IR:Item 987654321/6281
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(2) 論 文 名 稱 ： 建 立 篩 選 平 台 —影 響 肌 原 母 細 胞 分 化 之 化 合 物 總 頁 數 ： 68 頁 院校所組別：國立臺灣體育學院運動健康科學學系碩士班 畢業時間及提要別：九十八學年度第二學期碩士學位論提要 研 究 生：陳 南 君. 指 導 老 師：方 世 華. 博士. 中文摘要 當運動員接觸到對肌肉有害的化合物，就會引發肌肉損 傷的危機，影響其運動訓練與表現。我們希望利用一套嚴謹 的偵測平台，提早評估可能影響肌肉發展及分化的成份。本 研 究 論 文 以 C2C12 老 鼠 骨 骼 肌 細 胞 作 為 實 驗 平 台 ， 將 已 知 抑 制肌細胞分化之氯化甲醇. (methoxychlor， MXC)當 作 為 對 照. 組 ， 分 析 一 系 列 “YMT”人 工 新 合 成 的 黃 酮 類 化 合 物 對 肌 細 胞 分化的影響，利用細胞型態、細胞存活率、肌肉特定蛋白 Myogenin、 肌 酸 激 酶. (creatine kinase， CK)表 現 的 變 化 作 為. 評 估 的 依 據 。 實 驗 結 果 發 現 ， 不 同 的 YMT 新 合 成 化 合 物 對 於 肌 細 胞 的 影 響 也 不 相 同 ， 其 中 YMT10、 12、 14、 16 這 4 種 藥 物 各 別 以 0.5 nM、 7.5 nM、 1 nM、 5 nM 的 濃 度 就 可 達 到 抑 制 5 0 % 肌 小 管 細 胞 存 活 率 及 細 胞 融 合 指 數，遠 比 已 知 的 MXC 更 具 顯 著 的 抑 制 效 果 。 而 且 ， 藥 物 對 分 化 後 肌 細 胞 內 的 肌 酸 激 酶 活 性 與 Myogenin 表 現 量 的 抑 制 作 用 也 不 相 同 。 若 在 分 化 過 程 中 加 入 YMT10、 14 此 2 種 藥 物 後 ， 發 現 分 化 後 肌 小 管 細 胞 的 肌 酸 激 酶 活 性 、 細 胞 融 合 指 數 及 Myogenin 蛋. I.
(3) 白 質 表 現 量 皆 會 減 少 ； 然 而 在 分 化 過 程 加 入 YMT12 的 肌 小 管細胞中發現，雖然細胞融合指數及肌酸激酶活性明顯減 少 ， 但 Myogenin 的 蛋 白 質 表 現 量 並 沒 有 明 顯 改 變 ； 另 外 ， 分 化 過 程 中 加 入 YMT16 藥 物 時 ， 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 之 細 胞 融 合 指 數 及 Myogenin 蛋 白 質 表 現 量 會 減 少 ， 但 肌 酸 激 酶 活性卻呈現增加趨勢。此外，在分化開始後的不同階段加入 YMT10、 12、 14 及 16 這 4 種 藥 物 ， 發 現 藥 物 作 用 的 時 間 即 使 未 達 3 天，仍 會 對 細 胞 分 化 產 生 抑 制。由 本 實 驗 結 果 推 測 ， YMT 藥 物 的 苯 環 結 構 所 銜 接 的 取 代 基 可 能 造 成 對 肌 原 母 細 胞及分化後的肌小管細胞作用濃度不同的原因之一。同時我 們發現當肌原母細胞開始分化成肌小管細胞後，對藥物的敏 感性也隨之改變。這 4 種不同藥物可能透過影響不同的細胞 週期調控因子或訊號傳遞過程，進而改變了肌肉細胞分化後 的各種特性。至於這些新合成化合物影響肌肉分化過程的分 子機轉，未來需更進一步探討。目前本論文已建立一套篩選 的技術平台，可以應用在篩選任何可能抑制或促進肌細胞分 化的化合物。. 關鍵字：細胞分化. II.
(4) T i t l e o f T h e s i s ： To E s t a b l i s h t h e S c r e e n P l a t f o r m — T h e Effects of Unknown Chemical Compounds On The Myoblasts Differentiation Name of Institute： Department of Exercise Health Science, N a t i o n a l Ta i w a n C o l l e g e o f P h y s i c a l E d u c a t i o n G r a d u a t e D a t e： J u n e 2 0 1 0. D e g r e e C o n f e r r e d： M . P. E. N a m e o f S t u d e n t： C h e n , N a n - C h u n. A d v i s o r： F a n g , S h i h - H u a. ABSTRACT If athletes contact harmful compounds, which may lead to muscle damage, and muscle injury will have impact on athletes training and performance. The aim of this study is to establish a rigorous screening platform for early detection of compounds that may exert inhibitory effects on muscle d i f f e r e n t i a t i o n . We u s e d C 2 C 1 2 m o u s e m y o b l a s t c e l l l i n e a s a n experimental model, and a synthetic known inhibitor of muscle cell differentiation-Methoxycholor (MXC) as positive c o n t r o l t o m o n i t o r t h e a c c u r a c y o f t h i s s c r e e n i n g p l a t f o r m . We investigated whether a series of newly synthesized flavonoids compounds, “YMT”, may affect the muscle cell differentiation. M e a n w h i l e , w e o b s e r v e d t h e c h a n g e s o f m o r p h o l o g y, v i a b i l i t y, muscle specific protein– Myogenin, and creatine kinase (CK) a c t i v i t y. T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e e f f e c t s a s e r i e s o f Y M T compounds on C2C12 were different. When myoblasts were. III.
(5) treated with 0.5 nM of YMT10, 7.5 nM of YMT12, 1.0 nM of YMT14, and 5.0 nM of YMT16, the cell viability and formation of myotube were decreased about 50% compared w i t h t h e c e l l c o n t r o l . I n t e r e s t i n g l y, t h e e f f e c t s o f t h e s e Y M T compounds on creatine kinase activity and Myogenin protein were different. YMT10, 12, 14 and16 were added to the myoblast cultures when shifted to the differentiation medium a t t h e t h i r d d a y, Y M T 1 0 a n d 1 4 d e c r e a s e d t h e f u s i o n i n d e x , creatine kinase activity and Myogenin； YMT12 decreased the f u s i o n i n d e x a n d c r e a t i n e k i n a s e a c t i v i t y, b u t M y o g e n i n d i d n o t c h a n g e； Y M T 1 6 d e c r e a s e d t h e f u s i o n i n d e x a n d M y o g e n i n , but the creatine kinase activity was increased. In addition, YMT compounds effectively blocked the induction of fusion index when added at an early period of the differentiation of C2C12 cells. From our results, we can conclude that YMT analogues with different substituents might cause the different effects on myoblast or myotube. Meanwhile, we found the sensitivities of myoblast and myotube are different. YMT10, 12, 14 and16 may change the variety of characteristics through affecting the cell cycle regulator factors or signal transduc tion. However, further studies ar e n e e d e d t o e l u c i d a t e t h e d e t a i l m e c h a n i s m s . I n s u m m a r y, w e established a screening platform, which can be used to screen the effects of compounds on muscle cell differentiation.. Keywords： cell differentiation. IV.
(6) 誌謝 本論文能順利的完成要感謝許多人的幫忙及協 助 。 最 由 衷 感 激 莫 過 是 我 的 指 導 教 授 —方 世 華 老 師 及 史佩玉學姊，在這兩年中，讓對於生命科學懵懂無知 的我了解到要用嚴謹的態度、正確的思考邏輯面對實 驗及生活的一切。在論文及實驗研究過程中，皆能不 厭其煩的給予我教導及指正，並且在我感到沮喪、挫 折時，鼓勵我、開導我。真的非常感謝你們！ 另外，也非常感謝張振崗老師、和李再立老師於 百忙之中撥空仔細的審視本論文和參與口試，並提供 寶貴的意見，而使本論文更趨完善。 就讀研究所期間，也非常感謝巫錦霖老師、洪暐 老師、邱彥成老師在運科會議上都能給予指導及建 議。此外，在也感謝我的家人，在我升學路上一直支 持著我，並謝謝系所與實驗室裡的學長姐、親愛同學 們及學弟妹們，在我學習過程中給予我鼓勵及協助。 最後致上最誠摯的感謝，感謝一路陪伴、幫助過我的 每一個人!. V.
(7) 目錄 中 文 摘 要 ................................................................ Ⅰ ABSTRACT ............................................................. Ⅲ 誌 謝 ....................................................................... Ⅴ 目 錄 ....................................................................... Ⅵ 表 目 錄 .................................................................... Ⅸ 圖 目 錄 .................................................................... Ⅹ 附 錄 ....................................................................... XI 縮 寫 與 全 名 對 照 表 .................................................XII 第 壹 章 引 言 .............................................................1 第一節. 研 究 背 景 ................................................... 1. 第二節. 研 究 目 的 ................................................... 3. 第三節. 研 究 假 設 ................................................... 4. 第四節. 名 詞 解 釋 ................................................... 5. 第 貳 章 文 獻 探 討 ......................................................6 第一節. 肌 肉 細 胞 發 育 及 分 化 起 源 ............................. 6. 第二節. 肌 肉 損 傷 與 免 疫 系 統 的 關 連 ........................ 10. 第三節. 藥 物 對 肌 肉 發 育 及 分 化 影 響 ........................ 17. 第四節. 總 結 ........................................................ 21. 第 參 章 研 究 方 法 與 步 驟 ......................................... 22 第一節. 實 驗 設 計 .................................................. 22. 第二節. 實 驗 材 料 與 方 法 ........................................ 24. 壹、. 細胞培養. (cell cu1ture) .................................... 24. 貳、. 氯化甲醇. (methoxychlor， MXC)及 一 系 列. YMT 新 合 成 化 合 物 對 肌 原 母 細 胞 的 影 響 .............. 25. VI.
(8) 參、. 一 系 列 YMT 新 合 成 化 合 物 對 肌 小 管 細 胞 影 響 25 (crystal violet test) ................... 25. 肆、. 結晶紫定量分析. 伍、. 細 胞 型 態 的 辨 別 —伊 紅. (eosin-Y )染 色 法. 及 細 胞 融 合 指 數 之 計 算 ..................................... 26 陸、. 西方點墨法. (western blotting)偵 測. Myogenin 表 現 ................................................ 27 柒、. 肌酸激酶活性. (creatine kinase activity，. CK activity )之 分 析 .......................................... 29. 第 肆 章 結 果 ........................................................... 30 第一節. 肌 原 母 細 胞 與 肌 小 管 細 胞 之 細 胞 型 態 ............ 30. 第二節. 不 會 直 接 造 成 肌 原 母 細 胞 死 亡 的 MXC 及 YMT 藥 物 濃 度 篩 選 ........................................... 31. 第三節. YMT 藥 物 造 成 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 存 活 率 低 於 50%的 濃 度 之 測 試 ............................... 32. 第四節. 不 同 濃 度 的 YMT10、 YMT12、 YMT14、 YMT16 對 肌 小 管 細 胞 分 化 的 影 響 ................. 33. 第五節. 肌 原 母 細 胞 在 不 同 濃 度 的 YMT10、 YMT12、 YMT14、 YMT16 影 響 下 分 化 成 肌 小 管 細 胞 中 的 肌 酸 激 酶 活 性 表 現 .................................. 34. 第六節. 肌 原 母 細 胞 在 不 同 濃 度 的 YMT10、 YMT12、 YMT14、 YMT16 影 響 下 分 化 成 肌 小 管 細 胞 中 的 Myogenin 蛋 白 質 表 現 量 .......................... 35. 第七節. 不 同 分 化 階 段 加 入 YMT10、 YMT12、 YMT14 、 YMT16 對 肌 小 管 細 胞 分 化 後 的 細 胞 融 合 指 數 之 影 響 ............................................... 36. VII.
