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探討OTEX基因和前列腺癌的關係

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Academic year: 2021

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(1)壹、緒論 基因在生物體中扮演著傳遞生命遺傳訊息的角色,利用四個鹼基 進行不同的排列組合產生成千上萬的基因,每個基因有其所主導的功 能,以建構及維持生物個體的運行。所以,當基因產生斷裂或突變時, 就有可能對生物個體造成極大的影響。目前人類基因序列解讀計劃已 經完成,得知人類大約有三萬至四萬個基因,也由於這項計劃的完成, 使得科學家得以朝向研究未知基因功能方向繼續努力,更進一步釐清 基因與疾病之關聯性。. (一)同源箱基因 (homeobox gene) 1960 年 Jacob 和 Monod 在研究原核生物(prokaryote)時發現有一種 特殊的調節性基因,可調節特定基因的活性,所發現的第一個調節性 基因,經鑑定後得知此基因會轉譯成抑制子 (repressor) (Ptashne, 1967; Kumar et al., 1995);稍後在原核生物體內亦發現有活化子(activator) 的調節性基因存在,所以大致上認為調節性基因控制基因表現的方式 可分為抑制或活化。此外發現此兩種基因都可轉譯出可與專一序列結 合之蛋白 (sequence specific DNA binding protein),利用此特性與下游 基因啟動子結合,以調控下游基因的表現。 在真核 (eukaryote) 生物方面,果蠅 (Drosophila) 遺傳學家 Lewis. 1.

(2) 首先發現有些突變對於果蠅發育有極大的影響,稱為同源轉化突變種 (homeotic mutations) ,再追溯以往的研究,發現早在 1915 年學者 Bridge 即發現此種現象,命名為 Bridge mutations。由 Lewis 所發現的 基因群主要為調控體節的發育,例如這群基因中的 abx、bx3、pbx 三 個同源轉化基因發生突變時,會造成果蠅胸部第三體節長出兩對翅 膀,即命名這一群基因即為 Bithorax-Complex (Lewis, 1985)。 直到 1984 年,McGinnis 等人進一步確定基因的存在─antennapedia (Antp)基因,並定名為同源箱基因 (Homeo-box gene),進一步研究時 發現當 Antp 基因發生突變時會使得原本生長在頭部的觸角轉變成腳。 後來研究結果指出這些基因位在果蠅的第三對染色體,主要有兩個區 域,分別為觸角飾物叢基因群 (Antennapedia complex,ANT-C) 及雙 胸型叢基因群 (Bithorax complex,BX-C)。 觸角飾物叢基因群包含五個同源基因,調控著頭部的發育的分別 為 labial (lab) 、 deformed (dfd) , 調 控 胸 部 體 節 發 育 的 分 別 為 Antennapedia (Antp)、Sexcombs reduced (scr)以及參與成體發育的 proboscripedia (pb);另一區為雙胸型叢基因群包含三個同源基因, 分 別為調控體節發育的 ultrabithorax (ubx) 基因及調控腹部體節發育的 abdominla A (abdA) 與 abdominla B (abd B),此串基因在染色體上排 列的次序,會依著它們所控制的體節前後次序排列(附圖一)。. 2.

(3) 經由一連串的研究發現同源箱基因控制許多參與胚胎發育的基 因,而且從低等的環節動物到果蠅等的節肢動物,至哺乳動物的鼠、 人皆有同源箱基因的存在,並且發現在不同的物種間的同源箱基因, 在序列上有相當的保留性,就因為如此,一般學者認為同源箱可能是 由原核生物的一個基因演化而來 (Schneuwly et al., 1986)。 有鑒於蛋白質資料庫的發展,學者便可將同源箱基因蛋白與已知 的 蛋 白 序 列 進 行 比 對 , 發 現 同 源 區 蛋 白 與 酵 母 菌 的 mating-type proteins (MAT) α1 和 α2 相似性極高 (Shepherd et al., 1984),MATα1 已知是轉錄調控因子 (transcription regulator);MATα2 則是特定基因 的抑制子,所以認為同源區蛋白所扮演的角色可能是基因調節蛋白, 之後相繼有許多學者研究證實同源區蛋白質扮演轉錄調節因子 (transcription factor) 的角色以調節生物發育過程 (Desplan et al., 1985;Muller et al., 1988)。同源區蛋白中的同源區是一段由 60 個高保 留性胺基酸所組成,而同源區蛋白即藉由這個同源區去辨認下游目標 基因的調控區並與之結合,以調節該基因的表現。同源區的立體結構 為螺旋-轉-螺旋 (helix-turn-helix) 的結構,其中第三個螺旋為 DNA 結合位,在物種間具高度序列保留性,同源區與 DNA 結合時,會以 第三個螺旋(辨識螺旋)插入 DNA 之 major groove 並與 DNA 上的鹼基 產生氫鍵 (Laughon and Scott, 1984)。. 3.

(4) (二)PEPP 家族 同源箱基因依同源箱序列大約可分為 30-40 個亞群,以 HOX 同 源箱基因群、POU 同源箱基因群、Paired-type 同源箱基因群研究較為 詳細。 本論文所研究的基因 OTEX 經由同源區序列比對結果歸類於 paired-like 同源箱基因群中的 PEPP 家族。paired-like 與 paired class 皆是屬於 PRX superclass,而 paired-like 同源箱基因群的同源區胺基 酸序列與 paired class 相似,約有 55%~75%的相似度,兩者之間主要 的差別在於 (1) paired-like 同源箱基因群並沒有 paired 同源箱基因群 的 paired domain;(2) paired 同源箱基因群在同源區胺基酸序列的第 三個螺旋的第 9 個位置為 serine;而 paired-like 同源箱基因群在第三 個螺旋的第 9 個胺基酸位置大部分為 glutamine,少數為 lysine (Wayne et al., 2002)。 PEPP 家族基因包括了 Pem、Esx1 (Spx1)、Psx1 和 Psx2,此家族 具有幾個特徵: (1)所有家族成員包含小鼠及人類的基因皆位於 X 染 色體上; (2)PEPP 家族基因的同源區序列都被兩個內子 (intron) 所 隔開,分別在同源區序列 31/32 及 46/47 的位置會插入內子; (3)在 同源區 58 位置的胺基酸大都為 arginine。. 4.

(5) (1) Pem (placenta and embryonic expression homeobox gene) 小鼠的 Pem 含有四個外子 (exon),其中三個即為同源箱高保留序 列。並具有兩個啟動子 (promoter),在胎盤、卵巢、腫瘤細胞株、骨 骼肌表現的為 Pd (distal promoter)啟動子, Pd 啟動子位在 5’UTR 外 子附近;另一個為 Pp (proximal promoter) 啟動子,位在第一個內子 接近第一外子的位置,表現在睪丸、副睪 (在有睪固酮的環境下)。 Pem 是第一個證實會受荷爾蒙所調控的同源箱基因 (Maiti et al., 1996)。除了表現在生殖系統之外,在早期妊娠時,胚胎之外胚層細 胞膜亦會有 Pem 的表現,參與早期生殖細胞(PGC)的移動。雖然 Pem 與生殖系統功能調節有密切關係,但是將 Pem 基因突變後並沒有發 現生殖方面的功能有影響 (Pitman et al., 1998;Singh and Saini, 2003)。其他研究發現 pem 在 Sertoli 細胞表現時會增加鄰近生殖細胞 的 DNA 股斷裂(Wayne et al., 2002)。. (2) Esx1 (extraembryonic tissue-testis-homeobox gene) Esx 1 於胚胎形成過程中主要表現於外胚胎組織,包含卵巢囊 (ovary bag) 及絨毛膜 (chorion),研究發現將 Esx1 基因突變後,母鼠 有較嚴重的生理變化,會有胎盤發育不全的現象,而公鼠在生理上仍 屬正常。如果更進一步觀察胚胎發育,在胚胎第 11.5 天即可發現胚 胎內層發育異常,至第 13 天胎盤體積比正常的大,而且新生小鼠在 5.

