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香蕉不同品種對於黃葉病之抗性評估

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Academic year: 2021

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(1)台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 65(4):365–373 (2016) DOI: 10.6156/JTAR/2016.06504.02. 研究報告. 香蕉不同品種對於黃葉病之抗性評估 關政平 1 林孟逸 2 吳明哲 3 陳涵葳 1,* 摘要 關政平、林孟逸、吳明哲、陳涵葳。2016。香蕉不同品種對於黃葉病之抗性評估。台灣農 業研究 65(4):365–373。 本研究以人工接種方式,比較「北蕉」、「新北蕉」、「台蕉 5 號」、‘Gros Miche’、「南華蕉」及「玫瑰蕉」 等 6 種受試香蕉品種,對香蕉黃葉病之耐受程度。試驗以出瓶後 5 wk 大小一致之蕉苗進行接種,追蹤接種 後黃葉率、罹病率;此外,針對接種黃葉病原之香蕉假莖褐化部位進行定量分析,並配合即時聚合酶鏈鎖反 應技術檢測接種後香蕉假莖內病原菌之含量,作為耐病程度之量化評估。結果顯示「玫瑰蕉」為 6 種供試品 種中相對最抗黃葉病的品種,而 ‘Gros Michel’ 為相對最為感病之品種。 關鍵詞:香蕉、香蕉黃葉病、巴拿馬病、耐病性。. 前言 香 蕉 黃 葉 病 又 稱 巴 拿 馬 病 (Panama d i s e a s e), 係 由 Fusarium oxysporum f. sp. cubense (簡稱 Foc) 侵染香蕉造成,屬土壤傳 播病原菌,可透過灌溉水或是以感染之土壤等 方式傳播 (O’Donnell et al. 1998)。Foc 又可分 為 4 個生理小種 (race),其中以第 4 型生理小 種對「華蕉」(‘Cavendish’, AAA group) 之生長 發育及產量上造成負面影響最嚴重 (Hwang & Ko 2004)。病原菌侵染香蕉的過程是透過根部 微管束入侵植物體,造成木質部阻塞,進而使 得香蕉葉片無法獲取水分而黃化萎凋 (Li et al. 2013b)。典型的黃葉病是從下位葉開始黃化, 由葉片上的葉脈開始直至整片葉片萎凋 (Nelson et al. 1994; Ploetz 2006)。 其 病 徵 除 了 外 觀上觀察到的黃葉現象外,假莖褐化也是常用 於鑑定黃葉病病徵指標之一 (Ghag et al. 2012; Chen et al. 2013)。目前,尚未有研究針對此 病害提出完全有效的防治方法,因此,為了降. * 1 2 3. 低 黃 葉 病 害 對 香 蕉 產 量 的 負 面 影 響, 篩 選 出 抗病或耐病之香蕉品種為解決方法之一 (Buddenhagen 2009)。 台灣高屏地區自 1967 年開始發生黃葉病, 財團法人香蕉研究所 (以下簡稱「蕉研所」) 除 推廣組織培養健康蕉苗外,亦推動病園水稻輪 作, 有 效 降 低 當 時 蕉 園 廢 耕 問 題, 並 且 利 用 病 區 選 種、 國 外 引 種 與 組 織 培 養 蕉 苗 抗 病 篩 選 等 方 式, 培 育 抗 病 植 株,「新 北 蕉」(Musa spp. ‘Fromosana’, AAA genome) 據 此 成 功 自 「北蕉」(Musa spp. ‘Pei-Chiao’, AAA genome) 變異苗中篩選出來。根據蕉研所於 1990 年春 季,在中南部試種 40 ha,「新北蕉」黃葉病發 病率為 4.3%,顯著低於「北蕉」之黃葉病發病 率 25.5% (Taiwan Banana Research Institute 2002)。‘Gros Michel’ (AAA genome) 曾 經 是 全球最主要的外銷品種,但 1950 年代卻遭香 蕉黃葉病病原菌大肆摧毀,尤以中美洲受害最 深。「玫 瑰 蕉」(Rose, AA genome), 於 1995 年 自 比 利 時 國 際 香 蕉 種 原 中 心 引 進, 研 究 報. 投稿日期:2015 年 11 月 9 日;接受日期:2016 年 1 月 19 日。 通訊作者:swaychen@tari.gov.tw 農委會農業試驗所生物技術組助理研究員。台灣 台中市。 農委會農業試驗所生物技術組研究助理。台灣 台中市。 財團法人農業科技研究院植物科學研究所所長。台灣 新竹市。.

