沙門氏菌之單株抗體的生產與分析研究

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 沙門氏菌之單株抗體的生產與分析研究 Production and Characterization of Monoclonal Antibodies Directed to Salmonella enterica. 研究生：黃韻如 Yun-Ju Huang. 指導教授：王玉麒. 博士. Dr. Yu-Chie Wang. 中華民國一○一年七月.

(2) 致謝. 感謝王玉麒老師的指導，從基礎理論到實驗操作，讓我一個幾乎未曾碰過生物實驗的誇領域學生能在進入生命科學這個領域時，能快速地上手；老師也教導我如何嚴謹地規劃實驗及研究，使我能更全面地、更有邏輯地去思考；老師更細心地批改我的論文，讓本篇我能以精簡的字詞來清楚表達這個研究的內涵。感謝李冠群老師、楊沂淵老師在口試時提出的意見及在論文上的指導，點出了一些我之前沒有思考到的盲點。此外，也感謝實驗室的同任們：哲雄學長、永順學長、超凡學長、政霖學長、書宏、宗明、周坤、泰霖、奕輝、國華及國緯，在實驗上給予我協助，在我遇到困難時一起討論、解決問題。感謝多年的好友們不斷給我加油打氣，令我能在短時間內打起精神再出發。最後，感謝我的父母及兄長在這段時間給我的支持及陪伴，在我心情低落時給予我安慰，讓我在家裡可以放下煩惱得到足夠的休息。也感謝親戚們的鼓勵與關心，這些都是我努力的動力。謹以此論文獻給我感謝的人以及我愛的人。.

(3) 目錄. 摘要............................................................................................................. 1 Abstract ....................................................................................................... 3 壹、緒論..................................................................................................... 5 一、食物中毒與發展沙門氏菌偵測法的必要性 ............................. 5 二、沙門氏菌的介紹.......................................................................... 7 三、目前沙門氏菌的偵測方法 ....................................................... 12 四、研究目的.................................................................................... 19 貳、材料與方法 ...................................................................................... 21 一、抗原的製備................................................................................ 21 (1) 細菌的來源與培養條件 ...................................................... 21 (2) 超音波破菌條件測試 .......................................................... 22 (3) 細菌細胞壁抗原萃取 .......................................................... 22 (4) 蛋白質定量 .......................................................................... 23 二、單株抗體的生產........................................................................ 24 (1) 小鼠免疫注射 ...................................................................... 24 (2) 細胞融合 .............................................................................. 24 (3) 融合瘤細胞的篩選 .............................................................. 25 (4) 融合瘤細胞的選殖 .............................................................. 26.

(4) 三、單株抗體的純化與分析 ........................................................... 27 (1) 單株抗體的濃縮與 protien A/G 親和性管柱純化 ............. 27 (2) 沙門氏菌單株抗體對不同菌株的專一性分析 .................. 28 (3) 沙門氏菌單株抗體 isotyping .............................................. 29 (4) 單株抗體能否吸附細菌表面的測試 .................................. 29 (5) 抗原是否為 LPS 的分析 ..................................................... 30 (6) 沙門氏菌單株抗體間的競爭性分析 .................................. 32 (7) 沙門氏菌單株抗體的效價分析 .......................................... 32 四、沙門氏菌免疫偵測方法的探討 ............................................... 33 (1) Direct ELISA 的分析............................................................ 33 (2) Microfuge tube immunoassay 的分析 .................................. 34 參、結果................................................................................................... 35 一、抗體的製造................................................................................ 35 (1) 抗原的製備 .......................................................................... 35 (2) 單株抗體的製造與篩選 ...................................................... 37 二、抗體的特性分析........................................................................ 38 (1) 沙門氏菌單株抗體對不同菌株的專一性分析 .................. 38 (2) Isotyping ................................................................................ 42 (3) 單株抗體能否吸附細菌表面的測試 .................................. 42.

(5) (4) 抗原是否為 LPS 的分析 ..................................................... 43 (5) 沙門氏菌單株抗體間的競爭性分析 .................................. 44 (6) 沙門氏菌單株抗體的效價分析 .......................................... 45 三、沙門氏菌免疫偵測方法的探討 ............................................... 46 (1) Direct ELISA 的分析結果.................................................... 46 (2) Microfuge tube immunoassay 的分析結果 .......................... 46 肆、討論................................................................................................... 48 一、單株抗體的製造──免疫注射的抗原種類與劑量探討.......... 48 二、抗體的分析與應用潛力 ........................................................... 50 (1) 第 I 群抗體──可辨識所有測試的菌種 ............................. 51 (2) 第 II 群抗體──可辨識部份腸菌科菌種 ........................... 52 (3) 第 III 群抗體──可專一辨識沙門氏菌但不具血清型專一性 ................................................................................................. 53 (4) 第 IV 群抗體──可專一辨識沙門氏菌的 O5 抗原 ........... 56 (5) 沙門氏菌單株抗體的應用 .................................................. 57 三、沙門氏菌免疫偵測法的探討 ................................................... 58 伍、總結................................................................................................... 61 陸、圖表................................................................................................... 63 參考文獻................................................................................................. 106.

(6) 附錄......................................................................................................... 115 附錄一、縮寫對照表...................................................................... 115 附錄二、細菌培養液配方.............................................................. 117 附錄三、常用溶液配方.................................................................. 118.

(7) 圖目錄. （圖一）革蘭氏陰性菌細胞壁示意圖 .................................................. 63 （圖二）沙門氏菌的國家標準檢驗法操作流程 .................................. 64 （圖三）超音波破菌條件測試 .............................................................. 65 （圖四）兩種免疫注射抗原樣品的電泳分析圖 .................................. 66 （圖五）沙門氏菌單株抗體對不同菌株的作用力比較結果 .............. 70 （圖六）以免疫沉澱法測試抗體結合細菌顆粒的能力示意圖 .......... 74 （圖七）七株單株抗體對沙門氏菌菌體的免疫沉澱分析結果 .......... 75 （圖八）沙門氏菌單株抗體的辨識成份分析結果 .............................. 76 （圖九）抗體間對表位競爭的示意圖 .................................................. 78 （圖十）沙門氏菌單株抗體間 competitive ELISA 實驗結果 ............. 84 （圖十一）沙門氏菌單株抗體對其抗原的作用力分析結果 .............. 87 （圖十二）I-1 抗體對破菌抗原的 direct ELISA 分析結果 ................. 88 （圖十三）II-1 抗體對全菌抗原的 direct ELISA 分析結果................ 90 （圖十四）III-1 抗體對全菌抗原的 direct ELISA 分析結果 .............. 92 （圖十五）III-2 抗體對全菌抗原的 direct ELISA 分析結果 .............. 94 （圖十六）IV-1 抗體對全菌抗原的 direct ELISA 分析結果 .............. 96 （圖十七）IV-2 抗體對全菌抗原的 direct ELISA 分析結果 .............. 98.

(8) （圖十八）IV-3 抗體對全菌抗原的 direct ELISA 分析結果 ............ 100 （圖十九）Microfuge tube immunoassay 操作過程示意圖 ............... 101 （圖二十）IV-2 單株抗體對全菌抗原的 Microfuge tube immunoassay 結果......................................................................................................... 102 （圖二十一）本研究所使用的菌種分類表 ........................................ 103 （圖二十二）腸菌科中四種細菌（Klebsiella pneumoniae、Shigella sonnei、Escherichia coli 及 Salmonella enterica）之親源性關係比較資料............................................................................................................. 104 （圖二十三）三種沙門氏菌菌株的 O 抗原種類及單體結構 ........... 105.

(9) 表目錄. 表一、臺灣近年沙門氏菌中毒案件統計 ................................................ 6 表二、生產沙門氏菌單株抗體各階段的結果 ...................................... 38 表三、沙門氏菌單株抗體對各菌株的作用力比較結果 ...................... 41 表四、七株沙門氏菌單株抗體的 isotyping 結果 ................................. 42 表五、沙門氏菌單株抗體間的競爭作用結果 ...................................... 45 表六、兩種抗原製備法的比較 .............................................................. 49 表七、細菌抗原的免疫注射劑量比較 .................................................. 50 表八、本研究所生產的單株抗體可適用的實驗種類 .......................... 50 表九、現有的細菌免疫偵測法比較 ...................................................... 60.

(10) 摘要. 沙門氏菌（Salmonella enterica）是造成全球食物中毒的最主要病原菌之一，不但威脅人類的健康，也會造成社會問題及經濟損失，因此發展快速、準確的沙門氏菌檢驗方法有其必要性。目前我國對沙門氏菌的標準檢驗方法是使用傳統的細菌培養法，缺點是完成檢驗所需的時間較長，且耗費較多的人力與空間。故本研究擬生產可辨識沙門氏菌的專一抗體，以利後續更新沙門氏菌的檢測方法，或是做為沙門氏菌的基礎研究工具之用。在本研究中，我們以沙門氏菌（Typhimurium 血清型）的細胞壁溶出物或以超音波震盪處理的破菌樣品做為抗原，分別對小鼠進行免疫注射，經過三次細胞融合及選殖實驗後，總共篩選得到七株可辨識沙門氏菌的單株抗體：其中的一株（I-1）除了可辨識沙門氏菌之外，也會辨識各種測試的革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌；一株（II-1）除了可辨識沙門氏菌之外，也會辨識腸菌科中的大腸桿菌及志賀氏桿菌；兩株（III-1、III-2）會對沙門氏菌的 Typhimurium 和 Enteritidis 兩種血清型產生反應，但不會對其他腸菌科的細菌作用；另三株（IV-1、 IV-2、IV-3）則只會辨識沙門氏菌中的 Typhimurium 血清型菌株。這七株抗體中，有四株（III-2、IV-1、IV-2、IV-3）的辨識抗原，經檢 1.