(6) 體型上會比一般小鼠小 20% (Li et al., 1997 and 1998)。在成鼠部分, 公鼠體內 Esx1 只表現在睪丸,而在母鼠中則會表現在胎盤中。進一 步研究發現 Esx1 會表現在精子生成過程中精原細胞進行細胞分裂 前、精母細胞,和精細胞內,所以 Esx1 扮演的角色可能為調控精原 細胞的有絲分裂及精子成熟過程的減數分裂 (Li et al., 1997)。ESXR1 為人類的 Esx1 對等基因,位在於 X 染色體 Xq22.1-q22.3,ESXR1 同 源區序列與 Esx1 有 65%的相似度,目前研究發現此基因主要表現在 睪丸與卵巢 (Fohn and Behringer, 2001)。. (3) Psx1 和 Psx2 (placenatal–specicfic homobox gene) Psx1 和 Psx2,兩者皆在胎盤表現。在胚胎發育過程中大約在胚胎 8.5 天即可偵測到胎盤 Psx1 基因的表現, Psx2 在雄性胚胎時期一直 表現到胚胎 13.5 天;雌性可持續表現到胚胎 15.5 天; Psx2 在雌性 方面的表現量會高於雄性的 5 倍,且在胚胎 12.5 天時到達高峰 (Han et al., 1998)。經序列比較發現,Psx1 及 Psx2 在 DNA 序列上有高達 91%的相似度,而同源區蛋白序列有 81%的相似度。進一步研究指出 將 Psx 基因突變後並未發現有明顯的性狀,初步認為可能在卵子生成 過程中扮演重要角色。Psx 在同源區序列 51 的位置為 methionine,不 同於一般同源箱基因的 aspartate,一般認為此區域為直接與 DNA 結. 6.

(7) 合的位置,所以推測 Psx 同源箱蛋白可能會與某些特定基因作用,即 產生調節作用 (Han et al., 1998)。. (4) Tox Tox 基因產生的同源箱蛋白被歸類與 Paired/Pax (Prd/Pax) family 有關。演化分析樹分析顯示 Tox 被歸類在 PEPP family 裡的 paired-like 同源箱基因,Tox 基因位在 X 染色體上包含 3 個 exons,一項特殊的 發現是產生的蛋白質序列含有 2 個 polyglutamate 的序列,因而使得 Tox 蛋白更為酸性,Tox 轉錄子被測出有在老鼠的睪丸和卵巢中表 現,在出生後 Tox 基因即在睪丸內表現,主要在睪丸內的 sertoli 細胞 及精原細胞內表現,然而在成年老鼠中,Tox 表現集中在精細胞和精 子上,此外在卵巢濾泡的體細胞的發展中,早期在 theca 細胞,後期 在 granulosa and theca 細胞上 (Kang et al., 2004)。. (5) hPEPP1 和 hPEPP2 hPEPP1 和 hPEPP2 位在 X 染色體 24 的位置,與老鼠 X 染色體 上的 Pem, Psx-1, and Psx-2 位置類似。 Wilkinson 發現 hPEPP1 and hPEPP2 選擇性的在睪丸表現,但 hPEPP1 和 hPEPP,不像其它的 PEPP 家族裡的基因,在胎盤裡表現,也暗示 PEPP 基因調節的可能 性在從老鼠到人類之演化過程中已經有重大的改變,雖然 hPEPP1 在 7.

(8) 正常組織中有選擇性的表現,它也表現在某些器官的腫瘤細胞,較近 於小鼠和大鼠的 Pem 基因表現模式,而不類似小鼠的 Psx-1 或 Psx-2 的表現 (Wayne et al., 2002)。. (三) OTEX 基因 除了同源箱基因在發育過程中,對生殖系統的影響外,我們想知 道是否有其他未被發現的同源箱基因,參與精子生成過程,因此我們 實驗室之前利用設計一連串同源箱高保留序列退化引子 (degenerate primer),以進行退化性聚合酶連鎖反應 (degenerate PCR),得到一個 在人類睪丸表現的同源箱基因 TSX1。 在比對基因庫的基因組序列 時,我們發現 TSX1 位在染色體 Xq23.1 之位置,也同時發現在染色體 Xq22-24 位置有另外一個同源箱基因,買回 EST clone (AI631510)定 序後發現全長 750 bp, 轉譯出 184 個氨基酸,含有三個外子二個內 子,原命名為 TPX1 (Testis-pair-like homeobox gene-1),但於 2002 年 四月已被發表並命名為 OTEX (ovary-testis-epididymis-homeo-box gene) (Geserick et al., 2002;Geserick et al., 2002) 及同年之七月被發表命名 為 hPEPP1 (Wayne et al., 2002),我們之後均以 OTEX 稱之。將 OTEX 其同源區 60 個胺基酸與其它同源箱基因之同源區序列進行比對,應 是屬於 paired-like 的同源箱基因群 PEPP 家族。. 8.

(9) OTEX 基因主要表現在腦、卵巢、睪丸、副睪、前列腺,以及乳 腺細胞,但不像其他 PEPP 家族基因會表現在胎盤的位置 (顏,碩士 論文,2003)。此外,我們實驗室先前利用 OTEX cDNA 做探針對一 些物種進行 zoo blot 分析,發現 OTEX 基因在較低等的哺乳類動物中 並不存在,只存在人類基因組中,所以推測 OTEX 基因是在演化後期 才出現的基因,但也有可能是從低等哺乳類動物 PEPP 家族基因演化 而來 ( 顏,碩士論文,2003 )。 2002 年由 Christoph 等人發現在前列 腺癌細胞 PC-3 中 OTEX 基因之表現量會受雄性素刺激增加而升高。 也由於這項特性,讓我們不禁懷疑,OTEX 基因與前列腺癌之相關性。. (四)前列腺癌 (prostate cancer) 簡介 前列腺癌(又稱攝護腺癌) (Prostate cancer)是美國男性最常見的惡 性腫瘤,且為男性癌症死亡原因的第二位;在2003 年,美國估計會 有220,900位病患罹患前列腺癌,並造成 28,900 位病人死亡 (Jemal et al., 2003)。在台灣,國人前列腺癌的發生率和死亡率均呈逐年增加的 趨勢,根據行政院衛生署的統計,在民國91 年,前列腺癌已成為台 灣地區主要癌症死亡原因的第八位,共造成750人死亡,死亡率為6.54 人/每十萬人口 (Chen et al., 2002)。在國內,相較於其他常見的癌症, 前列腺癌的相關研究較缺乏,因此我們應投注更多的努力以研究前列. 9.

(10) 腺癌的危險因子和基因易感性,進而預防前列腺癌的發生!前列腺癌 確定的危險因子包括:年齡,種族,及家族史。前列腺癌的發生率在 不同種族間有顯著的差異性,非裔美國人最高,白種人次之,亞洲人 最低。這表示,不同種族間基因的變異,環境暴露與生活形態因子可 能在前列腺癌的發生扮演重要的角色。然而文獻上少有研究報告台灣 地區國人前列腺癌的危險因子,文獻回顧僅得在北台灣一較小規模研 究 (前列腺癌個案組90位,對照組180位) (國家衛生研究院 et al., 2003)。 前列腺 (又稱攝護腺) (Prostate) 為於膀胱的下方,解剖構造分為 peripheral zone 與 central zone,包括有腺體部分與基質部分。大部分 的 (70%) 前列腺癌 (prostate cancer) 發生在peripheral zone,前列腺 癌為腺癌 (adenocarcinoma),前列腺癌的分級系統有好幾種,最為人 熟知的應是葛里森氏分級法 (Gleason’s grading system)。此種分級法 是將癌細胞分為五級,由第一至第五級表示癌細胞分化漸趨不良。分 化良好的前列腺癌在顯微鏡下看來是互相緊靠的小型腺體,在腺體之 間基質較少,極少數細胞核會呈現分化不良。中度分化的前列腺癌則 含有較多排列紊亂的腺體,細胞核呈現較大的核仁或較差的分化,常 常有正常的腺體被癌細胞侵入其周圍,因此看起來像是良性與惡性的 腺體互相混合在一起。分化不良的高度惡化細胞則看起來已喪失腺體. 10.

