微生物金離子感測器與利用生物素酵素與其受體胜肽成像微生物中的蛋白質

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(1)國立臺灣師範大學化學系 Department of Chemistry, National Taiwan Normal University 碩士論文 Master Thesis. 微生物金離子感測器與利用生物素酵素與其受體胜肽成像微生物中的蛋白質 Microbial Sensor for the Detection of Gold and Imaging Microbial Proteins with Biotin Ligase and Biotin Acceptor Peptide. 指導教授：葉怡均. 博士. Advisor: Yi-Chun Yeh, Ph.D. 研究生：曾學瑋. 撰. Graduate Student: Hsueh-Wei Tseng 中華民國一百零三年七月 July, 2014.

(2) 謝誌當我得知直升輔大落榜時，心情伴隨著冷颼颼的東北季風，一陣一陣褪去我對化學的熱情，打算直接從軍去時，感謝輔大的老師們，在我推甄失利之後還不停地給我鼓勵，尤其是我的指導教授高華生老師以及老師陳元璋，幫助我在短時間內重振信心，選擇挑戰自我，經過幾番挫折及努力後，出乎意料地考上了國立臺灣師範大學。選擇就讀台師大後，沒想到也是一番波折，光是等備取就等到快要開學之外，還因為一時找不到指導教授而覺得驚慌失措，所幸最後葉怡均老師願意給我機會，讓我終於可以進入研究室開始我的研究生生活。在台師大的兩年，我不斷思索著未來，也經歷了一段時間的迷惘之後，終於找到自己想要努力去挑戰的目標及積極規劃的方向，真的非常感謝葉怡均老師的指導以及栽培，雖然數學不好常常計算錯誤配藥配錯、精神不好常常睡到快中午才來、不夠專注常常實驗前置作業做錯或是不夠認真準備書報討論和投影片，老師您還是願意花很多時間跟精神來指導我，尤其是英文和報告期刊的部分，我也在短時間內得到了很大的提升及進步，這對我在往後的幫助可是受用無窮！最後也謝謝您的肯定，肯定我的潛力，而且很幸運地在碩士兩年內完成老師賦予的題目並且成功發表了一篇期刊，此外也給我很多機會去挑戰自己，發掘自己的創造力，培養出能夠自己設計並規劃一個完整的實驗題目。如果當時進來台師大不是在老師您底下工作和學習，可能無法想像一個從高中到大學班上排名幾乎都吊車尾的人，在研究所兩年經過老師您的訓練和自己的堅持及努力不懈之後，竟然可以獲得斐陶斐的榮譽會員，這對我無疑是一個最大的肯定。這兩年的研究生成就，真的非常謝謝葉怡均老師，一切都是您的栽培，我才有今天的成就！而且我也對自己的目標和方向有更多的信心，在未來還會有很多需要老師指導和幫忙的地方，希望老師到時還願意幫助我。.

(3) 特別感謝陳家俊老師和黃文彰老師，在我們實驗室還尚未完成的時候，樂意提供空間、藥品和器材給我們使用，讓我們終於可以開始做一點實驗，不至於開學後都沒有進度。特別感謝林文偉老師，給了我很多建議和鼓勵，讓我原本迷惘的人生有了一個新的方向，而且也願意幫助我且支持我對於未來努力的方向和目標，在重新整理心情之後，繼續完成兩年的碩士班學位。感謝陳頌方老師，願意讓我使用您研究室的資源，使得我學習更多實驗技巧，且最重要的是幫助我完成研究成果，最後也謝謝老師願意花時間來當我的口試委員，除了給我很多研究上的建議之外，也讓我能夠在研究上有新的想法，而嘗試設計出一個新的研究，最後感謝老師給我的鼓勵和肯定。感謝台灣大學的黃筱鈞老師，讓我可以去您的研究室使用資源，幫助我完成我的研究成果，此外也謝謝您願意抽空特地來台師大當我的口試委員，最後還要感謝老師給我的鼓勵和肯定。感謝師大化學系的助教們，謝謝你們都非常有耐心的教導我們並且協助我們很多行政上的事物。感謝蔡宜蓉同學，在研究所這兩年彼此互相幫忙並鼓勵，讓我們都可以順利完成碩士班兩年的學位，也非常感謝妳常常聽我訴苦或是給我很多建議，希望未來也可以常常聯絡互相關照。感謝 C407 研究室的所有成員，尤其是學弟歐陽淳宇常常幫我糾正英文和報告的投影片，真是個囂張的學弟，不過卻意外的熱心和謹慎，未來實驗室就靠你了；學弟馬士元感謝你在實驗上常幫忙我，且還幫忙校正我的論文，雖然你有時在研究上的態度不夠嚴謹，希望未來能夠更專注在研究上並且幫助老師帶領之後進來的學弟妹們做研究；學妹兼大學同學的楊子瑩，希望在未來的一年，你能夠在這裡學習到更多，尤其是不求甚解和積極主動的態度，加油囉！另外，學弟顏家禾、林于寬和學妹陳姵璇、黃.

(4) 妤君，感謝你們也替學長姐們分擔實驗，也期許你們未來能更努力，為自己找到一個明確的目標而努力！感謝 A413 研究室的學長們，尤其是政宏學長，感謝每次去實驗室找你幫忙時，你都會不辭辛勞的幫助我們，不管是小事或是大事，都謝謝學長的幫忙！感謝 C404 研究室的所有成員，尤其是美麗的邱芷葳學姊和戴佩琳學姊，因為我是葉怡均老師第一屆的學生，所以有很多實驗上的問題或是對學校行政不熟悉都沒學長姊可以問，只好拜託妳們並透過妳們的幫忙，真的非常感謝妳們，不只人美還心地善良，只能怪我慧根不夠做事情比較笨拙，還要學姐們細心的指導；另外感謝同屆的同學們宋祖儀、劉昀昇、徐羽薇和林佳穎，除了時常彼此鼓勵並且互相幫忙之外，還偶爾一起吃飯、舉辦一些小活動和討論實驗，特別是林佳穎同學，在我陷於趕論文的深淵時，非常熱心的伸出援手幫助我，替我解決了很多問題，非常感謝！雖然是對面的鄰居，但感覺卻像都是同一間實驗室的成員一樣，真的非常感謝大家的付出和幫助！感謝 D301 研究室的各位，尤其是學長達達和小砲，還有學姊筱茹和孟潔，感謝你們也把我當葉家人一樣一起照顧，雖然我不是老葉家 (是小葉家)的成員，但你們還是常常找我參與你們研究室的活動，也會撥空幫我解決書報討論的問題或是考試的問題，真的非常感謝！另外，還有感謝同屆的同學們彼此互相鼓勵和支持！感謝 C104 研究室的各位，尤其是學長蔡長誌，雖然常常嘴裡不饒人，但還是會特別照顧學弟我；感謝同學們，雖然常常跑去你們實驗室鬧，不過你們還是很願意接納我，除此之外，我們還分享彼此領域的知識並一起學習和成長。感謝 D303C 研究室兩位美麗的學姊林亭君和王育暄，常常也會跑去你們家問問題或是聊聊天，學姊們也都很有耐心地回答，並常常約我一起吃.

(5) 飯或是同樂，真的很感謝你們對我的照顧。感謝在師大的輔大幫學長姐們、同學們和學弟妹們。果然是輔大人！想當初考上師大還一片迷惘的時候，在師大研究所的輔大學長姐們都很熱心地幫我介紹師大研究所各個領域的老師，並且親自帶我去研究室參觀，真的非常感謝學長姐們的幫忙；輔大的同學們，當時我們一起從輔大畢業、一起努力考上師大後，今天我們順利的要一起從師大研究所畢業了。兩年來，我們不時的一起吃飯、聊天和幫忙，即使面對了挫折，開玩笑歸開玩笑，還是會給點鼓勵，希望我們未來還能時常聯絡；來師大的輔大學弟妹們，希望未來也能幫助下一屆或是下下屆來自輔大的學弟妹們，我們要貫徹服務的精神，並且互相幫忙和鼓勵！感謝師大化研所系籃的大家，沒想到整天蹲在研究室之餘，還有額外的時間能夠運動，但除了運動之外，我們還一起去比賽，雖然最後沒有抱到任何一座獎杯回來，但至少當時比賽奮鬥的過程現在回想起來，還是意猶未盡阿！希望未來化研所的學弟們，能夠繼續為師大出去比賽，並透過籃球認識更多熱愛運動的化學人，以後運動不孤單，期許系籃的各位都是能文能武的人。感謝宅男宅女團和輔大主持王固定班底，不時對我關心和打氣，研究所這兩年除了工作之外，最常的就是跟你們揪團去郊遊或是打桌遊放鬆心情；聊聊彼此的未來及目標並且互相給予建議和鼓勵，真的非常感動有一群亦師亦友的好朋友們，從你們身上得到了很多也學到了很多！感謝在師大研究所這兩年來，常常陪在我身邊一起成長一起鬧的朋友們郭修甫、蔡譯緯、許永勝、陳全斌、洪子喬、詹侑得，謝謝你們不管是在我最失落或是最開心的時候，總是馬上來關心我甚至直接跑來找我，並且陪我分擔壓力或是分享喜悅；總是願意互相扶持並且有樂同享、有難同當，真的非常感謝我身邊有這樣一群知心的朋友們，希望不管未來我們身在何處，都能夠繼續保持聯絡，並且互相關心、勉勵彼此！.