(9) 第 伍 章 討 論 ........................................................... 37 表 目 錄 .................................................................... 43 圖 目 錄 .................................................................... 45 參 考 文 獻 ................................................................ 51 附 錄 ....................................................................... 67. VIII.
(10) 表目錄 表. 一. 、. 不 會 直 接 造 成 肌 原 母 細 胞 死 亡 的 MXC 及 YMT 藥 物 濃 度 篩 選 ............................................. 43. 表. 二. 、. YMT 藥 物 造 成 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 存 活 率 低 於 50%的 濃 度 之 測 試 ................................ 44. IX.
(11) 圖目錄 圖. 一、. 實 驗 流 程 圖 .................................................. 23. 圖. 二、. 肌 原 母 細 胞 與 肌 小 管 細 胞 之 細 胞 型 態 ............... 45. 圖. 三、. 不 同 濃 度 的 YMT10、 YMT12、 YMT14、 YMT16 對 肌 小 管 細 胞 分 化 的 影 響 ............................... 46. 圖. 四、. 肌 原 母 細 胞 在 不 同 濃 度 的 YMT10、 YMT12、 YMT14、 YMT16 影 響 下 分 化 成 肌 小 管 細 胞 中 的 肌 酸 激 酶 活 性 表 現 ........................................ 48. 圖. 五、. 肌 原 母 細 胞 在 不 同 濃 度 的 YMT10、 YMT12、 YMT14、 YMT16 對 分 化 成 的 肌 小 管 細 胞 中 的 Myogenin 蛋 白 質 表 現 量 ................................. 49. 圖. 六、. 不 同 分 化 階 段 加 入 YMT10、 YMT12、 YMT14、 YMT16 對 肌 小 管 細 胞 分 化 後 的 細 胞 融 合 指 數 之 影 響 ........................................................ 50. X.
(12) 附錄 附錄一、. 一 系 列 YMT 新 合 成 化 合 物 之 結 構 .................. 67. 附錄二、. YMT10、 12、 14、 16 各 別 化 學 結 構 式 之 示 意 圖 ...................................................... 68. XI.
(13) 縮寫與全名對照表 基因及轉錄因子 Myf-5： Myogenic factor 5. MyoD： Myogenic differentiation antigen-1. MRF4： Muscle regulatory factor4. 細 胞 核 轉 錄 因 子 ： Nuclear factor kappa B， NF-κB. 類 胰 島 素 生 長 因 子 ： Insulin-like growth factor， IGF. 纖 維 母 生 長 因 子 ： Fibroblast growth factor， FGF. 轉 化 生 長 因 子 ： Transforming growth factor， TGF. p38-分 裂 原 活 化 蛋 白 質 激 酶 ： p38- Mitogen-activated protein kinase， p38- MAPK. 肌 酸 激 酶 ： Creatine kinase， CK. XII.
(14) 藥品及材料 氯 化 甲 醇 ： Methoxychlor， MXC. 去 甲 基 二 氫 癒 創 木 酸 ： Nordihy- droguaiaretic acid， NDGA. 二 甲 基 亞 砜 ： Dimethyl sulfoxide， DMSO. 肌 肉 生 長 抑 制 素 ： Myostatin， MSTN. 胎 牛 血 清 ： Fetal bovine serum， FBS. 馬 血 清 ： Horse serum， HS. 磷 酸 鹽 緩 衝 液 ： Phosphate buffer saline， PBS. 辣 根 過 氧 化 酶 ： Horseradish peroxidase， HRP. XIII.
(15) 第壹章. 引言. 第一節. 研究背景. 骨骼肌主要的功能除了維持正常姿勢之外，還具有支撐 臟 器 與 避 免 內 部 組 織 受 到 傷 害 的 功 能，同 時，藉 由 肌 肉 收 縮 ， 可以拉動韌帶，使個體產生動作. (Huard, Li, & Fu, 2002)。. 一旦肌肉發生損傷，往往會造成活動障礙，嚴重時會帶來日 常生活上的不舒適與不便利。常引起肌肉損傷的原因有：激 烈 運 動、肌 肉 壓 迫、毒 物 刺 激、局 部 缺 血、酒 精 成 癮 等 因 素 ， 此外，近年來的研究發現，日常生活常用的藥品中也有某些 成 分 會 導 致 肌 肉 受 損 ， 例 如 ： 長 期 服 用 降 血 脂 藥 物 Statin， 就會造成肌細胞受損的副作用產生. (Mohaupt et al., 2009)。. Statin 對 肌 肉 副 作 用 的 影 響 範 圍 極 廣 ， 輕 微 可 導 致 肌 肉 酸 痛、無力等，嚴重會造成橫紋肌溶解，甚至在停藥之後，藥 物對肌肉造成損害仍會持續進行。現今普遍使用的除草劑和 (Methoxychlor， MXC)也 被. 殺蟲劑主成份之ㄧ的氯化甲醇. 認為具有導致肌細胞病變的危險. (Grow & Eroschenko, 2002;. S t e f f e n s , B a t i a , B a a r s o n , C h o i , & G r o w, 2 0 0 7 ) 。 這 些 導 致 肌 細胞受損的毒性成分往往不溶於水，容易殘存在體內不易被 代謝，它們除了會使肌細胞發育異常之外，連帶也會使生殖 內分泌系統產生病變及異常. ( A m s t i s l a v s k y, K i z i l o v a , &. Eroschenko, 2003; Grow & Eroschenko, 2002; Steffens et al., 2007)。 運動員不可避免地也會接觸到環境中各種特性不明的成 份，而運動員的肌力是決定運動表現好壞的主要因素，肌肉. 1.
(16) 細胞受傷會直接影響到訓練反應及運動表現，故我們認為若 能建立一套嚴謹的偵測平台，則可在藥物在傷害肌細胞之前 提早偵測及防範。 本 文 中 ， 所 測 試 的 化 合 物 “YMT”是 一 系 列 3',4',5'-四 甲 基查爾酮. (3',4',5'-trimethoxychalcone)的 類 似 物 ， 以 人 工 合 (substituent)， 是 含 有 查 爾 酮. 成的方式置換苯環上的取代基 (chalcones)合 成 的 化 合 物 物 共 有 23 種. (Rao, Fang, & Tzeng, 2009)， 此 藥. (YMT 1-23)， 由 朝 陽 科 技 大 學 曾 耀 銘 教 授 所 提. 供。查爾酮為黃酮類化合物的其中一類，其結構具有兩個苯 環. (benzene ring)， 而 黃 酮 類 化 合 物 具 有 抗 菌 、 抗 真 菌 、 抗. 發炎、抗癌等功能，被視為是一種天然的抗氧化劑，也普遍 存在於植物當中. (Rao et al., 2009)。 目 前 得 知 ， 這 些 YMT. 新合成化合物可以抑制一氧化氮 同時也能抑制肝癌細胞. ( n i t r i c o x i d e， N O ) 的 產 生 ，. (Hep G2)及 大 腸 癌 細 胞. (Colon205). 的 分 裂 ， 但 目 前 對 一 系 列 YMT 藥 品 是 否 會 對 肌 肉 細 胞 的 生 長 及 分 化 影 響 性 尚 不 明 確 。 因 此 ， 本 篇 論 文 我 們 利 用 C2C12 老 鼠 骨 骼 肌 細 胞 株 進 行 實 驗 ， 並 使 用 MXC 為 對 照 組 ， 評 估 一 系 列 YMT 化 合 物 對 肌 細 胞 的 存 活 率 程的影響。. 2. (viability)及 分 化 過.
(17) 第二節. 研究目的. 本 篇 論 文 以 in vitro 的 方 式 設 計 實 驗 ， 使 用 MXC 作 為 對 照 組 ， 將 一 系 列 YMT 化 合 物 當 作 測 試 樣 品 ， 評 估 藥 物 對 肌 細胞的存活率及分化過程的影響性。以藥物對細胞的毒性影 響及肌細胞分化指標測試，建立嚴謹的藥物篩選平台。.
(18) 第三節. 研究假設. 目 前 已 知 一 系 列 的 YMT 化 合 物 可 抑 制 巨 噬 細 胞 產 生 一 氧 化 氮 ， 達 到 抗 發 炎 效 果 。 另 外 ， YMT 化 合 物 也 能 抑 制 腫 瘤 細胞進行分裂，但其對肌細胞生長及分化的影響性尚不清楚 (Rao et al., 2009)。 所 以 ， 我 們 以 這 一 系 列 的 化 合 物 (YMT1-23)作 為 測 試 樣 品 ， 進 行 其 對 肌 細 胞 生 長 及 分 化 的 評 估測試。 我 們 預 期 這 一 系 列 的 YMT 新 合 成 化 合 物 中 有 部 分 會 對 肌細胞的分裂及分化產生影響，其影響性可能是在細胞型態 (morphology)、 肌 肉 特 定 蛋 白 質 表 現 量 及 肌 酸 激 酶 kinase， CK)的 表 現 。. 4. (creatine.
(19) 第四節 (一 ) 肌 原 母 細 胞. 名詞解釋. (Myoblast)： 未 經 分 化 的 肌 肉 前 趨 細 胞 ， 存. 在於肌肉組織中，當受到纖維母細胞生長因子 (fibroblast growth factor， FGF)刺 激 時 會 開 始 進 行 細 胞 分裂. (cell proliferation)。. (二 ) 肌 小 管 細 胞. (Myotube)： 由 肌 原 母 細 胞 融 合. (fusion)後. 而稱之，當肌小管成熟後最終組成肌纖維，使肌肉產生 收縮功能。 (三 ) 肌 細 胞 分 化. ( d i ff e r e n t i a t i o n ) ： 肌 細 胞 由 單 顆、單 核 的 型. 態轉變成多核、管狀的過程稱之。 (四 ) 肌 細 胞 生 成. (Myogenesis)： 由 肌 肉 前 趨 細 胞 經 過 一 連 串. 複雜的傳遞訊號使細胞開始分裂成為肌原母細胞，之後 再經過其他複雜的傳遞訊號，使細胞融合形成肌小管細 胞，最終成為具有功能的肌纖維。 (五 ) 肌 肉 特 異 性 調 控 因 子 群. (Muscle regulatory factors，. MRFs)： 由 Myf5 (myogenic factor 5)、 MyoD (myogenic differentiation antigen-1)、 Myogenin 和 MRF4 (muscle regulatory factor4)所 組 成 ， 當 肌 肉 特 異 性 調 控 因 子 群 被 啟動，會活化肌肉特異性調控因子表現及功能，以達到 調節肌肉分化過程之目的。 (六 ) 肌 肉 損 傷. (Muscle injury)： 是 指 外 來 刺 激 造 成 肌 肉 受 損. 的情形。肌細胞對自身的損傷具有一定程度的修復功 能，也稱之為肌肉再生. (regeneration)。. 5.