(2) 366. 台灣農業研究 第 65 卷 第 4 期. 告指出「玫瑰蕉」為抗黃葉病品種 (Chao et al. 2009)。「台蕉 5 號」(Musa spp. ‘Tai Chaio No. 5’, AAA genome), 中 文 俗 稱 為「玉 山」, 親 本 為「台 蕉 3 號」, 來 源 株 系 亦 為「北 蕉」。 「台蕉 5 號」新植與宿根栽培抗病性試驗中指 出,相較「北蕉」宿根栽培發病率 78.6%,「台 蕉 5 號」 僅 有 16.5% 之 發 病 率, 顯 示「台 蕉 5 號」對香蕉黃葉病俱有中抗性 (Taiwan Banana Research Institute 2002)。「華 南 蕉 」(‘Kluai Namwa’ 或 稱 ‘Pisang Awak’, ABB genome), 與 AAB 型的「呂宋蕉」(‘Latundan’)、「假呂宋 蕉」(‘Mysore’)、AAA 型的「紅皮蕉」(‘Morado’) 在台灣山區栽培較多,通稱為「芭蕉」,植株 粗 壯 適 應 性 強, 耐 旱 抗 病,「華 南 蕉」 對 Foc race 1 抗病,但對 Foc race 4 則感病 (Li et al. 2013a)。 由 於 Foc 為 土 壤 傳 播 真 菌, 若 發 生 在 香 蕉栽培田區經常不易根除。為了分辨不同生理 小 種, 利 用 分 生 方 法 使 用 序 列 特 徵 化 增 幅 區 域 (sequence characterized amplified region; SCAR) 等技術找尋專一性引子並利用聚合酶 連鎖反應 (polymerase chain reaction; PCR) 方 式 進 行 核 酸 增 幅, 成 功 放 大 race 4 專 一 性 片 段,可達到鑑定並區分 Foc 不同生理小種之目 的 (Lin et al. 2009)。 其 他 檢 測 Foc 的 技 術 亦 被應用,包括 PCR、real-time PCR (Lin et al. 2013)、 環 型 恆 溫 核 酸 增 幅 法 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP) (Das et al. 2012)、real-time fluorescence LAMP (Lin et al. 2013) 等。此外,亦有使用盆苗篩選抗黃葉 病之香蕉品種的系統 (Ghag et al. 2012; Chen et al. 2013)。 本研究嘗試建立香蕉黃葉病快速篩選流 程,並利用此篩選系統將 6 種不同香蕉品種依 照耐黃葉病的程度分群,研究內容包含:確認 病原菌之病原性、接種方法與條件、黃葉病發 病 指 標、 發 病 時 間 等。 另 外, 本 研 究 也 建 立 PCR、real-time PCR 等 方 式 檢 驗 黃 葉 病 原 菌 於菌土中之存在有無,或於香蕉品種中建立黃 葉病菌的定量方式,以作為品種間發病程度的 比較及應用於黃葉病害感染之檢測評估。. 材料與方法 香蕉材料 本試驗所使用的「北蕉」、「新北蕉」、‘Gros Michel’ 及「台蕉 5 號」小苗購自台灣香蕉研究 所,「南華蕉」與「玫瑰蕉」吸芽則購自集優農 場 (台灣南投市);小苗或吸芽經無菌處理與組 織培養繼代繁殖後,挑選苗齡約 1 mo 大小一 致瓶苗,培養於 B3 固態培養基 (1/2 MS salts, 340 mg L -1 NaH 2PO 4•H 2O, 160 mg L -1 adenine sulfate, 3% sucrose, pH 5.5, 0.7% agar),於 25℃ ± 2℃、12 h 光照環境下培養,待小植株 發根後出瓶,定植於 3 吋盆放置溫室馴化,5 wk 後選取株高一致且葉數接近的小苗進行接 種試驗。. 接種方法與條件 Foc 接種試驗參考 Tripathi et al. (2008) 及 Twizeyimana et al. (2007) 在實驗室內建立之 平台。Foc 病原菌 (TBRI-3) 取自蕉研所。Foc 之繼代培養係是使用 Difco TM Potato Dextrose Agar (Difco, USA) 培養基。栽培介質培養方式 為:Foc 菌塊於 Difco TM Potato Dextrose Broth (PDB, USA) 液 態 培 養 1 wk (28 ℃, 150 rpm) 後於無菌操作台操作下使用 Cheese cloth 過濾 去除菌絲,並搜集過濾後孢子液。利用離心法 去除培養基。使用無菌水回溶孢子並利用血球 計 數 器 計 算 孢 子 濃 度, 調 整 孢 子 液 至 試 驗 濃 度 10 7 spores mL -1。所有栽培介質皆經高溫高 壓滅菌處理 (121℃, 20 min),混合比例為根基 旺:玉米粉:Foc 孢子濃度 107 spores mL -1 = 2500 : 131 : 500 (mL) 後密封,於 28℃培養 1 mo。將培養 1 mo 之菌土:無菌根基旺 = 1 : 3 混合過篩後使用。接種時,將蕉苗移植至栽培 介質中,培養於溫室 (溫度 25–28℃),每個處 理之香蕉品種為 5 株,並含有未處理之負對照 組,重複試驗至少 3 次。為避免 Foc 於土壤中 的含量因澆水或環境因素逐漸減少,我們於香 蕉接種黃葉病菌 7 d 後,開始每週於栽培介質 中 加 入 1 次 20 mL pot-1 之 10 7 spores mL -1 之 Foc 懸浮液,並在 1 wk 內澆灌適量的 RO 水 2 次,1 次含量約為 30–40 mL pot -1。.