(11) 的外觀, 成為互相分離,侵入基質或正常部份的零亂細胞。臨床分 期則有AJCC TNM Staging (附表一)。早期前列腺癌的症狀並不明顯, 可能有下泌尿道阻塞或刺激性的症狀,或是血尿,血精症 (hemospermia),如果骨轉移則會引起骨骼疼痛,病理性骨折,脊髓壓 迫導致下肢癱瘓…等。目前合併肛門指診 (digital rectal examination) (DRE) 與前列腺特異抗原 (prostate specific antigen) (PSA) 檢查是目 前公認最佳早期偵測前列腺癌的診斷工具;美國泌尿科醫學會、美國 癌症醫學會建議五十歲以上男性每年應例行接受肛門指診,前列腺特 異抗原檢查,但是家族中有前列腺癌病例者,應該提早自45歲開始進 行每年一次的檢查。 前列腺在人類胚胎第三個月時受到 dihydrotestesterone (DHT) 的 影響,從 genital rudiment 長出, prostate gland precursor 到胚胎第四 個月時發育完成,出生後繼續受到 DHT 影響而成長。前列腺,是一 個核桃狀的腺體組織,它的位置在陰莖底端,連接著膀胱開口位於直 腸前方。前列腺主要功能在於產生精液以便保護、支持與傳送精蟲的 活動。 隨著年紀增加,前列腺會增生而產生排尿困難,這就是良性 前列腺肥大 (Benign Prostate Hyperplasia, BPH) 。但有些腺體會因改 變而造成不受控制的生長,因此導致腫瘤形成。前列腺癌在西方國家 較常見,在美國被列為導致男性癌症患者死亡的第二大殺手。. 11.

(12) 為何會發生前列腺癌,其確切的分子機轉 (molecular mechanism) 仍然是未明的;可能牽涉的機轉包括有 Cell kinetics、Germ line mutation、DNA methylation、tumor suppressor genes and oncogenes、 androgen receptor mutation、與 growth factors and epithelial-stromal interaction。 前列腺癌確定的危險因子 (Definitive Risk Factors) 包括有:(1) 年齡:前列腺癌的盛行率隨著年齡升高而增加,在 50 歲以後,前列 腺癌的發生率與死亡率幾乎呈現指數性的增加。發生前列腺癌的可能 性在男性 39 歲以下少於萬分之一,在 40-59 歲則約為 103 分之 1, 在 60-79 歲之間則有約 8 分之 1; (2)家族史:約有 9 % 的前列腺癌 與 45 % 在 55 歲之前發病的前列腺癌有遺傳性,為 autosomal dominant fashion,被發現的基因包括有 HPC1 (the hereditary prostate cancer 1) on chromosome 1q24-25 (Rennert et al., 2005) , CAPB (Carcinoma Prostate Brain) (Datta et al., 2006) , HPC (the hereditary prostate cancer ) (Vueba et al., 2006) / ELAC2 (elaC homolog 2) (Noda et al., 2006)..等等。 p53 腫瘤抑制基因 (p53 tumor supressor gene),位 於 chromosome 17q13,是所有人類癌症最常發生突變的基因之一 (Levine et al., 1991)。在前列腺癌, p53 基因的 mutation 在 germ line 與 somatic forms 皆有被發現 (Gumerlock et al., 1997) 。近來,. 12.

(13) Hemmer 等人報告 p53 外子 4 , codon 72 的基因多型性-其產生 arginine (CCG) 與 proline (CCC) 不 同 的 氨 基 酸 - 與 白 種 人 (Caucasians) 前列腺癌危險性有關 (Henner et al., 2001) 。他們發現個 案帶有 Pro / Pro 基因型相較於 Arg / Arg 基因型有較低的前列腺癌危 險性(OR=0.14, 95% CI =0.03-0.71, p=0.017)。 P21 (Waf1/CIP1),是一調節細胞週期的cyclin-dependent kinase inhibitor ,它是p53腫瘤抑制基因的一下游的媒介者 (downstream mediator) (Xiong et al., 1993)。 P21由p53基因所誘導,接著媒介p53 引 發的G1 arrest 。 P21在前列腺癌有表現,且與前列腺癌的臨床病程 發展 (clinical outcome) 有關 (Aaltomaa et al., 1999) ,這些發現指出 p21可能是一重要的cell-cycle regulator且參與了前列腺癌的癌化及進 展 (progression)。 P21基因的變異可能可影響 p53-mediated pathway of cell cycle arrest ,且增加癌症的易感性 (susceptibility)。在 p21 codon 31 的一 個基因多型性:C-to-A change ,導致Serine (Ser) to Arginine (Arg)的 置換 (substitution) 被發現 (Mousses et al., 1995)。 P21 codon 31 基 因多型性在許多流行病學研究顯示會增加肺癌、子宮頸癌、女性乳 癌、食道癌、與鼻煙癌的危險性 (Sjalander et al., 1996) ,但其結果仍 呈分歧 (Su et al., 2003)。 (3)種族 (Race):如上述,非裔美國人有較. 13.

(14) 高的發生率。 其餘前列腺癌可能的危險因子 (Probable Risk Factors) 尚包括 有: (1) Dietary Fat:高脂肪飲食可能會增加前列腺癌的危險性。 (2) 荷爾蒙 (Hormone):由於前列腺為一 androgen-dependent organ ,雄 性素 (androgen) 的濃度,被認為和前列腺癌的危險性有關,但其和 前列腺癌危險性的相關性尚未有定論。 前列腺癌有潛力的危險因子 (Potential Risk Factors) 則有:(1)輸 精管結紮 (Vasectomy):有許多報告指出輸精管結紮會增加前列腺癌 的危險性,但後來的研究並未發現輸精管結紮會影響前列腺癌危險性 (Goldacre et al., 2005)。 (2) 鎘 (Cadmium):鎘的暴露可能和前列腺 癌有關,可能是影響鋅 (Zinc) 代謝的緣故 (Hu et al., 2004)。 (3) 維 他命 A (Vitamin A) :維他命 A 為正常上皮細胞分化所必須,維他命 缺乏和許多癌症有關,但維他命與前列腺癌的相關性,結果尚呈分歧 (Santillo and Lowe, 2006) 。 (4) 維他命 D (Vitamin D):維他命 D 的 缺乏,被認為可能是前列腺癌的一危險因子 (Bao et al., 2006)。 前列腺癌的治療方式則依據其不同時期有所差異,在侷限性 (Localized) 的前列腺癌,目前的治療方式有:根除性手術,放射治療, 如果是週邊侵犯 (Locally advanced) 則需在手術或放射治療外加上 荷爾蒙治療,如果有遠處轉移或骨骼轉移,則以荷爾蒙治療為主;前. 14.

(15) 列腺癌經荷爾蒙治療後,有部分會轉變為 androgen independent,此時 考慮給予以下治療 (一) 手術治療 (二) 放射治療 (三) 荷爾蒙治療。. (五)雄性素 (androgen)、雄性素受器 (androgen receptor), 與前列腺癌 (prostate cancer) 之相關性 在正常環境下,適量的雄性素會維持前列腺的功能及生長。雄性 素 的 產 生 是 依 據 下 視 丘 - 腦 下 垂 體 - 性 腺 路 徑 (hypothalamic-pituitary-gonadal axis) , 由 下 視 丘 分 泌 促 性 腺 激 素 (GnRH) 刺激腦下垂體,使之分泌黃體激素 (LH) 作用於睪丸萊氏細 胞 (Leydig cells) ,而產生雄性素。在男性體內循環含量最多的雄性 素為睪固酮 (testosterone), 95%由萊氏細胞製造,另外 5%於腎上腺 製造。睪固酮在體內循環大多是利用性腺結合蛋白 (sex hormonebinding globulin,SHBG),另一小部份則是成游離態。性腺結合蛋白 攜帶睪固酮至目的細胞內,細胞內含有 5’-alpha-reductase 使睪固酮轉 變成活化態 5’-alpha-dihydrotestosterone (DHA) 與雄性素受器有非常 高的親和力,所以 5’-alpha-reductase 被認為在前列腺癌生成中也扮演 很重要的角色 (Culig et al., 2000);(Debes and Tindall, 2002)。 雄性素受器是一種會受到雄性素結合而活化的轉錄因子 (ligand-activated transcription factor) , 是 屬 於 nuclear receptor. 15.