(11) 測後確定為 lipopolysaccharide (LPS)上的 O antigen：其中一株（III-2）專一辨識沙門氏菌的 O12 antigen；其餘三株則是辨識 O5 antigen。本研究所生產的七種單株抗體，依其專一性及結合力的差別，或可做為基礎研究的工具，如不同菌種的親緣關係探討或特定抗原的鑑定；亦可被應用於病原菌檢測方法的開發或功能性食品的生產。此外，我們也開發了一種新的免疫檢測方式，藉簡易的離心濃縮步驟，將細菌的偵測極限降低至 104 CFU/mL，偵測時間僅需 2.5 h 以內。未來透過偵測敏感度的進一步提升，應有取代當前國家標準方法的潛力。. 關鍵字：沙門氏菌、單株抗體、抗體。. 2.

(12) Abstract. Salmonella enterica is one of the main pathogens causing foodborne disease in the world. It not only threaten people’s health, but also result in social problems and economic losses. Therefore it is important to develop a rapid and accurate detection method for Salmonella. Currently, the national standard detection methods in Taiwan employ the traditional bacterial culture method, which is time consuming, labor extensive, and space required. Thus, the aim of the present study is to produce Salmonella-specific monoclonal antibodies, which may be used as tools for basic researches and for development of immunochemical detection method for Salmonella. To fulfille our aim, we used detergent-dissolved cell wall components or sonicated bacterial cells (Salmonella enterica, serovar Typhimurium) as antigens to immunize mice.. After three independent. cell fusion and cloning processes, we have successfully selected seven Salmonella-detecting monoclonal antibodies (MAbs). Among them, one (I-1) recognizes not only Salmonella but also all the other tested Gram-positive and Gram-negative bacteria; one (II-1) can detect Salmonella and two other enteric bacteria (Escherichia coli and Shigella sonnei); two (III-1 and III-2) can react with Salmonella enterica of two different serotypes (Typhimurium and Enteritidis), but not other bacteria in Enterobacteriaceae; while the last three (IV-1, IV-2 and IV-3) can only recognize the Typhimurium serotype of Salmonella enterica (Typhimurium-specific). Results of antigen scrutinization revealed that 3.

(13) four of generated MAbs (III-2, IV-1, IV-2 and IV-3) detect recognize O antigens: MAb III-2 reacts with Salmonella O12 antigen, while the other three detect the O5 antigen. Based upon the difference in their specificity and antigen-binding capability, these seven MAbs might be applicable for basic researches, e.g. bacterial phylogenetic, structure and function, and pathogenesis studies. In addition, they may be used to develop bacterial detection methods or be used as supplement of functional foods. Presently, we have developed a microfuge tube-based immunoassay which can detect Salmonella at 104 CFU/mL within 2.5 h. By increasing the sensitivity of this assay, it has the potential to develop a new immunochemical detection method for Salmonella.. Key word : Salmonella, Monoclonal antibodies, antibodies.. 4.

(14) 壹、緒論. 一、食物中毒與發展沙門氏菌偵測法的必要性食物中毒是指攝入含有大量細菌、黴菌毒素、病毒、寄生蟲、有毒動植物及化學毒物等的食物，而發生身體不適的症狀，其中又以細菌性的食物中毒最為常見。世界衛生組織的報導（World Health Organization, WHO, 2002）指出，世界上最常造成食物中毒的細菌性病原為沙門氏菌（Salmonella）、曲狀桿菌（Campylobacter）、大腸桿菌（Escherichia coli）及霍亂弧菌（Vibrio cholerae）等。美國疾病防治中心公布美國國內 2011 年造成食物中毒的主要病原數據（Center for Disease Control and Prevention, CDC, 2012）則顯示，最主要的細菌性病原為沙門氏菌（11%）、產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens, 10%）、曲狀桿菌（9%）及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, 3%）。而我國行政院衛生署食品藥物管理局從民國 70 年至民國 100 年的統計資料則顯示，國內造成食物中毒的細菌性病原中，以腸炎弧菌（Vibrio parahemolytica, 62%）及金黃色葡萄球菌（19%）為主，其他較常見者則有仙人掌桿菌（Bacillus cereus, 14%）、沙門氏菌（9%）、病原性大腸桿菌（4%）、及肉毒桿菌（Clostridium botulism, 1%），其中沙門氏菌的中毒案件每 5.

(15) 年約有數件至數十件（表一）。. 表一、臺灣近年沙門氏菌中毒案件統計年份. 案件數. 感染人數. 死亡人數. 1999. 7. 262. 0. 2000. 9. 152. 0. 2001. 9. 176. 1. 2002. 6. 30. 0. 2003. 11. 177. 0. 2004. 8. 206. 0. 2005. 7. 89. 0. 2006. 8. 169. 0. 2007. 11. 95. 0. 2008. 14. 214. 0. 2009. 22. 472. 0. 2010. 27. 777. 0. 2011. 11. 67. 0. 資料來源：行政院食品藥物管理局（http://www.fda.gov.tw/content.aspx?site_content_sn=323）. 由上述資料可知，無論在國內、外沙門氏菌皆為最常見的食源性細菌之一。據估計，美國每年約有 40000 人發生沙門氏菌感染案件，在 1990 至 2006 年間，與沙門氏菌有關的死亡人數達 1316 人 6.

(16) (Cummings et al., 2010)，估計每年花費在沙門氏菌症（Salmonellosis）相關的經費約有 10 億美元(Buzby & Roberts, 1997)。2010 年 5 月因蛋雞飼料污染所爆發的一次大規模感染更是使超過 1500 人受害，並造成重大的經濟損失及消費者的恐慌(CDC 2010)。而台灣近年來以民國 99 年沙門氏菌中毒案件最為嚴重，共有 27 件，患者數達 777 人，去年（民國 100 年）雖然較少，但仍有 11 起案件，患者數有 67 人（表一）。沙門氏菌造成的影響除了食物安全和健康問題之外，更因使用醫療資源與經濟息息相關。例如丹麥自 1995 年對豬肉進行全國性的沙門氏菌監控後，順利使豬肉中含沙門氏菌比例在 1993 到 2000 年間降了 2.8%，並為國家省下 255 萬歐元的相關開支(Nielsen et al., 2001)。由此可知，發展沙門氏菌的偵測方法是一件相當重要的工作。. 二、沙門氏菌的介紹在分類地位上，沙門氏菌屬為細菌域（Bacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、γ 變形綱（Gammaproteobacteria）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、沙門氏菌屬（Salmonella）。其下有兩個種，分別為豬霍亂沙門氏菌（Salmonella bongori）及腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）。其中豬霍亂沙門氏 7.

(17) 菌與人類疾病無關，腸道沙門氏菌則常引發腸道感染（腸道血清型）或是全身性的疾病（類傷寒血清型）。世界衛生組織參考了 Kauffmann-White 通則及相關學者的研究，擬定了一套沙門氏菌的分類及命名法則，後來美國疾病防治中心在 2002 年稍微修改了此方法(CDC 2006)，成為最主要的命名標準。腸道沙門氏菌依照生化特性及基因型，被分成 6 個亞種，分別為 Salmonella enteric subsp. enteric（或表示為 subspecies I）、Salmonella enteric subsp. salamae（或表示為 subspecies II）、Salmonella enteric subsp. arizonae（或表示為 subspecies IIIa）、Salmonella enteric subsp. diarizonae（或表示為 subspecies IIIb）、Salmonella enteric subsp. houtenae（或表示為 subspecies IV）及 Salmonella enteric subsp. indica （或表示為 subspecies VI），而過去認為的 subspecies V 後來被認定為一個獨立的種，即為 Salmonella bongori。其中，subspecies I 主要生長在恆溫動物的體內，常見於人類疾病的幾個血清型主要分佈於此，其餘幾個亞種則主要生長在變溫動物體內或者是環境中(Brenner et al., 2000; Popoff et al., 2003)。根據與 WHO 合作研究沙門氏菌的機構 Institut Pasteur 於 2007 年公布的資料顯示，目前已經發現的腸道沙門氏菌約有 2557 種，其中分佈於 S. enterica subsp. enterica 亞種中的數量最多，佔 1531 種血清 8.

(18) 型。血清型的主要的分類依據為菌體抗原（somatic, O-antigen 或 O-polysaccharide）、鞭毛抗原（flagellar, H-antigen）、莢膜抗原（capsular, K 或 Vi-antigen）之差異(Popoff et al., 2003)。四種最常見的沙門氏菌血清型包寒腸炎沙門氏菌（S. Enteritidis）、鼠傷寒沙門氏菌（S. Typhimurium）、人類類傷寒桿菌（S. Typhi）及 S. Paratyphi 群（S. Paratyphi A、B、C），其中 S. Enteritidis 及 S. Typhimurium 二種為造成沙門氏菌症的最主要病原菌。在美國疾病管制局的研究中（2009），目前在食物中毒案件中所分離出的血清型以 Enteritidis 為最大宗，其次則是 Typhimurium ；在台灣的沙門氏菌感染案件中，過去以 Typhimurium 血清型佔多數，然而近年來 Enteritidis 的感染案件也有增加的趨勢(Lu et al., 2004)，有研究顯示 1995 年至 2001 年之間， Enteritidis 所屬的 O9 血清群案件已高過 Typhimurium 所屬的 O4 血清群(Su et al., 2005)。沙門氏菌外型為桿狀，直徑約 0.7～1.5 μm，長約 2～5 μm。不產生芽苞（non-spore-forming）。好氧或兼性厭氧。大多數菌株有菌毛（fimbriae 或 pili）(Chaubal & Holt, 1999)，大多數有周鞭毛（peritrichous flagella），具運動性(Holt & Chaubal, 1997)，為革蘭氏陰性菌（Gram-negative bacteria）的一種，細胞外有兩層膜，分別為胞質膜（cytoplasmic membrane）與外層膜（outer membrane），在兩層 9.