(20) 第貳章 第一節 壹、. 肌肉細胞發育. 文獻探討. 肌肉細胞發育及分化起源 (muscle development)起 源 及 功 能. 肌肉細胞可分為心肌、骨骼肌及平滑肌。骨骼肌主要的 作用是維持姿勢及支撐臟器與內部組織，以避免身體受到傷 害，當肌肉收縮拉動韌帶可以產生動作進行活動. (Huard et. al., 2002)。 肌 細 胞 生 長 是 經 由 不 同 的 刺 激 共 同 完 成 。 來 自 於自體分泌. (autocrine)、 旁 分 泌. (paracrine)及 內 分 泌. (endocrine)的 不 同 訊 息 傳 導 路 徑 ， 使 細 胞 內 的 調 控 因 子 活 化 造成基因改變，這些改變讓原本單顆、單核的肌原母細胞分 化成細長管狀且多核的肌小管細胞，成束的肌小管細胞再形 成可供人體活動使用的肌纖維。 骨骼肌細胞由中胚層. (paraxial mesoderm)開 始 發 展 ， 在. 胚胎時期，中胚層透過環節分裂. (segmentation)形 成 體 節. (somites)， 體 節 是 胚 胎 發 育 時 期 時 ， 位 於 神 經 管 兩 側 短 暫 存 在的結構，隨著發展過程的進行會進一步分化成生皮肌節 (dermomyotome)、 生 骨 節 細胞. (sclerotome)。 體 節 內 有 肌 肉 前 趨. ( m y o g e n i c p r e c u r s o r c e l l )， 當 其 受 到 神 經 管 及 外 胚 層 所. 釋放的訊號刺激後，促使中軸附近的肌肉前趨細胞變成軸上 生肌節. (epaxial myotome)， 主 要 的 功 能 是 分 化 成 軀 幹 及 肋. 骨；靠近腹部的肌肉前趨細胞則會轉變成軸下生肌節 (hypaxial myotome)， 其 主 要 分 化 為 體 壁. (body wall)及 四. 肢；腹側旁的肌肉前趨細胞則會轉變成為生皮節. (myotome). 最後分化為真皮及皮下組織；而背側的肌肉前趨細胞則轉變. 6.
(21) 成鞏節，最後分化成骨、軟骨或具有纖維性的結締組織. (Le. Grand & Rudnicki, 2007; Perry & Rudnick, 2000)。. 貳、. 肌肉發育及分化 影 響 肌 肉 發 展 過 程 的 因 子 很 多 ， Pax3 及 Pax7 是 骨 骼 肌. 的前趨細胞才會有的特有調控因子，在胚胎時期為肌肉發育 所 需 。 學 者 們 發 現 ， 缺 乏 Pax3 或 Pax7 基 因 的 小 鼠 會 影 響 肌 肉 生 成，因 此，無 法 正 常 生 成 四 肢 肌 肉. (Epstein, Lam, Jepeal,. Maas, & Shapiro, 1995)。 另 外 ， FGFs 及 纖 維 結 合 素 (fibronectin)為 兩 個 重 要 的 主 導 影 響 因 子 。 FGFs 可 以 刺 激 肌 細胞產生分裂，當纖維母細胞生長因子減少、纖維結合素增 加以及肌原母細胞中的肌肉特異性基因群. (muscle- specific. genes)開 始 表 現 時 ， 會 促 使 原 本 型 態 為 單 顆 、 單 核 的 肌 原 母 細胞排列成肌細胞鏈. (cell alignment)， 透 過 細 胞 膜 的 融 合. 作用分化成多核成熟的肌小管細胞. (Grow & Eroschenko,. 2002; Ono, Sensui, Sakamoto, & Nagatomi, 2006)。 解 剖 學 上，成束的肌小管細胞組合在一起即變成有收縮功能的肌纖 維。 目前已知的肌肉特異性調控因子群. (myogenic. regulatory factors， MRFs)， 包 括 Myf5、 MyoD、 Myogenin 以 及 MRF4 等. (Braun et al., 1989; Nishimura et al., 2008;. Rohwedel et al., 1994)。 這 些 調 控 因 子 群 皆 具 有 basic-helix-loop-helix (bHLH) domain 與 basic-DNA binding motif 的 特 性 ， 因 此 可 以 啟 動 基 因 上 游 的 啟 動 子. (promoter). 區 域 處 之 5’-CANNTG-3’序 列 。 該 區 又 可 稱 為 E-Box 結 合 區 (Perry & Rudnick, 2000; Rohwedel et al., 1994)。 肌 球 蛋 白 輕. 7.
(22) 鏈. (myosin light chain)、 肌 球 蛋 白 重 鏈. (myosin heavy. c h a i n， M H C ) 、 肌 酸 激 酶 、 旋 轉 素 I ( t r o p o n i n I ) 等 皆 有 E - B o x 結 合 區 結 構 存 在 。 當 上 游 調 控 區 域 的 E-Box 被 結 合 後 ， 則 可 活 化 MRFs 進 一 步 調 節 肌 細 胞 的 分 化. (Edmondson & Olson,. 1993; Legerlotz & Smith, 2008)。 MRFs 家 族 中 ， 不 同 的 成 員 負 責 的 角 色 各 有 不 同 ， 其 中 ， Myf-5 和 MyoD 被 視 為 早 期 調 控因子。這兩個調控因子主要的功能是使胚胎發育成肌肉前 (Perry & Rudnick,. 趨細胞，使肌原母細胞的分裂能順利進行. 2000; Rohwedel et al., 1994)； MyoD 則 是 磷 蛋 白 p r o t e i n ) 的 一 種，由 兩 個 雙 極 性 α 螺 旋 所 構 成，約 含 有 4 0 ~ 5 0 胺 基 酸 片 段. (phospho-. (amphipathic α helices). (Braun, Rudnicki, Arnold,. & J a e n i s c h , 1 9 9 2 ; Ta p s c o t t e t a l . , 1 9 8 8 ) 。 M y o g e n i n 與 M y o D 兩者的核苷酸序列結構相似，所以被公認為都是用來調控肌 肉 分 化 的 調 控 因 子 。 MyoD 通 常 被 認 定 為 是 使 胚 胎 趨 化 為 肌 肉 前 趨 細 胞 的 主 要 調 控 因 子 ； 而 Myogenin 則 負 責 調 控 肌 肉 細胞最後發育及分化的晚期階段，其能使單核肌原母細胞分 化成為細長管狀並多核的肌小管細胞及肌纖維. (Edmondson. & Olson, 1993; Le Grand & Rudnicki, 2007; Perry & Rudnick, 2 0 0 0 ; S m i t h , K a c h i n s k y, & M i l l e r, 1 9 9 4 ) 。 M y o D 最 早 是 由 D a v i s , We i n t r a n b , 與. Lassar (1987)的 研. 究 先 提 出 ， MyoD的 基 因 主 要 表 現 在 骨 骼 肌 ， 而 心 肌 、 平 滑 肌 內則並不表現. ( D a v i s , We i n t r a u b , & L a s s a r , 1 9 8 7 ; H o p w o o d ,. P l u c k , & G u r d o n , 1 9 8 9 ; M e g e n e y, K a b l a r, G a r r e t t , A n d e r s o n , & Rudnicki, 1996; Perry & Rudnick, 2000; Rohwedel et al., 1994)。 其 它 的 研 究 顯 示 ， C2C12小 鼠 骨 骼 肌 細 胞 株 在 開 始 分 化 後 約 2個 小 時 左 右 ， Myogenin的 mRNA就 開 始 表 現 ， 並 且 在. 8.
(23) 第 24小 時 達 到 最 高 峰. ( E d m o n d s o n & O l s o n , 1 9 8 9 )。 M y o g e n i n. mRNA的 分 析 結 果 也 發 現 ， Myogenin的 基 因 只 表 現 在 骨 骼 肌 及 橫 隔 膜 中，而 不 表 現 於 其 他 肌 肉 及 非 肌 肉 組 織 中。Hasty et al.(1993)及 Patapoutian et al.(1995)分 別 指 出 缺 乏 Myogenin 或 MRF4基 因 突 變 也 會 影 響 胚 胎 的 發 展 ， 使 小 鼠 無 法 正 常 生 成肌肉。實驗中大部分的小鼠一出生立即死亡，而少部分存 活 的 小 鼠 肋 骨 會 有 嚴 重 變 異 。 故 許 多 學 者 推 測 Myogenin及 MRF4是 影 響 肌 肉 型 態 及 功 能 發 育 過 程 不 可 缺 少 的 肌 肉 特 異 性調控因子. (Braun et al., 1989; Edmondson & Olson, 1989,. 1993; Hasty et al., 1993; Patapoutian et al., 1995)。. 9.
(24) 第二節 壹、. 肌肉損傷與免疫系統的關連. 體內免疫系統的防禦機制 免疫系統的功能主要是要維持體內防禦機制的恆定，一. 般分成兩個類型。第一類型稱為先天性免疫力. (innate. i m m u n i t y )， 指 的 是 健 康 個 體 在 受 感 染 前 就 已 存 在 於 體 內 的 防 禦機轉，可快速對微生物產生反應，包括：皮膚的屏障、吞 噬細胞 細胞. (phagocytes)的 吞 噬 作 用. (phagocytosis)、 自 然 殺 手. (natural killer cell， NK cell)、 補 體 系 統. (complement. system)等 。 具 有 吞 噬 能 力 的 細 胞 包 括 ： 嗜 中 性 白 血 球 (neutrophil)、 單 核 球. (monocyte)及 巨 噬 細 胞. (macrophage). （ 林 碧 鳳 、 江 伯 倫 , 2 0 0 6 , 第 2 章 ）。 嗜中性白血球是體內首先會對感染產生反應的白血球， 它們會在感染的第一時間內快速移動到感染部位，並且在吞 噬微生物後死亡；單核球源自於骨髓內的細胞及血管的內皮 細胞，當遇到微生物時，血液中的單核球會主動移動到發炎 部位，並且活化成巨噬細胞，而被活化的巨噬細胞則會進行 吞噬作用殺死微生物，吞噬微生物後的巨噬細胞會釋放出數 種協助發炎反應進行的細胞激素. ( c y t o k i n e s )。 細 胞 激 素 是 可. 溶性蛋白質，為免疫及發炎反應的介質，與免疫相關的細胞 激素包含：腫瘤壞死因子 化激素. (tumor necrosis factor， TNF)、 趨. (chemokine)、 介 白 素. (interleukin， IL)、 干 擾 素. (interferon， IFN)等 。 細 胞 激 素 主 要 與 活 化 自 然 殺 手 細 胞 、 巨噬細胞或者 B 細胞等，此外，細胞激素也與細胞分化、分 裂、調節修復有關，亦可以引發細胞凋亡 發炎反應. (apoptosis)及 產 生. (Nieman et al., 2003; Pedersen & Hoffman-Goetz,.
(25) 2 0 0 0 )，其 包 括：I L - 1、I L - 6 和 T N F - α ( D i n a r e l l o , 1 9 9 1 ; F e b b r a i o & Pedersen, 2002)。 這 些 細 胞 激 素 會 刺 激 內 皮 細 胞 增 加 選 擇 素. ( s e l e c t i n )、 整 合 素. (integrin)配 體 及 趨 化 激 素 ， 趨 使 嗜 中. 性白血球、單核球及 T 細胞. ( T- c e l l ) 往 感 染 部 位 聚 集 並 增 加. 血管的擴張及通透性以產生發炎作用. (inflammation)（ 林 碧. 鳳 、 江 伯 倫 , 2 0 0 6 , 第 2 章 ）。 第二類型稱之為適應性免疫力. (adaptive Immunity)， 其. 也被稱之後天性免疫力，當身體受到外物感染後會對入侵的 微生物產生專一性的免疫力。適應性免疫又可分為體液性免 疫力. (humoral immunity)及 細 胞 性 免 疫 力. immunity)。 體 液 性 免 疫 力 是 由 B 細 胞. (cell-mediated. (B-cell)產 生 抗 體. (antibody)， 它 具 專 一 性 可 以 辨 別 微 生 物 抗 原. (antigen)， 主. 要功能為中和抗原、活化補體系統及促進吞噬作用，進行消 滅微生物。細胞性免疫力，則主要是由 T 細胞消滅細胞內的 微 生 物 。 細 胞 性 免 疫 力 反 應 分 為 兩 種 —CD8+T 細 胞 、 CD4+T 細 胞 。 CD8+T 細 胞 會 殺 死 已 感 染 微 生 物 的 細 胞 ； CD4+第 一 型 輔助 T 細胞. (TH1 cells)會 釋 出 IL-2 以 刺 激 T 細 胞 生 長 ， 並. 使 TH1 cells 釋 放 出 IFN-γ 促 進 發 炎 反 應，活 化 巨 噬 細 胞 以 殺 死 被 吞 入 的 微 生 物，另 外，IFN–γ 也 會 刺 激 B 細 胞 產 生 抗 體 ； CD4+第 二 型 輔 助 T 細 胞. (TH2 cells)則 會 釋 放 出 IL-4 刺 激 IgE. ( I m m u n o g l o b u l i n E， I g E ) 抗 體 的 產 生 及 釋 出 I L - 5 促 使 嗜 酸 性 白血球. 貳、. ( e o s i n o p h i l ) 的 活 化（ 林 碧 鳳、江 伯 倫 , 2 0 0 6 , 第 5 章 ） 。. 體內細胞激素的改變 免 疫 系 統 除 了 受 到 下 視 丘 - 腦 下 垂 體 的 調 控 之 外，外 界 因. 素的刺激也會影響後天性免疫系統的功能出現變化. 11.