(3) 367. 香蕉對黃葉病之抗性評估. DNA 抽取 PCR 與 qPCR 檢測香蕉黃葉 病菌 使 用 MasterPure TM Complete DNA&RNA Purification Kit (EPICENTRE, Madison, WI, USA) 抽取 DNA。PCR 與 real-time PCR 反應 使 用 之 引 子 為 Foc-1:5’-CAGGGGATGTATGAGGAGGCTAGGCTA 以及 Foc-2:5’-GTGA CAGCGTCGTCTAGTTCCTTGGAG (Lin et al. 2009)。進行 PCR 反應,每個反應之總體積 為 25 μL,分別加入 2.5 μL 10× PCR buffer、 2 μL 2.5 μM dNTP、2 μL 10 μM primer、0.5 μL ProTaq DNA polymerase。PCR 反 應 使 用 之 試 劑:Pro Tag Plus (Protech, 波 士 特, 台 灣)。PCR 條件為:95℃ 2 min,接著 95℃ 30 s、 60℃ 30 s、72℃ 30 s, 共 40 個 循 環 後 進 行 72℃ 7 min。即時聚合酶連鎖反應使用試劑為 KAPA SYBR ® FAST qPCR Kits (Kapa Biosystems, Woburn, MA, USA),反應配方參考原廠 建議濃度。混合反應試劑後使用 ABI PRISM ® 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystem, USA) 進行反應,反應條件為 50℃ 2 min 後接著進行 40 次的循環反應,此循環反 應條件為 95℃ 30 s 及 60℃ 40 s。40 個循環反 應後接著進行 dissociation cycle:95℃ 15 s、 60℃ 1 min、95℃ 15 s 及 60℃ 15 s,確認放大 片段專一性。反應後將所得的結果匯入 Excel 進行計算和資料處理。Foc 標準曲線是利用序 列 稀 釋 後 的 Foc 基 因 組 DNA (genomic DNA; gDNA) 為模板,進行即時聚合酶連鎖反應, 模板 DNA 的濃度取對數值後與相對應的 Ct 值 作線性迴歸,即可得到濃度與 Ct 值之關係式。. 黃葉病之病徵判斷 本試驗所使用的香蕉黃葉病病癥判斷方法 有三,包括黃葉率、罹病指數及假莖褐化率, 判定方式分述如下: 葉片黃化數 黃葉率 (chlorosis, %) = × 100% 全株葉片數 罹病嚴重程度 (disease severity index; DSI),. 判定標準與分級如表 1 所列。 假莖褐化率 (corm discoloration, %) =. 假莖切面褐化面積 × 100% 假莖切面總面積. 香蕉假莖褐化率材料取樣自試驗栽培 61 d 之蕉苗假莖基部,拍攝假莖縱剖面照片,並利 用 Image J 軟 體 (http://imagej.nih.gov/ij/) 分 析切面總面積與褐化面積。. 結果 香蕉黃葉病原之定性與定量檢測 Foc 病 原 菌 來 自 蕉 研 所, 每 隔 1 mo 利 用 單 胞 分 離 技 術 培 養 於 PDA 培 養 基, 待 10–14 d 後以無菌水將菌株孢子洗出備用。Foc 病原 菌定性檢測是以聚合酶連鎖反應增幅目標片 段,Foc-1 與 Foc-2 引子對可專一性增幅台灣 Foc 第 4 生 理 小 種 242 bp 片 段, 瓊 脂 膠 體 電 泳分離結果顯示,此方法能快速鑑定培養基單 孢培養或帶菌土壤中的 Foc (圖 1)。此外,為 建立 Foc 病原定量檢測方法,本試驗利用即時 聚合酶連鎖反應技術,分別偵測 5 × 10 0、5 × 10 -1、5 × 10 -2、5 × 10 -3 與 5 × 10 -4 ng Foc 基 因組 DNA,繪製檢量標準線 (圖 2),Foc 濃度 以對數方式表示 (log of Foc concentration) 與 Ct (threshold cycle) 呈現線性關係,透過直線 迴歸分析,結果顯示斜率為 -3.8751,截距為 23.854,檢量線決定係數 (R 2 value) 達 0.99 以 上,可應用於 Foc 病原之定量分析。 表 1. 黃葉病之罹病嚴重程度。 Table 1. Disease severity index of Fusarium wilt disease. Score. Appearance. 0. No visible symptoms. 1. 0–1/4 leaves wilted or yellowed. 2. 1/4–1/3 leaves wilted or yellowed. 3. 1/3–1/2 leaves wilted or yellowed. 4. 1/2–3/4 leaves wilted or yellowed. 5. All leaves wilted/plant dead.