(19) 脂質為主的膜狀構造中間則是較革蘭氏陽性菌（Gram-positive bacteria）薄得多的肽聚醣層 (Bhunia, 2008) （圖一）。沙門氏菌的外層抗原中，最常被討論的為 O 抗原及 H 抗原兩種：在革蘭氏陰性菌的細胞外層膜上有脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）的構造，其組成由膜往外延伸又分為三個部份：脂質 A（lipid A）、核心多糖（core）以及 O 抗原多糖鏈（見圖一）。脂質 A 為嵌在外層膜上的疏水性構造，是一種內毒素（endotoxin），當細菌外層膜被宿主細胞內的免疫系統破壞時，脂質 A 便會被從外層膜釋放出來，並作用導致宿主腹瀉、發燒等不適症狀。核心多糖與脂質 A 相連，以沙門氏菌為例，主骨幹約有 6 個糖，另有 4～5 個側鏈。核心多糖之外的多糖鏈稱為 O 抗原，是沙門氏菌表現抗原性差異的最主要部位，通常以 4 至 6 個糖為一個重複單位，約以 6 至 10 組的重覆次數形成聚合物(Raetz & Whitfield, 2002)。過去對沙門氏菌 O 抗原以英文字母來命名，後來因英文不足，故改由數字來表示，不過由於習慣的關係，仍有不少文獻在表示常用的血清型時會以英文字母標示（例如：血清型 Typhimuriumn 所屬的 O4 血清群亦稱為 Group B；血清型 Enteritidis 所屬的 O9 血清群亦稱為 Group D1；血清型 Paratyphi A 所屬的 O2 血清型則又為 Group A）。O 抗原又被分為幾個血清群（O groups），同個血清群中又因不同的 O 單因子（O factor）的修飾而產生不同的血 10.

(20) 清型。分佈於鞭毛上的 H 抗原屬於鞭毛蛋白（flagellin）中的一部份。鞭毛蛋白的 C 端及 N 端通常為較保守的區域，為維持鞭毛絲狀結構的部位，而表現出抗原性的為較中間的區域，暴露於鞭毛表層。一般細菌在同個細菌細胞上只能表現出一種 H 抗原，但大部份沙門氏菌卻可同時表現兩種，分為 Phase 1 和 Phase2，但部份的沙門氏菌也只能表現出一種。鞭毛抗原也會有不同的 H 單因子（H factor）對此抗原進行修飾，造成各種變化的血清型(Iino, 1969)。此外，少數的血清群如 O7 及 O9（包含血清型 Typhi）的沙門氏菌在細胞壁外層會有莢膜的構造，保護菌體以更容易耐受宿主消化液影響或者是不受宿主吞噬細胞破壞，主要成份為多醣鏈，稱為莢膜抗原。也是檢驗血清型的依據之一。腸炎性的沙門氏菌是一種人畜共患的病原，會在人與動物之間交互傳染，而禽類通常是人類感染沙門氏菌的主要來源。一般感染者多為食入被動物或人類糞便污染的食物，由消化道進入人體，如蛋類、乳製品、禽類、豬肉、牛肉、及海鮮都時常成為沙門氏菌的傳播載體 (Malorny & Hoorfar, 2005)，少數為接觸寵物、牲畜感染。其感染後的潛伏期在 6 到 72 小時之間，通常在 12 到 36 小時便會有明顯症狀。受到感染後通常會產生急性腸胃炎，有噁心、嘔吐或下痢等症狀，常 11.

(21) 伴隨發燒、腹部絞痛。約 5%病人有可能引發菌血症，其中 5 – 10% 會發生轉移性局部感染，造成蕈狀血管瘤、骨髓炎、關節炎等，有時也會引發肝脾等處的膿瘍，然而此種狀況通常以嬰兒、幼兒、老年人、 AIDS 患者及器官移植手術後的病人等免疫力低落者為危險群 (Coburn et al., 2007)。. 三、目前沙門氏菌的偵測方法傳統偵測沙門氏菌的方法為進行細菌培養（bacteria culture），而後陸續發展出聚合酶鍊反應（polymerase chain reaction, PCR）及免疫分析法（immunoassay）等分子檢測方法以求改善。傳統細菌培養法通常分成幾個階段：非選擇性增菌培養、選擇性增菌培養與選擇性固態培養。首先以非選擇性的液態培養液如緩衝蛋白腖（buffer peptone water, BPW）或腦心浸出物培養液（brain heart infusion broth, BHIB）讓樣品中所含有的細菌被增量放大。這個步驟除了可以增加菌量外，更可以使樣品中那些在食物處理過程或運輸過程遭受到如加熱、高鹽、脫水及防腐劑等逆境亞致死（sublethal）的細菌重新活化，以利後續的培養及觀測。好的增菌過程可使細菌密度至少增加 1000 倍以上 (Kumar et al., 2008)。 12.

(22) 經過非選擇性培養的菌液，通常會再接種至選擇性培養液中進行增菌。這些選擇性的培養液中，往往會添加一些抑制細菌生長的物質，只有少數的菌種在此環境下受到的影響較小，故有放大目標菌種、減少非目標菌種的效果。目前常使用於沙門氏菌的選擇性培養液有亞硒酸胱胺酸培養液（Selenite cystine broth, SC）、四硫代硫酸鹽培養液（Tetrathionate broth, TT）及 Rappaport – Vassiliadis 培養液（RV）。SC 培養液中含有硒酸鹽類，會抑制大部份包含腸桿菌的革蘭氏陰性菌，對沙門氏菌的抑制效果則較不顯著；TT 培養液中的硫代硫酸鹽（thiosulfate）及四硫代硫酸鹽會抑制腸道微生物的生長，只有含有四硫代硫酸還原酶（tetrathionate reductase）的細菌如沙門氏菌才能在此種環境下增殖；除此之外，膽鹽（bile salt）也能抑制大腸桿菌群與部份革蘭氏陰性菌的生長，故在增殖沙門氏菌的培養液中，扮演抑制非目標菌種的角色；RV 培養基中含有孔雀綠（malachite green oxalate）是一種常見的殺菌藥劑，但除了傷寒及類傷寒兩類血清型之外的沙門氏菌卻可在此培養基中生存，故可被應用於篩檢食物中毒是否由沙門氏菌引起之用途。將 RV 培養液改良的 modified semisolid Rappaport-Vassiliadis 培養基（MSRV），其應用範圍與偵測敏感度均有顯著的提升(Harvey & Price, 1980; Busse, 1995; Eriksson & Aspan, 2007; Koyuncu & Haggblom, 2009)。 13.

(23) 在選擇性培養液中進行初步增菌後，通常會將菌液接種於選擇性固態培養基上，隨後依照沙門氏菌的生化特性，會使菌落或菌落周邊的培養基產生有別於其他菌種的顏色變化，有利於藉形態觀察即可概略分辨菌種及計算菌落數量。常見的選擇性固態培養基有木糖離胺酸去氧膽酸鹽培養基（Xylose lysine deoxycholate agar, XLD）(Nye et al., 2002)、海克頓腸內菌培養基（Hektoen enteric agar, HE）(Taylor & Schelhart, 1971)、亞硫酸鉍培養基（Bismuth sulfite agar, BS）(Pal & Marshall, 2009)、三糖鐵培養基（Triple sugar iron agar, TSI）(Thanes Gunasegaran, 2011)及離胺酸培養基（Lysine iron agar, LIA）(Thong, 2010)。典型的沙門氏菌在 XLD 上呈粉紅色菌落，若非典型菌落則呈黃色；在 HE 上，典型菌落呈藍綠色或藍色，非典型菌落則為黃色；而 BS 上，典型聚落褐色、灰色或黑色，有時會有金屬光澤，且菌落周圍之培養基起初會呈褐色，隨時間增長而轉為黑色，若非典型菌落則呈綠色，周圍的培養基顏色稍深或不變色；在 TSI 培養基斜面呈紅色（鹼性），底部呈黃色或無色（酸性），不一定會產生硫化氫使培養基呈黑色；在 LIA 培養基底部呈紫色（鹼性），且大多會產生硫化氫使培養基呈黑色。依行政院衛生屬公告的《食品微生物之檢驗方法──沙門氏桿菌之檢驗》資料，現行國家標準檢測方法即為遵照上述描述的內容，將 14.

(24) 不同的食材檢體加入特定的非選擇性增菌培養液中培養 24±2 小時，隨後再進行選擇性增菌培養和分離，例如將增菌後的檢體分別接種至 SC 培養液、TT 培養液及 RV 培養液中培養 24±2 小時；再取菌液接種於 XLD、HE 及 BS 等固態培養基，經 35℃下培養 24±2 小時，觀察菌落的外觀型態；之後，再從三種固態培養基上挑出兩個以上被認為是典型的沙門氏菌菌落來進行 TSI 及 LIA 培養基的斜面劃線及穿刺接種，並於 35℃條件下培養 24±2 小時；最後再將斜面培養中有典型反應之菌接種至尿素培養液中進行尿素酶反應試驗，若為負反應（培養液沒有從橘紅轉變為紫色）者則確定為沙門氏菌，再拿來進行血清型及生化分析。依此方法（圖二），估計從採樣到確認食品中是否含有沙門氏菌約耗時 4 至 5 天，再加上血清型及生化分析結果的確認則要等到 6 天之後。除了在選擇性培養基上觀察典型聚落的方法之外，也可於液態培養中偵測細菌生長所產生的代謝物，如一些有機酸、銨離子等會增加溶液導電度，故可透過測量培養液電阻變化；另外，二氧化碳、硫化氫等的產生量也會與細菌濃度相關(Marshall et al., 1999)。此外，細菌體內所含的 ATP 與外加的螢光素（luciferin）反應產生的冷光，也可以做為定量的標準。(Chen et al., 2000; Samkutty et al., 2001)。最確數（Most probable number, MPN）是傳統培養法中常使用的細菌計數法， 15.

