植物遺傳資源體外超低溫冷凍保存技術研習心得

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(1)出 國 報 告. 植物遺傳資源 體外超低溫冷凍保存技術 研 習 心 得 農試所鳳山分所 邱金春. 一、前言 植物遺傳資源的妥善保存與有效 利用,可以永續生產安全及足夠的糧食 避免飢餓和貧窮,並在農業生產過程 友善我們居住的生態環境。近年來氣候 環境變遷加劇,許多現有作物有瀕臨絕 種或被取代、退化的疑慮,更突顯種 原保存技術的重要性。將種子儲藏於 種子庫是傳統的種原保存方式,然而 無性繁殖作物及很多熱帶、亞熱帶植物 無法以種子保存遺傳資源。目前已知 利用組織培養技術進行植物體外保存 (in vitro conservation )及超低溫冷凍保存 (cryopreservation),不但能減少保存種原 耗用的土地空間和人力成本,也能避免 外在環境如溫度、降雨、日照、病害或 蟲害等因子的干擾,在分子生物檢測技 術輔助下,為安全且有效的中、長期保 存方法。. 二、印度NBPGR舉辦「植物遺 傳資源體外超低溫冷凍保存技 術」研習 印度國家植物遺傳資源署(National B u re a u o f Plan t G en etic Re sou r ce s, NBPGR)為全球作物保存中心之一,配. 置有國家種子庫、國家植物組織培養 保存庫和超低溫庫,專責辦理及研發 種原在基因庫內之長期保存(圖一)。 NBPGR與亞太農業研究機構聯盟(AsiaPacific Association of Agricultural Research Institutions, APAARI)、生物多樣性國際 中心(Biodiversity International)等於西元 2011年11月14-26日在新德里合辦第六屆 「植物遺傳資源體外超低溫冷凍保存技 術」研習會,以當前應用於中長期保存 無性繁殖作物及非傳統種子型態保存作 物的試管體外保存技術與超低溫冷凍保 存技術,設計實際操作練習的研習課程 (圖二)。學員來自伊朗、南非、迦納、 斯里蘭卡、台灣、奈及利亞及印度共計 13名,有種原庫經理、大學教授及農業 研究人員。講師除了NBPGR的研究員 擔任外,並聘請Prof. Huge Pritchard、 Dr. Ir. Bart Panis、Dr. Haeng-Hoon Kim、 Dr. Barbara M. Reed、Dr. J. L. karihaloo 等英、美、韓及比利時專家共同擔任講 師。講師們都有多年的工作經驗,因此 能提供詳盡的上課講義並適時的解答學 員們的疑惑,實習過程每位學員都有機 會親自操作練習加深印象。. 三、超低溫冷凍保存種原 作 者:邱金春助理研究員 連絡電話:07-7310191-707. 32. 農業試驗所技術服務.2012年09月.91期. 水分在細胞內扮演重要角色維持植 物各種生理機能,植物細胞含水量約8595%,種子含水量約8-15%。水低於0 oC.

(2) 開始形成冰晶,破壞細胞膜導致細胞失 去膨壓、崩解而死亡。超低溫保存是指 在-80oC以下的超低溫保存種原的技術, 因此植物必須有克服冰凍逆境的保護措 施,包括避免冰晶形成或冷馴化加強耐 低溫能力(圖三)。材料冷凍前的適度脫水 可除去細胞內的自由水避免冰晶形成, 配合玻璃質化(vitrification)或藻膠包埋 (encapsulation)等技術,可以提高材料回 溫後的存活率。茲將技術研習心得介紹 如下:. (一)種子、胚、休眠芽及花粉的快速冷 凍保存 對於難以種子儲藏類型如含水量 高、脂質多、對低溫敏感或體積大的種. 圖一、NBPGR設置的超低溫冷凍庫,種原記錄須詳細並 建檔,方便管理。. 子,可以只切取胚作為保存體,唯材料 必需先進行含水量與發芽率的評估。一 般而言,種子以含水量10-14%為宜,胚 則以10-25%含水量為底線;材料在適當 含水量下即可放入冷凍瓶(cryovial)後再 放入液態氮快速冷凍;回溫時,以3740 oC水浴法進行即可。若材料回溫後發 芽率差,可考慮改變材料脫水速率或以 不同成熟期的材料作為保存體。 果樹作物多以無性繁殖保存品種 特性,溫帶果樹耐寒、具休眠性,可在 冬季摘取深度休眠後的休眠芽作為保存 體,材料乾燥脫水至含水量20-30%後即 可放入液態氮中保存,方法簡單易行, 且回復生長後經嫁接多有提早開花的優 點;目前蘋果屬(Malus)、桑屬(Morus)及 梅屬(Prunus)等都成功地以此法進行種原 保存,但是此法不適用於缺乏休眠性的 熱帶性果樹種原保存。 花粉保存主要是基於雜交育種的 需要,對於花粉壽命短的禾本科、十字 花科、菊科等作物,或是栽植於不同地 區、甚至不同開花期的作物,可以增加 雜交機會。惟受限於成熟花粉培養目前 無法再生植株,因此花粉保存只可作為 種子及營養系保存的補充。如同種子冷 凍保存過程,花粉應先進行含水量與萌 芽率的評估,再快速冷凍。一些短命花 粉如小麥、玉米、水稻、甘蔗等應用此 技術已成功延長花粉壽命。. 出 國 報 告. (二)玻璃質化與液滴冷凍保存. 圖二、研習會提供的講義詳述冷凍原理及操作程序,值 得參考。. 玻璃質化是指以不形成冰晶的方式 使細胞內的液體轉為無定型的固體呈玻 璃般凍結固化的生理變化,冷凍保護劑 主要保護細胞於0oC以下避免冰晶形成, 蔗糖、甘露醇、甘油、乙二醇等都可作 為植物組織的護凍劑,通常以兩種以上 化合物配製成高濃度(15-30%)溶液進行. 農業試驗所技術服務.2012年09月.91期. 33.

