水稻培養細胞中碳水化合物代謝之研究(2/3)

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

Car bohydr ate Metabolism in Rice Tissue Culture 計畫編號：NSC 88-2313-B-002-051-A06 執行期限：87 年 08 月 01 日至 88 年 07 月 31 日 主 持 人：劉麗飛 教授 國立台灣大學農藝系 一、 中文摘要 植物細胞具分化全能性，亦即可 經由培養條件的調整，使單一細胞再 生為完整植株。惟至目前為止，對此 分化全能性機制的了解仍極有限。本 研究室過去的研究，證明水稻的培養 細胞經滲透壓處理後，會提高細胞內 IAA、ABA 之含量，而與植株再生有 密切相關。因此，本試驗乃進一步探 討植物荷爾蒙與碳水化合物代謝的關 係，及其滲透壓誘導水稻癒合組織植 株再生過程中的角色。將台南 5 號未 成熟胚培養在外加植物荷爾蒙(即同時 含有 IAA 合成前驅物 anthranilic acid 及 ABA 的 MSD10 培養基 中(TN5-AnA)培養) 與滲透壓處理兩系統中， 結果發現:1.在癒合組織誘導階段均有 較低澱粉水解酵素活性，且主要皆因 á-Amy(á-澱粉水解酵素)蛋白質合成減 少之故。另外，在植株再生階段，兩 系統澱粉水解酵素的表現一致。2. 兩 系 統 澱粉 代 謝相 關 酵 素 的 表 現 均 類 似，但蔗糖相關代謝酵素的表現則有 明顯不同 ， 其 中 在 癒 合 組 織 誘 導 階 段，滲透壓的系統處理下蔗糖代謝相 關酵素活性均顯著被誘導，相反的， 外加植物荷爾蒙的系統處理下則 SS (蔗糖合成酵素)、Sol-IT (可溶性蔗糖轉 化酵素)及 Bound-IT (結合性蔗糖轉化 酵素)均顯著受到抑制。而在植株再生 階段，兩種處理下蔗糖分解酵素活性 均比對照組高。上述結果強烈顯示滲 透壓處理可能藉由內生 ABA 及 IAA 含 量的改變來調控部分碳水化合物代謝 相關酵素(如 á-Amy)的表現，達到誘導 植 株 再 生 的目 的 。 這 是一 全 新的 發 現，將可對植物分化全能性之機制有 進一步的了解。 關鍵詞：碳水化合物代謝、水稻、組 織培養、滲透壓逆境 Abstr act

Plant cells possess totipotency that means whole plants could be regenerated from single cell by modulating culture conditions. The mechanisms of totipotency, however, were limitedly understood so far. From thorough studies, it had found the contents of endogenous IAA and ABA were increased significantly in rice callus by osmotic stress treatment, and were correlated to the ability of shoot regeneration. We, therefore, did further studies to explore the correlation among phytohormones, carbohydrate metabolism and osmotic stress during shoot regeneration.

MSD10 basal medium containing

anthranilic acid and ABA. The results showed all the phenomenons were similar to those under osmotic stress treatment. Higher IAA and ABA levels inhibited all the sucrolytic enzyme (Sol-IT, Bound-(Sol-IT, and SS) and amylase activity. Therefore, the higher soluble sugars and starch contents might be resulted from sucrose uptaking by sucrose transporter dominantly and inhibiting starch degradation, respectively. In conclusion, osmotic stress induced some changes of carbohydrate metabolism, and was brought about shoot regeneration. Parts of those changes were regulated by changes of endogenous IAA and ABA levels. But there are some processes induced by osmotic stress might be regulated by other factors during shoot regeneration.

Keywords:carbohydrate metabolism, rice, tissue culture, osmotic stress

二、緣由與目的 植物細胞具分化全能性，亦即可 經由培養條件的調整，使單一的細胞 再生為完整植株。此現象已廣泛應用 於植物的大量繁殖及遺傳工程改良植 物性狀上。對此分化全能性的研究已 逾四十年，早期主要著重在分化條件 的探討，亦即在培養基中添加不同量 或不同比例植物荷爾蒙、各種碳源或 營養添加物等，觀察對植株再生的影 響；近年來則著重在和此分化全能性 有關之基因選殖、及基因表現的研究 上。然而相關研究雖多，對於分化的 機制，至今仍未有定論。 本研究室過去的試驗中發現，水 稻的培養細胞經滲透壓處理後可明顯 促進植株再分化能力；此過程與細胞 內碳水化合物代謝有密切相關。在癒 合組織誘導期 Bound-IT 酵素活性顯 著提高，造成細胞內可溶性糖含量明 顯提高，此結果會抑制澱粉水解酵素 表現，導致澱粉含量提高。在分化初 期， 蔗 糖分 解 相 關 酵 素 活 性 逐 漸 升 高，蔗糖含量逐漸下降，而葡萄糖急 遽升高；分化後期，細胞內可溶性糖 含量逐漸下降，澱粉水解酵素大量被 誘導，分解累積在細胞中的澱粉，提 供芽體形成所需能量及還原力來源。 顯然地，滲透壓逆境可引發一連串碳 水化合物代謝作用的改變，而導致植 株再生；然而，滲透壓逆境是直接影 響或是透過某些訊息傳遞因子（signal transduction factors）而調控這些代謝相 關酵素的表現呢？這是非常值得深入 探討的問題。 本研究室近期的研究進一步發現 滲透壓逆境所誘導之高分化率水稻癒 合組織內，IAA 及 ABA 含量明顯高 於不具分化能力者，將其移到分化培 養基後，此內生 IAA 及 ABA 含量迅 速降低。若利用外加 IAA 生合成前驅 物，Anthranilic acid 及 ABA 取代滲透 壓處理，則可同時提高細胞內 IAA 及 ABA 含量，此癒合組織移到分化培養 基後， IAA 與 ABA 含量很快降低且 可大幅提高分化率到 50% 以上，此現 象與滲透壓處理者雷同。但是，此內 生荷爾蒙含量之變化，如何調控植株 再生，則仍不清楚。因此本計畫乃深