(25) 可約略估計樣品中所含活菌的量。將樣品經過一系列的稀釋（不同稀釋倍率做三重覆），經過培養之後，分析每管是否含菌後，再依 MPN 統計對照表可推算出原樣品中的菌數。聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction, PCR）是一種分子生物學方法。用高溫使 DNA 雙股分離，再利用 DNA 聚合酶依模板股從引子開始依序聚合，在試管內（in vitro）模擬 DNA 複製的作用，反覆擴增特定的 DNA 片段的技術。此技術標榜在偵測標的極少的情況下，也能在一小時之內將目標 DNA 放大百萬倍以上。在偵測的專一性部份，選定已知目標生物中較保守的基因設計引子進行擴增，以沙門氏菌的偵測為例，過去 rRNA 基因、穩定 DNA 結構的基因或三羧酸循環（TCA cycle）中的相關酵素基因等皆為常用的目標基因(Chiu et al., 2005; Ye et al., 2011)。實際的應用上，PCR 經過多年來的改良，又發展出多種不同的偵測型式。Multiplex PCR 針對細菌特定基因的不同段序列同時進行放大的作用，以達到同時偵測多種菌株的效果；Real-time PCR（又稱 Q-PCR）則是在每個聚合反應循環後以螢光強度偵測 PCR 產物，再以循環數與生成產物量作出曲線，即時、方便且敏感地得到可定量的數值。此二種偵測方式皆已被廣範應用於細菌的偵測之上(Velusamy et al., 2010) 。 16.

(26) 免疫分析法（Immunoassay）是利用抗體與抗原的結合能力進行定性及定量的生化分析法。酵素連結免疫吸付法（Enzyme-linked immune-sorbent assay, ELISA）常被使用於沙門氏菌的偵測，配合接合在抗體上的酵素、螢光進行呈色反應，並依呈色深淺或螢光強度進行定量分析。檢驗中常使用的 ELISA 方法為三明治法（sandwich ELISA），先在分析盤上固著（coating）第一層專一性抗體，再加入待測樣品使底層抗體吸附目標抗原（可能為全菌或者是單一蛋白）。洗去未附著的物質後，再加入第二層含有標記酵素或螢光的專一性抗體，再洗去未接上的抗體後進行標記的定量。分析中所用的抗體偵測標的包括有 LPS(Blais & Martinez-Perez, 2008; Roesler et al., 2011)、莢膜抗原（capsular antigens）、鞭毛抗原（flagellar antigens）、外層蛋白（outer surface protein）、外毒素（exotoxins）及一些酵素等(Gracias & McKillip, 2004)。除 ELISA 之外，抗體的吸附能力也應用於許多新的分析法上 (Velusamy et al., 2010)。免疫磁珠分離技術（Immuno-magnetic separation, IMS）是一種將專一性抗體固定在磁珠上，加入樣品中吸附抗原的分離方法。雖然較少用在單獨偵測，但在分析成份複雜的樣品時，經過此分離之後可為接下來的分析減少背景訊號或者是基質干擾的問題(Shin & Kim, 2008; Leon-Velarde et al., 2009)。也有將免疫分 17.

(27) 析法與電化學方法（electrochemical method）結合應用，利用三明治酵素免疫分析法的概念，讓抗原被固著在電極上的第一層抗體上，並在第二層專一性抗體上標定上可產生氧還原反應的酵素，如山葵過氧化酶（Horseradish peroxidase, HRP），當第二層抗體辨識被吸附在電極表面的菌體時，標定於抗體上的酵素產生氧化還原反應進行電子轉移，產生的電流訊號便被電極偵測。在操作電化學實驗之前，一般會先以循環伏安法（Cyclic voltammetry, CV）選定氧化或還原電位後，再以固定電位偵測電流訊號強弱以供定量(Yang et al., 2008; Salam & Tothill, 2009)。另有研究將抗體固定在金奈米短棒（nanorod）上，再對檢體進行標定，隨後透過電子顯微鏡的觀察，可在原位（in situ）偵測個別菌體於檢體中的分布情形(Fu et al., 2008)。此外，也有利用表面化學的技術進行沙門氏菌的偵測，如表面電漿（Surface plasmon resonance, SPR）(Mazumdar et al., 2007)及石英共振聲波裝置（acoustic wave device）(Pathirana et al., 2000)等應用。上述三類偵測沙門氏菌的方法中，細菌培養法無論在時間、勞力、實驗空間上都耗費甚巨，且因為有增菌培養的過程，無法準確回推增菌前的濃度，故多半使用於定性而無法準確定量。PCR 方法是個快速且可同時處理大量樣品的方法，但若不配合增菌過程的話，其偵測極 18.

(28) 限則約於 104 CFU/mL 左右(Malorny & Hoorfar, 2005)，且許多文獻會討論到 PCR 不太適宜處理基質過於複雜的樣品，必須配合分離的步驟才能解決樣品中基質對 PCR 反應的影響(Eriksson & Aspan, 2007; Murphy et al., 2007)。免疫檢測方法相對而言操作方便、花費時間短，只要選用的抗體得當便擁有很高的專一性，更重要的是可以同時檢測大量的樣品，所耗費的人力成本可大幅下降。目前 ELISA 檢測的極限約在 104 CFU/mL 到 107 CFU/mL 左右(Gracias & McKillip, 2004; Kumar et al., 2008)，若要提高偵測極限，或許得配合預增菌的培養過程，將細菌濃度提高到抗體可偵測的範圍，另也有些研究使用奈米粒子的技術增加標記的螢光分子訊號量，甚至可將檢測極限降至單一個細菌細胞(Zhao et al., 2004; Fu et al., 2008)。. 五、研究目的沙門氏菌會引起人體的急性腸胃炎，嚴重者可能導致死亡，是引發食物中毒事件的主要病原之一，發展沙門氏菌的快速偵測方法已成為重要的課題。在各種偵測方法中，我們對於免疫偵測方法的開發有極大的興趣，而抗體正是開發免疫偵測法中不可或缺的重要工具，因此，本研究之目的即在於生產可辨識沙門氏菌的單株抗體，並分析其作用特性及探 19.

(29) 討其在檢驗或是基礎研究上的應用潛力；此外，我們也利用本研究所生產的抗體，發展一簡易、快速的沙門氏菌免疫偵測方法，期待能在確定專一性及提升敏感度後，成為替代目前國家標準測定法之新方法。. 20.

(30) 貳、材料與方法. 一、抗原的製備 (1) 細菌的來源與培養條件本研究所使用的各種細菌中，Listeria monocytogenes 為台北市衛生局檢驗室從食品檢體中分離出的菌株、Klebsiella pneumoniae 為環保署環境檢驗所分離出的菌株、Pseudomonas flurescens 為我們實驗室中自己分離出的菌株，而其餘 Salmonella enterica serovar Typhimurium（BCRC 10747）、Salmonella enterica serovar Enteritidis（BCRC 10744）、Escherichia coli（BCRC 10675）、 Bacillus subtilis（BCRC 10255）、Staphylococcus aureus（BCRC 10781）、Streptococcus dysgalactiae（BCRC 12577）、Vibrio parajaemolyticus（BCRC 10806）、Shigella sonnei（BCRC 10773）則皆源自生物資源保存與研究中心（Bioresource Collection and Research Center，BCRC）。使用的培養液方面，Bacillus subtilis、Vibrio parajaemolyticus 及 Shigella sonnei 三種細菌是以 neutrient broth（NB）（配方見附錄二-A）培養，Vibrio parajaemolyticus 的培養液則是添加 3% NaCl 的 NB 培養液，其餘菌株則皆以 lysogency broth（LB）（配 21.

(31) 方見附錄二-B）培養。培養條件上，除 Vibrio parajaemolyticus 及 Pseudomonas flurescens 是培養於 28℃中，其餘菌種皆於 37℃ 下培養。 (2) 超音波破菌條件測試取於 LB 培養液培養至 OD600 約 1.0（細菌濃度約為 109 CFU/mL）之 Salmonella enterica serovar Typhimurium 菌液，以 5000 g 離心 5 分鐘，去除上清液，之後加入 PBS buffer（配方見附錄三-A）回溶至 1010 CFU/mL 濃度。取菌液 0.5 mL 於微量離心管中，將微量離心管置於冰浴中，以超音波均質機（Misonix Ultrasonic cell disruptor XL）的探針伸入液面至約一半深度處，以 6 W 的功率、破菌 20 秒後暫停 40 秒的模式進行循環操作，測試的破菌時間為 10 到 120 秒。為分析破菌處理的效果，將處理後的菌液經稀釋（103 至 106 倍稀釋）後滴 5 μL 於 LB 固態培養盤上，置 37℃經隔夜培養，計算菌落數並回推原始濃度，計算經超音波破菌後的存活率。剩餘的菌液則以 15000 g 離心後，取其上清液，以 Bradford assay 測其中蛋白質濃度。存活率 =. 經超音波破菌後的細菌濃度（. ）. 未經超音波破菌的細菌濃度（. ）. (3) 細菌細胞壁抗原萃取 22. × 100%.

(32) 取培養至 OD600 = 1.0 的沙門氏菌菌液 1 mL 至 100 mL 的 LB 培養液過夜培養，將菌液以 5000 g 離心 10 分鐘，倒去上層培養液，保留底部細菌顆粒，加入 5 mL PBS 重新懸浮，進行三次離心清洗，最後將細菌顆粒重新懸浮至 3 mL 含有 1% Triton X-100 的 Tris buffer（50 mM Tris, 1% Titon X-100, pH 7.0）中，置於 4 ℃中震盪萃取 24 小時。之後以 5000 g 離心 10 分鐘後，保留上清液於 4℃下與 Tris buffer 進行透析 24 小時，透析過後的樣品再進行冷凍乾燥，最後將乾燥後的物質回溶至 100 μL 的 PBS 中，進行 Bradford assay 定量及保存。 (4) 蛋白質定量本研究中以 Bradford assay 進行蛋白質定量分析，以 0 μg/mL、 20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL 及 100 μg/mL 的 Bovine serum albumin（BSA, Sigma A7960）為標準品，而待測樣品進行系列稀釋後，將標準品與稀釋後的樣品分別取 50 μL 加入 96 孔盤中，再各加入 200 μL Bradford reagent（配方見附錄三-I），靜置 10 分鐘後，以 ELISA reader 讀取每個分析孔於 595 nm 波長之吸光質。隨後繪出 BSA 標準品濃度與吸光值的標準曲線，用以計算樣品的蛋白質濃度。. 23.