(16) superfamily ,基因位在 X 染色體上,含 8 個內子,轉譯為 919 個氨 基酸的蛋白質。可分為 3 個主要區域 (1) 受體結合區 (ligand-binding domain):含有調節性序列 (TAF-2);(2) DNA 結合區 (DNA-binding domain) : 含 有 2 個 zinc finger domain ; 及 (3) 轉 錄 活 化 區 (transactivation domain):帶有轉錄活化因子 (TAF-1) 區。沒有和受體 結合的雄性素受器會與 heatshock protein 90、70 和 56 結合以避免非 專一性活化。雄性素與雄性素受器結合,便會使受器上第 21 個胺基 酸磷酸化,zinc finger domain 會與 androgen-responsive element (ARE) 結合,活化目標基因啟動子,使之進行轉錄,以增加前列腺細胞的生 長 (Culig et al., 2000;Debes and Tindall, 2002)。 而目前的研究發現歐美族群發生前列腺癌機率較高的原因,可能 是因為前列腺長期暴露在高劑量的雄性素中。往上一代推,發現歐美 47%懷孕婦女之雄性素的含量較高,也就是說子代在胎兒時期就已經 暴露在高濃度雄性素環境中;而亞洲種族發生前列腺癌機率較低,調 查原因發現亞洲種族 5’-alpha-reductase 以及 SHBG 的含量都較少活性 也較低,由於這些因素,所以使得前列腺不會長期暴露在高劑量雄性 素環境中 (Debes and Tindall, 2002)。 在前列腺癌中,不受調控的雄 性素或雄性素受器會刺激細胞產生 cyclin-dependent kinase 活性使細 胞過度增生,並抑制細胞凋零,導致前列腺癌的發生 (Debes and. 16.

(17) Tindall, 2002)。. (六)同源箱基因與前列腺癌之相關性 由過去一些研究可知,有些同源箱基因可藉由改變前列腺癌細胞 增生、凋零之平衡狀態,而導致前列腺癌的發生。. (1) NKX3.1 NKX3.1 是第一個被證實為胚胎時期前列腺發育時表現之專一性 同源箱基因 (Bhatia-Gaur et al., 1999)。 NKX3.1 屬於 Human NK 家族 之同源箱基因,位在人類染色體 8p21 的位置 (Gao et al., 2000)。個體 出生後基因大量表現在前列腺內側 (ventral prostate)、前列腺外側 (dorsolateral prostate)、前列腺前端 (anterior prostate),睪丸則有少量 的表現 (Bhatia-Gaur et al., 1999)。研究發現在前列腺癌細胞中, NKX3.1 可受雄性素刺激而抑制其表現量,證實此基因為一個受荷爾 蒙調節的同源箱基因(Korkmaz et al., 2000)。在臨床上,從前列腺癌組 織切片觀察 NKX3.1 蛋白質表現情形,發現在良性增生組織, NKX3.1 表現比正常組織減少了 5%、高度內層上皮細胞瘤則減少 20%、荷爾 蒙治療無效之組織減少 34%、轉移癌組織減少 78% (Bowen et al., 2000),因而判斷 NKX3.1 為前列腺專一性抑癌基因。. 17.

(18) (2) GBX2 GBX2 位在人類染色體 2q37、表現組織很廣,包含有大腦、心臟、 脾臟、胎盤、卵巢、前列腺,利用 RT-PCR 得知在前列腺癌細胞株中 GBX2 表現量大於正常上皮細胞株,再利用定量 PCR 計算前列腺癌組 織與正常組織 GBX2 RNA 表現差異,證實前列腺癌組織 GBX2 RNA 表現量大於 3x105 copies /μg RNA 佔 67%、而正常組織 GBX2 RNA 表 現量大於 3x105 copies /μg RNA 只佔約 20%。進一步以 EMSA (electrophoretic mobility shift assay) 證實, GBX2 利用與 IL-6 基因啟 動子 ATTA 序列結合,而啟動 IL-6 之表現,由之前研究可以得知 IL-6 表現量增加,可以使得前列腺癌細胞大量增生,因此 GBX2 可能是藉 由 IL-6 來調控前列腺細胞之生長 (Gao et al., 2000)。. (3) HOXC8 屬於 HOX 同源箱基因家族,位在人類染色體 12 號上。利用前列 腺癌細胞組織切片,證實 HOXC8 RNA 主要表現於惡性前列腺上皮細 胞,且表現程度與癌症惡化程度成正比,Gleason score 3-5 之組織並 沒有 HOXC8 之表現,Gleason score 6 組織 HOXC8 表現 20%之細胞, Gleason score 7-9 HOXC8 表現則高達 92%,由此可知,HOXC8 基因 之表現隨前列腺癌細胞分化程度有關,分化程度越差基因表現量越 高;反之,則減少,故推論此基因亦為調控前列腺癌的重要同源箱基 18.

(19) 因之ㄧ (Waltregny et al., 2002)。. 貳、研究目的 先前的研究已發現 OTEX 基因會在前列腺組織及前列腺癌細胞株 中表現,而且受到雄性素的調節,而已知雄性素與受體結合後之訊息 傳遞路徑與前列腺之發生有密切相關性,所以我們懷疑 OTEX 基因可 能在癌化的過程中扮演了重要角色,所以本論文主要目的是探討 OTEX 基因與前列腺癌間之關係。. 參、研究設計 (1)之前實驗室已對不同器官、組織進行 RT-PCR 分析,發現 OTEX 基因有在大腦表現,所以以 SK-N-SH 及 IMR32 腦神經母瘤細胞株為 樣本,分析 OTEX 基因於這些細胞株內的表現 。 (2)利用 Real-time PCR 分析 BPH 和 PCa 病人前列腺檢體 OTEX 表 現情況,以了解癌化與 OTEX 表現之相關性。 (3)測試 OTEX 是否直接受到雄性素之調節,利用 OTEX 啟動子的 冷光載體,以探討此問題。 (4)過量表現 OTEX 基因與 PC3 細胞株中,以評估基因對細胞生長 及分化之影響。 研究架構,如圖一所示。 19.

(20) 肆、材料與方法 (一) 研究材料 細胞株: (1) LNCaP 細胞株 (ATCC no. CRL-1740):P53 mutant,人 類前列腺惡性腫瘤,淋巴結轉移,依賴雄性素的前列腺癌 細胞,轉移到淋巴節,培養在 RPMI-1640 培養液裡,培養 環境為 37℃,5% CO2& 95% 大氣之培養箱。每三天更換 一次培養基,每 7~9 天進行一次繼代培養。 (2) PC3 細胞株 (CRL-1435):P53 null,人類前列腺惡性腫 瘤,不依賴雄性素的前列腺癌細胞,轉移到骨髓,培養在 F12K 培養液裡,培養環境為 37℃, 5% CO2& 95%大氣之 培養箱。每三天更換一次培養基,每 7~9 天進行一次繼代 培養。. 藥品: (1) 以下藥物購自 Sigma: Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Hygromycin HEPES 20.

(21) R1881 (人工合成雄性素) (2) 以下藥物購自 GIBCO: G418 (Geneticin) Sodium bicarbonate Sodium pyruvate Penicillin / Streptomycin (3) 以下藥物購自其他公司: Isopropanol Chloroform FBS 試劑: (1)以下試劑購自 Invitrogen: TRIZOL® Reagent (RNA 萃取試劑) SuperScript™ III Reverse Transcriptase (200 U/µl) (反轉錄試 劑) 5X First Strand Buffer[250 mM Tris-HCl(pH 8.3),375 mM KCl,15 mM MgCl2] (反轉錄試劑) 0.1M DTT (反轉錄試劑) (2) 以下試劑購自其他公司: oligo(dT)15 Plasmid Mini kit (DNA 萃取試劑). 21.