(4) 368. 台灣農業研究 第 65 卷 第 4 期. M. 1. 2. 3. (A). 4 242 bp. 香蕉黃葉病原致病性檢測 為 確 保 單 孢 分 離 培 養 之 Foc 病 原 具 有 致 病性,香蕉黃葉病原致病性檢測以容易感病之 ‘Gros Michel’ 品 種 為 材 料, 接 種 之 帶 菌 栽 培 介質製備時固定加入 10 7 spores mL -1 之孢子懸 浮液,使接種效果一致。接種後 1 mo 即可見 ‘Gros Michel’ 下位葉開始黃化,黃葉率隨接種 天數增加而上升,接種後 70 d 除下位葉黃化、 掉落外,新葉生長緩慢 (圖 3B),假莖縱切後 亦可見基部維管束褐化病癥。. Rn. 4.151 a 1.151. 0. 20. b 25. c 30. d. e. 35. f. 40. Cycle number. (B). 50 40. Ct. 圖 1. 以核酸增幅方式鑑定 Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 isolate (Foc) 利用專一性引子放大 Foc 片 段 用 於 鑑 定 實 驗 室 培 養 之 FOC。 從 土 壤 中 (Lane 1)、無 Foc 接種之土壤 (Lane 2 and 3) 及 Foc 菌絲塊 (Lane 4)。接著,使用抽取之 100 ng DNA 當 作模板進行 40 次循環之 PCR。PCR 結果顯示於 2% DNA 膠電泳圖。黑色箭頭指的是 Foc 放大後的片段 大小位置。 Fig. 1. Identification of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 isolate (Foc). Specific primer sets amplifying Foc fragments were used to identify cultured Foc. Total DNA was extracted from inoculated soil (lane 1), Foc-free soil (lanes 2 and 3), and one sliced of Foc cultured medium (lane 4). Following, 100 ng of extracted DNA were used as templates to perform 40 cycles of PCR. Results were shown after gel electrophoresis. Black arrow indicates the position of amplified Foc fragments (242 base pairs) on 2% of DNA gel.. 8.151. 30 20. y = -3.8571x + 23.854 R2 = 0.9994. 10 0. -4. -3. -2. -1. 0. 1. Log DNA (ng) 圖 2. 以 qPCR 增幅 Foc 全 DNA 進行靈敏度試驗。 (A) 由 qPCR 增幅曲線評估 Foc DNA 濃度之靈敏度。 a:5 ng,b:5 × 10-1 ng,c:5 × 10-2 ng,d:5 × 10-3 ng,e:5 × 10-4 ng,f:5 × 10-5 ng。Rn:螢光訊號。(B) 由 Ct 值與 Foc 對應 log DNA 濃度得到之標準曲線。 Fig. 2. Amplification plot and stand curve of Foc detection by qPCR assay. (A) To estimate the sensitivity of qPCR assay for Foc detection. Amplification curves from “a” to “e” were generated by qPCR analysis after using 5 ng (curve a), 5 × 10-1 ng (curve b), 5 × 10-2 ng (curve c), 5 × 10-3 ng (curve d), and 5 × 10-4 ng (curve e), and 5 × 10-5 ng (curve f) of Foc gDNA as templates. Rn, fluorescence signal normalized with passive reference dye signal. (B) Standard curve was generated by plotting values of threshold cycles (Ct) versus logarithm of DNA concentration of Foc (ng).. 不同香蕉品種對黃葉病之抗性評估 為釐清「南華蕉」、「玫瑰蕉」、「新北蕉」、 「台蕉 5 號」、「北蕉」以及 ‘Gros Michel’ 等 6 個品種蕉苗對黃葉病抗性評估,選取大小一致 的組織培養苗種植於 Foc 帶菌栽培介質中,定 期記錄植株接種後下位葉黃化之比例。依據黃 葉率統計結果顯示,接種後 40 d,「南華蕉」 和 ‘Gros Michel’ 發病快,黃葉率顯著較其他 品種高 (P < 0.05);而接菌後 53 d,「南華蕉」、 「台蕉 5 號」、「北蕉」、‘Gros Michel’ 等香蕉 品種相繼發病,「玫瑰蕉」和「新北蕉」的黃葉 率則低於其他 4 個品種,差異具有顯著性 (P <. 0.05) (圖 4A)。此外,罹病指數由 disease severity index 調 查 計 算 結 果 與 黃 葉 率 的 結 果 俱 一致性的結果 (圖 4B)。除了黃葉率與罹病指 標外,假莖褐化程度亦可作為黃葉病罹病評估 指 標 之 一。 將 試 驗 後 61 d 的 蕉 苗 挖 出, 去 除 土壤與多餘根系後,進行假莖基部 (corm) 縱 切觀察,結果顯示栽培於無病原土壤的 6 品種 蕉苗,假莖均呈健康之乳白色,而栽培於帶菌 土壤 61 d 後,只有「玫瑰蕉」的假莖基部仍為 乳白色,其餘 5 個品系蕉苗則呈現不同程度之 褐化現象 (圖 5);為比較不同品種蕉苗間假莖.