(33) 二、單株抗體的生產 (1) 小鼠免疫注射將 Balb/c 母鼠（購自國家實驗研究院實驗動物中心，Balb/c 母鼠，6 週齡）分為兩組，每組三隻。第一組注射抗原為經超音波處理 80 秒後煮沸殺菌 5 分鐘的菌體，第二組小鼠則注射沙門氏菌細胞壁萃取物。第一次注射，第一組取來自 108 CFU 菌量之抗原，第二組取 100 μg 抗原，皆分別溶於 75 μL PBS buffer 中，加入 75 μL Freund’s Complete Adjuvant 做為佐劑，充份乳化後，以皮下注射 6 針（每針 20 μL），腹腔注射 1 針（每針 30 μL），注射於小鼠體內。經一個月後進行第二次注射，取與第一次注射等量抗原，溶於 75 μL PBS buffer 中，惟佐劑改使用 75 μL Freund’s Incomplete Adjuvant，充份乳化後，以與第一針相同方式分別注射於小鼠體內。第二次注射後經 15 日後進行激發注射（booster injection），第一組取來自 5×107 CFU 菌量的抗原，第二組取 50 μg 抗原，溶於 50 μL PBS buffer 中，不加任何佐劑直接以腹腔注射於小鼠體內。 (2) 細胞融合將經過激發注射過三日的小鼠，以頸椎脫臼法犧牲後，以心臟刺穿採取鼠血。之後將小鼠以 70%酒精充份潤溼後移至無 24.

(34) 菌操作台進行以下步驟。取出小鼠脾臟並以 IMDM（GIBCO 12200-036）沖洗出內部細胞，與骨髓癌細胞（myeloma cell）混充分合，以 50%之 PEG1500（Boehringer Mannheim 783641）使兩種細胞進行融合。隨後將細胞懸浮於 50 mL IMDM + 20%胎牛血清（Hyclone SH30071.03）+ 10% HAT（Sigma H0262）的培養液中，滴於 96 孔培養盤中，置於培養箱中，以 37℃及 5%二氧化碳濃度的條件下培養約 10 天。另外，將細胞融合前取的鼠血放置於 4℃過夜使其血清血球分層後，吸取血清加入 0.02% NaN3 保存。 (3) 融合瘤細胞的篩選本研究中以 ELISA 來進行融合瘤細胞篩選。以 borate saline （配方見附錄三-B）配製 108 CFU/mL 之沙門氏菌抗原（經超音波破菌處理），於 96 孔盤中每孔加入 50 μL，置於 4℃下 coating 過夜。隔日以 ELISA wash buffer（配方見附錄三-C）沖洗 96 孔盤後，每孔加入 180 μL 之 ELISA blocking buffer（配方見附錄三 -D），於室溫下靜置 2 小時。隨後以 ELISA wash buffer 沖洗三次，於無菌操作台中吸取融合瘤細胞培養液 50 μL 作為一級抗體，在室溫下反應 2 個小時後，以 ELISA wash buffer 沖洗三次，每孔再加入以 ELISA diluents buffer （配方見附錄三-E）5000 倍稀釋 25.

(35) 之 RAM-AP（Rabbit-anti-mouse immunoglobin alkaline phosphatase labeled, Sigma A4312）50 μL 為二級抗體，於室溫下反應 2 個小時。以 ELISA wash buffer 三次沖洗後，每孔加入 50 μL 之 p-nitrophenly phosphate（pNPP）受質（配方見附錄三-G）在室溫下進行呈色 1 個小時，隨後將 96 孔盤以 ELISA reader 偵測分析孔中溶液於 405 nm 與 490 nm 吸光值之差值，最後保留分祕抗體吸光值高於 0.1 的融合瘤細胞株繼續培養。 (4) 融合瘤細胞的選殖將經 ELISA 實驗篩選出之細胞株培養至長滿培養孔，以無菌滴管將細胞與培養液混合均勻後，吸取少量細胞液，以血球計數器計算細胞濃度後，取約 80 個細胞的培養液加入 6.5 mL 的 IMDM + 20%胎牛血清 + 10% HT 的培養液中，分別滴於 96 孔培養盤中，置於培養箱中，以 5%二氧化碳濃度於 37℃下培養約 10 天。於顯微鏡下挑出恰好只長出一個細胞團落的培養孔，吸取其培養液做 ELISA 試驗篩選（步驟見 25 頁）。保留正反應的細胞株大量培養，並收取含有單株抗體之培養液以 500 g 離心 5 分鐘，收集上層培養液，加入 0.02%的 NaN3 保存，以進行後續純化與分析。. 26.

(36) 三、單株抗體的純化與分析 (1) 單株抗體的濃縮與 protien A/G 親和性管柱純化將從細胞培養中收取的培養液量取體積後進行 50%的硫酸銨沉澱，隨後以 15000 g 離心 30 分鐘，再加入培養液 1/20 初始體積的 PBS 回溶沉澱物，並以 15000 g 離心 15 分鐘，取其上清液進行 protein A/G 純化。以 10 倍 protein A/G（Pierce 20422）膠體體積之 PBS buffer 流過管柱進行清洗，隨後以兩倍膠體體積 pH 2.5 的 Gly-Cl 溶液進行 fake elution 後，再以 20 倍膠體體積之 PBS 清洗管柱。再來將經過硫酸銨濃縮之培養液通過 protein A/G 管柱（保留住流出液），隨後以 20 倍體積之 PBS 通過管柱，清洗去除未專一性結合於膠體上之成分。隨後加入 2 倍膠體體積之 pH 2.5 的 Gly-Cl 溶液進行流洗，將流出液每 1 mL 收集一管（每管事先加入 0.2 mL 之 pH8.5 的 Tris-Cl 溶液），待 Gly-Cl 溶液流完則加入 PBS 繼續收集，約收集 10 管後再以 20 倍膠體體積之 PBS 清洗管柱。測量每管收集液 OD280 吸光值，並收集吸光值超過 0.036 之流出液。將已通過管柱之濃縮培養液再重複進行上述通管柱、清洗、流洗、清洗的過程，直到收集液中吸光值最高的一管低於 0.1 後，將流出的培養液再進行一次 50%的硫酸銨沉澱，濃縮 27.

(37) 為 1/20 體積，經澄清後再重複進行通管柱和流洗的流程，直到收集液中吸光值最高的一管再度低於 0.1 即可停止。將所有收集液集中後，進行 50%硫酸銨沉澱，最後盡量以最少體積的 PBS 進行回溶。以 15000 g 離心澄清化後，取出 80 μL 以 PBS 進行 10 倍稀釋，測其 OD280 值以下列公式換算出抗體的濃度，並加入 0.02% NaN3 分裝待用。. C. ：抗體濃度(mg/mL). A. ：280 nm 吸光值：抗體消光系數 1.36 (cm-1mg-1mL). b. ：光徑長 1 (cm). (2) 沙門氏菌單株抗體對不同菌株的專一性分析將選用的 12 種菌株養至 OD600 約為 1.0 時，以 5000 g 離心 5 分鐘，之後倒去上清液，加入 PBS 清洗後，再以 PBS 將菌液重新懸浮至濃度為 5×109 CFU/mL，以超音波均質機處理 100 秒後煮沸 5 分鐘殺菌。再來以 borate saline 將菌液稀釋至 108 CFU/mL，取 50 μL 加入 96 孔分析盤中，置於 4℃ coating 過夜。以 ELISA wash 沖洗三次後，加入 1 μg/mL 純化後的沙門氏菌單株抗體 50 μL 為一級抗體反應 1 個小時。隨後用 ELISA wash 28.

(38) buffer 三次沖洗後，再加入以 ELISA diluent buffer 稀釋 10000 倍之 GAM-AP（goat-anti-mouse Ig alkaline phosphatase labelled）（Sigma A1418）做二級抗體反應 1 個小時，最後加入 pNPP 受質呈色 1 個小時，於 ELISA reader 偵測 405 nm 及 490 nm 吸光值之差值。 (3) 沙門氏菌單株抗體 isotyping 以 Southern Biotechnology Association 生產之 isotyping kit （5070-04）進行抗體 isotype 分析。將 GAM（goat-anti-mouse Ig）以 borate saline 稀釋至 3 μg/mL，取 50 μL 加入 96 孔盤中置 4℃ 下 coating 過夜。隔日以 ELISA wash buffer 沖洗 96 孔盤後，加入 180 μL 之 ELISA blockin buffer，於室溫下靜置 2 小時。經三次沖洗，以我們生產之沙門氏菌單株細胞培養液為一級抗體反應 1 個小時後，再沖洗三次，加入 50 μL GAM-AP、GA-IgG1-AP、 GA-IgG2a-AP、GA-IgG2b-AP、GA-IgG3-AP、GA-IgM-AP、 GA-κ-AP、GA-λ-AP（以 ELISA diluents buffer 稀釋 500 倍）為二級抗體。1 個小時後，經三次 ELISA wash buffer 的沖洗，加入 pNPP 受質進行呈色 30 分鐘，於 ELISA reader 中讀取 405 nm 與 490 nm 吸光值之差值。 (4) 單株抗體能否吸附細菌表面的測試 29.