入探討滲透壓逆境下，內生 IAA 及 ABA 含量之變化，碳水化合物之代謝 與植株再生三者間之關係。 三、結果與討論 TN5 在同時含有 anthranilic acid 及 ABA 的 MSD10 培養基中（TN5-AnA）培養，在癒合組織誘導階段， TN5-AnA 之 Sol-IT、Bound-IT 及 SS 三者的活性均低於 TN5；而在培養初 期(第 10 天時)，TN5-AnA á-Amy 活性 高於 TN5 處理者，後期(第 14 天以 後)，則 TN5 處理 á-Amy 活性顯著高 於 TN5-AnA 處理者。但是到分化後期 時四者的活性則均高於 TN5。另一方 面，在癒合組織誘導階段，TN5-AnA SS1 及 SS2 蛋白質表現低於 TN5 者; 移到分化培養基後，TN5-AnA 在分化 後期 SS1 表現有逐漸增加的趨勢，並 高於 TN5 者;SS2 表現在兩處理間則沒 有明顯差異。不論是癒合組織誘導或 植株再生階段，TN5 Bound-IT 蛋白質 表現均高於 TN5-AnA 處理者;不過分 化後期，TN5-AnA Bound-IT 被誘導的 程度高於 TN5 處理者。癒合組織誘導 階段，隨著培養天數增加 TN5 á-Amy 蛋白質表現逐漸增加；而 TN5-AnA 在 培養初期有較高 á-Amy 含量，之後表 現有稍微增加，但均低於 TN5 處理 者。移到分化培養基後，兩處理 á-Amy 含量及變化趨勢差異不大。由上述相 關分析發現，外加植物荷爾蒙與滲透 壓處理兩系統中:1.在癒合組織誘導階 段均有較低澱粉水解酵素活性，且主 要皆因 á-Amy 蛋白質合成減少之故。 另外，在植株再生階段，兩系統澱粉 水解酵素的表現一致。2. 兩系統澱粉 代謝相關酵素的表現均類似，但蔗糖 相關代謝酵素的表現則有明顯不同， 其中在癒合組織誘導階段，滲透壓的 系統蔗糖代謝相關酵素活性均顯著被 誘導，相反的，外加植物荷爾蒙的系 統則 SS、Sol-IT 及 Bound-IT 均顯著受 到抑制。而在植株再生階段，雖然兩 系 統 蔗糖 分 解酵 素 活 性 均 比 對 照 組 高，但蛋白質表現的趨勢不盡相同。 綜合上述結果，滲透壓處理與外 加植物荷爾蒙兩系統，均可大幅提高 水稻培養細胞植株再生的能力；雖然 兩系統在分化過程中，蔗糖代謝相關 酵素的表現並不一致，但澱粉代謝相 關酵素的表現及整體碳水化合物含量 的變化是一致的，此結果強烈暗示兩 系統間有相當程度的關聯性；換句話 說，滲透壓處理可能藉由內生 ABA 及 IAA 含量的改變來調控部分碳水化合 物代謝相關酵素(如 á-Amy)的表現，達 到誘導植株再生的目的。由本研究室 近來其他相關的研究也已證明，此兩 種不同處理，均可導致細胞內 IAA 及 ABA 含量顯著提高，再配合前研究發 現 的 兩者 碳 水化 合 物 含 量 類 似 的 變 化，推測，高濃度滲透壓處理可能導 致細胞內 IAA 及 ABA 含量提高，藉 由這兩種植物荷爾蒙作為訊息傳導因 子，調控碳水化合物之代謝，進一步 影響植株之再生。本研究此階段之結 果發現兩種處理引發碳水化合物代謝 相關酵素之表現雖不全然相同，卻能 造成類似的含量變化，誘導植株之再 生，這是一全新的發現，將可對植物 分化全能性之機制有進一步的了解。 四 計畫成果自評

經過五年的研究，本計畫除已建 立 水 稻細 胞 高植 株 再 生 率 培 養 系 統 外，更進一步對滲透壓調控碳水化合 物代謝，進而誘導水稻培養細胞植株 再生的機制有深入的了解，與計畫預 期成果相符，甚至有更深入的探討。 由於水稻是國內目前最重要的栽培作 物，近年來，利用遺傳工程技術改良 水稻品種的研究正快速發展中，亟需 有高分化能力的植株再生系統配合， 本計畫中所建立以高濃度蔗糖或甘露 糖醇處理誘導植株再生的系統，極適 合應用於遺傳工程研究中。此外，由 於滲透壓下誘導植株再生之機制的研 究並不多 ， 本 計 畫 已 發 現 高 滲 透 壓 下，可經由碳水化合物代謝之調控而 影 響 植 株 之再 生 ， 本 研究 進 一步 發 現，此高濃度滲透壓處理可能先提高 細胞內 IAA 與 ABA 含量，再進一步 調控部分碳水化合物代謝相關酵素(如 á-Amy)的表現達到誘導植株之再生。 五、參考文獻

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