(6) 最後，真的非常感謝一路陪著並栽培我長大的家人，尤其是一直辛苦養育我的爸爸和媽媽，我知道這趟學習的路上，我一直很叛逆，也一直很有自己的想法，不過最後還是被您們給說服踏入了理工科，這一路上真的受了很多挫折和失敗，還好很幸運地挺了過來，也從中學習到了很多樂趣及經驗，好不容易有了一個明確的目標，雖然一開始您們不太支持，但是我知道您們其實只是擔心我。到了最後，我算是成功了一半，並且證明了我是有能力可以去挑戰這個夢想的！也謝謝爸爸媽媽的諒解與最後的支持！我會繼續努力並直到圓滿達成我的夢想！.

(7) 目錄目錄............................................................................................................. I 圖表目錄.................................................................................................... V 摘要.......................................................................................................... IX Abstract ..................................................................................................... X I.. 微生物重金屬感測器 .........................................................................1. 第一章緒論...............................................................................................1 1.1 生物感測器 (biosensor) .......................................................................... 1 1.2 微生物與重金屬 ...................................................................................... 2 1.2.1 生物礦化作用 (biomineralization)............................................................. 2 1.2.2 微生物對金屬的耐受性 ............................................................................. 2 1.2.3 MerR 家族的轉錄調節因子 (transcriptional regulator of MerR family) ... 4. 1.3 金金屬微生物感測器 (microbial sensor of gold) .................................. 6 1.4 微生物宿主 .............................................................................................. 7 1.5 研究動機 .................................................................................................. 9 1.6 研究目標 ................................................................................................ 10. 第二章實驗藥品與器材 ........................................................................ 11 2.1 實驗儀器 ................................................................................................ 11 2.2 實驗藥品 ................................................................................................ 12. 第三章實驗方法 ....................................................................................14 I.

(8) 3.1 微生物感測器的設計 ............................................................................ 14 3.1.1 質體設計 ................................................................................................... 14 3.1.2 質體基因工程 (cloning) ........................................................................... 15. 3.2 實驗步驟 ................................................................................................ 21 3.2.1 專一性 (specificity) .................................................................................. 21 3.2.2 干擾性 (interference) ................................................................................ 22 3.2.3 耐受性 (tolerance) .................................................................................... 22 3.2.4 靈敏度 (sensitivity) .................................................................................. 23 3.2.5 最低偵測極限 (limit of detection, LOD) ................................................. 23. 第四章實驗結果與討論 ........................................................................24 4.1 微生物金離子感測器之篩選 ................................................................ 24 4.1.1 質體 PcupA/R-cupR-rfp 和宿主組合之金離子篩選 ................................ 24 4.1.2 質體 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 和宿主組合之金離子篩選 ............ 33. 4.2 微生物金離子感測器中 CupR 調控蛋白對金離子的感測 ................ 42 4.3 微生物金離子感測器之重金屬環境干擾及選擇性 ............................ 45 4.3.1 質體 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 和 C. metallidurans 宿主組合之微生物金離子感測器對其他重金屬的干擾探討 ..................................................... 45 4.3.2 質體 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 和 R. eutropha 宿主組合之微生物金離子感測器對其他重金屬的干擾探討 ............................................................. 48. 4.4 微生物金離子感測器之螢光強度與金離子濃度關係 ........................ 52 4.4.1 質體 PcupA/R-cupR-rfp 和 C. metallidurans 宿主組合之金離子濃度探討 ............................................................................................................................. 52 4.4.2 質體 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 和 C. metallidurans 和 R. eutropha 宿主組合之金離子濃度探討 ................................................................................. 53. 4.5 微生物 R. eutropha 金離子感測器改良 ............................................... 61 II.

(9) 4.5.1 質體 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp-cupC 和 R. eutropha 宿主之組合 . 61 4.5.2 質體加入 cupA 和 cupC 的不同組合並與 R. eutropha 宿主組成感測器 ............................................................................................................................. 63. 4.6 螢光顯微鏡下的微生物金離子感測器效率 ........................................ 67. 第五章結論.............................................................................................69 II.. 微生物蛋白質顯像技術 ................................................................71. 第六章緒論.............................................................................................71 6.1 生物顯像技術 (biological imaging) ..................................................... 71 6.2 生物素化作用 (biotinylation) ............................................................... 73 6.3 目標蛋白質 (target proteins) ................................................................ 74 6.3.1 細胞表面的目標蛋白質 ........................................................................... 74 6.3.2 蛋白質與蛋白質之間的作用 (Protein-protein interaction) .................... 77. 6.4 研究動機 ................................................................................................ 80 6.5 研究目標 ................................................................................................ 81. 第七章實驗藥品與器材 ........................................................................82 7.1 實驗儀器 ................................................................................................ 82 7.2 實驗藥品 ................................................................................................ 83. 第八章實驗方法 ....................................................................................86 8.1 質體設計和基因工程 (cloning) ........................................................... 86 8.1.1 質體設計 ................................................................................................... 86 8.1.2 質體基因工程 (cloning) ........................................................................... 87. 8.2 蛋白質純化 (protein purification) ........................................................ 91 III.

(10) 8.2.1 蛋白質標記 (His-Tag) .............................................................................. 91 8.2.2 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophore, SDS-PAGE) .................................................... 93 8.2.3 蛋白質純化 ............................................................................................... 96 8.2.4 蛋白質濃度測定 (Bradford protein assay) .............................................. 97 8.2.5 鎳樹脂回收 (recovery of Ni-NTA resin) .................................................. 98. 8.3 微生物蛋白質標記 (microbial proteins labeling) ................................ 99. 第九章實驗結果與討論 ......................................................................101 9.1 微生物外膜蛋白質標記 ...................................................................... 101 9.2 微生物體內蛋白質與蛋白質間的交互作用觀察 .............................. 103. 第十章結論...........................................................................................106 參考文獻 ..................................................................................................... 107. IV.

(11) 圖表目錄 Fig. 1-1 鏈黴菌 (Streptomyces lividans)染色體中對汞的調節基因組 mer4b。 ............................................................................................................................. 3 Fig. 1-2 mer 調節基因系統啟動子機制。 ........................................................ 3 Fig. 1-3 S. typhimurium 染色體中的 gol 調節基因組。 ................................. 4 Fig. 1-4 C. metallidurans 染色體中，對金的調節基因組 cup 系統示意圖 7。 ............................................................................................................................. 5 Fig. 1-5 比較 CueR (E. coli)、GolS (S. typhimurium)和 CupR (C. metallidurans) 的 C 端金屬結合根的辨識序列 7。.................................................................. 5 Fig. 1-6 設計質體後轉化到大腸桿菌 (E. coli)做微生物金離子感測器。 ... 6 Fig. 1-7 利用微生物金離子感測器檢測金的濃度並藉由紅色螢光蛋白 (red fluorescence protein, RFP)當作輸出圖 10。 ...................................................... 7 Fig. 3-1 質體設計 ............................................................................................ 14 Fig. 3-2 微生物金離子感測器的反應機制 11。 ............................................ 15 Table 3-1 引子的名稱和序列。 ...................................................................... 16 Fig. 3-3 接合作用的示意圖。 ........................................................................ 20 Fig. 4-1 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100. M 的濃度於 E. coli. DH10B 的培養液中。 ..................................................................................... 25 Fig. 4-2 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100. M 的濃度於 C.. metallidurans CH34 的培養液中。 ................................................................. 27 Fig. 4-3 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100. M 的濃度於 R. eutropha. H16 的培養液中。 ........................................................................................... 29 Fig. 4-4 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100. M 的濃度在於 12 小. 時之後比較三個不同微生物宿主的專一性。............................................... 31 Fig. 4-5 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100 V. M 的濃度於 24 小時.