(39) 將沙門氏菌菌液（109 CFU/mL）分裝至微量離心管中，每管各 1 mL，以 5000 g 離心 5 分鐘，倒去上清液後，分別加入 25 μg 純化之沙門氏菌單株抗體，並保留一管則不加入任何抗體，每管再加入 25 μL ELISA blocking 溶液，最後將體積皆以 PBS 補至 250 μL，置於 28℃下震盪反應 2 小時。隨後以 2000 g 離心 5 分鐘，保留底部細菌顆粒，以 PBS 重複離心清洗三次，最後加入 100 μL 2 倍 SDS sample buffer（配方見附錄三-J）回溶，加熱煮沸 5 分鐘後以 13000 rpm 離心 10 分鐘並保留上層液。將保留的上層液取 10 μL 以 120 V 的電壓進行 12% SDS-PAGE 電泳，之後進行 electroblotting 將膠上蛋白以 40 V 電壓轉至 NC membrane 上 30 分鐘。將此膜以 ELISA blocking 溶液中於室溫浸泡 1 個小時後，將轉漬過之 NC membrane 浸泡於以 ELISA diluent buffer 進行 5000 倍稀釋之 RAM-AP 做為一級抗體，反應 1 個小時，經 ELISA wash buffer 沖洗二次後，浸泡於 Western substrate buffer（配方見附錄三-H）中 15 分鐘，再加入 BCIP 及 NBT 做為受質進行呈色。 (5) 抗原是否為 LPS 的分析本研究中採用 Ronholm et al. 於 2011 年發表的文章中所使用的「苯酚－水（phenol-water）」的二相萃取法進行了細菌 LPS 30.

(40) 的粗萃取以供測試。將沙門氏菌經過夜培養後，以 5000 g 離心 10 分鐘，最後以 PBS 回溶於與初始體積相等的滅菌水中，置於 70℃水浴中 10 分鐘，再加入等體積預熱至 70℃的 90%水飽和 phenol（amresco 0945），於 70℃水浴之下劇烈搖晃 20 分鐘（確認劇烈搖晃後水層與苯酚層混合呈現乳白色狀），隨後迅速降溫至 10℃，再以 5000 g 離心 10 分鐘。抽取水層保存，並將 phenol 層加入等體積的滅菌水後，於 70℃水浴之下依前述步驟進行再次萃取，降溫離心後，亦抽取水層保留。將兩次萃取的水層收集在一起，對水透析過夜後進行冷凍乾燥，最後以 50 μL 二次水回溶保存。取 10 μL 前述萃取物，與 5 μL 三倍 SDS sample buffer 混合，再加入一倍 SDS sample buffer 將體積至最終體積為 100 μL，於沸水中處理 5 分鐘，以 120 V 電壓進行 15%的 SDS-PAGE 電泳後，隨後進行 electroblotting 將膠上的物質以 40 V 電壓轉至 NC membrane 上 30 分鐘。同時取超音波破菌處理後的上清液 10 μg 於 SDS sample buffer 中，以沸水處理 5 分鐘後，進行 12%的 SDS-PAGE 並進行轉漬。將兩張轉漬完成的 NC membrane 以 ELISA blocking 溶液於室溫浸泡 1 個小時，將 membrane 縱切成 3 mm 寬的長條，分別 31.

(41) 以 1 μg/mL 沙門氏菌單株抗體為一級抗體反應 1 個小時。經 ELISA wash buffer 潤洗二次之後，加入以 ELISA diluent buffer 稀釋 10000 倍之 GAM-AP 為二級抗體反應 1 個小時，再以 ELISA wash buffer 潤洗二次，隨後浸泡於 Western substrate buffer 中 15 分鐘，最後以 NBT 及 BCIP 為受質呈色約 10 分鐘至 1 個小時。 (6) 沙門氏菌單株抗體間的競爭性分析取 50 μL 經超音波破菌處理且煮沸 5 分鐘的菌液（106 CFU/mL，溶於 borate saline）加入 96 孔分析盤，於 4℃下 coating 過夜。隔日以 ELISA wash buffer 沖洗三次後，加入濃度為 1 μg/mL 之沙門氏菌單株抗體單獨偵測（I-1～IV-3）及兩兩皆以 1 μg/mL 濃度混合（I-1 與 II-1、I-1 與 III-1…至 IV-2 與 IV-3 共 21 組）的溶液各 100 μL，反應一個小時。經三次 ELISA wash buffer 沖洗後，加入 50 μL 經 10000 倍稀釋之 GAM-AP 做為二級抗體反應一個小時。再經三次 ELISA wash buffer 的沖洗，最後以 pNPP 受質呈色一個小時，用 ELISA reader 偵測 405 nm 及 490 nm 吸光值之差值。 (7) 沙門氏菌單株抗體的效價分析取 50 μL 經超音波破菌處理的菌液（108 CFU/mL，溶於 borate saline）加入 96 孔分析盤於 4℃下 coating 過夜。以 ELISA 32.

(42) wash buffer 沖洗三次，將沙門氏菌單株抗體以 ELISA diluent buffer 稀釋成 0.01、0.1、1 及 10 μg/mL 做為一級抗體反應 1 個小時。經三次沖洗後，加入以 ELISA diluent buffer 稀釋 10000 倍之 GAM-AP 為二級抗體反應一個小時，三次沖洗後，以 pNPP 受質呈色 1 個小時，用 ELISA reader 讀取 405 nm 及 490 nm 下吸光值的差值。. 四、沙門氏菌免疫偵測方法的探討 (1) Direct ELISA 的分析將沙門氏菌培養至 OD600 約等於 1.0 的菌液，以 5000 g 離心、倒去上清液後，加入等體積 PBS 回溶，後分成兩組，一組經過煮沸殺菌 5 分鐘後以 borate saline 稀釋為 103 至 108 CFU/mL，另一組則不經煮沸直接稀釋相同的倍率，將兩組稀釋好的菌液加取 50 μL 加入 96 孔盤中，於 4℃下 coating 過夜。隔日經 ELISA wash buffer 沖洗三次，再加入 1 μg/mL 沙門氏菌單株抗體為一級抗體反應 1 個小時。再經三次 ELISA wash buffer 沖洗，加入 10000 倍稀釋之 GAM-AP 為二級抗體反應 1 個小時。隨後經 ELISA wash buffer 沖洗三次，最後以 50 μL 之 pNPP 受質呈色 1 個小時，用 ELISA reader 讀取 405 nm 及 490 下吸光值之差值。 33.

(43) (2) Microfuge tube immunoassay 的分析取 1.5 mL 微量離心管，加入 1.5 mL ELISA blocking buffer，置於 4℃下過夜後將 ELISA blocking 溶液甩乾。分別加入經過煮沸處理 5 分鐘的沙門氏菌菌液 106、105、104 、103 CFU/mL 四種濃度各 1.5 mL，以 10000 g 離心 5 分鐘後，倒掉上清液並倒置微量離心管於紙巾上使其將殘留液沾乾。隨後加入 10 μg/mL 我們生產的沙門氏菌單株抗體、5000 倍稀釋之 GAM-AP 及 5000 倍稀釋之 RAG-AP 各 50 μL，充份混合後，於室溫下震盪反應 1 個小時，以 10000 g 離心 5 分鐘，倒去上清液以 1.5 mL ELISA wash buffer 回溶並再以 10000 g 離心，重覆此清洗、離心步驟三次，最後一次離心後倒去上清液並倒置於紙巾上沾乾。每管加入 pNPP 受質各 100 μL，混合均勻後於室溫下反應一個小時，各吸出 50 μL 加入 96 孔分析盤中，於 ELISA reader 讀取 405 nm 及 490 nm 下吸光值之差值。. 34.

(44) 參、結果. 一、抗體的製造 (1) 抗原的製備本研究選用 Salmonella enterica serovar Typhimurium 做為生產沙門氏菌單株抗體的菌株，因為該菌株是造成台灣食品中毒事件的最主要血清型(Hsueh et al., 2004)。我們共採用兩種抗原製備方式：一是以含 Triton X-100 的緩衝液溶出細菌細胞的表面成份，另外也將細菌直接以超音波震破，將所得的細胞內外成份均用作為免疫注射的抗原。在表面抗原的溶取方面，我們希望能生產辨識細菌表面抗原的單株抗體，如此未來不但可能作為研究細菌表面結構與致病性的工具，當應用於細菌偵測時，樣品便不必先經過破菌處理，可簡化偵測的步驟。由於 Salmonella enterica 等革蘭氏陰性菌的細胞璧肽聚糖之外，尚有一層由雙層磷脂所構成的外層膜（outer membrane），其上嵌有許多蛋白質及脂多糖。為了溶出這些曝露在細菌最表層的抗原，我們利用含有介面活性劑 Triton X-100 的緩衝溶液浸泡菌液，試圖破壞外層膜脂雙層的結構，將其上的抗原溶出。將混合沙門氏菌的溶液搖晃過夜後，離心將菌體沉於底 35.

(45) 部，取其上清液再進行透析以去除 Triton X-100 的成份，即取得細胞表面的溶出物。超音波破菌處理之目的，是希望製備細菌內部、外部的個種抗原成份，使我們有更高的機會篩選得到專一辨識沙門氏菌的單株抗體。為了確認超音波破菌處理的完成程度，本研究從兩方面來探討──細菌的存活率與釋出之水溶性蛋白的濃度。由圖三結果可知，超音波處理時間為 10 至 40 秒範圍時，隨著處理的時間增加，細菌的存活率遞減，菌液中水溶性蛋白質的濃度也隨破菌處理時間的增加而上升。超音波處理時間達 80 秒之後，細菌存活率便無顯著變化，水溶性蛋白質的濃度亦維持在約 2.65 mg/mL 而不再有顯著變化。由此可推知，超音波處理 80 秒之後，大部份細菌皆已被打破，細胞內部的蛋白質也被釋放出來，所以再延長處理時間所釋出的蛋白質也不會再增加。故本研究的抗原製備，除了使用細胞壁溶出成分之外，也使用經超音波破菌處理 80 秒後的菌液。比較兩種抗原製備方式的結果（圖四）顯示，以 Triton X-100 緩衝液溶出的細胞成分多分布於 70 kDa 以下，而超音波處理的細菌成分則主要分布在 100 kDa 至 23 kDa 之間，二者的成分似 36.