(5) 香蕉對黃葉病之抗性評估. (A). 369. (B). 圖 3. Foc 致病性測試。種植於無帶菌土 (A) 和帶菌土後 70 d (B) 之 ‘Gros Michel’ 植株鳥瞰圖,植株培養於溫 室 (25–28℃)。 Fig. 3. Pathogenicity test of Foc on banana cultivar ‘Gros Michel’. Bird view of phenotypes of ‘Gros Michel’ cultivated in Foc-free soil (A) and Foc infected soil (B) in greenhouse. Photos were taken at 70 days post Foc inoculation.. 基部褐化之差異,本試驗利用 Image J 軟體將 圖像資料進行量化分析,結果顯示 ‘Gros Michel’ 假莖基部褐化最為嚴重,而「玫瑰蕉」則 無褐化現象,量化數值差異顯著 (P < 0.05) (表 2);利用即時聚合酶連鎖反應檢測 6 品種蕉苗, 假莖基部 Foc 基因組 DNA 含量,除「玫瑰蕉」 外,「北蕉」、「新北蕉」、「台蕉 5 號」、‘Gros Michel’ 及「華南蕉」等均檢測出 Foc 存在 (表 2)。上述結果顯示在本試驗的條件下,「玫瑰 蕉」為受試 6 品種蕉苗中最為抗病。. 討論 本試驗參考蕉研所的黃葉病接種方法 (Tang et al. 2002) 後做了部分修改,包括:(1) 帶菌介質之製備:Tang et al. 將 Foc 菌絲接種 於介質中進行 3 wk 的菌絲增殖;而本試驗為 了固定每批帶菌介質的菌量,於製備時加入定 量的 Foc 孢子懸浮液,培養 1 mo。(2) 接種方 法:Tang et al. 將帶菌介質與砂土混合後取 10 mL 體積置於盆底,再將蕉苗連根帶介質移入 盆中;本試驗則是將帶菌介質與固定比例之根 基旺充分混合均勻後分裝於盆缽,將除去母盆 栽培介質的蕉苗根部洗淨後再植入帶菌介質盆 中。(3) 受試蕉苗之苗齡:根據蕉研所黃葉病 接種試驗結果顯示,北蕉 1 mo 苗齡蕉苗發病 率較 3 mo 苗齡高;本試驗以出瓶後 5 wk 大小 一致之蕉苗進行試驗。本試驗以修改後的黃葉. 病接種條件,對 6 品種香蕉之黃葉病耐受性進 行評估,結果顯示在為期 2 mo 的試驗中,「新 北蕉」比「北蕉」更為耐病,此結果與過去蕉 研所發表之文獻結果相仿 (Tang et al. 2002)。 然 而, 種 植 於 帶 菌 栽 培 介 質 53 d 後, 在 本 試 驗的篩選條件下,「台蕉 5 號」的耐病性與「北 蕉」則無顯著性差異;可能是因為修改後的接 種方法較為嚴苛,試驗中所使用的帶菌介質孢 子含量多且平均分散,接種時清洗根部所造成 的表皮傷口,可增加受試蕉苗根部與 Foc 病原 接觸機會。此外,本試驗使用 5 wk 之蕉苗, 苗齡小發病較嚴重。Tang et al. 採用較溫和的 接種方法,可避免早期篩選壓力過大而丟失耐 病苗株,但本試驗擬藉由較強的篩選壓力,得 到較為明確的病癥,有利於後續耐病評估方法 的建立。本試驗結果亦顯示,‘Gros Michel’ 為 感 病 品 種, 而 玫 瑰 蕉 在 為 受 試 品 種 中 最 為 抗 病,2009 年 Chao et al. (2009) 對 6 種二倍體 芭蕉品種抗黃葉病能力評估研究中,亦指出「玫 瑰蕉」對黃葉病具有抗性。 由本試驗不同檢測方法結果得知,香蕉黃 葉病不能僅憑單一種檢測方式判定;例如「玫 瑰蕉」的下位葉子容易因生理老化或水分變化 而發生黃化現象,但這並非黃葉病的典型黃葉 病徵,若只用黃葉率來進行罹病檢定,則容易 出現偽陽性結果。因此,2 個以上的罹病評估 指標可有效提升判定準確性。本試驗除了黃葉 率外,還利用罹病嚴重程度指標、假莖褐化率.