(12) 之後比較三個不同微生物宿主的專一性。................................................... 32 Fig. 4-6 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100. M 的濃度於 E. coli. DH10B 的培養液中。 ..................................................................................... 34 Fig. 4-7 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100. M 的濃度於 C.. metallidurans CH34 的培養液中。 ................................................................. 36 Fig. 4-8 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100. M 的濃度於 R. eutropha. H16 的培養液中。 ........................................................................................... 38 Fig. 4-9 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100. M 的濃度於 12 小時. 之後比較兩個不同微生物宿主的專一性。................................................... 39 Fig. 4-10 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100. M 的濃度於 24 小. 時之後比較兩個不同微生物宿主的專一性。............................................... 40 Fig. 4-11 由肉眼判觀察顏色的變化。 .......................................................... 41 Fig. 4-12 將設計好的質體刪除 cupR 基因，只保留啟動子和紅色螢光蛋白 11. 。 .................................................................................................................... 42. Fig. 4-13 將刪除 cupR 基因的質體與原本的質體作比較。........................ 43 Fig. 4-14 微生物 C. metallidurans 感測器在各重金屬的專一性檢測 11。 . 45 Fig. 4-15 微生物 C. metallidurans 感測器在各種重金屬的干擾檢測。 ..... 47 Fig. 4-16 微生物 R. eutropha 感測器在各重金屬的專一性檢測 11。 ......... 48 Fig. 4-17 微生物 R. eutropha 感測器各加 50. M 重金屬作干擾性檢測。. ........................................................................................................................... 50 Fig. 4-18 C. metallidurans 和 PcupA/R-cupR-rfp 的質體基因組感測器劑量反應曲線。 ........................................................................................................... 52 Fig. 4-19 C. metallidurans 和 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 的質體基因組感測器劑量反應曲線。 ....................................................................................... 53 Fig. 4-20 R. eutropha 和 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 的質體基因組感測器 VI.

(13) 劑量反應曲線。 ............................................................................................... 54 Fig. 4-21 C. metallidurans 當作宿主的感測器在低濃度的金離子中檢測。 55 Fig. 4-22 R. eutropha 當作宿主的感測器在低濃度的金離子中檢測。 ....... 55 Fig. 4-23 C. metallidurans 當作宿主的感測器在金離子濃度中的檢測。 ... 56 Fig. 4-24 C. metallidurans 當作宿主的感測器偵測金離子。 ....................... 57 Fig. 4-25 R. eutropha 當作宿主的感測器在金離子濃度中的檢測。 ........... 58 Fig. 4-26 R. eutropha 當作宿主的感測器偵測金離子。 ............................... 59 Fig. 4-27 R. eutropha 和 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp-cupC 的質體基因組感測器。 ............................................................................................................... 62 Fig. 4-28 R. eutropha 和 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp-cupC 的質體基因組感測器高低濃度檢量線。 ................................................................................... 63 Fig. 4-29 不同的質體設計。 .......................................................................... 64 Fig. 4-30 不同質體的 R. eutropha 的感測器比較。 ..................................... 65 Fig. 4-31 比較四組不同質體的 R. eutropha 感測器，其每單位螢光強度及針對高濃度的金離子耐受性。 ........................................................................... 66 Fig. 4-32 C. metallidurans 感測器在有金離子的情況下產生螢光的效率。 67 Fig. 4-33 R. eutropha 感測器在有金離子的情況下產生螢光的效率。 ....... 68 Fig. 4-33 R. eutropha 感測器 (含有 cupC 基因的質體)在有金離子的情況下產生螢光的效率。 ........................................................................................... 68 Fig. 6-1 列舉五種常用的標記方法： ............................................................ 72 Fig. 6-2 運用 biotinylation 的方法做標記的示意圖。 ................................. 73 Fig. 6-3 兩圖皆是同一個區域的 HeLa (Helen Lane)細胞圖，並標記細胞的表面蛋白質。 ................................................................................................... 74 Fig. 6-4 FhuA 蛋白質用 biotinylation 標記的示意圖。 ................................ 76 Fig. 6-5 蛋白質 A 與蛋白質 B 間的交互作用，分別接上 BirA 酵素和對其 VII.

(14) 具有專一性的胜肽做 biotinylation 標記並檢視 19。 .................................... 77 Fig. 6-6 螢光顯微鏡下觀察 HEK 細胞中的 FKBP/FRB 兩個蛋白質間的交互作用。 ............................................................................................................... 78 Fig. 6-7 蛋白質 FtsZ 與 ZapA 交互作用透過 biotinylation 標記的示意圖。 ........................................................................................................................... 79 Fig. 8-1 質體的設計。 .................................................................................... 86 Fig. 8-2 FhuA 蛋白質用 biotinylation 標記的模型圖。 ................................ 87 Fig. 8-3 蛋白質 FtsZ 與 ZapA 交互作用透過 biotinylation 標記的模型圖。 ........................................................................................................................... 87 Table 8-1 引子的名稱和序列。 ...................................................................... 88 Fig. 9-1 利用顯微鏡觀察大腸桿菌外膜 FhuA 蛋白質接上紅色螢光蛋白。 ......................................................................................................................... 101 Fig. 9-2 利用顯微鏡觀察大腸桿菌外膜 FhuA-BAP 在加入 BirA 酵素、ATP 和生物素螢光衍生物之後的情況。............................................................. 102 Fig. 9-3 利用顯微鏡觀察大腸桿菌體內 FtsZ 蛋白質接上紅色螢光蛋白。 ......................................................................................................................... 103 Fig. 9-4 利用顯微鏡觀察大腸桿菌 FtsZ-BAP/ZapA-BirA 在加入生物素螢光衍生物之後的情況。 ..................................................................................... 104. VIII.

(15) 摘要第一部分，我們運用基因工程技術設計出一組針對金離子有專一性且選擇性良好的微生物感測器。本實驗是採用耐金屬貪銅菌 (Cupriavidus metallidurans)對金的調節基因組 cup 系列的基因作為感測器的元件，並透過基因工程技術以紅色螢光蛋白 (RFP)當作輸出訊號，用來檢測金屬。我們將其應用於耐金屬貪銅菌 (Cupriavidus metallidurans) 和青枯桿菌 (Ralstonia eutropha)這兩種對環境適應力較強的土壤菌，一起探討這兩種微生物感測器的專一性、耐受性和選擇性。由於傳統的儀器檢驗需要高成本、高人力又耗時，可利用微生物感測器做簡單的操作，而且低成本又省時的特性，在簡單的檢測及定量時，可以提供另一種替代的分析工具。第二部分，我們運用生物素化作用 (biotinylation)標記法來觀察微生物的蛋白質。螢光蛋白標記雖然是現在最普遍且高專一性的方法，但螢光蛋白普遍都較大，會影響或干擾目標蛋白質的運動；生物素化作用標記則是運用一段可結合生物素的胜肽 (biotin acceptor peptide, BAP)經過生物素的酵素 (biotin ligase, BirA)催化，就可以與生物素 (biotin)結合，專一性高且都是小分子，接下來就是比較兩個方法的效果。此系統原本應用於哺乳類動物細胞的蛋白質研究，而本實驗將其技術應用於微生物的蛋白質標記，不只是觀察單一的蛋白質，也可以觀察蛋白質與蛋白質之間的交互作用 (protein-protein interactions, PPIs)，拓展對於微生物的顯像技術和應用方法的選擇。. 關鍵字：微生物感測器、耐金屬貪銅菌、金的調節基因組 cup、青枯桿菌、生物素化作用標記法、可結合生物素的胜肽、生物素的酵素、生物素. IX.

(16) Abstract The part I of this thesis presents a fluorescence-based microbial sensor for the detection of heavy metal ions as a novel analytical tool for environmental applications. Our results demonstrate the effectiveness of whole-cell biosensor in the selective detection of gold ions. Cupriavidus metallidurans has a gold-resistance system controlled by cup regulon that has a gold-specific sensory protein CupR, a transcriptional regulator of MerR family. Two heavy-metal tolerant proteobacteria, Cupriavidus metallidurans and Ralstonia eutropha, were examined and showed great specificity. This work highlights the potential of employing engineered microbial strains as robust analytical tools. And, the part II describes a simple way to label proteins of microbes with biotinylation. The fusion of a fluorescent protein to target proteins has high specificity, but its size potentially disrupts trafficking and may cause misfolding. So we used an enzyme, biotin ligase (BirA) from E. coli, and a 15-amino acid peptide, biotin acceptor peptide (BAP), to achieve the high specificity and rapid labeling. Besides, BAP is a small tag and has less potential to disrupt target proteins. Microbial surface proteins tagged with BAP are biotinylated by biotin ligase. The other hand, this methodology also can label protein-protein interactions (PPIs) in cell. One protein of interest is fused to BirA, while another protein is fused to BAP substrate. Aside from mammalian cells, this work has demonstrated the adaptability of this technique to microbial system.. Keyword: fluorescence-based microbial sensor, Cupriavidus metallidurans, X.

(17) gold-resistance system controlled by cup regulon, Ralstonia eutropha, biotinylation, biotin acceptor peptide (BAP), biotin ligase (BirA), biotin. XI.