(26) (Pederse n, Akers trom, Ni elsen, & Fischer, 2007) 。 在 過 去 幾 十年中，學者們發現當身體壓力. (physical stress)， 如 ： 肌. 肉損傷、創傷（手術、燒傷、急性心肌梗塞等因素）及運動 均會影響內分泌及細胞激素，而使得體內的免疫系統產生改 變. (Pedersen & Hoffman-Goetz, 2000)。 Nieman et al. (2003). 指 出 骨 骼 肌 也 會 產 生 細 胞 激 素 ， 當 肌 肉 收 縮 時 ， I L - 6、 I L - 1 β 、 I L - 8、 I L - 1 5、 T N F - α 及 I F N - γ 等 細 胞 激 素 表 現 就 會 受 到 影 響 。. 參、. 肌酸激酶 肌酸激酶為雙偶聚合酶酵素，在脊椎動物體內扮演著維. 持能量平衡的功能，其負責催化高能量的磷酸肌酸 ( p h o s p h a t e c r e a t i n e， P C ) 和 A D P， 產 生 肌 酸. ( c r e a t i n e ) 及 AT P. 以提供身體的能量來源。. PCr + ADP. Creatine kinase ← →. C r e a t i n e + AT P. 細 胞 質 內 的 肌 酸 激 酶 異 構 酶 分 成 兩 型 —包 括 腦 分 泌 型 (brain， B type)及 肌 分 泌 型. (muscle， M type)兩 種 ， 此 兩 種. 型 態 可 組 合 出 三 種 不 同 的 二 聚 體 ， 包 括 ： CK-MM、 CK-BB、 CK-MB， 常 存 在 於 人 體 器 官 、 腦 組 織 、 神 經 組 織 、 肌 肉 組 織 中. (Chamberlain, Jaynes, & Hauschka, 1985)。 另 外 還 有 一 種. 是由粒線體表現出的肌酸激酶異構酶. (the mitochondrial. c r e a t i n e k i n a s e i s o e n z y m e， C K - M t )， 通 常 在 人 體 心 臟 、 肝 臟 、 腦 部 等 結 構 中 可 被 發 現 。 C K - M M， 被 發 現 於 心 肌 、 肌 纖 維 的 M 線. (M line)中. ( L a n g & W u r z b u r g , 1 9 8 2 ; Wa l l i m a n n , W y s s ,. B r d i c z k a , N i c o l a y, & E p p e n b e r g e r, 1 9 9 2 ) ， 其 半 衰 期 約 1 5 小. 12.
(27) 時 ， 常 用 來 診 斷 心 肌 梗 塞 等 相 關 疾 病 ； CK-BB 在 腦 部 及 神 經 組 織 中 的 含 量 較 多 ， 在 血 漿 中 的 濃 度 範 圍 約 在 0.5—1 U/L 之 間 ， 而 C K - B B 的 半 衰 期 比 C K - M M 來 得 短， 大 約 3 小 時 左 右 。 CK-BB 亦 會 大 量 表 現 在 肌 原 母 細 胞 內 ， 但 當 肌 原 母 細 胞 分 化 為 肌 小 管 細 胞 後 ， CK-BB 的 濃 度 也 就 會 隨 之 下 降. (Lang &. Wu r z b u rg , 1 9 8 2 ; Tr a s k & B i l l a d e l l o , 1 9 9 0 ; Wi l s o n , B r i n d l e , & Fulton, 1995)； CK-MB 則 主 要 是 由 肌 肉 組 織 表 現 ， 半 衰 期 約 12 小 時 ， 濃 度 正 常 範 圍 約 0—2 U/L 之 間 ， 但 新 生 兒 、 幼 兒 及 小 孩 體 內 濃 度 會 比 成 人 來 得 高。C K- M B 通 常 用 來 檢 測 因 運 動所造成的急性心肌梗塞等相關疾病. ( L a n g & Wu r z b u rg ,. 1 9 8 2 )。 過 去 研 究 也 指 出 肌 酸 激 酶 大 量 存 在 於 成 熟 的 骨 骼 肌 與 心 肌 細 胞 內 ， 從 L a n n g e n , S c h o l s , K e l d e r s , Wo u t e r s , 與 Janssen-Heininger (2001)以 及 Magalara et al. (2003)的 研 究 皆 發 現 ， C2C12 小 鼠 骨 骼 肌 細 胞 株 在 加 入 含 有 馬 血 清 的 培 養 基後，其細胞內的肌酸激酶濃度明顯增加. (Chamberlain et. a l . , 1 9 8 5 ; L a n g e n , S c h o l s , K e l d e r s , Wo u t e r s , & J a n s s e n - H e i n i n g e r , 2 0 0 1 ; M a g l a r a , Va s i l a k i , J a c k s o n , & McArdle, 2003)。 此 外，Ito et al. (2005) 發 現 25 µM 的 去 甲 基 二 氫 癒 創 木 酸. ( n o r d i h y - d r o g u a i a r e t i c a c i d， N D G A ) 可 明 顯 阻 斷 肌 原 母 細. 胞的分化，並降低因從肌原母細胞分化成肌小管細胞的 CK-MB 異 構 酶 濃 度 。 當 NDGA 的 濃 度 愈 高 時 ， CK-MB 異 構 酶的濃度就愈低。總和文獻可知，肌酸激酶除了可作為肌肉 損傷的指標外，也可作為細胞分化的指標，肌酸激酶的活性 可能會隨著肌原母細胞分化成肌小管細胞而增加，然而，當 肌肉的分化過程被減緩甚至抑制時，可能會減少細胞內肌酸. 13.
(28) 激酶的活性. (Chamberlain et al., 1985; Ito et al., 2005;. Maglara et al., 2003)。. 肆、. 肌肉損傷對免疫系統與細胞激素影響 肌細胞對損傷通常會有一定程度的修復功能，這種功能. 稱之為肌肉再生。常見的外來損傷包括：過度的機械性刺 激、體能訓練、毒物刺激，而局部缺血 肌肉損傷原因之一. (eschemia)也 是 造 成. (Maglara et al., 2003; Tidball, 2005)。 當. 肌肉受損後，會透過三個不同的階段進行肌肉修補作用 (Jackman & Kandarian, 2004)。 第 一 階 段 ， 退 化 -發 炎 ( d e g e n e r a t i o n - i n f l a m m a t i o n )， 通 常 會 在 受 傷 後 的 第 一 時 間 出 現 ， 並 且 退 化 -發 炎 的 狀 況 會 持 續 1~2 週 ， 當 肌 原 纖 維 (myofibrils)受 損 時 ， 會 使 得 細 胞 外 液 內 的 鈣 離 子 滲 入 受 傷 區 域，造成腫脹並產生血腫. (hematoma)、 壞 疽. (necrosis)， 而. 體內的巨噬細胞及 T 細胞會透過微血管到達受傷區域並分泌 出促發炎細胞激素，趨使嗜中性白血球及巨噬細胞，以促使 發炎作用加劇，而巨噬細胞也會透過釋放生長因子調節受損 組 織 的 修 復 及 生 長，並 促 使 纖 維 組 織 母 細 胞 補過程中合成膠原蛋白. (fibroblast)在 修. (Butterfield, Best, & Merrick,. 2006)； 第 二 階 段 ， 肌 肉 受 損 後 的 第 7~10 天 會 開 始 進 行 再 生 作 用，並 在 第 14 天 左 右 達 到 高 峰，在 此 階 段 有 許 多 相 關 的 生 長 因子會被釋放出來，包括：肝細胞生長因子 g r o w t h f a c t o r，H G F )、類 胰 島 素 生 長 因 子 factor-1， IGF-1)、 b 纖 維 母 生 長 因 子 factor， bFGF)、 轉 化 生 長 因 子 -α. (insulin-like growth. (b fibroblast growth. (transforming growth. factor-α， TGF-α)、 轉 化 生 長 因 子 -β. 14. (hepatocyte. (transforming growth.
(29) f a c t o r - β， T G F - β ) 等 以 調 控 肌 細 胞 的 分 裂 及 分 化 、 促 使 肌 肉 再 生 及 修 復。此 外，受 傷 部 位 也 會 開 始 產 生 疤 組 織 促使血管向內生長；第三階段則為纖維化作用. (scar tissue) (fibrosis)，. 約 在 肌 肉 受 損 後 第 2~3 週 出 現 ， 疤 組 織 的 形 成 會 幫 助 肌 肉 組 織修復完全. (Huard et al., 2002; Nozaki et al., 2008)。. Stupka 等. (2001)指 出 肌 肉 損 傷 會 使 肌 酸 激 酶 、 嗜 中 性. 白血球及巨噬細胞數目快速上升，且體內的促發炎細胞激素 I L - 6、 I L - 1、 T N F - α 濃 度 也 會 隨 之 增 加. (De Rossi, Bernasconi,. B a g g i , d e Wa a l M a l e f y t , & M a n t e g a z z a , 2 0 0 0 ; F e b b r a i o & P e d e r s e n , 2 0 0 2 ; G o k h a l e , C h a n d r a s h e k a r a , & Va s a n t h a k u m a r , 2 0 0 7 ; S t u p k a , T a r n o p o l s k y , Y a r d l e y , & P h i l l i p s , 2 0 0 1 ) 。 To f t et al. (2002)研 究 發 現 ， 受 測 者 在 做 完 60 分 鐘 的 腳 踏 車 測 驗 後 ， 其 體 內 血 漿 中 的 IL-6、 IL-1 的 受 體 拮 抗 劑. (receptor. antagonist)皆 會 在 運 動 後 4 小 時 達 到 最 高 值 ， 而 肌 酸 激 酶 濃 度及嗜中性白血球數目是在運動後一小時後就顯著性地增加 ( To f t e t a l . , 2 0 0 2 ) 。 另 一 篇 研 究 也 顯 示 ， 以 6 5 % 的 最 大 攝 氧 量 強 度 做 30 分 鐘 的 離 心 運 動 ， 運 動 後 2 小 時 血 漿 中 的 IL-6 濃度開始顯著上升，並且在運動後 7 天內，其血漿中的肌酸 激 酶 及 IL-6 濃 度 均 持 續 升 高 Stupka 等. (Bruunsgaard et al., 1997)；. ( 2 0 0 1 ) 發 現 在 不 同 強 度 的 離 心 運 動 中，可 使 肌 酸 激. 酶 、 MPO (myeloperoxidase， 常 出 現 於 單 核 球 及 嗜 中 性 白 血 球 中 的 酵 素 )及 CD68 (一 種 醣 蛋 白 ， 會 表 現 在 單 核 球 及 巨 噬 細 胞 上 ) 明 顯 增 加，該 研 究 認 為 升 高 的 原 因 是 運 動 所 造 成 肌 肉 損傷所致。也有學者認為單次運動及因運動引起的肌肉損 傷 ， 皆 會 快 速 增 加 體 內 IL-6 濃 度. (Febbraio & Pedersen,. 2 0 0 2 )。 由 上 述 文 獻 結 果 可 知 ， 肌 酸 激 酶 濃 度 、 I L - 6 的 變 化 可. 15.