(22) Qiaprep Spin Miniprep kit (DNA 萃取試劑) 10 mM dNTP Mix(10 mM each dATP, dGTP, dCTP and dTTP at neutral pH (反轉錄試劑) RNaseOUT Recombinant RNase Inhibitor (反轉錄試劑) RNaseOUT Recombinant RNase Inhibitor (Porcine) 限制酶均購自: New England Biolabs Inc. 引子 ( primer ): 本論文所使用的核酸引子大部分合成自台灣明欣公司,少 部分來自生工有限公司,以及 TPX-1F、TPX-1B 來自 Genset oligos Primer. Sequence(5’→3’). 用途. T7. 5'-TGTAATACGACTCACTATAGGGC-3'. cloning (pGEM-T Easy). Sp6. 5'-TTAGGTGACACTATAGAATACTCA-3'. cloning (pGEM-T Easy). ARE-F. 5'-GGCTCTTCAGGGTTTTTC-3'. cloning OTEX 啟動 子. ARE-B2. 5'-GGCTGGAGCGCTGCGCCCC-3'. cloning OTEX 啟 動. 22.

(23) 子. OTEX-ptF. 5'-CCGAGTAGGGTGTAGTCAGCAAAG-3'. confirming OTEX 啟動 子. OTEX-ptB. 5'-GCACAAGCAAGAGAGGGAATGG-3'. confirming OTEX 啟動 子. OTEXproARE-B. 5'-TCAACACAGAATAAACACGAGGCTG-. confirming. 3'. OTEX 啟動 子. RVprimer3m-F. 5'-ACTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAG-3'. cloning (pGL3modified vector). GLprimer2-B. 5'-CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA-3'. cloning (pGL3modified vector). B-actinF'. 5'-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3'. RT-PCR control. B-actinB'. 5'-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3'. RT-PCR control. TPX-1F. 5'-GTCCACGACACCGTGTTCTACTG-3'. TPX-1B. 5'-AGAGGAGATAAGGGTAGCCTGAGC-3' OTEX PCR. 23. OTEX PCR.

(24) AI631510-F. 5'-AAAATAAGCCCCACACCTCAGC-3'. OTEX PCR. AI631510-B. 5'-CCCGCACTTTGTCTTCAGTCAC-3'. OTEX PCR. PSA3’-F. 5'-CTCTCGTGGCAGGGCAGT-3'. PSA PCR. PSA3’-B. 5'-GAGGCGTAGCAGGTGGTC-3'. PSA PCR. OTEXproMscIPacI-F. 5'-TTCTC AAAGG GTGCG TTAG-3'. OTEX 啟動 子 sequencing. 儀器: PCR machine (Astec PC320) PCR gradient machine (Astec PC-818A) 超高速離心機 Model J2-21 centrifuge (Beckman) Microplate autoreader EL-311 (Bio-TEK) TD-20/20 Single-Tube Luminometer (Turner Biosystems) Dry Bath Incubator (Major Science) Plasmids: pGEM-T Easy Vector (3015 bp) pGL3-Basic-pcDNA modified Vector (6079 bp) phRG-TK Vector (4843 bp) pERV3 (8.4 kb) pEGSH (4.8 kb) pEGSH-luc (6.4 kb). (二) 實驗方法 24.

(25) (1)神經母細胞瘤株 SK-N-SH 及 IMR32,OTEX 基因表現之 分析: 1.RNA 之萃取: 取細胞 (2 x 106 個) 離心 1200 rpm 5 分鐘,去除上清液。加入 0.5 ml TRIzol (Invitrogen),室溫放置 5 分鐘。加入 0.1 ml 氯仿,劇烈震 盪 15 秒,室溫放置 3 分鐘。於 4 ℃ 12000 rpm 離心 15 分鐘。取上清 液, 加入 0.25 ml 異丙醇,室溫放置 10 分鐘。於 4 ℃ 12000 rpm 離 心 10 分鐘。去除上清液,加入 0.5 ml 75%酒精。於 4 ℃ 7500 rpm 離 心 10 分鐘,去除上清液。真空加熱,乾燥 RNA,去除殘留酒精。加 入 20 μl 60℃ DEPC-H2O,充份溶解,並保存 RNA 於-70 ℃。 2.反轉錄 PCR (reverse transcription PCR): 1.取 Oligo dT (500 μg/ml) 1 μl、RNA 1-5 μg 補水至 16 μl 2.70 ℃加熱 10 分鐘 3.加入 10X Stratescript (Stratagene) buffer 2 μl、0.1 M DTT 2 μl 及 10 mM dNTP 1 μl,於 37℃反應 2 分鐘 4.加入 RNase inhibitor (40 U/μl) (波仕特) 2 μl、Stratescript (50 U/μl) (Stratagene) 1 μl,於 37℃反應 2 小時 5.利用引子 B-actinF’、B-actinB’引子,當做對照組:denature 溫度是 94 ℃ for 5 min,之後進行 35 cycles 之反應:94 ℃ for 1 min,49 ℃ for. 25.

(26) 1 min,72 ℃ for 2 min,final elongation:72 ℃ for 10min。 6.也利用兩對引子 AI-631510-F 及 B,TPX-1F 及 B 來作為偵測 OTEX 表現用:AI631510-F、AI631510-B,先 denature:94 ℃ for 5 min,才 進行 35 cycles:94 ℃ denature for 1 min,56 ℃ for 1 min,72 ℃ for 2 min,最後 elongation:72℃ for 10min,另一組引子 TPX-1F、TPX-1B, 先 denature 94℃ for 5 min,才進入 35 cycles:94℃ for 1 min,55℃ for 1 min,72℃ for 2 min,最後 elongation:72 ℃ for 10min。. (2)利用 Real-time PCR (TaqMan PCR)分析 BPH , PCa 病人 PSA ( KLK3 )和 OTEX 的表現情形 1.抽前列腺組織RNA:參考Invitrogen TRIzol Reagent Protocol,秤 取10 pg~5 μg的前列腺組織塊(由臺北醫學大學附設醫院泌尿科及病 理科提供),用180℃隔夜烘乾的剪刀剪碎,放入研缽中,然後倒入液 態氮,把組織磨碎,把磨碎組織倒入15 ml離心管,加入1 ml Trizol reagent,於室溫反應5分鐘,加入0.2 ml chloroform,均勻震盪15秒, 放在室溫3分鐘,於4℃下離心11.5G 15分鐘,取上清液放入另一 eppendorf中,加入0.5 ml isopropyl alcohol,上下翻轉3次,於室溫下 反應10分鐘,再於4℃離心11.5G 10分鐘,去上清液,以0.5 ml 75% alcohol 洗RNA沉澱物,倒掉上清液,加1 ml 75% alcohol,左右上下. 26.

(27) 輕搖數次,於4°C離心7500轉5分鐘,小心倒掉上清液,用真空抽乾, 加入約20 μl DEPC-H2O溶解後,測OD260/280定量,分裝5 μg RNA於 eppendorf中,儲存於-70℃冰箱中。. 2.反轉錄作用:取10 pg~5 μg的mRNA,加入1 μl oligo(dT) (50 μM) 及1 μl (50 μM)的random primer及1 μl 10 mM dNTP mix加入微離心管 內,加滅菌水到總體積為13 μl,原混合液在65℃加熱5分鐘,置於冰 上至少1分鐘後,把微離心管快速離心,然後加入4 μl 5X First-Strand Buffer、1 μl 0.1 M DTT、1 μl RNaseOUT Recombinant RNase Inhibitor 及1 μl SuperScript III RT反轉錄酶,藉由pipetting混合均勻。如果使用 random primer作反應,此時先把微離心管先放在25℃作用5分鐘。把 微離心管放在50°C作用30分鐘到1小時,進行反轉錄反應。再把溫度 提高到55℃ 10分鐘以避免模板產生特殊二級結構。最後利用70℃ 15 分鐘讓酵素去活化。經此反應完成之單股的cDNA可以當成PCR反應 的模板。. 3.聚合酶連鎖反應確認測試:取 10 倍稀釋的模板 cDNA 1 μl,加 入 10X buffer 1.5 μl、2.5mM dNTP 1.2 μl、forward primer 及 backward primer 各 0.5μl、Taq 0.1 μl 及 H2O 10.3 μl,進行 PCR 反應(利用 B-actinF’ 、 B-actinB’ , PSA3’-F、PSA3’-B , TPX-F、AI631510-B primer) 確認 cDNA 品質。. 27.