(18) I.微生物重金屬感測器第一章緒論 1.1 生物感測器 (biosensor) 在分析化學中，最重要的部分是對物質成分的分析，可用來量測藥品、化合物質與其他分子。現在主要都是以傳統分析儀器來進行分析，雖然優點是高準確率，但需要高成本、高人力及較長的時間進行量測。近幾年生物感測器不斷的被開發，其最獨特的地方就是利用生物體當作元件，在分析目標物時，具備高專一性、高靈敏度或高選擇性，尤其是低成本和可以即時輸出 (real-time output)的特性最吸引人，而在生物感測器的種類中，又依照不同的生物元件有不同的感測器，比如：酵素、抗體、蛋白質…等。生物感測器主要分為蛋白質為主的感測器 (Protein based biosensor)和整個微生物細胞為主的感測器 (whole-cell based biosensor)兩大類 1。蛋白質為主的感測器包含了酵素 (Enzymes)感測器、蛋白質 (Purified Protein) 感測器 (不涉及酵素的作用)和抗體 (Antibodies)感測器，這些感測器都具有高靈敏度和高專一性，在使用上也相當廣泛，但其純化過程較麻煩且產率也不高，需花費較多時間跟成本。相較於蛋白質為主的感測器，微生物細胞為主的感測器 (whole-cell based biosensor)是利用整個微生物細胞作為感測器，不需要純化只需要利用簡單的基因改造工程，將調節基因 (regulatory gene)、啟動子 (promoter)和表達基因 (reporter gene)結合的質體輸送到微生物體內。其在檢測時操作容易，雖然專一性和靈敏度會依不同調節基因產生的調節蛋白而對待測物的辨識度及結合能力有所不同，但大致上都具有很好的靈敏度及專一性，還有低成本和省時的優點 2。 1.

(19) 1.2 微生物與重金屬. 1.2.1 生物礦化作用 (biomineralization) 金屬在自然界的循環中，微生物扮演著主要的其中一環，因為有些金屬離子是微生物必需的營養，所以微生物本身發展出一套代謝的機制，透過其基因組產生的蛋白質來管理體內的金屬平衡，將多餘的金屬排出體外，進而形成生物礦化作用. (biomineralization)3 。如革蘭氏陰性菌. (Gram-negative)中的耐金屬貪銅菌 (Cupriavidus metallidurans)，其含有許多抵抗金屬的機制，可以透過抵抗基因組的調節來減少金屬在微生物體內累積而造成毒性增加，因此在自然界礦產豐富的地區，此類的細菌被大量的發現於這些礦物上。. 1.2.2 微生物對金屬的耐受性當微生物暴露在污染的環境下，其本身會啟動一些防禦機制保護自己。生物膜 (biofilm)則是其中一種由微生物自身產生的多醣體所形成的保護機制，而微生物會被多醣體包圍，故大量的微生物因此聚集並附著在同一個地方，透過此方式可以使微生物更容易應變外在的環境且更容易存活。另外一種保護機制則是調節因子的系統，透過轉錄調節因子 (transcriptional regulator)感應外來的侵入物，進而啟動整個系統的抵禦外來物，幫助微生物調節並減少體內的毒化物量，最後利用膜內外蛋白將毒物排出，使微生物能夠存活於惡劣的環境。早期發現某些微生物能夠存活在重金屬的環境下，深入研究後，這些微生物是將重金屬離子還原成原子來降低重金屬毒性，其中 mer 的基因調節系統是最早被發現的基因調節系統，其可以讓汞離子被微生物還原成汞原子 (Fig. 1-1)4 。之後，科學家更深入的研究 mer 基因調節系統的反應代 2.

(20) 謝機制，在 mer 基因調節系統中，是當 MerR 調節蛋白結合汞離子時，其錯合物會與啟動子結合，透過此方式控制並表現其他的基因組產生蛋白 (Fig. 1-2)。. Fig. 1-1 鏈黴菌 (Streptomyces lividans) 染色體中對汞的調節基因組 mer4b。. Fig. 1-2 mer 調節基因系統啟動子機制。 (A) 在沒有汞的環境中，MerR 蛋白以二聚體的形式和啟動子結合，不利於 RNA 聚合酶的附著，故後續基因的轉錄受到抑制。 (B)當環境中含有汞離子時，MerR 蛋白則會與汞離子結合，並影響其與啟動子的結合，使 RNA 聚合酶得以作用 4a。. 除了汞之外，其他重金屬的調節因子和機制也陸續被發現，如鋅、鎘、銅、鉛…等，而不同重金屬分別有各自的調節因子，這些轉錄調節因子都被稱為 MerR 家族，因為這一類的蛋白質有相似的 N 端 DNA 結合的螺旋結構 (N-terminal DNA-binding helix-turn-helix)和多種訊號辨識的 C 端 5， 3.

(21) 在 MerR 家族中，N 端都有類似的胺基酸序列與啟動子的結合形式有關； C 端則是都有一段類似的胺基酸金屬結合根 (metal binding root, MBL)，每種調節因子會與因應的金屬而有些微不同。. 1.2.3 MerR 家族的轉錄調節因子 (transcriptional regulator of MerR family) 微生物除了對汞有 MerR 調節蛋白之外，還有對鋅的調節蛋白 ZntR、對銅的調節蛋白 CueR 和對鉛的調節蛋白 PbrR，這些都是在 MerR 之後陸續被發現轉錄調節因子，並且都被歸類為 MerR 家族的一員，近期也有很多新的轉錄調節因子被陸續發現，而其中最讓人感興趣的就是微生物對金的調節系統了。 2007 年 Fernando C. Soncini6 發表了一個新的 MerR 家族成員 GolS，被發現於鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)的調節基因組 gol (Fig. 1-3)，而 GolS 調節蛋白可以調控並表現 gol 基因組的三組基因，分別為 golT、 golB 和 golS 本身。. Fig. 1-3 S. typhimurium 染色體中的 gol 調節基因組。. 除了鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)含有 gol 調節金的基因組之外，耐金屬貪銅菌 (Cupriavidus metallidurans)也有相似功能的基因組。除此之外，C. metallidurans 包含了多種重金屬抵抗基因組，使其能夠存活在含有重金屬汙染的沉積物或是土壤中，所以在前面提到的生物礦化作用 (biomineralization)中，此微生物扮演著重要的角色。2009 年 Chuan He7 針對 C. metallidurans 調節金的基因組的研究，發表了調節基因組 cup 系統， 4.

(22) 其基因組產生的調節蛋白 CupR 可以調控三組基因，分別為 cupC (可製造運輸並排解重金屬的蛋白 CupC)、cupA (可製造輸送重金屬的膜上蛋白 CupA)和 cupR 自己 (Fig. 1-4)7。另外，作者挑了來自三種不同微生物中的調節蛋白做基因序列的比較與檢視，分別為 C. metallidurans 對金離子的調節蛋白 CupR、S. typhimurium 對金離子的調節蛋白 GolS 和 E. coli 對銅離子的調節蛋白 CueR，這三種皆為 MerR 家族的調節蛋白 (Fig. 1-5)7。透過 Fig. 1-5 可以發現，三種不同的調控蛋白都有一段類似的金屬結合根 (metal binding root, MBL)，因為這些調控蛋白都是利用半胱氨酸 (cysteine)上的硫基與金離子結合 (CueR 跟銅結合)，金屬於軟性金屬 (soft metal)，而金離子為軟性路易斯酸 (soft Lewis acid)，故能與軟性路易斯鹼 (soft Lewis base) 的硫基形成穩定的錯合物 8。. Fig. 1-4 C. metallidurans 染色體中，對金的調節基因組 cup 系統示意圖 7。. Fig. 1-5 比較 CueR (E. coli) 、 GolS (S. typhimurium) 和 CupR (C. metallidurans)的 C 端金屬結合根的辨識序列 7。. 5.

(23) 1.3 金金屬微生物感測器 (microbial sensor of gold) 微生物基因工程的進步，讓微生物感測器可以取代一些毒化物的分析方法，目前這類的生物感測器已經被用來偵測幾個重金屬，包括汞、鉻、砷、鉛、鎳、鈷、鋅、金和銅。在微生物中，它們利用金屬反應轉錄的調節蛋白 (metal-responsive transcriptional regulator protein)來控制體內的金屬離子濃度。MerR 家族的蛋白質則是最常見的一系列金屬調節蛋白，其中包括 CueR 為針對銅金離子的調節蛋白；MerR 為針對汞離子和 GolS 為針對金離子的調節蛋白等 9。 2008 年，Peng R. Chen 和 Jing Zhao10 利用此系統發展出針對重金屬金離子的微生物感測器 (Fig. 1-6A)，並利用紅色螢光蛋白 (red fluorescence protein, RFP)當作訊號輸出 (output)，即可檢測螢光的強度並佐證此微生物感測器對金的敏感度以及專一性 (Fig. 1-6B)。. Fig. 1-6 設計質體後轉化到大腸桿菌 (E. coli)做微生物金離子感測器。 (A)參考 S. typhimurium 的 gol 調節基因組並利用基因工程的技術重新設計一個微生物感測器，在基因的下游植入紅色螢光蛋白的基因組當作訊號輸出後移植到大腸桿菌 (E. coli)。 (B)為微生物金離子感測器示意圖 10。 6.