(30) 作為肌肉對運動強度、持續時間、耐力及肌肉損傷與否的反 應依據. (Febbraio & Pedersen, 2002)。. 16.
(31) 第三節. 藥物對肌肉發育及分化影響. 目前已被證實會促進肌肉生成的成分或藥物歸類如下： 瘦體素. ( l e p t i n )、 鈣 黏 蛋 白. ( c a d h e r i n )、 生 長 素. (ghrelin)等 ；. 而 會 抑 制 肌 肉 分 化 的 藥 物 則 有 ： A23187、 2,4-dinitrophenol (DNP)、 Chlorpromazine、 Dexamethasone、 二 甲 基 亞 砜 (dimethyl sulfoxide， DMSO)、 suramin、 肌 肉 生 長 抑 制 素 (myostatin， MSTN)、 Statin、 NDGA、 MXC 等 。 瘦體素，是一種由脂肪細胞所分泌的蛋白質，過去研究 發現其與 T 細胞、B 細胞、造血細胞、平滑肌細胞與胃癌細 胞的分裂有關. ( G a i n s f o r d e t a l . , 1 9 9 6 ; Ta n a b e , O k u y a ,. T a n i z a w a , M a t s u t a n i , & O k a , 1 9 9 7 ; Yu e t a l . , 2 0 0 8 ) 。 Yu e t a l . (2008)的 研 究 指 出 ， 瘦 體 素 的 濃 度 愈 高 時 ， 骨 骼 肌 細 胞 的 分 裂 速 度 也 愈 快 ； 相 反 的 ， 肌 酸 激 酶 活 性 、 Myogenin 及 肌 球 蛋 白重鏈的蛋白質表現就會減少。 鈣黏蛋白為穿膜醣蛋白. (transmembrane glycoprotein). 的一種，是存在於細胞膜上的細胞黏附分子. (cell adhesion. m o l e c u l e )。 除 了 會 促 使 細 胞 間 相 互 黏 附 外 ， 也 主 導 胚 胎 發 育 中不同組織及器官的形成，另外，其與細胞的分化及腫瘤病 變也有密切關係. ( I v a n o v, P h i l i p p o v a , & T k a c h u k , 2 0 0 1 ) 。. Redfield, Nieman, & Knudsen (1997)研 究 發 現 ， 透 過 N-鈣 粘 蛋白. (N-cadherin)， 會 增 加 BHK-21/C13 骨 骼 肌 細 胞 的 β-連. 環蛋白. (β-cateinin)， 及 肌 節 中 的 肌 球 蛋 白. 量，以 促 進 肌 肉 分 化. (myosin)表 現. (Redfield, Nieman, & Knudsen, 1997)。. 生長素是由胃部的上皮細胞所分泌的胜肽類激素，它除 了會刺激食慾和活化位於腦下垂體的生長激素受器，以刺激. 17.
(32) 生長激素釋放外，也可作為血管擴張劑，增加一氧化氮的生 物活性. (bioactivity) (Filigheddu et al., 2007)。 加 入 乙 醯 化. (acylated)的 生 長 素 或 是 去 乙 醯 化. (des-Acyl)的 生 長 素，皆 會. 抑 制 C2C12 小 鼠 骨 骼 肌 細 胞 分 裂 、 促 進 細 胞 分 化 ， 使 細 胞 融 合 指 數 及 Myogenin 及 肌 球 蛋 白 重 鏈 的 蛋 白 質 表 現 量 明 顯 增 加. (Filigheddu et al., 2007)。 Duncan 與 Jackson (1987)的 研 究 指 出 ， 在 Balb/C 小 鼠. 肌 肉 內 分 別 注 入 會 造 成 肌 肉 損 傷 藥 物 ： A 2 3 1 8 7 ( 2 0 µ M )、 D N P (1000 µM)、 NDGA (5 µM)及 chlorpromazine (200 µM)後 ， 發 現 注 入 A23187 或 DNP 兩 者 ， 使 小 鼠 比 目 魚 肌 所 釋 放 的 肌 酸 激酶濃度比其他 2 種藥物來得高，藥物也會造成肌纖維 Z 線 (z-line)漸 漸 地 被 破 壞 甚 至 消 失. (Duncan & Jackson, 1987)。. 近期發現，用於治療關節炎、過敏等發炎現象的皮質類固醇 藥 物 ， 例 如 ︰ Dexamethasone， 其 會 透 過 接 受 器 Atrogin-1 或 者 是 MuRF1 導 致 肌 肉 萎 縮. (Menconi, Gonnella, Petkova,. Lecker, & Hasse lgren, 2008)。 Nishi mura et al. (2008) 研 究 發 現 C2C12 加 入 常 用 於 止 痛 消 炎 藥 品 的 DMSO 後 ， 藥 物 濃 度 約 在 2.5% 時 會 明 顯 降 低 肌 肉 特 異 性 調 控 因 子 Myf5、 MyoD 及 Myogenin 的 mRNA 表 現 ， 並 且 發 現 肌 肉 水 解 相 關 基 因 ， 如 ： Atrogin-1、 MuRF1 及 Foxo3a 的 mRNA 表 現 量 明 顯 上 升 (Menconi et al., 2008; Nishimura et al., 2008)。 Myostatin 為 第 八 號 生 長 分 化 因 子. (growth and. differentiation factor-8， GDF-8)， 屬 於 轉 化 生 長 因 子 -β superfamily 的 成 員 ， 在 肌 肉 發 展 是 扮 演 負 向 調 控 的 角 色 ， 會 抑 制 細 胞 的 分 裂 及 分 化 。 Langley et al. (2002)研 究 發 現 myostatin 會 透 過 Smad 3 機 制 抑 制 MyoD 及 Myogenin 的 活 性. 18.
(33) 及表現，使得骨骼肌無法正常由肌原母細胞分化成肌小管細 胞. ( L a n g l e y e t a l . , 2 0 0 2 )。 若 抑 制 了 m y o s t a t i n 的 表 現 ， 則 會. 明 顯 刺 激 肌 原 母 細 胞 的 分 化 速 度 至 90% 以 上 ， 並 且 會 增 加 Myogenin mRNA 450 倍 以 上 的 轉 譯 速 度. (Joulia, et al.,. 2003)。 (suramin)或 者 是 NDGA. 在 其 他 研 究 中 發 現，如：蘇 拉 明. 等 抗 纖 維 化 作 用 與 抗 氧 化 藥 物 皆 會 抑 制 TGF-β1 表 現 ， 以 致 於 抑 制 TGF-β1 與 接 受 器 結 合，並 抑 制 myostatin 的 活 性 以 促 使肌肉修復、再生. (Lee et al., 2003; Nozaki et al., 2008)。. 而當蘇拉明濃度愈高時，肌原母細胞分化後細胞融合指數也 愈 高 ， 並 且 同 時 也 發 現 到 蘇 拉 明 會 影 響 Myostatin 表 現 量 及 老鼠脛前肌受傷部位的纖維化程度. (Nozaki et al., 2008)。. NDGA 是 從 creosote bush 中 萃 取 ， 為 天 然 的 抗 氧 化 劑 ， 也是脂肪氧化酶. (lipoxygenase)抑 制 劑. ( F u j i w a r a , Ta k a m i ,. Misumi, & Ikehara, 1998; Lee et al., 2003)。 當 自 由 基 (reactive oxygen species， ROS)過 多 ， 造 成 DNA 氧 化 傷 害 ， 當細胞遇到外來物質傷害時會釋放出花生烯酸. (arachldonie. a c i d )， 以 刺 激 脂 肪 氧 化 酶 活 性 及 促 使 淋 巴 球 細 胞 產 生 促 發 炎 細胞激素，並且也會趨化巨噬細胞及嗜中性白血球以進行防 禦. (Fujiwara et al., 1998)。 研 究 發 現 ， NDGA 會 抑 制 未 飽 和. 脂 肪 酸 轉 變 成 5-Lipoxygenase， 使 得 花 生 烯 酸 無 法 刺 激 淋 巴 球細胞分泌促發炎細胞激素. (Kim et al., 2008)。 在 過 去 研 究. 也 顯 示 ， NDGA 除 了 會 抑 制 淋 巴 球 趨 化 作 用 之 外 ， 也 會 抑 制 TGF-β 活 性 及 阻 斷 肌 原 母 細 胞 的 分 化. (Lee et al., 2003)， Ito. et al. (2005)研 究 發 現 ， 在 C2C12 肌 原 母 細 胞 在 分 化 成 肌 小 管 細 胞 的 過 程 中 加 入 25 µΜ 的 NDGA， 並 不 會 造 成 細 胞 損 傷 或. 19.
(34) 者 凋 亡 ， 但 是 會 明 顯 抑 制 MyoD、 Myf5 及 Myogenin 等 肌 肉 特 異 性 調 控 因 子 表 現 ， 從 此 篇 研 究 中 也 發 現 到 NDGA 對 肌 肉 細胞早期的發展及分化過程影響較大。 Mohaupt et al. (2009) 的 研 究 更 指 出 ， 常 用 於 治 療 高 血 脂 藥 物 Statin， 會 導 致 病 患 產 生 肌 肉 酸 痛 、 無 力 感 ， 嚴 重 時 會產生橫紋肌溶解、肌肉病變情形，甚至停藥之後藥物仍會 持續造成肌肉損傷；再者，存在於農作物、家畜、庭院、動 物 飼 料 及 穀 倉 的 有 機 氯 除 蟲 劑 MXC， 是 屬 於 氯 化 乙 烷 衍 生 物。此成分不易溶於水，會殘存在體內不易被代謝，當人體 或 小 鼠 短 期 暴 露 於 MXC 中，就 有 可 能 導 致 肌 細 胞 病 變 之 外 ， 更會影響到內分泌系統甚至造成生殖能力和性器官的發育病 變. (Amstislavsky et al., 2003; Gartrell, Craun, Podrebarac, &. Gunderson; Grow & Eroschenko, 2002; Steffens et al., 2007)。 Steffens 等. (2007)發 現 以 100 µM 以 下 的 MXC 濃 度. 處理肌原母細胞及肌小管細胞時，皆不會造成肌原母細胞抑 或 是 肌 小 管 細 胞 的 凋 亡，但 是 MXC 會 減 緩 C2C12 分 裂 速 率 ， 因此減少了肌小管細胞的形成。. 20.
(35) 第四節. 總結. 肌細胞生成是經過相當複雜的過程，當中胚層的肌肉前 趨細胞受到訊號影響，會發展成為肌節及肌原母細胞。而某 些的生長因子或肌肉特異性調控因子開始表現時，會促使肌 原母細胞排列成肌細胞鏈並產生細胞融合作用，使之分化為 肌小管細胞，最終形成為成束並具有收縮功能的肌纖維。當 肌肉損傷時，體內會開始釋放出大量的促發炎細胞激素及肌 酸激酶。然而，肌酸激酶也會表現於成熟的肌肉細胞中，當 肌細胞分化時，其細胞內的肌酸激酶活性也會開始增加。因 此，我們推測肌酸激酶除了可作為肌肉損傷指標外，也可當 作肌細胞的分化指標。已有許多研究指出，許多藥物皆可能 會影響肌肉生長或分化過程。肌力是決定運動員運動表現好 壞的主要因素，肌細胞受損對運動員訓練及表現之間的直接 關連性是不可被否認的。故我們認為，若能建立一套嚴謹的 藥物篩選機制，就能在肌肉組織受到藥物不可逆之傷害之前 提早防範。.