(46) 有部份重疊，但含量比例不盡相同。. (2) 單株抗體的製造與篩選單株抗體生產過程中，每一階段的細胞篩選株數與呈陽性反應的細胞株數如表二。第一次細胞融合實驗的小鼠，其注射的抗原為 Triton X-100 緩衝液的溶出物，細胞融合後滴於 96 孔培養盤中，約有 77.9%的培養孔中長出融合成功的細胞；第二次及第三次細胞融合實驗的小鼠，其注射的抗原為經 80 秒超音波破菌處理後的菌液，培養盤中分別有 6.7%及 46.7%的培養孔長出融合成功的細胞。第二次細胞融合的成功率偏低，推測其原因可能為使用的 HAT 培養液存放時間過久，導致所含的 aminopterin 的效果減弱，使得未融合成功的骨髓癌細胞之生長未受到抑制，因而影響融合瘤細胞生長，導致可被篩選的細胞株量減少。最後，三次細胞融合實驗的結果，共選殖出 7 株能分泌辨識沙門氏菌抗體之細胞株。. 37.

(47) 表二、生產沙門氏菌單株抗體各階段的結果. 註：(+)代表經篩選後呈陽性反應的細胞株數。. 二、抗體的特性分析 (1) 沙門氏菌單株抗體對不同菌株的專一性分析為進一步瞭解本研究所生產的 7 株單株抗體之特性，我們進行這些抗體對不同菌種能否作用的測試。我們共選取 10 種菌種，其中包含 4 種革蘭氏陽性菌和 6 種革蘭氏陰性菌。此外，也測試包含 Typhimurium 和 Enteritidis 在內的 3 種沙門氏菌血清型。進行測試的方法上，我們採用 direct ELISA 的模式：coating 的抗原為 108 CFU/mL 經過超音波破菌處理的各種細菌，一級抗體為我們生產的單株抗體，二級抗體為 GAM-AP 的 10000 倍稀釋液，最後加入 pNPP 為呈色受質。由於有些抗體可能無法直接與細菌顆粒結合，故我們先不以全菌做測試，此外，由於 RAM-AP 的兔子抗體與 Staphylococcus aureus 細胞壁上之 protein A 以及 Streptococcus dygalactiae 細胞壁上的 protein G 有較強的非專一 38.

(48) 性結合能力，而山羊抗體對此兩種蛋白的非專一性結合能力則較低(Langone, 1980)，為了減少非專一性反應的偽陽性結果，故在此使用 GAM-AP 做為二級抗體。由圖五可見，抗體 10F2 無論對我們所測試的革蘭氏陰性或陽性菌都會產生反應，然而反應的強度不盡相同，普遍而言，對革蘭氏陰性菌的反應強度較對陽性菌為高［圖五：(e)］；抗體 5D11 除了會辨識我們當初注射至小鼠體內之 Salmonella enterica 的各種血清型之外，對於 Shigella sonnei 及 Escherichia coli 二菌種亦可作用，但對同屬腸菌科的 Klebsiella pneumoniae 則不會反應［圖五：(b)］；而 1C6 及 11D12 兩種抗體，除了對 Salmonella enterica 之外，並不會與其他菌種作用；其中 11D12 對 Staphylococcus aureus 有微弱的訊號，由之後的 isotyping 分析（表四）可知，11D12 的 isotype 為 IgG3，該訊號應是小鼠的 IgG3 抗體 Fc 部位與 Staphylococcus 表面的 protein A 作用吸附力之結果。進一步測試 1C6 及 11D12 對 Salmonella 不同血清型的專一性時，則發現該二株抗體對 Typhimurium 及 Enteritidis 兩種血清型皆會辨識［圖五： (a)、(f)］；7F7、8G8 及 11E1 三株抗體只對 Salmonella enterica serovar Typhimurium (O : 4, 5, 12)有明顯的作用訊號，對其餘菌種則皆無反應，對同為 Salmonella enterica 的另一血清型 Enteritidis， 39.

(49) 甚至對同是 Typhimurium 血清型但表面 O 抗原略有差異的菌株亦都無法辨識［圖五：(c)、(d)、(g)］。依照上述各單株抗體對不同菌種作用的特性差異，我們將此 7 株抗體分成四大群（I～IV），且為了方便後續的描述，故將此 7 株抗體重新命名，並將相關資料整理如表三。. 40.

(50) 表三、沙門氏菌單株抗體對各菌株的作用力比較結果. Designated name (Original name) Bacteria (Gram ＋/－). I-1 (10F2). II-1 (5D11). III-1 (11D12). III-2 (1C6). IV-1 (8G8). IV-2 (11E1). IV-3 (7F7). +. －. －. －. －. －. －. Listeria monocytogenes (＋). ++. －. －. －. －. －. －. Staphylococcus aureus (＋). +. －. +. －. －. －. －. Streptococcus dysgalactiae (＋). +. －. －. －. －. －. －. Vibrio parahaemolyticus (－). ++. －. －. －. －. －. －. Pseudomonas fluorescens (－). +. －. －. －. －. －. －. Klebsiella pneumoniae (－). +. －. －. －. －. －. －. Shigella sonnei (－). ++. ++. －. －. －. －. －. Escherichia coli (－). ++. ++. －. －. －. －. －. Bacillus subtilis (＋). Salmonella enterica (－) －－－ ++ ++ + + serovar Enteritidis (O : 1, 9, 12) Salmonella enterica (－) ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ serovar Typhimurium (O : 4, 5, 12) Salmonella enterica (－) －－－ ++ ++ ++ ++ serovar Typhimurium (O : 4, 12) 註：在同次 ELISA 實驗中，訊號高於 1.5 者標為「+++」，介於 1.5 至 0.5 之間者標文「++」，介於 0.5 至 0.1 者為「+」，訊號低於 0.1 者標為「－」 41.

(51) (2) Isotyping 我們以各種 isotype-specific 的抗體對生產出的 7 株單株抗體進行 isotyping 分析，結果如表四。其中 4 株抗體的重鏈為 IgG1， 2 株為 IgM 及 1 株 IgG3，輕鏈則全部皆為 κ。. 表四、七株沙門氏菌單株抗體的 isotyping 結果 Isotype Designated name. Heavy chain. Light chain. IgM IgM IgG3 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1. κ κ κ κ κ κ κ. I-1 II-1 III-1 III-2 IV-1 IV-2 IV-3. (3) 單株抗體能否吸附細菌表面的測試為瞭解本研究生產的單株抗體是否會與細菌表面結合，我們進行免疫沉澱實驗（圖六）。實驗過程中，我們取 25 μg 的沙門氏菌單株抗體（250 μL 體積）與 109 CFU 未經破菌處理的沙門氏菌混合反應 2 小時，之後，進行三次重複離心及 PBS 清洗的步驟，並於沉澱的細菌樣品中，加入 100 μL 的 2 倍 SDS sample buffer，經煮沸 5 分鐘以破壞抗體與抗原間的結合後，將細菌顆粒再次離心，並取上層的 SDS sample buffer 進行 SDS-PAGE 分離及電泳轉漬操作，以 5000 倍稀釋之 RAM-AP 進行免疫染色。若我們的抗體會與細菌表面的抗原結合，則在進行 PBS 清洗的過程中，抗體會因吸附於細菌表面而不會隨 PBS 被移除，最後在進行免疫轉漬實驗時，則會在重鏈（約 50 kDa）與輕鏈（約 25 kDa）的位置產生訊號［圖六：(a)］；反之，若抗體辨識的為 42.

(52) 細胞內的抗原或者是分泌性的抗原，由於不會吸附在細菌表面，在以 PBS 清洗時便會被我們移除，故最後在進行免疫染色時不會有任何訊號出現［圖六：(b)］。由圖七的結果可知，II-1、III-1、III-2、IV-1、IV-2 及 IV-3 六株抗體的實驗樣品在重鏈及輕鏈處皆有明顯的訊號，並與僅 loading 純抗體的分子量大小相等，顯示此六株抗體皆確實能隨沙門氏菌顆粒一起沉澱下來，抗體辨識的表位應是分布細菌細胞的表面；僅有抗體 I-1 於免疫染色時，經免疫沉澱後的樣品無任何訊號，顯示其並無法與細菌顆粒共沉澱，辨識的可能為細胞內或分泌性的的抗原。 (4) 抗原是否為 LPS 的分析我們也利用免疫染色來分析單株抗體所辨識的抗原成分。首先，我們以破菌樣品的上清液做為分析之標的，由圖八：(a)的結果顯示：III-2、IV-1、IV-2 及 IV-3 四株抗體所辨識的樣式（pattern）相似，皆為在 60～110 kDa 的範圍內的多個條帶；而 II-1 及 III-1 兩株抗體則在小於 15 kDa 的低分子量位置辨識單一條帶；而 I-1 則無法辨識到任何抗原，推測原因可能是在進行 SDS-PAGE 的處理過程中，破壞了這株抗體可辨識的表位之故。為了進一步確認抗體所辨識的抗原成分，我們也以萃取 LPS 進行免疫染色分析。由結果［圖八、(b)］可清楚看出，III-2、IV-1、 IV-2 及 IV-3 四株抗體辨識 18～50 kDa 範圍的階梯狀條帶，根據前人研究(Ronholm et al., 2011)可知，此階梯狀條帶的分布樣示為細菌細胞壁上 O 抗原的典型特徵；此外，I-1、II-1 及 III-1 三株抗體皆無法對萃取的 LPS 作用，故可推論此三種抗體的抗原與 LPS 無關。 43.

