/PRF/5 做活性抑制，發現 第 108 瓶活性最強，對 Hep3B 及 PLC/PRF/5 之抑制率為 53.13% 及 72.21%。但是亦發現有 proliferation 的結 果，尤其是 69, 178, 252 及 239 瓶增加細 胞分裂，可由 30% 到 45%。 第 108 瓶位在 20% E/H 之 eluent，因等不 及活性的測試，我們先以 30% fraction 進 行分離純化，利用 HPLC 而確認如下化合 物 (34 個)，屬於新化合物共 13 個，首次 由 天 然 分 出 新 化 合 物 有 6 個 。 下 列 structure，依不同骨架作標示。目前只有 compound S1 作 anticancer，成果算不錯， 對 PLC/PRF/5 之 IC50 值為 20.5 µg/mL。 四、References 1. 江素瑛等人(2002) 樟芝之致基因毒 性與抗基因毒性評估，中華保健食品 學會年會，台北市。 2. 宋祖瑩等人(2002) 樟芝深層培養發 酵濾保護四氯化碳誘導大鼠急性肝 損傷之能力，中華保健食品學會年 會，台北市。 3. 沈立言等人(2002) 牛樟芝菌絲體發 酵過濾液對肝臟生理機能之影響，中 華保健食品學會年會，台北市。 4. 郭淑卿等人(2002) 樟芝菌株發酵液 對大鼠紅血球及肝臟抗氧化系統之 影響，中華保健食品學會年會，台北 市。 5. 蔡敬民、劉翠玲(2002) 樟芝對於血糖 及血脂質之影響，中華保健食品學會 年會，台北市。 6. 賴宏亮等人(2002) 樟芝免疫調節活 性之研究，中華保健食品學會年會， 台北市。 7. 鍾彩華等人(2002) 牛樟芝菌絲體發 酵萃取液對大白鼠初代肝細胞生存 力、抗氧化解毒代謝能力之影響，中 華民國食品科學技術學會年會，彰化 縣。 O O HO O O H HO O F2: 5-Hydroxymethylfurfan-2-carboxylic acid methyl ester F1: 5-Hydroxymethylfurfural 1. Furanoid
2. Benzoquinone and Benzene
COOCH3
OCH3
H3CO OCH3
**B3: 3, 4, 5-Trimethoxybenzoic acid methyl ester
OCH3 OCH3 H3CO H3CO **B2: 1, 2, 4, 5-Tetramethoxybenzene O O H3CO H3CO B1: 2,3-Dimethoxy-[1,4]benzoquinone OH OCH3 OCH3 OH OCH3 *B4: 1, 2-Bis(3-hydroxy-2,4,5-trimethoxyphenyl)ethane H3CO OCH3 OCH3 COOCH3
**PM4: 2, 5-dimethoxybenzoic acid methyl ester OH OCH3 OH H3CO H3C OCH3 OH OCH3 H3CO PM2: 2, 3, 6-trimethoxy-4-methylphenol *PM1: 2, 4-dimethoxy-5-methylbenzene-1, 3-diol
3. Phenylmethanoid and Benzoquinonemethanoid
OH OCH3 H3CO **PM3: 2, 3-dimethoxy-5-methylphenol O O H3CO H3CO PM5: 2, 3-dimethoxy-5-methyl[1,4]benzoquinone 4. Phenylethanoid OCH3 H3CO OH CO2CH3
*PE1: Methyl 2-hydroxy-2-(2, 5-dimethoxyphenyl)acetate
5. Naphthoquinone (C11) OCH3 OCH3 O O OH H3CO *N1: 5-Hydroxy,2, 3 [1,4]naphthoquinone
6. Diterpenoid (Labdane,C20) OH O O *D4: 6α, 19-dihydroxy-8(17),11E-labdadien-16,15-olide *D1: 19-Hydroxy-8(17)-labdaden-16,15-olide HO O O H HO O O H D2: 19-Hydroxy-8(17),13-labdaden-16,15-olide HOOC H D3: Pinusolidic acid O O HO 7.Ergostane ( C28 ) HO O
ST1: Ergosta-7, 9(11), 22E-trien-3β-ol
O OH *ST2: 6β-hydroxy-4, 22E-ergostadiene -3, 15-dione O ST4: Ergosta-4, 6, 8 (14), 22E-tetraen -3-one O ST3: 3-Oxo-5β-22t-ergostene HO
*ST5: Ergosta-7,9(11), 25-trien-3β-ol
HO
**ST6: Ergosta-5, 25--dien-3β-ol
HO OO ST7: Ergosterol peroxide O OH ST8: 6β-hydroxy-4, 22E-ergostadien-3-one 8.Lanostane HO O H O O
LA1: 6β-Hydroxy-7, 9(11), 24E-lanostatrien-26-al *LA2: 3,11-Dioxolanosta-8, 24E-dien-26-oic acid O OH 9. Fatty acid CH3(CH2)nCOOH n=20-26 (n=20, 100%) 10. CoQ3 OAc O MeO MeO H H H O H O H 3-methyldihydrofuran-2-one OH O O OH O O OH HO OH O HO O