(36) 第參章. 研究方法與步驟. 第一節. 實驗設計. 為 了 了 解 一 系 列 YMT 新 合 成 化 合 物 是 否 會 影 響 C2C12 細 胞 生 長 及 分 化 的 過 程 ， 我 們 使 用 MXC 作 為 對 照 組 ， 以 肌 原母細胞作為藥物濃度的初步篩選工具，先挑出不使肌原母 細胞死亡的濃度後，再針對肌原母細胞分化為肌小管細胞過 程 中 ， 各 別 加 入 YMT 化 合 物. (YMT1-23)後 ， 由 肌 原 母 細 胞. 分化為肌小管細胞的細胞存活率測試結果中，挑出會顯著影 響 肌 細 胞 分 化 的 藥 物 ， 再 進 一 步 分 析 分 化 過 程 中 若 有 YMT 藥物存在，其對分化後肌小管細胞的細胞型態、細胞融合指 數 、 肌 酸 激 酶 、 肌 肉 特 定 蛋 白 質 表 現 量 的 影 響 性（ 見 圖 一 ）。. 22.
(37) 圖. 一、實驗流程圖 首 先 以 未 分 化 的 肌 原 母 細 胞 對 一 系 列 YMT 及 MXC 進 行. 初步的藥物濃度篩選，篩選出不會直接造成肌原母細胞死亡 的藥物濃度後，再進行肌原母細胞分化為肌小管細胞的過程 中 加 入 YMT 藥 物 後 ， 評 估 其 對 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 之 細 胞 存活率、細胞型態、肌酸激酶、肌肉特定蛋白質表現量的影 響。. 23.
(38) 第二節 壹、. 細胞培養. 實驗材料與方法. (cell cu1ture). C2C12 肌 細 胞 細 胞 株. (購 自 食 工 所 ， 台 灣 )由 小 鼠 的 骨 骼. 肌 取 得 ， 本 研 究 中 使 用 的 培 養 基 為 RPMI-1640 medium (SH30011.01; HyClone， Logan， USA)、 1% L-glutamine (SH30034.01; HyClone， Logan， USA)、 1% 盤 尼 西 林 (SV30010; HyClone， Logan， USA)及 10% 胎 牛 血 清. (fetal. bovine serum， FBS) (SH30071.03; HyClone， Logan， USA)。 C2C12 培 養 於 恆 溫 37℃ 、 5% 的 二 氧 化 碳 培 養 箱 中 ， 每 隔 3~4 天進行一次繼代培養，以保持細胞生長所需的酸鹼值。繼代 培養時，首先將上清液倒出，並且用 1 倍的磷酸鹽緩衝液 ( p h o s p h a t e b u f f e r s a l i n e， P B S ) 清 洗 2 次 ， 以 2 ㏄ 的 胰 蛋 白 酶 (trypsin)把 細 胞 打 下 後 ， 將 細 胞 加 入 裝 有 1 倍 PBS 的 15 mL 離 心 管 ， 並 使 用 離 心 機 以 1800 rpm、 4℃ 離 心 3 分 鐘 ， 將 細 胞 與 上 清 液 分 離 。 離 心 後 ， 倒 掉 上 清 液 ， 並 且 加 入 含 有 10% 胎 牛 血 清 的 培 養 基 混 勻 ， 取 出 約 20 µl 的 細 胞 液 ， 外 加 等 量 的台盼藍. (trypan blue)計 算 細 胞 數 目 ， 再 依 結 果 換 算 取 所 需. 的細胞量進行繼代培養。 C2C12 肌 細 胞 株 較 為 特 殊 ， 其 以 不 同 成 分 血 清 的 培 養 基 培 養 會 表 現 出 兩 種 不 同 的 肌 細 胞 型 態。當 以 含 1 0 % 胎 牛 血 清 的培養基培養時，其為肌原母細胞；而讓肌原母細胞分化為 肌 小 管 細 胞 的 條 件 是 更 換 為 含 有 2% 馬 血 清. (horse serum，. HS) ( SH30074.04; HyClone， Log an， US A) 的 培 養 基 ， 培 養 至 少 3 天，肌原母細胞即分化為成熟肌小管細胞 Saxel, 1977a)。. 24. ( Ya f f e &.
(39) 貳、. MXC 及 一 系 列 YMT 新 合 成 化 合 物 對 肌 原 母 細 胞 的 影 響 使 用 96 孔 盤 以 每 孔 2×105 的 細 胞 數 目 培 養 肌 原 母 細 胞，. 並 且 加 入 含 有 10% 胎 牛 血 清 的 培 養 基 後 ， 放 入 恆 溫 37℃ 、 5% 的 二 氧 化 碳 培 養 箱 中 培 養 。 細 胞 貼 附 2 小 時 後 ， 再 分 別 加 入 不 同 濃 度 的 一 系 列 YMT 新 合 成 化 合 物 及 濃 度 為 1000 µ M、5 0 0 µ M、1 0 0 µ M、1 0 µ M 的 M X C ， 之 後 ， 放 入 恆 溫 3 7 ℃ 、 5% 的 二 氧 化 碳 培 養 箱 中 培 養 4 小 時 後 再 分 析 細 胞 存 活 率 。 每 種 新 合 成 化 合 物 及 MXC 濃 度 皆 以 三 重 覆 進 行 。. 參、. 一 系 列 YMT 新 合 成 化 合 物 對 肌 小 管 細 胞 影 響 使 用 96 孔 盤 以 每 孔 1.5×105 的 細 胞 數 目 培 養 肌 小 管 細. 胞 。 加 入 含 有 2% 馬 血 清 的 培 養 基 後 ， 放 入 恆 溫 37℃ 、 5% 的二氧化碳培養箱中培養。細胞貼附 2 小時後，再分別加入 不 同 濃 度 的 一 系 列 YMT 新 合 成 化 合 物 及 MXC， 之 後 再 放 入 恆 溫 37℃ 、 5% 的 二 氧 化 碳 培 養 箱 中 ， 培 養 3 天 後 分 析 細 胞 存 活 率 。 每 種 新 合 成 化 合 物 及 MXC 皆 以 三 重 覆 進 行 。 以 6 公 分 培 養 皿 培 養 肌 小 管 細 胞 ， 細 胞 數 目 為 3×105 並 加 入 含 有 2% 馬 血 清 的 培 養 基 後 ， 放 入 恆 溫 37℃ 、 5% 的 二 氧化碳培養箱中培養。使細胞貼附 2 小時後，再分別加入不 同 濃 度 的 YMT10、 YMT12、 YMT14、 YMT16 及 MXC。 然 後 放 入 恆 溫 37℃ 、 5% 的 二 氧 化 碳 培 養 箱 中 培 養 ， 於 3 天 後 進 行 細 胞 染 色 與 照 像 或 者 萃 取 總 蛋 白 質，凍 於 - 8 0 ℃ 再 進 行 蛋 白 質分析。. 25.
(40) 肆、. 結晶紫定量分析. (crystal violet test). 結晶紫，為深紫色蛋白質染劑，是具有黏性的染劑， 可 快 速 染 在 細 胞 膜 上 。 C2C12 肌 細 胞 株 為 貼 附 型 細 胞 ， 健 康 的肌細胞株會貼附於培養基上；而不健康甚至死亡的肌細胞 株會懸浮於上清液。由貼附的細胞所吸收的結晶紫可決定存 活的細胞數目多寡。 實 驗 步 驟 為 ， 先 倒 掉 培 養 於 96 孔 盤 上 的 細 胞 對 照 組 及 實 驗 組 之 上 清 液 ， 加 入 100 µl 的 1 倍 PBS 清 洗 ， 然 後 倒 掉 1 倍 PBS， 再 加 入 40 µl 的 1 倍 fix solution (G-6257; Sigma)， 讓細胞黏附固定於盤底上，使作用十五分鐘後，再倒掉 1 倍 fix solution， 加 入 40 µl 的 結 晶 紫 溶 劑. (結 晶 紫 粉 末 5 g、. 9 5 % 酒 精 )， 反 應 1 5 分 鐘 ， 之 後 利 用 流 動 清 水 將 多 餘 的 結 晶 紫 染 劑 清 洗 掉 。 待 96 孔 盤 自 然 晾 乾 後 ， 加 入 100 µl 的 1 倍 s o r e n s o n s o l u t i o n ( 1 M t r i - s o d i u m c i t r a t e，0 . 1 N N a C l，9 0 % 酒 精 )溶 解 細 胞 ， 利 用 波 長 570 nm 偵 測 溶 解 液 的 吸 光 值 ， 再 以 偵測數值評估細胞存活率。. 伍、. 細 胞 型 態 的 辨 別 —伊 紅. (eosin-Y )染 色 法 及 細. 胞融合指數之計算 伊紅是一種鮮紅色酸性染劑，可染鹼性物質，例如：細 胞質、血紅素、細胞核及肥大細胞等。過去的研究常利用此 法進行細胞染色，再輔以計算細胞核方式，計算出細胞核的 細胞融合指數，以量化細胞分化情形. (Sabourin,. Girgis-Gabardo, Seale, Asakura, & Rudnicki, 1999)。 實 驗 方 式 為 ， 將 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 ， 以 4℃ 的 1 倍 的 PBS 清 洗 2 次 後 ， 加 入 固 定 液. (4% paraformaldehyde)並 以 搖. 26.
(41) 擺式振盪器. (shaker)作 用 10~15 分 鐘 ， 使 細 胞 黏 附 固 定 於 盤. 底 上 ， 之 後 倒 掉 固 定 液 後 再 加 入 1% 伊 紅 ， 以 搖 擺 式 振 盪 器 作 用 10~15 分 鐘 ， 使 伊 紅 染 色 於 細 胞 質 上 ， 最 後 再 利 用 流 動 清水將多餘的伊紅清洗乾淨，直至清水呈透明為止並自然晾 乾。細 胞 乾 燥 後，以 顯 微 鏡. 200 倍 數 的 視 野 下 隨 意 選 取 5 個. 區域計算細胞核數目，並將計算結果套入公式，換算該實驗 組的細胞融合指數，加以辨別肌小管細胞的分化程度。計算 公式如下：已分化為肌小管細胞的總細胞核數. 全部細胞核. 數＝細胞融合指數。. 陸、. 西方點墨法. (western blotting)偵 測 Myogenin 表 現. (1) 總 蛋 白 質 的 萃 取 及 定 量 本實驗是利用蛋白質萃取緩衝液. (protein extraction. b u f f e r ) 萃 取 總 蛋 白 質。首 先 將 分 組 的 細 胞 以 4 ℃ 的 1 倍 的 P B S 洗 淨 後 ， 加 入 適 量 的 l y s i s b u f f e r ( 5 0 m M t r i s，P H 7 . 6，2 5 0 m M N a C l ， 5 m M E D TA ， 0 . 1 % N P - 4 0 ， 7 X c o m p l e t e m i n i p r o t e a s e i n h i b i t o r c o c k t a i l t a b l e t ) ( R o c h e， G e r m a n y ) ， 然 後 將 被 打 破 的 細 胞 刮 下 ， 並 收 集 至 1.5 mL 微 量 離 心 管 中 ， 置 於 冰 上 反 應 1 0 ~ 1 5 分 鐘 。 接 著 以 1 3 0 0 0 r p m、 4 ℃ 離 心 1 0 分 鐘 ， 離 心 之 後 所 得 的 上 清 液 即 是 總 蛋 白 質。將 總 蛋 白 質 取 至 另 一 個 新 的 1 . 5 mL 的 微 量 離 心 管 中 ， 利 用 Bio-Rad protein assay (Bio-Rad， Hercules， CA， USA)， 於 595 nm 進 行 蛋 白 質 定 量 ， 之 後 進 行垂直電泳分離。 (2) SDS-聚 丙 烯 醯 胺 膠 電 泳. (sodium dodecyl sulfate. p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ； S D S - PA G E ) 以 3 0 % P o l y a c r y l a m i d e ( B i s a c r y l a m i d e： A c r y l a m i d e ＝ 1 ：. 27.