(28) 4.Real-time PCR: 利用 ABI 網站 (www.appliedbiosystems.com) 的 ”Search for TaqMan® Gene Expression Assays” 的 找 尋 適 當 的 primer,選擇跨內子的 primer,所採用的 primer 分別是 Hs00426859_g1 (KLK3) 和 Hs00411370_m1 (OTEX) 。由陽明大學”微陣列及基因表 現分析核心設施”協助完成 Real-time PCR,上機前先做 QC,把 QC 通過的 samples 拿去上機,samples 沒過的,仍有一次補 samples 的機 會,補 samples 之後仍會做 QC,仍沒過的 samples 需要簽切結書才會 做,最後把做出來的 samples data 以 EXCEL 檔寄回,反應流程如附 圖二。 CT 值為樣品 PCR 反應突破 threshold line 所需要的循環數, 需 選取在 PCR 呈現對數期增加之區域,計算公式為△CT = CT ( KLK3 or OTEX )-CT (β-actin ),而 OTEX RNA 相對於 β-actin RNA 為△CT, OTEX RNA 相對於 β-actin RNA 的表現量=2. -△C. T,而且△△CT. =△CT. (PCa)-△CT(BPH),為比較 KLK3 或 OTEX 基因在不同程 度病人的表現情形。. (3)OTEX 基因表現受雄性素受器調節之分析 1.啟動子選擇策略: 利用Promoter Scan (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan/) 分 析OTEX 基因上游1 kb序列,建構不同OTEX 啟動子片段的firefly. 28.

(29) luciferase質體DNA , transient transfect入LNCaP細胞後,再給予 LNCaP細胞雄性素促效劑R1881 (10nM) (Kizu et al., 2004),藉著測量 冷光的表現量 (如圖二) 是否有變化,來判斷OTEX 啟動子活性是否 有受到R1881的調控。. 2.Reporter 質體之選殖: 設計不同片段 OTEX 啟動子的螢火蟲冷光載體 DNA (如圖三、 四、五、六),和另一個 internal control DNA:phRG-TK (如附圖四) 在 transient transfection 共轉入細胞後,給予雄性素促效劑 R1881,做冷 光測定, 判斷雄性素促效劑 R1881 是否會直接影響細胞表現冷光基 因。. 3.OTEX啟動子載體構築: 把OTEX 1.2 kb啟動子片段從BAC clone “RP11 42G24”做PCR放 大,選殖到T-A cloning vector,之後利用SpeI及NcoI把此片段自 pGEM-T Easy vector中切出,利用Sticky ends接入用SpeI及NcoI各切1 刀的pGL3-basic-pcDNA modified vector(由李桂楨老師實驗室提供) (如附圖三),做heat shock轉型作用,使用colony PCR篩選colony,用 菌落質體vector上的primer (RVprimer3m-F及GLprimer2-B) 做colony PCR,成功挑到colony,之後利用EcoRV, BglII (如圖四)切掉片段, 用Klenow polymerase補平5’ overhang,用T4 ligase於4℃隔夜接合blunt. 29.

(30) ends及利用MscI,SpeI (如圖四)切掉片段, 用Klenow polymerase補平 5’ overhang, 用T4 ligase於4℃隔夜接合blunt ends及利用MscI,PacI (如圖四)切掉片段,以及T4 DNA polymerase切掉3’ overhang,然後利 用T4 DNA ligase 於4℃隔夜把Blunt ends接起來,以製造不同form的 啟動子片段,做heat shock轉型後,做colony PCR,養菌抽DNA,限制 酶切割Mapping (如圖五) 後,送定序確認 (如圖六)。. 4.轉型作用(Transformation): 取ligation完成之DNA 4 μl 加入20 μ l DH5α competent cell中,置 於冰上15分鐘。 42℃加熱45秒,再放置冰上。將菌液均勻塗佈於LB 培養皿 (含Ampicillin 100 μg/ml ) 上,於37 ℃培養14~16小時 5.OTEX基因啟動子的transient transfection及功能性分析: 培養LNCaP細胞於24-well培養盤上 (2 × 105 個細胞),待細胞生 長至 8 分滿時,用 2 µl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 轉移 0.8 µg 質 體 DNA 進入細胞中。其作法是將溶液 A (0.8 µg DNA in 50 µl RPMI) 及溶液 B (2 µl lipofectamine 2000 in 50 µl RPMI) 均勻混合後,置於室 溫下 30 分鐘,待 Liposome 的形成後,加入培養液中,於 37℃培養 6 小時,之後用 PBS wash 1 次,換成 charcoal treated-FBS RPMI 或 no-FBS RPMI 一天後, 給予 R1881 10nM RPMI 24 小時後 (如圖二), 以培養液沖下細胞,離心 0.1G 5 分鐘,去除上清液,加入 PBS wash. 30.

(31) 離心 0.4G 5 分鐘,去除上清液,取得細胞後,加入 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) 中之 PLB 試劑,混勻後,以液態氮 冰凍、解凍二次打破細胞,再離心 16.1G 1 分鐘,取上清液,分別加 入 firefly luciferase 的受質 LAR II 和 Renilla luciferase 的受質 Stop&Glo 作用後,以冷光儀 ( TD-20/20 Luminometer ) 於不同波長測定 firefly 及 Renilla 的冷光強度,所測得的 Renilla 冷光強度可作為轉移效率的 內 在 控 制 組 , 以 比 較 不 同 片 段 啟 動 子 的 強 度 。 將 表 現 的 firefly luciferase 活性與當基準值的 Renilla luciferase 活性相比後, 給予 R18811 與沒給予 R1881 相比,可得知 R1881 是否會影響啟動子活性, 將其餘啟動子片段互相比,可得知 R1881 結合的 ARE 位置對啟動子 的影響,經六重複 (duplicate) 後,取的一個平均值,挑選離平均值 較近的三個數字,得到平均值及標準差,並利用 t-test 分析重組質體 間相對活性的差異。. (4) OTEX 的過量表現對 PC3 細胞株之影響 為了更進一步瞭解OTEX的功能,所以我們架構OTEX表現質體 (pEGSH-OTEX),再經colony PCR確定OTEX cDNA片段接入的方向為 正接及限制酶切割確認 (如圖九),並且經由核酸定序結果確定在 OTEX cDNA與pEGSH載體接合處無任何鹼基脫落或增加 (如圖十),. 31.

(32) 所以可以確定OTEX與其後FLAG之in frame,故之後可以FLAG抗體偵 測OTEX蛋白表現。 Complete Control® Inducible Mammalian Expression System: 昆蟲細胞的蛻皮激素 (ecdysone) 調節系統在缺乏蛻皮激素類似 物 (ponasterone A) 情況下,重組蛻皮激素受體 (recombinant ecdysone receptor) 可與對應之ecdysone responsive element結合,抑制 啟動子之基本表現;加入ponasterone A 後,引發蛻皮激素受體蛋白 質產生構形變化 (conformation change),對基因表現的影響由抑制轉 為誘導,如附圖五。 OTEX inducible construct transfection: 利用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 把 OTEX cDNA-inducible 質 體 DNA transfection 送到 PC3 細胞株內。首先種 2x105 個 PC3 細胞至 24 well 中的一個 well 內,每個 well 內含有 0.5 ml medium,於 37 °C 培養 48 小時。 先準備(A) DNA 0.8 μg 加入無血清和無抗生素培養液 F12K 配到 50 μl (DNA 為 pERV3 DNA (如附圖六) 以及之後 pEGSH-OTEX cDNA inducible construct (如圖八) , (B) 2 μl Lipofectamine 2000 加無血清 無抗生素培養液配到 50 μl 反應 5 分鐘,將(A)(B)均勻混合,反應 20. 32.