(3) 出 國 報 告. 圖三、植物細胞於超低溫冷凍逆境保存原理。. 圖四、香蕉等多種作物成功以液滴冷凍技術保存種原。. 34. 農業試驗所技術服務.2012年09月.91期.

(4) 玻璃質化誘導,提高冷凍耐受性。玻璃 質化法簡單易行,但大部份護凍劑具有 毒性,處理時間太長對培植體有毒害作 用,放置時間不足則沒有防護效果,提 供適當護凍劑前處理才是此技術的成功 關鍵。PVS2與PVS3都常作為護凍劑,已 知PVS3溶液對植物細胞的毒害較輕,材 料玻璃質化時應優先考慮使用。目前大 蒜、波蘿蜜、荔枝、柑橘及多種藥用植 物都成功以此技術保存種原,且獲得高 存活率。 由玻璃質化法衍生的液滴冷凍 (droplet freezing)技術則是以鋁箔薄片取 代冷凍瓶,將材料放在鋁箔片上直接置 入液態氮中,可確保材料有較快的冷凍. 速率及回溫速率,目前應用此技術已成 功保存馬鈴薯、蘆筍、香蕉等多種作物 莖頂(圖四與圖五)。. (三)包埋脫水法 包埋脫水法是對低溫敏感種原如 蘋果等營養芽,在乾燥及冷凍保存過程 需保護莖頂分生組織避免凍傷,通常以 5%藻膠包埋莖頂,逐步提高培養基中 蔗糖濃度預培養,再以含氯化鈣溶液進 行藻膠包埋,包埋處理後的藻膠球粒以 loading solution調整滲透壓,放入PVS2 脫水乾燥,有助於提高對低溫的耐受性 而提高冷凍保存的存活率,此方法一次 能處理較多材料且對植物的毒害較小, 因此廣泛被應用於種原的保存(圖六)。 目前應用此技術已成功保存多種溫帶及 熱帶作物莖頂及體胚,包括蘋果、梨、 黑莓、覆盆子、桑葚、薄荷、楊桃、枳 殼、巴西橡膠樹和甜橙等,以及甘蔗、 山藥、百合、香蕉等單子葉植物。. 出 國 報 告. 四、結語. 圖五、香蕉莖頂組織經超低溫冷凍保存後仍保持生命 力。. 圖六、藻膠包埋西洋梨(Pyrus communis)莖頂組織進行超 低溫冷凍保存。. 超低溫冷凍保存植物種原技術逐 漸成熟,在印度、美國、韓國、日本等 國家都應用於實際種原保存工作上,唯 現階段仍以溫帶性作物有較多成功的案 例,熱帶或亞熱帶作物因本質上不耐低 溫及乾燥,目前僅香蕉、柑橘、甜橙、 桑葚、楊桃、荔枝、波蘿蜜等有成功案 例。台灣因地理氣候條件多為熱帶或亞 熱帶作物育種,應可以就此領域尋求技 術上的突破讓台灣在植物遺傳資源保存 研究上異軍突起。因應「基因農場」時 代的來臨,除了種子、胚、胚芽、莖頂 等 材 料 外 , 特 定 性 狀 基因 片 段 、 突 變 體、雙單倍體(double haploid)、遠緣雜交 種等都是值得重視與保存的新植物遺傳 資源。. 農業試驗所技術服務.2012年09月.91期. 35.

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參考文獻

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