(6) 370. 台灣農業研究 第 65 卷 第 4 期. (A). 100. (B). 29 DPI. 75 50. a. a. 25 b. 0. 75. b. Rose. Formosana. Pei Chaio. Tai Chiao No. 5. Gros Michel. 5. b. 40 DPI. a. 4. a. 50. 75. b. b. 0 100. b. b. 25. DSI. Chlorosis (%). 100. b. Pisang Awak. 2 53 DPI. a. a. 1. a. 50. a. b 25 0. ng. sa. Pi. 3. 0 0. b. k. a Aw. se. Ro. rm. Fo. a. an. os. o. ai. h iC. Pe. ao. hi. iC Ta. .5. No. s. ro. G. el. ich. 29. 40. 53. Days. M. Cultivar 圖 4. 不同香蕉品種之黃葉率與罹病嚴重程度。(A) 種植後 29、40 與 53 d 之蕉苗黃葉率,資料經由 ANOVA 和 Tukey’s test 計算後資料間俱有顯著性差異則標示 a、b (α = 0.05),試驗進行 5 重複。(B) 6 個品種於不同時 間點之罹病嚴重程度,調查的方式依照表 1。 Fig. 4. Percentage of chlorosis leaves and disease severity index of 6 cultivars after cultured at Foc infected soil. (A) Percentage of yellowing leaves per seedlings was estimated at 40, 29 and 53 dpi. Error bar represents standard deviation of 5 replicates. Data were analyzed by one-way ANOVA and Tukey’s test. Groups with different alphabets represents a statistically significant difference among them (α = 0.05). (B) Disease severity index (DSI) of 6 cultivars. Values of DSI obtained from Foc infected bananas were estimated according to the criterion addressed in Table 1.. 以及 qPCR 等方式進行罹病檢定,希望可藉由. 片, 接 種 後 0–96 h 雖 尚 未 出 現 病 徵, 但 已 可. 不 同 檢 定 方 法 量 化 罹 病 程 度。 在 本 試 驗 條 件. 測得病原菌 IGS 序列,配合天竺葵內生基因片. 下,假莖褐化率與 qPCR 的判斷結果較外觀鑑. 段作為內控制組 (internal control) 即可進行定. 別準確,且結果可進行量化評估。應用 qPCR. 量 (Suarez et al. 2005);感染十字花科黑斑病. 方式進行病害檢測,具有簡便、準確、再現性. (Alternaria brassicicola) 的阿拉伯芥,亦可利. 高 等 特 點, 目 前 已 廣 泛 應 用 於 真 菌 性 病 害 的. 用 qPCR 方式偵測病葉中病原菌 Cutinase A 基. 檢 測 (McCartney et al. 2003)。 以 qPCR 檢 測. 因 進 行 定 量, 但 感 染 後 期 植 物 細 胞 開 始 死 亡. 接 種 灰 黴 病 (Botrytis cinerea) 之 天 竺 葵 葉 圓. 後,病原菌生物量便不與植物內生基因含量相.