(24) 1.4 微生物宿主發展微生物感測器，最重要的就是微生物本身，該使用哪一種微生物當作宿主？前面提到微生物金離子感測器的微生物宿主是選用大腸桿菌 (Escherichia coli)，因為大腸桿菌繁殖速度較快，只花半天的時間就可以觀察到結果，但是大腸桿菌本身對於金的毒性耐受性不是很好，所以 2008 年，Peng R. Chen 和 Jing Zhao10 發展出來的重金屬金離子微生物感測器的金離子濃度只能到 20M (Fig. 1-7)。. Fig. 1-7 利用微生物金離子感測器檢測金的濃度並藉由紅色螢光蛋白 (red fluorescence protein, RFP)當作輸出圖 10。. 本實驗會採用除了大腸桿菌外，還會另外使用兩種微生物當作宿主，分別為耐金屬貪銅菌 (Cupriavidus metallidurans)和青枯桿菌 (Ralstonia eutropha)。C. metallidurans CH34 本身為一種土壤菌，此種微生物可以存活在較惡劣的環境中，尤其本身含有對金金屬耐受性的機制，可以提高對金的檢測濃度；R. eutropha H16 也是一種土讓菌且生物需求較簡單、繁殖快速與不具致病性，若應用在生物感測器上，無須擔心對操作人員健康上的危害，在之前的生物科技研究上也長期受到關注，如生物塑膠和生質能源的研究。用此兩種微生物當作宿主，在未來的應用上可以有較多選擇， 7.

(25) 且對金的選擇性和靈敏性都相當好 11。. 8.

(26) 1.5 研究動機一直以來，分析化學主要都是以傳統分析儀器來進行分析，但是這類的儀器不只是需要專業的人員操作，還需花費較多人力資源且過程費時，成本也相對較高，雖然有較高的準確率。近幾年，很多低成本、低人力且可即時觀測結果的生物感測器正在蓬勃的發展，而且這些生物感測器又有高專一性、高選擇性和高靈敏度優點，這些特性都是讓科學家不斷去鑽研並開發更精密的生物感測器的理由，希望未來在檢定一些簡單的有機物、重金屬或是毒化物時，能夠快速且便宜的篩檢。重金屬一直是被環保所關注的議題，因為大多數的重金屬都是劇毒的，而且不管是自然界中存在的或是人為所製造的，重金屬一直存在於我們生活中，只要含量過多，就會造成生物體立即性的毒害。因此，管控重金屬儼然成為一個重要且緊急的一門技術，如果能夠透過結合微生物感測器技術，達到高效率且即時檢測的效果，便可以即時觀測並保護環境。除了環保議題之外，可以將其應用在一些貴重金屬的探測，例如金這類高價值的原料；在工業上，亦能利用微生物感測器做為檢測金在沉澱物或是廢液中的含量，相較於利用傳統的分析法，成本跟時間就相對都節省不少，回收金的成本整也可以降低。綜合上述，生物感測器 (微生物感測器)相較於一般傳統的分析儀器，具有低成本且可即時觀測的優勢，使用上可以比傳統的儀器更方便，此外微生物感測器有高靈敏度和高專一性，可以明確地檢測出單一目標物。因此，發展微生物感測器是一個具有應用潛力的方向，不僅可以促進環境保育，還可以應用於工業用途！. 9.

(27) 1.6 研究目標微生物感測器的重要，從前面的章節就不斷的被討論，尤其是針對貴重金屬的檢測方面，希望有更多元的發展，所以本實驗會與前面文獻中發展出來的重金屬金離子感測器類似，不過不同於前面文獻所使用針對金離子的感測系統，是源自於鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)對金的調節基因組 gol (Fig. 1-3)，本實驗是採用耐金屬貪銅菌 (Cupriavidus metallidurans)對金的調節基因組 cup (Fig. 1-4)作為重金屬金離子感測器。接著就是將此系統仿造 Fig. 1-6 或是設計成其他的模式的質體，接著將其植入微生物體內，並且運用於檢測金離子的濃度。這次實驗會用三種不同的微生物作為宿主，分別為大腸桿菌 (E. coli)、耐金屬貪銅菌 (C. metallidurans)和青枯桿菌 (R. eutropha)，並針對各個微生物金離子感測器的專一性、靈敏度 (最低濃度檢測極限)、選擇性 (干擾性實驗)和耐受度做一連串深入的研究並探討。. 10.

(28) 第二章. 實驗藥品與器材. 2.1 實驗儀器名稱 (中文). 名稱 (英文). 廠牌. 高速冷凍多用途離心機. Centrifuge(Refrigerated). Hettich. 數位顯示型乾浴器. Dry Bath. Basic Life. 離心機. High-Performance. WiseStir. Micro-Centrifuge 螢光數位影像照膠系統. Image Analysis System. SmartGel™. 低溫迴轉式振盪培育箱. Low Temperature Orbital. YIHDER. Shaking Incubator 電泳槽. Mini Horizontal Gel. Major Science. Electrophoresis System 多功能盤式分析系統. Multi-Mode Microplate. BioTek. Reader 光學顯微鏡. Optical Microscope. ZEISS. 恆溫迴轉式振盪培育箱. Orbital Shaking Incubator. Firstek. 酸鹼度測試儀. pH Meter. CLEAN. 四位數分析天平. Uni Bloc Electronic Balance. Shimadzu. 二位數精密天平. Uni Bloc Electronic Balance. Shimadzu. 熱循環儀主機. Thermal Cycler. Arktik™. 多功能試管振盪器. Vortex. Scientific Industries. 精密恆溫水槽. Water Bath. 11. Firstek.

(29) 2.2 實驗藥品名稱 (中文). 名稱 (英文). 廠牌. 瓊脂. AGAR. Zymeset. 瓊脂糖. Agarose. Zymeset. 氯化銅. Copper(II) chloride,. Acros Organics. anhydrous 二甲基碸. Dimethyl sulfoxide. AMRESCO. (DMSO) 溴化乙啶. Ethidium bromide (EtBr). 乙烯二胺四醋酸二鈉. Ethylenediaminetetraacetic Fluka Chemie (Sigma). AMRESCO. acid disodium salt dihydrate (EDTA) 甘油. Glycerol. Zymeset. 硫酸健大黴素. Gentamycin sulfate. Zymeset. 三水合四氯金酸. Hydrogen. Acros Organics. tetrachloroaurate(III) trihydrate 三氯化鐵. Iron(III) chloride. Acros Organics. 硫酸卡那黴素. Kanamycin sulfate. Zymeset. LB 培養基. LB Broth Miller. Zymeset. (Lysogeny Broth or Luria-Bertani Medium) 六水合硫酸鎳. Nickel(II) sulfate. Acros Organics. hexahydrate 磷酸鹽緩衝液. 10X PBS Buffer 12. BasicLife Bioscience.

(30) (Phosphate buffered saline) 硝酸銀. Silver(I) nitrate. Acros Organics. 二氯化鋅. Zinc(II) Chloride. Acros Organics. 13.

(31) 第三章實驗方法 3.1 微生物感測器的設計. 3.1.1 質體設計前述提到，我們可以仿製 Peng R. Chen 和 Jing Zhao10 所設計出來的質體 (Fig.1-6A)，也可以參考耐金屬貪銅菌 (Cupriavidus metallidurans)對金的調節基因組 cup (Fig. 1-4)的排序，設計出以下兩種質體(Fig. 3-1)。. Fig. 3-1 質體設計 (A)仿製前面重金屬金離子微生物感測器的模型，並用紅色螢光蛋白當作訊號輸出。 (B)仿製原生菌種耐金屬貪銅菌 (Cupriavidus metallidurans)對金的調節基因組 cup 的排序所設計出來的重金屬金離子微生物感測器，並用紅色螢光蛋白當作訊號輸出。. 透過 Fig. 3-1 的兩個圖，可以推測此微生物金離子感測器的機制。CupR 為轉錄活化因子 (transcriptional activator)，經由 cupR 調節基因轉錄轉譯出來的蛋白質，其形態會以二聚體的形式存在 (Fig. 3-2)。當 CupR 蛋白碰到金離子時，其蛋白質上的金屬結合根 (metal binding loop)會和金離子配位而形成錯合物，然後會以錯合物的形式跟啟動子結合，造成了啟動子的結構改變而促使聚合酶開始轉錄 (可參考 Fig. 1-2B)，開始產生紅色螢光蛋白 14.

(32) (RFP)，再透過 Multi-Mode Microplate Reader 作螢光強度的分析。. Fig. 3-2 微生物金離子感測器的反應機制 11。. 3.1.2 質體基因工程 (cloning) 首先，將設計好的質體開始以基因工程的方式，將每個部份的基因組合起來，其過程會經過選育、篩選、定序最後儲存。 A. 選育 1. 引子 (primer) 透過網路尋找要 cloning 的目標物基因，並將其基因序列取前端 (5 端)和後端 (3 端)設計成 20~30 bp 長的引子 (primer)後，再委外以人工方式合成。. 15.