(33) 分鐘,把(A)(B)混合液加入 24 well 中含有無血清和無抗生素培養液 F12K 500 μl 細胞中,於 37°C 反應隔夜。將培養皿 24 wells 中無血清 和無抗生素培養液 F12K 換成含血清及抗生素之培養液 F12K。. Stable clone selection (pERV3) 隔天之後利用 200 μg/ml G418 (Geneticin) 篩選細胞株 3 個星期, 之後降低為 100 μg/ml G418 (Geneticin) 維持細胞成長,等細胞數目夠 多時,在 24 well 內加入 200 μl 10x Trypsin 5 分鐘後,加入 200 μl F12K 中和 trypsin 作用,然後利用抽吸方式,把細胞沖散,把細胞 supernatant 移置已注入 3 ml F12K 的 6 cm2 培養皿內,等 2 天後,細胞貼附在培 養皿上,用 100 μg/ml G418 維持細胞生長至一定數量。. Clonal clone selection (pERV3) 細胞轉型後,隔天利用 200 μg/ml G418 (Geneticin) 篩選細胞株 3 個星期, 在 24 well 內加入 200 μl 10x Trypsin 5 分鐘後,加入 200 μl F12K 中和 trypsin 作用,然後利用抽吸方式,把細胞沖散,取出放入 15 ml 離心管內,離心 1200 轉 5 分鐘,倒掉上清液,加入 1 ml F12K medium 把細胞打散,數細胞個數,數完細胞後,算好 seeding 入 96 wells 的細胞懸浮液體積,數目小於等於 1 個細胞數的體積 seeding 入 96 wells 內,在把細胞 seeding 入 well 內之前先把 medium 補足至 50 μl,. 33.

(34) 等 1 天細胞貼附在 96 wells 培養皿上,挑每個 well 內僅含 1 個細胞, 在上面做記號,隔天用 100 μg/ml G418 維持細胞生長,培養到細胞數 目 9 成滿時,抽掉 medium,用 PBS 清洗,加入 20 μl 10x Trypsin 5 分鐘後,加入 20 μl F12K 中和 trypsin 作用,然後利用抽吸方式,把 細胞沖散,把細胞 supernatant 移置已注入 460 μl F12K 的 24 well 內,等 2 天細胞貼附在培養皿上,用 100 μg/ml G418 維持細胞生長至 8~9 成滿,抽掉 medium,用 PBS 清洗,加入 200 μl 10x Trypsin 5 分 鐘後,加入 200 ul F12K 中和 trypsin 作用,然後利用抽吸方式,把細 胞沖散,把細胞 supernatant 移置已注入 3 ml F12K 的 6cm2 培養皿內, 2 天後細胞貼附在培養皿上,用 100 μg/ml G418 維持細胞生長至 8~9 成滿,抽掉 medium,用 PBS 清洗,加入 1 ml 10X Trypsin 5 分鐘後, 加入 1 ml F12K 中和 trypsin 作用,然後利用抽吸方式,把細胞沖散, 把細胞 supernatant 移置已注入 8 ml F12K 的 10 cm2 培養皿內,等 2 天細胞貼附在培養皿上,用 100 μg/ml G418 維持細胞生長至 8~9 成滿。. Morphology 觀察 利用顯微鏡觀察細胞外觀、型態、聚集程度等等。. MTT assay -細胞存活率測定:. 34.

(35) 原理:MTT assay 是常用於測定細胞存活率的分析方法, MTT (3( 4,5dimethyl – thiazol - 2-yl) - 2,5-diphenyltetrazolium bromide )為一種 水溶性、呈現黃色的 tetrazolium 鹽類。此鹽類若與細胞之粒線體中的 去氫酶作用,其鹽類結構中的 tetrazolium ring 會被切斷,形成紫色非 水 溶 性 的. formazan. (1- ﹝ 4,5-dimethyl-thi-azol-2-yl ﹞ -2,5-. diphenyl-formazan) , 以 DMSO 溶 解 之 , 在 此 利 用 enzyme-link immunosorbent assay(ELISA)reader 分析,在波長 570 nm 下測其吸 光值,因為只有活的細胞具有活性粒線體去氫酶酵素(如附圖七),若 吸光值愈大,則表示細胞存活率愈高,故所測得的吸光值與細胞存活 率成正比,因此我們可利用 formazan 產量多寡評估細胞存活率。 方法:MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium , bromide) 製備 (最終濃度0.5 mg/ml):100 mg MTT 溶於 18.18 ml PBS溶液中,在24wells中,每well加入50 μl MTT,置入37℃ 培養箱,反應2小時。吸去上清液,每well加入500 μl DMSO,輕輕搖 晃,使結晶溶解,將紫色上清液取出加入到96 well盤之其中2 well內, 以570 nm測吸光值。. 伍、結果 (1)分析神經母細胞瘤株 SK-N-SH 及 IMR32 表現 OTEX 基因之情形,. 35.

(36) 結果我們發現這 2 株細胞株並沒有表現 OTEX 基因,如圖十二。. (2)由於 GenBank database 之資訊日新月異,我們之前實驗室已由 Zoo blot 分析得知 OTEX 只存在 human genome 中,但我們仍持續搜尋 OTEX 基因在其他物種存在之情況,結果我們發現黑猩猩的 X 染色體 上有和人類 OTEX 非常相似之區域,由於目前並尚未有黑猩猩 OTEX 之 EST clone,我們只由基因組序列比對,做一個人類的 OTEX 基因 序列和黑猩猩的比較不同相異處圖,圖中把相異處用三角形標示出來 並註明相異核苷酸,如圖十三所示。. (3)利用real-time PCR檢測我們由前列腺組織萃取出來的RNA經反轉 錄作用獲得cDNA,送至國立陽明大學”微陣列及基因表現分析核心設 施”協助,後續Real-time PCR ( TaqMan PCR )之工作 (如附圖二),所 得到之CT值可反應出目標cDNA的最初量,且與最初量呈反比的比率。 我們可利用CT值的高低比較BPH,PCa病人的前列腺組織KLK3 ( PSA ) 和OTEX 的表現量,以β-actin RNA的表現量來當作內生性的控制組, 在KLK3 (PSA) 中,BPH的平均△CT為-7.1720,PCa的平均△CT為 -6.6056,KLK3 (PSA) △CT的t-test結果P=0.66818,沒有達到統計上的 意義,而△△CT = △CT (PCa)-△CT (BPH) = -6.6056- (-7.1720) = 0.5664,Relative Quantity=2. -△△C. T=2. 36. -(0.5664). =0.6753,所以the ratio of.

(37) PCa/BPH =0.6753,在OTEX中, BPH的平均△CT為8.6126, PCa的 平均△CT為8.7996, OTEX △CT的t-test結果P=0.9195沒有達到統計上 的意義,而△△CT=△CT (PCa) - △CT (BPH) = 8.7996 - 8.6126 = 0.187, Relative Quantity=2. -△△C. T=2. -(0.187). =0.8784,所以the ratio of PCa / BPH. =0.8784,因此KLK3 (PSA) 基因表現量在PCa相對於KLK3 (PSA)基因 表現量在BPH為0.6753, OTEX基因表現量在PCa相對於OTEX基因表 現量在BPH為0.8784。. (4)OTEX 啟動子由 BAC clone “RP11 42G24” ( 由王憶卿老師實驗室 提供 ) 作 PCR 放大,把 PCR products 接入 pGEM-T Easy vector 中, 利 用 限 制 酶 構 築 出 四 種 啟 動 子 片 段 的 冷 光 載 體 , 用 DLR (dual luciferase reporter assay) 藉由冷光的表現量來測試啟動子的活性,結 果顯示在圖四 A 圖中存在預期 ARE site、SRF site 和 T-Ag site,當 R1881 加入時,RLA(relative luciferase activity)比值降低,推測可能具 有 ARE silencer,抑制啟動子活性,雖然具有 ARE site 但是啟動子恢 復活性抵不過被抑制,所以加 R1881 後,冷光值降低,在圖四 B 圖 中具有 T-Ag site 缺少預期 ARE site、SRF site 和,當 R1881 加入時, RLA(relative luciferase activity)比值也降低一些,推測啟動子可能具有 弱的 ARE silencer binding site,抑制啟動子活性,但是在圖四 C 圖中. 37.