(7) 371. 香蕉對黃葉病之抗性評估. Mock. Foc. Pisang Awak. Rose. Formosana. Pei Chaio. Tai Chiao No. 5. Gros Michel. 圖 5. 不同香蕉品種假莖縱切之檢測。檢測在 6 個品種於無 Foc 和有 Foc 之土壤種植 61 d 後之內部病徵。箭 頭指出假莖褐化的部位。 Fig. 5. Cross section through the base of 6 banana cultivars. Internal symptoms of 6 cultivars were examined after inoculated by ddH2O (mock) or Foc for 61 days. Arrow indicates discolored region. 表 2. 6 種不同香蕉品種中 Foc 之含量與假莖基部褐化程度。 Table 2. Detection and quantification of Foc in corms for 6 cultivars of banana. Cultivar Pisang Awak Rose. Discolorationz (%) 26.3 ± 4.6 ab 0c. Foc concentrationy (10-2 ng) 1.3 ± 0.5 a ND. New Pei Chiao. 13.5 ± 5.5 bc. 1.2 ± 0.5 a. Pei Chiao. 17.8 ± 7.5 ab. 2.5 ± 1.0 a. Tai Chiao No. 5. 23.4 ± 4.9 ab. 3.3 ± 1.8 a. Gros Michel. 33.7 ± 7.4 a. 4.5 ± 2.2 a. z. Discolored region and total area of corm was determined by Image J. Percentage of discolored area = (discolored region/total corm area) × 100%. Mean ± standard error (n = 3). Means followed by the same letter(s) within each column are not significantly different at 5% level by LSD test. y Concentration of Foc in corm (50 mg) was estimated by qPCR and Ct values of each reaction was calculated by using equation shown in Fig. 2B. Mean ± standard error (n = 3), ND represents the Foc concentration is lower than the detection limit. Means followed by the same letter(s) within each column are not significantly different at 5% level by LSD test.. 關 (Gachon & Saindrenan 2004)。由於 Foc 在 感 染 初 期 仍 屬 於 半 活 體 寄 生 (hemibiotrophic) 型,由植物根部進入維管組織系統後,Foc 轉 變為腐生 (necrotrophic) 型真菌,可能造成維 管束細胞死亡。故本試驗 qPCR 定量檢測並未 加入內控制組作為對照,而是固定採樣 50 mg 之假莖基部材料,受試蕉苗除「玫瑰蕉」測不 到 Foc 外, 其 他 受 試 品 種 均 可 測 得 Foc,「新. 北蕉」與「南華蕉」分別測得 1.2 × 10 -2 及 1.3 × 10 -2 ng, 較「北 蕉」、「台 蕉 5 號」 及 ‘Gros Michel’ 為低,但差異不顯著。原因是「北蕉」、 「台蕉 5 號」及 ‘Gros Michel’ 的偵測誤差較大, 推斷 qPCR 的檢測方法靈敏度高,更適合感染 初期偵測,配合植物內生基因作為內控制對照 才能有效定量。本試驗利用 6 品種香蕉苗進行 黃葉病耐病試驗,並由 3 種不同的檢測方式,.

(8) 372. 台灣農業研究 第 65 卷 第 4 期. 包含黃葉率、假莖褐化程度、qPCR 之技術證 明「玫瑰蕉」為 6 品種中最抗病之品種,而 ‘Gros Michel’ 為 6 品種中最感病之品種。. 誌謝 本研究計畫經費來自行政院農業委員會科 技計畫 (103–104 農科-6.3.2-農-C1) 補助試驗 經費,謹此致謝。. 引用文獻 Buddenhagen, I. 2009. Understanding strain diversity in Fusarium Oxysporum f. sp. cubense and history of introduction of ‘Tropical Race 4’ to better manage banana production. Acta Hort. (ISHS) 828:193–204. Chao, C. P., S. Y. Lee, Y. Y. Su, and C. S. Chiou. 2009. Study on six kinds of banana AA varieties of horticultural traits in Taiwan. p.21–26. in: Proceedings of the Fourth Symposium on Horticulture in Both Sides of the Taiwan Straits. November 11, 2009. Pingtung, Taiwan. National Pingtung University of Science and Technology Publ., Pingtung, Taiwan. (in Chinese) Chen, Y. F., W. Chen, X. Huang, X. Hu, J. T. Zhao, Q. Gong, X. J. Li, and X. L. Huang. 2013. Fusarium wilt-resistant lines of Brazil banana (Musa spp., AAA) obtained by EMS-induced mutation in a micro-cross-section cultural system. Plant Pathol. 62:112–119. Das, A., B. Shawn, and M. T. Mcintosh. 2012. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of capripoxviruses. J. Clin. Microbiol. 50:1613–1620. Gachon, C. and P. Saindrenan. 2004. Real-time PCR monitoring of fungal development in Arabidopsis thaliana infected by Alternaria brassicicola and Botrytis cinerea. Plant Physiol. Biochem. 42:367–371. Ghag, S. B., U. K. S. Shekhawat, and T. R. Ganapathi. 2012. Petunia floral defensins with unique prodomains as novel candidates for development of fusarium wilt resistance in transgenic banana plants. PLoS One 7:1–11. Hwang, S. C. and W. H. Ko. 2004. Cavendish banana cultivars resistant to Fusarium wilt acquired through somaclonal variation in Taiwan. Plant Dis. 88:580–588. Li, C., J. Shao, Y. Wang,W. Li, D. Guo, B. Yan, Y. Xia, and M. Peng. 2013a. Analysis of banana transcriptome and global gene expression profiles in banana roots in response to infection by race 1 and tropical race 4 of Fusarium oxysporum f. sp. cubense. BMC Genomics 14:851.. Li, C. Y., G. Mostert, C. W. Zuo, I. Beukes, Q. S. Yang, O. Sheng, R. B. Kuang, Y. R. Wei, C. H. Hu, L. Rose, P. Karangwa, J. Yang, G. M. Deng, S. W. Liu, J. Gao, A. Viljoen, and G. J. Yi. 2013b. Diversity and distribution of the banana wilt pathogen Fusarium oxysporum f. sp. cubense in China. Fungal Genom. Biol. 3:1–6. Lin, Y. H., C. C. Su, and C. P. Chao. 2013. A molecular diagnosis method using real-time PCR for quantification and detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4. Eur. J. Plant Pathol. 