(33) 以下 Table 3-1 為本實驗用到的引子： Primers. Sequence. rfp_NdeI fw. TTTTCATATGgcgagtagcgaagacgttatcaaaga. rfp_BamHI rv. TTTTGGATCCttaagcaccggtggagtg. cupR_EcoRI fw. TTTTGAATTCttagtgatggcaggccgggcg. cupR_BglII rv. TTTTAGATCTattagtgatggcaggccgggcg. PcupR_EcoRI fw. TTTGAATTCaatccttgaccttccaatggtggtaaggttcacagtgc agttgtcgcgctccgtcgctcagattccacgactccgatgaacatcggaga agccgcgg. PcupR_BglII rv. TTTTAGATCTtgtcgcgtgcgactcaacaaat. cupR(rev)_EcoRV fw. TTTGATATCttagtgatggcaggccggg. cupR(rev)_EcoRI rv. TTTGAATTCatgaacatcggagaagccgcgg. PcupCR_EcoRI fw. TTTTGAATTCggagtcgtggaatctgagcgacg. PcupCR_BglII rv. TTTTAGATCTggtgatgactcctgttgggttggatcg. cupC_BamHI fw. TTTTGGATCCtttaagaaggagatatacatatgatccagttccaagt cgaagg. cupC_XhoI rv. TTTTCTCGAGtcagcttgccgacttgaccg. cupA_BamHI fw. TTTTGGATCCtttaagaaggagatataatgacccatcctgccgcat ctctc. cupA_BamHI rv. TTTTGGATCCttaaatcattgcgttacctccttgtggcc. Table 3-1 引子的名稱和序列。. 2. 基因片段 (insert) 透過 PCR 儀器進行聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction)，其中引子 (primer)結合目標基因片段的前端及後端，引導 DNA 聚合酶開 16.

(34) 始 DNA 的合成，並且能快速又大量的得到目標基因片段。接著使用洋菜膠配置膠體，做膠電泳分析來分離 DNA 片段大小 (在這裡是要確認 PCR 之後的目標基因片段是否有成功)，最後透過 DNA 比對尺 (Ladder)找出目標基因片段後，將其分離並純化。膠電泳分析之後切下來的膠體，使用 GeneaidTM Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將含有目標基因片段的膠體純化並最後加入純水 (ddH2O)回收目標基因片段，可將其保存於 4℃ or -20℃的環境。. 3. 載體 (vector) 取一個含有質體的大腸桿菌 (含有 Kanamycin 的基因)，將其長於培養液 Luria-Bertani medium (LB medium) 6mL 並加入 1%的 Kanamycin (Kan)，再將其培養於 37℃的培養箱並以 250 rpm 轉速培養隔夜。隔日，使用 PrestoTM Mini Plasmid Kit 純化菌液的質體，最後總共加入 30L 的純水 (ddH2O)得到質體並保存於 4℃ or -20℃的環境。. 4. 裁減 (digestion) 第二型限制內切酶 (Type II restriction enzyme)會辨認目標基因中的特定序列，並水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵，產生平整或是粘性端切口。將上述載體和 PCR 出來的目標基因片段，於 37℃的培養箱以相同的限制酶裁減約 2~4 小時後，再使用 GeneaidTM Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 純化出載體及目標基因片段，最後可得到有相同的缺口的載體和目標基因片段，緊接著進行連接酶作用反應 (ligation)。. 17.

(35) 5. 連接作用 (ligation) 使用連接酶 (ligase)將裁切好的載體和目標基因片段一起反應並置於室溫約 1~2 小時，使載體和目標基因片段可以結合，形成新的完整質體。. 6. 轉化 (transformation) 透過轉化作用可以將質體植入微生物體內，使微生物獲得額外的遺傳物質。將剛剛接合作用完的質體，利用轉化作用，將其植入大腸桿菌體內，在塗上含有 Kanamycin 抗生素的培養基上，置於 37℃的培養箱培養至隔夜。 B. 篩選 (screen) 經由轉化作用得到質體的微生物，會先經過 Kanamycin 抗生素的篩選後，才會生成一個一個的菌落 (colony)，但為了更精準地確認此菌落的微生物是否含有完整的質體，我們會再透過載體和目標基因片段的各擇一端引子來做 PCR 及膠電泳分析，透過這樣的檢查，可以更加確定實驗的完成。 C. 定序將篩選過後的菌落或是將其質體抽出後，將其和可以包含目標基因片段的引子 (前端或是後端皆可)送至生技公司進行定序，再將定序後的結果作比對，查看否是是接合正確的質體。 D. 儲存 (glycerol stock) 整個實驗完成後，將正確的菌落長於培養液中並包含 1%的 Kanamycin (Kan)，培養於 37℃的培養箱並以 250 rpm 的轉速培養隔夜。隔日，取 700L 的菌液並混合 300L 的甘油 (glycerol)於保存管中，在儲存於-80°C 中。甘油的在低溫中能避免水結冰，使得微生物不會死亡， 18.

(36) 而且低溫可降低細胞活性，延長保存的時間。 E. 接合作用 (conjugation) 將完成的質體，透過轉化作用到大腸桿菌的另外一種菌株 E. coli S17，此菌株的細菌表面含有線毛 (性菌毛，pilus)，透過此線毛與其他菌的膜結合，菌與菌之間建立了一道細胞質的橋樑，可將自身所帶的質體基因透過此橋梁傳到另外一個菌的質內 (Fig. 3-3)。當其他菌透過此方法得到新的質體基因時，也可以獲得質體的功能 (如抗藥性或蛋白質表現等)。. 19.

(37) Fig. 3-3 接合作用的示意圖。 (A)一個帶有質體的細菌 E. coli S17 菌株為提供者，而另外一個細菌 (C. metallidurans 或 R. eutropha)則為接受者。 (B)線毛開始與另一個細菌的膜結合。 (C)兩菌之間建立了直通細胞質的橋樑，並透過聚合酶開始複製質體並轉移到接受者。 (D)最後兩個菌都擁有質體。. 20.

(38) 3.2 實驗步驟每當要做一系列的檢測實驗時，必須先將儲存在-80℃的菌拿出來，並用接種棒或是微量滴管尖 (tip)取一點劃在培養皿上 (含有抗生素)，最後放入 37℃的培養箱裡到隔天。隔日，再從培養皿上取一個菌落，培養於 3mL 的培養液中 (LB)並加 1%的抗生素 Kanamycin (若是 C. metallidurans 或 R. eutropha 則加抗生素 Kanamycin 和 Gentamycin)，接著培養於 37℃的培養箱並以 250 rpm 的轉速培養至隔夜。隔天，取原本的菌液 2%加到新的且含有抗生素的培養液中，此過程為稀釋 (dilution) ，依照不同實驗的需求稀釋不同數量的試管，並透過 Multi-Mode Microplate Reader 檢測生長的 OD 值 (波長 600nm 的吸收度，可做為微生物生長指標)，大腸桿菌約在 4 小時 OD600 為 0.4~0.6 之間 (若是 C. metallidurans 或 R. eutropha 則是 6 小時)。. 3.2.1 專一性 (specificity) 此實驗目的為了佐證微生物感測器的系統是否只針對金離子有專一性。將放到隔天的待測菌液稀釋後，放入 37℃的培養箱並以 250 rpm 培養 4 小時 (若是 C. metallidurans 或 R. eutropha 則是 6 小時)後，加入待測物金屬離子 (inducer)。本實驗共有 0、50 和 100M 的 Au3+、Cu2+、Zn2+、Ni2+及 Fe3+，各試管加入待測金屬離子之後，再培養於 37℃的培養箱並以 250 rpm 培養 24 小時。之後觀察紅色螢光的強度與金屬的關係，並用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值，分別比較各個金屬鹽類與微生物感測器所發出的螢光關係。. 21.

(39) 3.2.2 干擾性 (interference) 此實驗目的是為了佐證微生物感測器的系統在環境中不同的金屬離子干擾下，對金離子有無選擇性 (selective)和專一性。將放到隔天的待測菌液稀釋後，放入 37℃的培養箱並以 250 rpm 培養 4 小時 (若是 C. metallidurans 或 R. eutropha 則是 6 小時 ) 後，加入待測物金屬離子 (inducer)。本實驗共有 4 個不同濃度的 Au3+溶液 (0、0.1、0.5 和 25M)，並在各個濃度中分別加入其他重金屬離子 (50M 的 Cu2+、Zn2+、Ni2+及 Fe3+)，分別有 Au3+、Au3+ + Cu2+、Au3+ + Zn2+、Au3+ + Ni2+、Au3+ + Fe3+、Au3+ + Ag+ 和 Au3+加所有的重金屬離子，再培養於 37℃的培養箱並以 250 rpm 培養 24 小時，用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD600，接著將螢光的強度除以 OD600 值的比率相互比較，觀察是否在含有其他金屬離子下會干擾微生物感測器的準確性和專一性以判別此微生物感測器的選擇性是否良好。. 3.2.3 耐受性 (tolerance) 此實驗可以佐證微生物感測器的系統對於高濃度金離子的偵測極限。將放到隔天的待測菌液稀釋後，放入 37℃的培養箱並以 250 rpm 培養 4 小時 (若是 C. metallidurans 或 R. eutropha 則是 6 小時)後，加入待測物金離子 (inducer)。這次實驗主要是以 Au3+的濃度由小到大來測試微生物感測器的系統可以偵測的最高濃度極限，也就是微生物可以存活於含有多少金離子濃度的環境下不會死亡，另外測量紅色螢光蛋白的強度可以到多高。依照不同濃度的 Au3+ (0~200M)稀釋於培養液中，再培養於 37℃的培養箱並以 250 rpm 培養 24 小時，用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及 22.