(38) 缺少預期 ARE site、SRF site 和 T-Ag site,當 R1881 加入時, RLA(relative luciferase activity)比值稍微升高,推測可能缺少 ARE site,使得啟動子活性恢復,以及缺少強的及弱的 ARE silencer binding site,啟動子活性不被抑制,所以啟動子活性升高一些,在圖四 D 圖 中存在預期 ARE site,缺少 SRF site 和 T-Ag site,當 R1881 加入時, RLA(relative luciferase activity)比值明顯升高,推測可能缺少強的及弱 的 ARE silencer binding site,抑制啟動子活性,但是具有預期 ARE site,在加入 R1881 時,使得啟動子活性升高。. (5)利用 G418 篩選已經做 pERV3 基因轉殖的 PC3 前列腺癌細胞,篩 到的細胞分 stable clone 和 clonal clone,把篩到的 clone 用 control 質 體”pEGSH-luc”做 transient transfection,做二重覆 (duplicate) 確認, 做 transient transfection 隔 1 天後,把 PonA 配成 5 μM,10 μM F12K, 換入 24 wells 內,等 12 小時後,測 luciferase 活性,來確認 pERV3 是否有進入 PC3 細胞內,把冷光測出的值高的,即表示 pERV3 有進 入細胞中,所以後來活性高的有 stable 1、clonal 1、clonal 3,把這些 細胞株轉入 pEGSH-OTEX cDNA inducible 質體,用 hygromycin 做篩 選, 使用 200 μg/ml hygromycin 篩選轉殖 pEGSH-OTEX DNA 的 pERV3-stable1、pERV3-clonal 1、pERV3-clonal3 PC3 細胞,篩選一個. 38.

(39) 星期後,降低濃度至 50 μg/ml 使得篩完的細胞維持增生到一定數 量,以進行後續實驗分析。. 陸、討論 (1)之前實驗室已經利用 RT-PCR 分析過人體不同組織 OTEX 的表 現,發現在前列腺、睪丸、副睪、卵巢和大腦中均有 OTEX 之表現, 所以我們想了解腦神經母細胞瘤株 SK-N-SH 和 IMR-32 是否也有 OTEX 基因的表現,結果在做完實驗後發現此二株細胞沒有 OTEX 基 因的表現,很可能剛好此二株細胞株沒有表現 OTEX 基因,如圖十 二,以 OTEX 引子對 (TPX-1F 及 AI631510-B) 作 PCR 放大分析,均 無法偵測到 OTEX 之表現,β-actin 引子對放大之結果說明 RNA 之萃 取及 RT-PCR 並沒有問題。. (2)利用 NCBI 提供 Blast 的功能,把 OTEX 基因和 OTEX 蛋白質 比對其他物種基因庫和蛋白質資料庫,比對的結果大部分相似度都很 低, 只有黑猩猩的 DNA 相似度很高,人類的 OTEX 基因序列和黑猩 猩的比較不同相異處圖,圖中把相異處用三角形標示出來並註明相異 核苷酸 (如圖十三),而蛋白質的相似度為 100%, 所以 OTEX 基因 為演化後期才出現的基因。. 39.

(40) (3)利用 Real-time PCR 比較 KLK3 和 OTEX 基因表現在 BPH 和 PCa 病人前列腺有無顯著差異時,算出△CT 的 t-test 沒有顯著差異,但是 在半定量 (志宏學長完成) 的結果下,有顯著差異,其中的原因有可 能是 cDNA 內雜質太多, samples 數不夠多,而這次只用 20 個 samples, 做同步定量 PCR 費用二萬多元,如果病人數目夠多且按照 Gleason Score 來分類或者是腫瘤大小,腫瘤病理時期等等,做統計比 較,很可能就會有統計上的差異了。. (4) 利用從王憶卿老師實驗室提供的 BAC clone “RP11 42G24”, 用 PCR 把 OTEX 啟動子 clone 出來,把 PCR 產物和 pGEM-T Easy vector (3015bp)做 T-A cloning,使用 colony PCR 確認,在成功挑到 colony 後,養細菌抽質體 DNA,用限制酶做 Mapping,送定序,確認沒問 題後,把它用限制酶 NcoI 和 SpeI 切下啟動子,和用 NcoI 和 SpeI 處 理過 pGL3-Basic-pcDNA modified luciferase 質體 DNA 做接合,用 colony PCR 挑到菌落後,抽 DNA,用限制酶做 Mapping (如圖五), 送定序 (如圖六),確認無誤後,做啟動子不同片段的質體 DNA,完 成不同片段的啟動子,以會受到雄性素調控表現 OTEX 基因的 LNCaP 當我的目標細胞,做 4 種不同啟動子片段的 transient transfection 後, 給予 R1881 (人工合成的雄性素),啟動子是否會受到 R1881 的結合而. 40.

(41) 表現量增加,在 data 顯示上,不同片段啟動子的冷光活性表現量有不 同,結果在 R1881 加入與否測出有相異的為,在 Charcoal-treated RPMI medium 中 construct(A)(B)在 R1881 給予後,活性皆降低,然而 construct(C)(D)活性反而升高,而還需要再做不同缺失片段來確認啟 動子更詳細的活性區域。. (5) 起 初 使 用 pEF/OTEX/IRES/hrGFP 表 現 OTEX cDNA 和 pEF/IRES/hrGFP 對照組載體,利用表現 hrGFP reporter 基因,使用 G418 去篩選,因為細胞容易因為換 medium 時而漂浮起來,不能全 部換掉 medium,所以必須殘留少許 medium 時,導致某些不表現螢 光細胞和 transient 表現螢光細胞死後仍在培養皿中,因為螢光蛋白半 衰期很長,容易干擾判斷,篩到後來看到的具有螢光細胞,幾乎都是 死細胞,沒有看到有活的細胞,如果是 OTEX 基因對細胞造成死亡, 但是對照組質體的細胞應該存活,反而篩到後來轉殖 OTEX 基因和轉 殖載體細胞皆死光,所以很難判定是 OTEX 基因對細胞造成影響, 還 是對照組質體對細胞造成影響,此實驗重複了 3 次,最後都是同樣結 果,後來利用 inducible construct 系統建構 OTEX cDNA 的可被誘導載 體,細 胞 株 則 改 用 比 較 容易貼的前列腺癌細胞 PC3 ,首先利用 Lipofectamine 2000 轉殖 pERV3 質體 DNA 進入細胞,利用 G418 做篩. 41.

(42) 選,篩到 stable 和 clonal 細胞株後,用 control 基因 pEGSH-luc 做 pERV3 是否存在的確認,也就是在加 Pon A 後,測冷光值,冷光值升高,即 表 示 pERV3 存 在 細 胞 中 , 把 這 些 細 胞 做 pEGSH-OTEX cDNA transfection, 用 hygromycin 篩選一星期,之後把濃度降低到一半繼 續 maintain 到細胞數夠多,加入 Pon A,觀察細胞在過量表現 OTEX 基因情況下,觀察 morphology,MTT,RT-PCR 等等。. 柒、參考文獻 顏志宏,碩士論文,人類同源箱基因 OTEX 在正常睪丸組織及前列 腺癌細胞株中之分子特性研究,2003. 黃書彬,博士論文,台灣南部地區攝護腺癌分子流行病學之研究,2004. 王怡方,碩士論文,人類同源箱基因OTEX之功能性研究,2005 A a l t o m a a S , L i p p o n e n P, E s k e l i n e n M , A l a - O p a s M , K o s m a V M (1999) Prognostic value and expression of p21(waf1/cip1) p r o t e i n i n p r o s t a t e c a n c e r. P r o s t a t e 3 9 : 8 - 1 5 . B a o B Y, Ya o J , L e e Y F ( 2 0 0 6 ) 1 { a l p h a } , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D3 suppresses interleukin-8-mediated prostate cancer cell angiogenesis. Carcinogenesis. Bhatia-Gaur R, Donjacour AA, Sciavolino PJ, Kim M, Desai N, Yo u n g P, N o r t o n C R , G r i d l e y T, C a r d i f f R D , C u n h a G R , Abate-Shen C, Shen MM (1999) Roles for Nkx3.1 in p r o s t a t e d e v e l o p m e n t a n d c a n c e r. G e n e s D e v 1 3 : 9 6 6 - 9 7 7 . 42.

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參考文獻

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