(42) 29)作 長 10 公 分 ， 寬 8 公 分 的 SDS-聚 丙 烯 醯 胺 膠 ， 膠 體 分 為 上 下 兩 層 ， 上 層 為 2 . 5 % s t a c k i n g g e l， 下 層 為 7 . 5 % s e p a r a t i n g gel。 (3) 電 泳. (electrophoresis)及 轉 印. (transfer). 膠體凝集後，將其置於電泳槽中，槽中注入 1 倍的電泳 (electrophoresis running： tris-base 30.3g、 glycin 144g、 SDS 10g 配 成 1L)緩 衝 液 ， 將 等 量 的 總 蛋 白 質 加 入 電 泳 之 檢 體 槽 中 ， 兩 層 膠 體 分 別 以 100 及 120 伏 特 的 電 流 進 行 電 泳 分 析 。 接 著 將 經 過 電 泳 分 析 的 膠 體 ， 以 100 伏 特 之 電 流 進 行 轉 印 分 析，將蛋白質轉印至硝化纖維膜. (nitrocellulose membrance). (Millipore， Billerica， USA)上 。 (4) blocking 將 轉 印 後 的 轉 印 膜 浸 泡 於 blocking solution [5 g non-fat dry milk 溶 於 100 mL 的 1 倍 tris-buffered saline- tween 20 ( T B S T ) ( 5 0 m M t r i s - b a s e， 1 5 0 m M N a C l a n d 0 . 0 5 % t w e e n - 2 0 ) ] 緩 衝 液 中 ， 在 室 溫 下 置 於 搖 擺 式 振 盪 器 ， 搖 晃 約 60 分 鐘 ， 再 以 1 倍 TBST 清 洗 3~4 次 ， 以 避 免 非 專 一 性 的 鍵 結 。 (5) 初 級 抗 體 作 用 將 Myogenin (ab1835， Abcam)和 α-tubulin (ab7291， Abcam)的 初 級 抗 體 分 別 以 1:200 及 1:5000 稀 釋 於 1 倍 TBST 中 。 將 轉 印 膜 浸 泡 於 Myogenin 及 α-tubulin 的 初 級 抗 體 稀 釋 液 中 ， 在 室 溫 下 置 於 搖 擺 式 振 盪 器 上 ， 搖 晃 約 60 分 鐘 後 ， 再 利 用 1 倍 的 TBST 在 室 溫 下 清 洗 轉 印 膜 ， 以 洗 去 非 特 異 性 結 合的抗體，共清洗 4 次。 (6) 二 級 抗 體 作 用 將具有辣根過氧化酶. (horseradish peroxidase， HRP). 28.
(43) (AP124P Goat anti-mouse IgG HRP， Chemicon international I n c . ) 鍵 結 之 二 次 抗 體 以 1 : 4 0 0 0 稀 釋，使 轉 印 膜 於 室 溫 下 反 應 1 小 時 ， 接 著 利 用 1 倍 的 TBST 在 室 溫 下 清 洗 轉 印 膜 ， 以 洗 去非特異性結合的抗體，共清洗 4 次。 (7) 檢 測 蛋 白 質 使用化學冷光系統. ( e n h a n c e d c h e m i l u m i n e s c e n c e， E C L ). 與 二 級 抗 體 上 的 H R P 反 應 產 生 冷 光。再 於 暗 房 中 以 高 感 光 富 士底片感光及沖片，並將結果所得之影像以螢光測定儀及定 量分析軟體. ( Q u a n t i t y O n e s o f t w a r e， B i o - R a d ) 進 行 蛋 白 質 表. 現之定量分析。. 柒、. 肌酸激酶活性. (creatine kinase activity， CK. activity )之 分 析 以比色法. (colorimetric determination)的 原 理 分 析 細 胞. 中肌酸激酶的濃度。萃取細胞總蛋白質之後以肌酸激酶套組 (ECPK-100， BioAssay System， USA)進 行 分 析 。 依 照 試 劑 套 組 所 附 的 實 驗 步 驟 進 行 測 試。首 先，以 取 100 µl 的 水 加 10 µl 的 校 正 液 作 為 校 正 值 ； 另 外 ， 110 µl 的 水 當 作 背 景 值 ； 針 對 檢 體 的 分 析 ， 取 10 µl 的 檢 體. (定 量 1 µg 的 總 蛋 白 質 )與 100. µ l 還 原 試 劑 混 合 均 勻 ， 總 體 積 皆 為 1 1 0 µ l。 各 別 將 反 應 物 加 入 至 96 孔 盤 中 ， 放 入 恆 溫 37℃ 作 用 10 分 鐘 ， 以 分 光 光 度 計 偵 測 波 長 340 nm 之 吸 光 值 ， 30 分 鐘 後 再 偵 測 一 次 吸 光 值 。 最 後 ， 將 所 偵 測 到 的 吸 光 值 代 入 公 式 ： CK (U/L)＝ (OD40min － OD10min/ODcalibator－ ODH2O)×100， 換 算 出 肌 酸 激 酶 濃 度 並 分析結果。. 29.
(44) 第肆章 第一節. 結果. 肌原母細胞與肌小管細胞之細胞型態. 肌 原 母 細 胞 以 含 有 2% 馬 血 清 的 培 養 基 培 養 三 天 後 ， 肌原母細胞即分化為肌小管細胞。實驗結果是先以伊紅將細 胞 染 色 後 ， 在 顯 微 鏡 2 0 0 倍 視 野 下 所 拍 得 的 照 片（ 見 圖 二 ）。 照 片 明 顯 可 見 肌 原 母 細 胞（ 圖 二 A ）呈 現 單 核 、 單 顆 的 形 態 ； 而 肌 小 管 細 胞 （ 圖 二 B） 因 透 過 細 胞 融 合 作 用 ， 而 呈 現 出 細 長管狀且多核的特性，與肌原母細胞的型態明顯不同。. 30.
(45) 第二節. 不 會 直 接 造 成 肌 原 母 細 胞 死 亡 的 MXC 及. YMT 藥 物 濃 度 篩 選 在 肌 原 母 細 胞 的 生 長 過 程 中 在 加 入 1000 µM、 500 µM、 100 µM 及 10 µM 的 MXC 濃 度 並 進 行 4 小 時 的 短 時 間 培 養 ， 然後再以結晶紫定量分析評估細胞存活率。實驗結果可見， 當 MXC 濃 度 為 1000 µM 時 ， 細 胞 存 活 率 為 54.6%； 而 濃 度 為 500 µM， 細 胞 存 活 率 是 58.5%； 另 外 ， 其 濃 度 為 100 µM 時 ， 細 胞 存 活 率 為 91.9%； 而 濃 度 為 10 µM 時 ， 細 胞 存 活 率 則 達 到 9 6 . 9 %（ 見 表 一 ）。 由 此 顯 示 ， 1 0 0 µ M 以 下 的 M X C 濃 度並不會使肌原母細胞因細胞毒性死亡。 23 種 YMT 新 合 成 化 合 物 不 會 造 成 肌 原 母 細 胞 死 亡 的 濃 度 初 步 篩 選 結 果 如 下 （ 見 表 一 ）： Y M T 7 、 1 1 、 1 2 的 濃 度 約 為 1 µM， YMT8、 10、 15 的 濃 度 約 為 5 µM， YMT13 的 濃 度 約 為 6.25 µM， YMT4、 9、 16、 17、 20、 21、 23 的 濃 度 約 為 10 µM， YMT1、 6、 14 的 濃 度 約 為 12.5 µM， YMT2、 3 的 濃 度 約 為 2 5 µ M ， 而 Y M T 5、 1 8、 1 9、 2 2 的 濃 度 則 是 約 為 5 0 µ M 。 上 述 所 篩 選 出 的 濃 度 皆 能 使 肌 原 母 細 胞 存 活 率 達 90% 以 上，顯示肌原母細胞不是因藥物毒性而導致細胞死亡。 以肌原母細胞作為不會造成細胞死亡的藥物濃度初步篩 選工具，先獲得不使細胞死亡的藥物濃度後，再針對肌原母 細胞分化為肌小管細胞時，探討這一系列化合物對分化過程 的影響。. 31.
(46) 第三節. YMT 藥 物 造 成 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 存 活 率. 低 於 50% 的 濃 度 之 測 試 依肌原母細胞篩選出的結果，做為肌原母細胞分化為肌 小 管 細 胞 的 過 程 中 所 加 入 的 參 考 濃 度，發 現 2 3 種 不 同 的 新 化 合物參考濃度，皆會造成肌小管細胞致死。因此，本實驗將 新 合 成 化 合 物 濃 度 往 下 調 整 ， 以 找 出 在 YMT 藥 物 作 用 下 ， 造 成 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 存 活 率 低 於 50% 的 濃 度 。 以 23 種 YMT 藥 物 造 成 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 存 活 率 低 於 5 0 % 的 濃 度 測 試 結 果 如 下 （ 見 表 二 ）： 其 中 以 低 濃 度 就 可 以 使 肌 小 管 細 胞 存 活 率 低 於 5 0 % 的 化 合 物 有 Y M T 1 0、 1 2、 1 4 、 16， 其 濃 度 分 別 為 0.5 nM、 7.5 nM、 1 nM、 5 nM。 這 4 種 藥 物 對 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 的 靈 敏 度 高 於 其 他 YMT 藥 物 ， 因 此，我們將以這 4 個藥物作為探討肌肉細胞分化過程的主要 對象。. 32.
(47) 第四節. 不 同 濃 度 的 Y M T 1 0、Y M T 1 2、Y M T 1 4、Y M T 1 6. 對肌小管細胞分化的影響 本 結 果 是 先 以 伊 紅 將 細 胞 染 色 後 ， 再 以 顯 微 鏡 200 倍 視 野 下 隨 機 選 取 5 處 照 相 （ 見 圖 三 （ A ））， 然 後 計 算 相 片 中 的 細 胞 融 合 指 數 ， 取 平 均 值 （ 見 圖 三 （ B ））。 圖 三 （ A） 中 (a)為 未 加 入 任 何 藥 物 的 肌 小 管 細 胞 ， 其 細 胞 融 合 指 數 達 95.6%， 此 處 作 為 控 制 組 ； (b)為 加 入 100 µM MXC 為 對 照 組，細 胞 融 合 指 數 為 4 9 . 9 %；( c ) ( d ) ( e ) 分 別 是 加 入 0 . 7 5 nM、 0.5 nM、 0.25 nM 的. YMT10， 其 細 胞 融 合 指 數 值 各 為. 36.5%、 51.5%、 71.3%； (f) (g) (h)分 別 是 加 入 11.25 nM、 7.5 n M、 3 . 7 5 n M 的 Y M T 1 2， 指 數 為 4 0 . 9 %、 5 1 . 5 %、 8 7 . 0 %； ( i ) (j) (k)是 加 入 1.5 nM、 1.0 nM、 0.5 nM 的 YMT14， 指 數 各 別 是 4 3 . 5 %、 5 2 . 1 %、 8 2 . 8 %； ( l ) ( m ) ( n ) 則 是 分 別 加 入 7 . 5 n M 、 5 n M、2 . 5 n M 的 Y M T 1 6，該 指 數 分 別 為 5 0 . 4 %、5 5 . 0 %、8 0 . 1 %。 4 種藥物濃度越高時，細胞融合指數就越低，呈現出明 顯的劑量依賴性. (dose-dependent)現 象 。. 33.