(40) 生長的 OD600 ，再將螢光的強度除以 OD600 值的比率檢視劑量反應 (dose-response)曲線的關係，觀察微生物感測器的效率和最大檢測的範圍。. 3.2.4 靈敏度 (sensitivity) 此實驗目的是為了佐證微生物感測器的系統對於低濃度金離子的偵測極限。將放到隔天的待測菌液稀釋後，放入 37℃的培養箱並以 250 rpm 培養 4 小時 (若是 C. metallidurans 或 R. eutropha 則是 6 小時)後，加入待測物金離子 (inducer)。本實驗主要是以趨近於零的 Au3+濃度並檢視微生物感測器的系統可以偵測的最低濃度極限，依照不同濃度的 Au3+ (0~1M)稀釋於培養液中，再培養於 37℃的培養箱並以 250 rpm 培養 24 小時，用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD600 值，再將螢光的強度除以 OD600 值的比率作劑量反應曲線的圖，再從中找出線性並用線性回歸 (linear regression)的數值來佐證此微生物感測器的準確率，此外還可利用公式求出最低濃度極限。. 3.2.5 最低偵測極限 (limit of detection, LOD) 為了探討微生物金離子感測器偵測金離子濃度的靈敏度，我們會利用最低偵測極限 (limit of detection, LOD)來找出感測器的最小值，並使用公式 LOD = K × SD / S 來計算；K = 3 (依據 IUPAC 建議，K = 3 其準確率高於 90%)，SD 為空白試劑的標準差值，S 則為校正曲線的斜率。. 23.

(41) 第四章實驗結果與討論 4.1 微生物金離子感測器之篩選利用微生物金離子感測器對金離子的專一性，找出最佳的條件。首先，先找出效果最明顯的時間，也就是螢光強度跟生長的 OD 值最好的時間點，接著區分出效果較明顯的質體基因組配上宿主的組合，最後再用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD600 值，並作圖比較出較適合做為微生物金離子感測器的組合。. 4.1.1 質體 PcupA/R-cupR-rfp 和宿主組合之金離子篩選組合一： Fig. 3-1 (A) 的質體配上不同宿主之組合 (E. coli 、 C. metallidurans 和 R. eutropha)。 PcupA/R-cupR-rfp (E. coli DH10B). 24.

(42) Fig. 4-1 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100M 的濃度於 E. coli DH10B 的培養液中。分別在 (A)8 小時、(B)12 小時和 (C)24 小時，用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值。. 25.

(43) PcupA/R-cupR-rfp (C. metallidurans CH34). 26.

(44) Fig. 4-2 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100M 的濃度於 C. metallidurans CH34 的培養液中。分別於 (A)8 小時、(B)12 小時和 (C)24 小時，用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值。. 27.

(45) PcupA/R-cupR-rfp (R. eutropha H16). 28.

(46) Fig. 4-3 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100M 的濃度於 R. eutropha H16 的培養液中。分別於 (A)8 小時、(B)12 小時和 (C)24 小時，用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值。. 經過簡單的測試之後發現，當金屬離子和微生物感測器一起培養 24 小時可得到最佳的值，故我們在做一次實驗並做三重複取誤差值，時間則再比較 12 和 24 小時。. 29.

(47) PcupA/R-cupR-rfp 12hr. 30.

(48) Fig. 4-4 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100M 的濃度在於 12 小時之後比較三個不同微生物宿主的專一性。 (A) E. coli DH10B (B) C. metallidurans CH34 (C) R. eutropha H16。. PcupA/R-cupR-rfp 24hr. 31.

(49) Fig. 4-5 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100M 的濃度於 24 小時之後比較三個不同微生物宿主的專一性。 (A) E. coli DH10B (B) C. metallidurans CH34 (C) R. eutropha H16。. 32.

(50) 從 PcupA/R-cupR-rfp 的質體基因組和宿主搭配的專一性實驗中可以發現，當宿主為 C. metallidurans 的時候，效果看似還不錯，但是其易受銅離子的干擾，導致不只對金的會產生紅色螢光，這樣會減低金離子感測器探測金離子的效率，接下來，我們換另一組質體基因組 Fig. 3-1(B)，重複一樣的專一性實驗。. 4.1.2 質體 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 和宿主組合之金離子篩選組合二： Fig. 3-1 (B) 的質體配上不同宿主之組合 (E. coli 、 C. metallidurans 和 R. eutropha)。 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp (E. coli DH10B). 33.

(51) Fig. 4-6 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100M 的濃度於 E. coli DH10B 的培養液中。分別在 (A)8 小時、(B)12 小時和 (C)24 小時，用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值。. 34.

(52) cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp (C. metallidurans CH34). 35.

(53) Fig. 4-7 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100M 的濃度於 C. metallidurans CH34 的培養液中。分別在 (A)8 小時、(B)12 小時和 (C)24 小時，用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值。. 36.

(54) cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp (R. eutropha H16). 37.

(55) Fig. 4-8 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100M 的濃度於 R. eutropha H16 的培養液中。分別在 (A)8 小時、(B)12 小時和 (C)24 小時，用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值。. 經過簡單的測試之後發現，當金屬離子和微生物感測器一起培養 24 小時可得到最佳的值，尤其是 C. metallidurans 和 R. eutropha 兩個做為宿主的感測器效果突出，故我們後面只做這兩種感測器的專一性檢測，並做三重複取誤差值，時間則比較 12 和 24 小時。. 38.

(56) cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 12hr. Fig. 4-9 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100M 的濃度於 12 小時之後比較兩個不同微生物宿主的專一性。 (A) C. metallidurans CH34 (B) R. eutropha H16。. 39.

(57) cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 24hr. Fig. 4-10 各加入四種不同金屬並分別為 0、50、100M 的濃度於 24 小時之後比較兩個不同微生物宿主的專一性。 (A) C. metallidurans CH34 (B) R. eutropha H16。. 40.

(58) 從 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 的質體基因組和宿主搭配的專一性實驗中可以發現，當宿主為 C. metallidurans 和 R. eutropha 的時候，整體效果佳，其受到銅離子的干擾也較小，產生的紅色螢光強度也較強，這兩組金離子感測器光用肉眼就可以清楚看到顏色的變化。. Fig. 4-11 由肉眼判觀察顏色的變化。 (A)為 C. metallidurans 在不同金屬離子溶液中並分別為左邊 50M 和右邊 100M 的濃度的顏色變化。 (B)則為 R. eutropha 在不同金屬離子溶液中並分別為左邊 50M 和右邊 100M 的濃度的顏色變化。. 41.

(59) 4.2 微生物金離子感測器中 CupR 調控蛋白對金離子的感測經過重金屬的專一性檢測之後，接下來我們要討論紅色螢光蛋白是否為 CupR 調節蛋白來控制並表現，所以我們將設計好的質體中的 cupR 調節基因刪除 (Fig. 4-12)並與含有 cupR 基因的感測器作比較證明 CupR 調控蛋白為主要在有金離子環境下，可以控制並表現紅色螢光蛋白。. Fig. 4-12 將設計好的質體刪除 cupR 基因，只保留啟動子和紅色螢光蛋白 11. 。. 分別透過兩種微生物宿主 C. metallidurans 和 R. eutropha 的金離子感測器來表現並比較兩組質體的差異，藉此證明 CupR 調節蛋白是主要調控整個機制的關鍵。. 42.

(60) Fig. 4-13 將刪除 cupR 基因的質體與原本的質體作比較。 (A)透過 C. metallidurans 的感測器分別於 0、0.1、0.5、5、10 和 25M 的金離子濃度來比較； (B)則是透過 R. eutropha 的感測器分別於 0、5、10 和 25M 的金離子濃度來比較 11。. 43.

(61) 從實驗的結果可以得知，當沒有 CupR 蛋白時，從不同濃度金離子檢測中，微生物感測器的每單位螢光強度皆不變或是變化不大；有 CupR 蛋白時，在不同濃度金離子檢測中，微生物感測器的每單位螢光強度隨著金離子濃度增加而增強，即可證明整個微生物金離子感測器的感測原理，是利用 CupR 蛋白當作感測元件用來檢測金離子，並控制啟動子與表現紅色螢光蛋白的調控蛋白。C. metallidurans 的感測器沒有 cupR 基因的質體還是會有螢光的產生，而主要的原因是因為 C. metallidurans 本身含有 cupR 的基因於染色體中，所以會被些許的影響而產生螢光；而 R. eutropha 的感測器就可以很明顯地看到，沒有 CupR 蛋白的質體感測器就不會有螢光的產生。. 44.