D5:14-Deoxy-11,12-dihydroandrographolide *D6:6a ,19-dihydroxy-8(17), 11E-labdadien-16,15-olide ( isomer of *D4 ) D7:14-Deoxyandrographolide O HOOC O D8:15-methoxypinusolidic OMe
抗肝癌活性結果 Hep G2
Cell growth inhibition (%)
N.D 38.00 11.22 -3.76 H2O N.D 45.63 19.26 -4.15 BuOH 115.8 83.33 52.27 3.78 EA 35398 N.D 35.81 18.63 0.81 H2O N.D 46.03 11.36 -4.78 BuOH 115.63 82.03 55.83 9.14 EA 35396 N.D 44.95 20.65 -9.82 H2O 222.36 56.53 26.06 0.62 BuOH 112.46 81.12 66.47 25.57 EA NO8 N.D 48.40 26.18 -2.78 H2O N.D. 49.16 21.09 -4.92 BuOH 92.01 88.61 71.98 30.38 EA NO7 IC50 value (μg/ml) 50 μg/ml 125 μg/ml 50 μg/ml
NO.7, NO.8 , 35396 , 35398 四種不同種類的牛樟芝經初步萃取再 Partition 後，分為 EA ,
BuOH , H2O 三層進行抗肝癌活性測試，以下為結果。
一、測定項目：
中樞神經系統作用 (Ab25-35)(阿茲海默氏症Alzheimer's Disease的預防) 二、實驗條件 :
新生大白鼠（Sprague-Dawley）之大腦皮質之神經元細胞培養成初級單層細胞。神經元細胞培養 至第五天加入D1-D8 (0, 1, 5, 10, 20μg/ml)處理2小時，再以5μM fAb25-35 (7 days ageing)處理 40小時，其存活情形與毒性反應以MTT試驗方法測試。數據以cell death (%)表示。 三、藥理活性報告 : 1.D-1, -2, -4, -5, 和-6在濃度高於20µg/ml時對神經元具有毒性，所以濃度選擇低於 20µg/ml。 D-8在濃度高於20µg/ml時對神經元仍不具有毒性，所以濃度選擇低 於100µg/ml。 2.篩選數據如以下圖表所示。簡述其活性如下： a. D-1在5, 10, 20µg/ml濃度下分別降低Ab25-35所造成的神經元死亡達37.6%, 30.6%, 和24.0%。 b. D-2在10, 20µg/ml濃度下分別降低Ab25-35所造成的神經元死亡達28.1%, 和18.8%。 c. D-8在50, 100µg/ml濃度下分別降低Ab25-35所造成的神經元死亡達19.6%, 和40.4%。 d. D-4在10, 20µg/ml濃度下分別降低Ab25-35所造成的神經元死亡達24.7%, 和32.8%。 e. D-5在10, 20µg/ml濃度下分別降低Ab25-35所造成的神經元死亡達22.5%, 和25.8%。 f. D-6在20µg/ml濃度下降低Ab25-35所造成的神經元死亡達26.9%。 3.綜述之，D-1在濃度5µg/ml和D-8在濃度100µg/ml下具有最好的神經元保護效果。 D ※ -8 (15-methoxypinusolidic acid) 為肖楠分離出的雙萜類，具有神經元保護效 果，其結構與此次牛樟芝分離出的Diterpenoid (Labdane type) 相似，但牛樟芝尚未有生合成出
Diterpenoid 之報告，此為首次新發現，具有價值的成果。
HOOC H
O O
Hep 3B
Cell growth inhibition (%)
228.9 51.52 35.22 4.67 H2O N.D 42.02 25.28 1.18 BuOH 175.62 69.20 42.42 8.30 EA 35398 N.D. 40.75 12.59 3.26 H2O N.D 42.63 25.26 9.04 BuOH 180.2 68.16 40.95 5.96 EA 35396 203.5 61.94 30.97 4.64 H2O N.D 52.16 24.93 4.47 BuOH 156.9 74.57 49.78 11.82 EA NO8 185.5 62.87 31.19 12.9 H2O N.D 43.89 20.64 5.46 BuOH 120.9 77.60 58.81 28.31 EA NO7 IC50 value (μg/ml) 250μg/ml 125μg/ml 50μg/ml PLC/PRF/5
Cell growth inhibition (%)
N.D 41.45 10.72 3.46 H2O N.D 47.45 15.65 5.51 BuOH 139.8 80.73 55.50 15.48 EA 35398 N.D 46.58 12.42 -2.44 H2O N.D 36.72 7.09 -3.73 BuOH 118.2 91.35 66.77 16.826 EA 35396 N.D 39.54 13.32 1.04 H2O N.D 36.26 14.40 1.90 BuOH 47.3 91.42 72.39 47.09 EA NO8 N.D 30.15 13.89 -2.49 H2O N.D 30.59 8.06 -2.54 BuOH 40.59 91.58 70.56 49.86 EA NO7 C50 value (μg/ml) 250μg/ml 125μg/ml 50μg/ml