(53) (5) 沙門氏菌單株抗體間的表位競爭性分析我們也想知道本研究所生產的單株抗體，其所辨識的表位是否相同或是非常接近，另外也為了確認未來應用於偵測方法的開發時，可否將不同抗體混合使用，以增強偵測的訊號強度，我們於是設計 competitive ELISA 的實驗來進行分析。在 competitive ELISA 實驗中，我們先 coating 經超音波破菌處理的沙門氏菌（106 CFU/mL，使用 50 μL/well），一級抗體則分別由沙門氏菌單株抗體（1 μg/mL，50 μL/well）單獨進行反應，或將測試的抗體兩兩混合作用。結果可用圖九的示意圖進行推論，當兩抗體所辨識的表位無競爭關係時，混合偵測的訊號約會等於兩抗體單獨偵測訊號的和［圖九：(a)］；若兩抗體所辨識的表位相同或是接近，因而產生表位的競爭關係，則兩抗體混合偵測的訊號則會小於單獨偵測訊號的和［圖九：(b)、(c)］。根據實驗結果［圖十：(a)～(u)］（表五）可知，I-1 與所有其他單株抗體間皆無表位競爭的情況，而其餘六株單株抗體之間則皆有表位競爭的情形，其中以 II-1 和 III-1 之間、III-2、IV-1、 IV-2 和 IV-3 之間的競爭情形最為顯著。在先前的實驗結果中（圖七），我們已知 I-1 並非辨識沙門氏菌表面的抗原，而其餘六株則是，故可以合理解釋 I-1 不會與其他六株抗體發生表位競爭作用；II-1 及 III-1 在免疫染色的分析中呈現相似的結果（圖八），故有可能辨識相近的抗原表位；III-2、IV-1、IV-2 及 IV-3 四株抗體辨識的皆是 O 抗原，雖然 III-2 所認的與其餘三株不同，但 O12 與 O5 的結構間有相當的重疊，故也可能會互相競爭。. 44.

(54) 表五、沙門氏菌單株抗體間的競爭作用結果. 註：「N」代表對應兩抗體間無競爭抗原的情況；「Y」指兩抗體間會有競爭抗原的情況；標示「**」者代表兩抗體間競爭訊號與無競爭之理論值相差 5%以上；標示「*」者代表兩抗體間競爭訊號與無競爭之理論值間雖有顯著差異，然而訊號相差在 5%以內。各組 competitive ELISA 結果詳見圖十. (6) 沙門氏菌單株抗體的效價分析為瞭解本研究生產之單株抗體對沙門氏菌的作用強度，我們利用 coating 固定抗原濃度（經超音波破菌處理之菌液，濃度為 108 CFU/mL，使用 50 μL/well），但改變抗體的濃度（0.01 μg/mL 至 10 μg/mL），來比較七株抗體與抗原的結合能力。由圖十一的結果可見， I-1 及 III-1 兩株抗體的濃度減少至 0.1 μg/mL 時，其訊號即與負對照組接近，其餘五株抗體的濃度則在降為 0.01 μg/mL 時，才與負對照組的訊號相似。七株抗體的使用濃度為 1 μg/mL 時，其對抗原的作用訊號皆已到達飽和，其中 I-1、II-1 及 III-1 三株抗體的飽和訊號較低，約在 0.5 至 0.7 之間，而 III-2、 IV-1、IV-2 及 IV-3 四株抗體的飽和訊號較高，約為 2.5 至 3.0 之間。 45.

(55) 三、沙門氏菌免疫偵測方法的探討 (1) Direct ELISA 的分析結果最簡易的細菌免疫偵測法多採 direct ELISA 的方式，該方法是將抗原直接 coating 於 96 孔盤中，再加入可辨識細菌之抗體做為一級抗體進行偵測。在探討 direct ELISA 的偵測極限之前，我們先分析熱處理細菌對抗體偵測效果的影響。由實驗結果［圖十三：(a)～圖十八： (a)］可知，相較於未煮沸處理的沙門氏菌樣品，II-1～IV-3 六株抗體對煮沸過的樣品有較強烈的訊號，以 coating 的細菌濃度為 108 CFU/mL 為例，煮沸樣品的訊號為活菌訊號的 2～7 倍，故本研究之後的 direct ELISA 測試，皆以先經煮沸處理的沙門氏菌為樣品。抗體 I-1 辨識的抗原並非位於細菌表面，並須經破菌處理才可被偵測，故並沒有進行抗原煮沸處理的測試。依先前的實驗結果（圖十一），我們所生產的七株抗體在使用濃度為 1 μg/mL 時，其偵測訊號會達到飽和，於是我們固定該抗體濃度，並降低 coating 於 96 孔分析盤中的細菌濃度，以測試 direct ELISA 可偵測到的最低細菌濃度。由 ELISA 結果［圖十二、圖十三：(b)～圖十八：(b)］可知， I-1、II-1、III-1 及 IV-1 四株抗體的抗原偵測極限約在 105 CFU/mL 到 106 CFU/mL 之間（訂偵測極限為訊雜比 S/N≧3）；而 III-2、 IV-2 及 IV-3 三株抗體的抗原偵測極限則約為 105 CFU/mL。. (2) Mircrofuge tube immunoassay 的分析結果除了 Direct ELISA 的分析之外，本研究也試圖開發更為簡便的細菌免疫偵測法──Microfuge tube immunoassay。本偵測法的 46.

(56) 操作方法如圖十九，我們將細菌樣品加入於微量離心管中，再藉離心方式將細菌顆粒沉澱管底，隨後倒去上層液，再同時加入我們生產的單株抗體、GAM-A 及 RAG-AP 進行反應，最後經過三次離心與清洗後，加入 pNPP 受質呈色。由結果（圖二十）可以看到 Microfuge tube immunoassay 方法在偵測 104 CFU/mL 的細菌樣品時，其呈現之訊號仍有顯著差異且大於負對照組之 3 倍數值，然而在偵測 103 CFU/mL 的樣品時訊號已與負對照阻無顯著差異（p<0.05），故我們認為此 Microfuge tube immunoassay 可將偵測極限降至 104 CFU/mL。. 47.

(57) 肆、討論一、單株抗體的製造──免疫注射的抗原種類與劑量探討在生產免疫偵測細菌所需的抗體前，首要考慮的是抗原的製備方式。我們希望能篩選出能專一性地辨識沙門氏菌的單株抗體，以提高偵測的專一性，降低偽陽性的可能。另一方面，也希望此抗體在應用上能盡量減少樣品的前處理，使得發展出的偵測法能快速且簡便。目前細菌的抗體生產上，有些研究會以經煮沸、福馬林處理及紫外光處理等方法使細菌死亡後進行注射（表七），有些研究則以表面的 O 抗原為目標，將 LPS 萃取出來後才進行免疫注射。我們的考量是若能生產出可辨識細菌表面抗原的抗體，則未來進行沙門氏菌檢體之分析時，將可免除破菌的處理程序而減少時間花費。在此考量下，我們期盼製備細菌的表面成分作為抗原，因此採用的策略之一是以含界面活性劑 Triton X-100 的緩衝液來溶洗出細菌的表面成分(Schnaitman, 1971)，以做為動物免疫注射的抗原。然而，實驗結果顯示（圖七），第一次細胞融合實驗篩選出來的兩株抗體（I-1 及 IV-1）中，I-1 抗體所辨識的抗原並非分布於細菌表面，推測原因可能是在溶洗過程中，我們未先將細菌煮沸殺死，因此部份細菌仍會分泌蛋白質於溶洗液中，除此之外，若細菌因死亡而破碎，則會導致細胞內成分外露。我們的第二種抗原製備策略是將細菌以超音波震盪的方式打破，使細胞內外的抗原全部釋放，如此將可提升篩選出沙門氏菌專一性抗體的機率。在進行破菌步驟時，我們設定的目標是在使細菌釋出細胞內的抗原，但並不希望將菌體過度破碎化，以利辨識表面抗原之抗體的生成。依測試實驗的結果（圖三），超音 48.

(58) 波處理 80 秒的時間已足夠使大部份細菌破碎，所以之後對小鼠的免疫注射，即採用超音波破菌處理 80 秒後的細菌樣品做為抗原。由實驗結果（圖七）可見，第二次與第三次細胞融合實驗所篩選出的抗體（II-1、III-1、III-2、IV-2 及 IV-3）多辨識細菌細胞表面的抗原。比較兩種抗原製備的方法（表六），Triton X-100 的溶出法可得的抗原量較超音波破菌處理少，且製備所需的時間也較長。. 表六、兩種抗原製備法的比較目標抗原取得的抗原總量（每 100 mL 菌液）抗原製備時間. Triton X-100 溶出法細胞壁抗原. 超音波破菌處理細菌全抗原. 1.8 mg. 26.5 mg. 3 日. 1.5 日. 在抗原的免疫注射劑量方面，我們從參考文獻中得知，若直接注射細菌（經煮沸或紫外光照射等殺菌處理）所需使用的劑量約在 5×106～109 CFU 之間（表七）。我們原本以每隻小鼠 7.5×108 CFU 的劑量進行免疫注射，但在注射第一針的一週後，免疫注射之小鼠即全數死亡，我們推測其原因可能是沙門氏菌的內毒素含量過高所致；隨後，我們將注射劑量降低至 108 CFU，小鼠便不再有死亡的情況。. 49.

(59) 表七、細菌抗原的免疫注射劑量比較目的. 注射菌種. 處理方法. Salmonella enterica. 劑量 (CFU) 109. 疫苗注射製造抗體. Salmonella enteric. 108. 紫外光照射. 製造抗體. Escherichia coli. 5×106. 煮沸. 製造抗體. Salmonella enterica. 109. 製造抗體. Vibrio cholerae. 0.3%福馬林處理煮沸. 5×106. 煮沸. 文獻 (Germanier & Furer, 1971) (Fehr et al., 1997) (Ghosh et al., 2006) (Ronholm et al., 2011) (Pengsuk et al., 2011). 二、抗體的分析與應用潛力在經過三次細胞融合與選殖過程後，本研究共篩選到七株可辨識沙門氏菌之單株抗體。我們對於此七株抗體做了包括 Isotyping、抗體與細菌顆粒的結合能力、辨識之抗原成分、對各種菌種的專一性、對沙門氏菌血清型專一性、抗體間競爭表位情形及抗體對抗原效價等一系列分析，並將這些抗體能否作用於不同免疫化學實驗的結果整理於表八。. 表八、本研究所生產的單株抗體可適用的實驗種類. 註：標示「+」代表可運用於此種實驗；標示「－」則代表無法使用於該實驗。. 我們以免疫沉澱的方式來分析這些單株抗體是否會與完整 50.