(62) 4.3 微生物金離子感測器之重金屬環境干擾及選擇性為了讓微生物金離子感測器能夠在未來實際的被應用，接下來的實驗則是模擬有多種重金屬的環境，來檢測這兩種微生物感測器對金離子的選擇性和專一性，會不會被其他重金屬所干擾。這次實驗分別加入 0、0.1、0.5、25M 的金離子濃度於培養液中，並分成多組，共有只有 Au3+、Au3+ + Cu2+、Au3+ + Zn2+、Au3+ + Ni2+、Au3+ + Fe3+、Au3+ + Ag+和 Au3+加數個重金屬離子，而後者的重金屬離子都為 50M，並用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值，再將兩值相除作單位螢光的強度。. 4.3.1 質體 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 和 C. metallidurans 宿主組合之微生物金離子感測器對其他重金屬的干擾探討在做干擾實驗前，因為多加了鐵離子，外加要再注意每個重金屬離子個別對微生物金離子感測器是否會造成干擾，故會再做一次單獨只加各個重金屬離子的實驗和混合的一起做個比較。. Fig. 4-14 微生物 C. metallidurans 感測器在各重金屬的專一性檢測 11。. 45.

(63) 從 Fig. 4-14 可以發現，微生物 C. metallidurans 的感測器會被銅離子所影響，而且之前的專一性實驗也顯示出銅離子對微生物 C. metallidurans 的感測器的干擾性是存在的 (Fig. 4-10(A))。所以接下來的干擾性實驗，會著重於有關銅離子的干擾性：. 46.

(64) Fig. 4-15 微生物 C. metallidurans 感測器在各種重金屬的干擾檢測。 (A)依金離子的濃度變化為主，並在各濃度分別加入都是 50M 的重金屬離子銅、鋅、鎳三種金屬還有混合的種金屬溶液。 (B)依不同金離子的濃度分別加入都是 50M 的重金屬離子銅、鋅、鎳和三種金屬的混合，並觀察銅離子的影響。 (C)依不同金離子的濃度分別加入都是 50M 的重金屬離子鐵、銀和混合兩者的金屬離子。. 由以上的實驗可以觀察出，微生物 C. metallidurans 的感測器對銅也有偵測的效果，且做了多組單獨只有銅離子的情況下，產生的螢光情況很不穩定，明顯容易受到銅離子的干擾，若是在檢測金離子的情況下含有銅離子更是會導致螢光強度提升，而造成整體趨勢線改變，影響判斷檢測金離子的效果。在其他重金屬離子方面，對 C. metallidurans 的感測器都沒有太多的影響，比較於同濃度只有含金離子的條件下，螢光強度都不會相差太多，但若是含有銀離子的話，則是會造成微生物的死亡，所以沒有螢光的產生。 47.

(65) 4.3.2 質體 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 和 R. eutropha 宿主組合之微生物金離子感測器對其他重金屬的干擾探討在做干擾實驗前，因為多加了鐵離子，外加要再注意重金屬離子個別對微生物金離子感測器是否會造成干擾，故會再做一次單獨只加各個重金屬離子的實驗和混合的一起做個比較。. Fig. 4-16 微生物 R. eutropha 感測器在各重金屬的專一性檢測 11。. 從 Fig. 4-16 看不出來微生物 R. eutropha 感測器會被銅離子所影響，而且之前的專一性實驗也顯示出銅離子對微生物 R. eutropha 感測器的干擾性也是不明顯的 (Fig. 4-10(B))。接下來的干擾性實驗，還是會比較注意有關銅離子的干擾性：. 48.

(66) 49.

(67) Fig. 4-17 微生物 R. eutropha 感測器各加 50M 重金屬作干擾性檢測。 (A)依金離子的濃度變化為主，並在各濃度分別加入重金屬離子鋅、鎳、鐵和三種重金屬的混合溶液。 (B)依銅離子的濃度變化為主，在各濃度分別加入重金屬離子鋅、鎳、鐵和三種重金屬的混合溶液。 (C)依金離子的濃度變化為主，比較在各濃度加入銅離子和銅、鋅、鎳、鐵四種重金屬離子的混合溶液。 (D)依金離子的濃度變化為主，在各濃度分別加入重金屬離子鐵、銀和混合兩者的重金屬離子溶液 11。 50.

(68) 由以上的實驗可以觀察出，在 Fig. 4-17 (A)，微生物 R. eutropha 感測器在各個重金屬的干擾下 (沒有銅離子)，不會受到太多影響，比較於同濃度只有含金離子的條件下，每單位的螢光強度並沒有差很多。在(B)為了檢視只有銅離子的情況下，被其他重金屬的干擾時會不會產生螢光，結果可以看到不管銅的濃度有多少，每單位的螢光強度都不變，且其值也不會被因為含有其他重金屬離子而有所改變。在(C)若是在檢測金離子的情況下，環境中含有銅離子會導致每單位的螢光強度提升，而造成整體趨勢線改變，影響判斷檢測金離子的效果。最後在(D)，若是環境中含有銀離子的話，則是造成每單位的螢光強度不便或是減少，但是銀會造成微生物的死亡，所以會造成沒有螢光的產生。. 51.

(69) 4.4 微生物金離子感測器之螢光強度與金離子濃度關係透過前面的篩選之後，我們得到了三組質體基因組配上宿主有不錯的金離子反應效果的感測器，所以接下來要探討的方向為觀察在不同濃度的金離子情況下，其各個微生物金離子感測器的表現會是如何？此外，還要做微生物感測器對金離子劑量反應曲線的定量分析。. 4.4.1 質體 PcupA/R-cupR-rfp 和 C. metallidurans 宿主組合之金離子濃度探討這次實驗分別加入 0、0.5、1、10、25、50、60、75、90、100M 的金離子濃度於培養液中，然後分別觀測三組不同微生物金離子感測器的效率及螢光的強度：. Fig. 4-18 C. metallidurans 和 PcupA/R-cupR-rfp 的質體基因組感測器劑量反應曲線。用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值並將兩值相除後作一個劑量反應曲線，雖然有不錯的螢光強度，但耐受性較差。 52.

(70) 由 Fig. 4-18 可以發現， PcupA/R-cupR-rfp 的質體基因組的 C. metallidurans 微生物金離子感測器，對金離子的濃度耐受性較差，雖然螢光強度還算不錯。後續實驗只會針對 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 的質體基因組做一系列的檢測來深入探討其微生物金離子感測器的效果。. 4.4.2 質體 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 和 C. metallidurans 和 R. eutropha 宿主組合之金離子濃度探討分別加入 0、0.5、1、10、25、50、60、75、90、100M 的金離子濃度於培養液中，然後分別觀測三組不同微生物金離子感測器的效率及螢光的強度：. Fig. 4-19 C. metallidurans 和 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 的質體基因組感測器劑量反應曲線。用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值並將兩值相除後作一個劑量反應曲線，有較佳的螢光強度，且其耐受性佳，另外在 0 到 0.5M 的金離子濃度間還可以做低濃度的探測。 53.

(71) Fig. 4-20 R. eutropha 和 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 的質體基因組感測器劑量反應曲線。用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值，並將兩值相除後作一個劑量反應曲線。雖螢光強度還好，但且其耐受性佳，在 0 到 0.5M 的金離子濃度間也可以做低濃度的探測。. 由 Fig. 4-18 到 Fig. 4-20 可以發現，cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 的質體基因組比起 PcupA/R-cupR-rfp 的質體基因組更能夠被宿主 C. metallidurans 和 R. eutropha 兩者適應，並組成效果較佳的微生物金離子感測器。因此，針對 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp 的質體基因組我們會做一系列的檢測來深入探討其微生物金離子感測器的效果。首先，檢測微生物金離子感測器對金離子的線性關係，在高濃度或是低濃度的趨勢線，接著是檢測最高可承受的金離子濃度以及最低金離子偵測極限。在低濃度檢測的部分，分別加入金離子 0、0.01、0.05、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5M 的濃度，並用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的 54.

(72) 強度以及生長的 OD 值，並將兩值相除後作一個劑量反應曲線。. Fig. 4-21 C. metallidurans 當作宿主的感測器在低濃度的金離子中檢測。. Fig. 4-22 R. eutropha 當作宿主的感測器在低濃度的金離子中檢測。. 55.

(73) 兩次低濃度實驗都各做了三重複取誤差值，並可以發現，雖然由 C. metallidurans 當作宿主的感測器的螢光強度較高，但其線性關係的趨勢線 R 平方值只有 0.9218；由 R. eutropha 當作宿主的感測器，雖然螢光強度較弱，不過其趨勢線 R 平方值卻有 0.9917。接下來要檢測這兩組的微生物金離子感測器對金離子濃度的耐受程度並檢視其線性關係，兩者的趨勢線和 R 平方值在哪個範圍的濃度有較佳的值。在金離子濃度檢測的部分，分別加入金離子 0、0.01、0.05、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、1、5、10、25、50、60、75、90、100、150、200M 的濃度，並用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值，並將兩值相除後作一個劑量反應曲線，另外要在推算其趨勢線和最低偵測極限。. Fig. 4-23 C. metallidurans 當作宿主的感測器在金離子濃度中的檢測。金離子濃度到 50M 時已經趨近於飽和狀態，且達到 150M 的時候，螢光強度已經驟降 11。. 56.