(48) 第 五 節 肌 原 母 細 胞 在 不 同 濃 度 的 YMT10、 YMT12、 Y M T 1 4、Y M T 1 6 影 響 下 分 化 成 肌 小 管 細 胞 中 的 肌 酸 激 酶活性表現 本 實 驗 取 1 µ g 的 總 蛋 白 質 進 行 肌 酸 激 酶 活 性 分 析（ 見 圖 四 ） 。 結 果 顯 示 ， 肌 原 母 細 胞 的 肌 酸 激 酶 活 性 平 均 為 43.7 U/L； 而 肌 小 管 細 胞 的 肌 酸 激 酶 活 性 平 均 為 63 U/L； 在 分 化 過 程 分 別 加 入 0.75 nM、 0.5 nM、 0.25 nM 的 YMT10， 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 之 肌 酸 激 酶 活 性 各 約 為 43.15 U/L、 64.89 U/L、 66.59 U/L； 若 加 入 11.25 nM、 7.5 nM、 3.75 nM 的 Y M T 1 2 ， 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞，其 肌 酸 激 酶 活 性 則 約 為 3 5 . 2 4 U/L、 38.52 U/L、 49.98 U/L； 分 化 過 程 若 分 別 加 入 1.5 nM、 1.0 nM、 0.5 nM 的 YMT14 後 ， 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 之 肌 酸 激 酶 活 性 表 現 約 是 34.56 U/L、 38.52 U/L、 49.34 U/L； 而 在 分 化 過 程 分 別 加 入 7.5 nM、 5.0 nM、 2.5 nM 的 YMT16 之 後 ， 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 ， 其 肌 酸 激 酶 活 性 則 各 別 是 51.60 U/L、 46.32 U/L、 37.89 U/L。 結果可見，肌小管細胞的肌酸激酶活性表現大於肌原母 細 胞 。 而 YMT10、 12、 14、 16 對 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 中 的 肌酸激酶活性表現影響並不完全一致。當分化過程中，分別 加 入 YMT10、 12、 14 此 3 種 藥 物 後 ， 當 藥 物 的 濃 度 愈 高 ， 分化後的肌小管細胞之肌酸激酶活性表現則愈低；然而， YMT16 藥 物 濃 度 愈 高 ， 細 胞 的 肌 酸 激 酶 活 性 表 現 則 愈 強 。. 34.
(49) 第 六 節 肌 原 母 細 胞 在 不 同 濃 度 的 YMT10、 YMT12、 YMT14 、 YMT16. 影 響 下 分 化 成 肌 小 管 細 胞 中 的. Myogenin 蛋 白 質 表 現 量 圖 五 中 (A)為 西 方 點 墨 法 呈 色 於 X 光 片 上 的 實 驗 結 果 ， 定 量 後 的 平 均 量 化 結 果 整 理 於 圖 五 (B)。 實 驗 結 果 可 見 肌 原 母 細 胞 的 Myogenin 蛋 白 質 表 現 量 明 顯 低 於 肌 小 管 細 胞 ； 而 在 分 化 過 程 分 別 加 入 不 同 濃 度 的 YMT10、 14 及 16 此 3 種 藥 物後，可以發現藥物的濃度愈低時，其肌小管細胞的 Myogenin 表 現 量 愈 高 ， 並 皆 呈 現 劑 量 依 賴 的 特 性 ； 然 而 ， 加 入 不 同 濃 度 的 YMT12， 肌 小 管 細 胞 的 Myogenin 蛋 白 質 表 現 量 則 沒 有 明 顯 變 化 （ 見 圖 五 ）。. 35.
(50) 第 七 節 不 同 分 化 階 段 加 入 Y M T 1 0、Y M T 1 2、Y M T 1 4、 YMT16 對 肌 小 管 細 胞 分 化 後 的 細 胞 融 合 指 數 之 影 響 圖 六 (A)為 加 藥 方 式 示 意 圖 ， 第 0 天 為 加 入 含 有 2% 馬 血清的培養基，以誘發肌原母細胞分化，經過 3 天則細胞將 分化成肌小管細胞。A 組為分化過程完全不加藥物，此作為 控 制 組；B 組 是 3 天 全 程 加 藥；C 組 為 第 0 天 加 藥 2 4 小 時 後 ， 更 換 成 含 有 2% 馬 血 清 並 未 含 有 藥 物 的 正 常 培 養 基 ； D 組 是 於 第 1 天 ~第 3 天 連 續 加 藥； E 組 為 第 1 天 加 藥 後， 隔 天 更 換 成 含 有 2% 馬 血 清 的 正 常 培 養 基；而 F 組 則 是 在 第 2 天 ~第 3 天連續加藥。加藥後細胞融合指數的平均量化結果整理於圖 六 (B)。 實 驗 結 果 發 現 ， 未 加 入 任 何 藥 物 的 A 組，其 細 胞 融 合 指 數 均 可 達 96% 左 右 。 在 不 同 實 驗 設 計 B、 C、 D、 E、 F 組 加 入 YMT10 藥 物 後 ， 細 胞 融 合 指 數 各 別 為 54.3%、 74.0%、 7 4 . 4 %、 7 4 . 8 % 和 8 4 . 1 %； 而 加 入 Y M T 1 2 藥 物 後 ， B、 C、 D 、 E、 F 組 的 細 胞 融 合 指 數 為 58.8%、 71.7%、 73.3%、 85.6%及 87.0%； 另 外 ， 加 入 YMT14 藥 物 後 ， B、 C、 D、 E、 F 組 的 細 胞 融 合 指 數 則 為 5 6 . 6 %、 7 0 . 5 %、 7 7 . 3 %、 7 8 . 5 % 與 8 0 . 8 %； 而 加 入 YMT16 藥 物 後 ， 其 B、 C、 D、 E、 F 組 的 細 胞 融 合 指 數 各 別 是 54.1%、 63.8%、 72.3%、 80.1%及 86.3%。 結 果 顯 示，不 論 加 入 Y M T 1 0 、 1 2 、 1 4 、 1 6 這 4 種 藥 物 ， 皆 以 B 組 的 分 化 抑 制 性 最 明 顯 ； 而 在 YMT10、 12、 14 不 同 的 加 藥 時 間 組 別 ( C 、 D、 E、 F ) 的 細 胞 融 合 指 數 卻 沒 有 明 顯 差 異 。 但 加 入 YMT16 後 發 現 ， 越 晚 加 入 藥 物 其 細 胞 融 合 指 數 會呈現增加的趨勢。. 36.
(51) 第伍章 討論 C2C12 細 胞 是 肌 肉 細 胞 株 ， 具 有 與 一 般 細 胞 株 不 一 樣 的 特性，在加入不同成分的血清後，經過 3 天後會由肌原母細 胞分化成肌小管細胞。在本論文中，我們也觀察所培養的 C 2 C 1 2 肌 原 母 細 胞 與 肌 小 管 細 胞 的 型 態 明 顯 不 同 （ 圖 二 ）， 相 關 文 獻 提 到 血 清 成 分 、 含 量 的 改 變 是 造 成 C2C12 細 胞 由 肌 原 母細胞分化成肌小管細胞的主因. (Langen, Schols, Kelders,. Wo u t e r s , & J a n s s e n - H e i n i n g e r , 2 0 0 3 ; Ya f f e & S a x e l , 1 9 7 7 a , 1977b)。 肌 肉 細 胞 生 長 時 ， 基 質. (matrigel)是 提 供 類 似 肌 內. 膜的環境，以維持細胞的生長或分化。不同的血清成分會改 變基質成分，而當胎牛血清的成分減少或者更換為馬血清 後，改變了基質環境，因此，減少肌原母細胞分裂並誘發肌 細胞開始進入分化過程. ( Ya f f e & S a x e l , 1 9 7 7 a ) 。. 在 一 系 列 YMT 新 合 成 化 合 物 造 成 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 存 活 率 低 於 5 0 % 的 實 驗 中 發 現 ， Y M T 1 0、 1 2、 1 4、 1 6 此 4 種 藥 品 在 比 其 他 YMT 化 合 物 較 低 的 濃 度 即 會 抑 制 肌 細 胞 分 化，且 此 有 效 抑 制 濃 度 遠 低 於 已 知 的 化 合 物 M X C ( S t e f f e n s e t al., 2007)。 這 樣 的 結 果 顯 示 ， 同 樣 是 YMT 系 列 的 藥 物 ， 並 非 對 肌 細 胞 的 分 化 有 相 同 的 影 響 性 ， 各 類 YMT 藥 物 不 造 成 肌 原 母 細 胞 死 亡 的 濃 度 也 有 1 ~ 5 0 倍 不 等 的 差 距（ 表 一 ） 。Rao 等. (2009)的 研 究 當 中 發 現 ， 這 一 系 列 YMT 新 合 成 化 合 物 對. 抑制癌細胞的分裂能力之影響濃度也不相同，可能因為這些 Y M T 藥 物 的 苯 環 結 構 不 同 而 影 響 了 它 們 的 活 性 （ 附 錄 一 ）。 根 據 本 論 文 中 的 結 果 ， 我 們 推 測 各 類 YMT 藥 物 導 致 細 胞 死 亡的濃度差異也可能是與苯環結構銜接不同的取代基有關。. 37.
(52) 此 外，YMT10 是 其 中 最 具 影 響 效 果 之 化 合 物，以 低 於 5×10-10 M 的 濃 度 就 可 以 造 成 分 化 後 的 肌 小 管 細 胞 存 活 率 低 於 50%， 其 次 具 影 響 效 果 之 化 合 物 是 Y M T 1 4， 這 兩 個 化 合 物 的 分 子 式 相同，取代基也都相同，唯獨取代基的鍵結位置不同（附錄 二 ）。 Y M T 1 2 及 Y M T 1 6 分 別 與 Y M T 1 0 有 一 個 及 兩 個 不 同 的 取代基，可能因此而造成了彼此之間有效濃度的差異。 肌原母細胞與肌小管細胞除了細胞型態不同之外，在其 他特性上也有許多顯著的不同點，例如：肌原母細胞的 Pax3、 Pax7、 大 分 子 量 的 熱 休 克 蛋 白. (heat shock proteins，. HSPs)及 肌 肉 特 異 性 基 因 群 內 的 Myf5、 MyoD 的 表 現 皆 高 於 肌 小 管 細 胞 ； 而 肌 原 母 細 胞 中 的 肌 酸 激 酶 活 性 、 IL-6 及 旋 轉 素 I、 肌 球 蛋 白 、 p38-分 裂 原 活 化 蛋 白 質 激 酶. (p38-. mitogen-activated protein kinase， p38- MAPK)及 肌 肉 特 異 性 基 因 群 內 的 Myogenin、 MRF4 的 表 現 則 是 低 於 肌 小 管 細 胞 ( A n d r e s & Wa l s h , 1 9 9 6 ; B a e z a - R a j a & M u n o z - C a n o v e s , 2 0 0 4 ; Chamberlain et al., 1985; Epstein et al., 1995; Maglara et al., 2003; Steffens et al., 2007)。 當 我 們 以 相 同 濃 度 分 析 YMT 藥 物對肌原母細胞或肌小管細胞之影響時，發現這兩種不同階 段 的 肌 細 胞 對 同 一 種 YMT 藥 物 的 敏 感 度 不 同 ， 影 響 細 胞 存 活率以及細胞特性的效果也不盡相同。此結果暗示，當肌原 母細胞開始分化成肌小管細胞後，對藥物的敏感性有可能隨 之改變。 L a n n g e n , S c h o l s , K e l d e r s , Wo u t e r s , & J a n s s e n - H e i n i n g e r (2001)及 Magalara 等. (2003)的 研 究 皆 指 出 在 C2C12 加 入 含 有. 馬血清的培養基後，其細胞內肌酸激酶活性明顯增加。在我 們 的 研 究 中 也 發 現，肌 原 母 細 胞 中 的 肌 酸 激 酶 活 性 約 為 4 2 . 5 9. 38.
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