135:395–405. Lin, Y. H., J. Y. Chang, E. T. Liu, C. P. Chao, J. W. Huang, and P. F. Chang. 2009. Development of a molecular marker for specific detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4. Eur. J. Plant Pathol. 123:353–365. McCartney, H. A., S. J. Foster, B. A. Fraaije, and E. Ward. 2003. Molecular diagnostics for fungal plant pathogens. Pest Manag. Sci. 59:129–142. Nelson, P. E., M. C. Dignani, and E. J. Anaissie. 1994. Taxonomy, biology, and clinical aspects of Fusarium species. Clin. Microbiol. Rev. 7:479–504. O’Donnell, K., H. C. Kistler, E. Cigelnik, and R. C. Ploetz. 1998. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:2044–2049. Ploetz, R. C. 2006. Fusarium wilt of banana is caused by several pathogens referred to as Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Phytopathology 96:653–656. Suarez, M. B., K. Walsh, N. Boonham, T. O’Neill, S. Person, and I. Barker. 2005. Development of real-time PCR (TaqMan®) assays for the detection and quantification of Botrytis cinerea in planta. Plant Physiol. Biochem. 43:890–899. Taiwan Banana Research Institute. 2002. 2001 Annual Report. Taiwan Banana Research Institute. Pingtung, Taiwan. 79 pp. (in Chinese) Tang, C. Y., S. Y. Lee, and C. H. Tai. 2002. A net-house method for the mass screening of resistance to fusarium wilt in banana and its efficiency in clonal selection. J. Chinese Soc. Hort. Sci. 48:309–318 (in Chinese) Tripathi, L, J. Odipio, J. Tripathi, and G. Tusiime. 2008. A rapid technique for screening banana cultivars for resistance to Xanthomonas wilt. Eur. J. Plant Pathol. 121:9–19. Twizeyimana, M., P. S. Ojiambo, A. Tenkouano, T. Ikotun, and R. Bandyopadhyay. 2007. Rapid screening of Musa species for resistance to black leaf streak using in vitro plantlets in tubes and detached leaves. Plant Dis. 91:308–314..

(9) 香蕉對黃葉病之抗性評估. Evaluation of Banana Cultivars Resistance to Fusarium Wilt Disease Cheng-Ping Kuan1, Meng-Yi Lin2, Min-Tze Wu3, and Han-Wei Chen1,*. Abstract Kuan, C. P., M. Y. Lin, M. T. Wu, and H. W. Chen. 2016. Evaluation of banana cultivars resistance to Fusarium wilt disease. J. Taiwan Agric. Res. 65(4):365–373.. In this study, for comparing different levels of tolerance in banana species to Fusarium wilt disease, several cultivars, i.e., ‘Pei Chaio’, ‘Formosana’, ‘Tai Chiao No. 5’, ‘Gros Michel’, ‘Pisang Awak’, and ‘Rose’, which were commonly cultivated in Taiwan, were inoculated artificially with Fusarium pathogen. Percentages of chlorosis were estimated after culturing two-month-old seedlings of bananas in Fusarium-inoculated soil in greenhouse. Besides, we examined browning region of corm sections of Foc-inoculated plants quantitatively and qualitatively and estimated the amounts of Foc in each corm section by real-time PCR method. Results showed that cultivar ‘Rose’ was the more resistant cultivar among six cultivars while ‘Gros Michel’ was the more susceptible cultivar. Key words: Banana, Fusarium wilt, Panama disease, Tolerance.. Received: November 9, 2015; Accepted: January 19, 2016. * Corresponding author, e-mail: swaychen@tari.gov.tw 1 Assistant Research Fellows, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 2 Research Assistant, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 3 Director, Plant Technology Laboratories, Agricultural Technology Research Institute, Hsinchu, Taiwan, ROC.. 373.

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參考文獻

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