蜂肽誘導人類乳癌細胞株MCF-7凋亡之研究; Bee venom induce human breast cancer cell line MCF-7 apoptosis
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(2) 目錄 目錄. i. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 表目錄. iv. 圖目錄. v. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 中文摘要. vii. 英文摘要. viii. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 第一章 前言. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 第二章 文獻探討. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 第一節 人類乳癌. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 1. 3. 3. 第二節 人類乳癌細胞株(MCF-7). 5. 第三節 蜂肽(Bee venom). 5. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ㄧ、 蜂肽來源. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 5. 二、蜂肽組成與特性. 5. 三、蜂肽抗癌機轉. 8. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 第四節 細胞凋亡. 9. ㄧ、細胞凋亡. 9. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 二、細胞凋亡的特徵. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 9. 三、細胞凋亡的機轉. 10. 第五節 細胞週期調控. 11. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ㄧ、細胞週期. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 二、細胞週期調控蛋白. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 第六節、活性氧成分(Reactive oxygenase；ROS)與抗氧化酵素. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 11. 12. 14. ㄧ、活性氧成分(ROS). ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 14. 二、抗氧化防禦系統. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 14. 三、ROS 與細胞凋亡. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 14. 17. 第三章 研究架構. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. i.
(3) 第四章 材料與方法. 18. 第一節 實驗材料. 18. ㄧ、細胞株來源. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 18. 二、藥品與試劑. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 18. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 三、儀器設備、器材. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 第二節 實驗方法. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 21. 22. ㄧ、藥品配製. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 二、細胞培養. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 22 23. 三、細胞型態的觀察-利用倒立式相位差顯微鏡觀察. 24. 四、細胞存活率的測定. 24. 五、細胞週期測定. 26. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 六、粒線體膜電位測定. 26. 七、活性氧成分測定. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 27. 八、DAPI 染色. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 28. 九、彗星試驗. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 29. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 十、西方墨點法. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 32 37. 第三節、統計分析. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 38. 第五章 結果. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 第一節、蜂肽（Bee venom）對 MCF-7 形態的影響. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 第二節、蜂肽（Bee venom）抑制 MCF-7 增生的效果. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 38. 38. 第三節、蜂肽（Bee venom）對人類乳癌細胞株 MCF-7 之細胞週期影響. 39. 第四節、利用流式細胞儀來偵測蜂(Bee venom)肽對 MCF-7 的影響. 40. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 一. 活性氧成分(Reactive oxygen species；ROS)產生的影響 二. 粒線體膜電位的影響. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 第五節 蜂肽（Bee venom）是否會造成 MCF-7 之 DNA 損傷 一. DAPI staining. 40. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ii. 40. 40. 41.
(4) 二. Comet assay. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 41. 第六節 利用西方墨點法來探討蜂肽(Bee venom)對 MCF-7 的抗氧化酵素蛋白表現. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 41. 第七節 利用西方墨點法來探討蜂肽(Bee venom)對 MCF-7 的調控細胞週期蛋白表現. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 41. 第八節 利用西方墨點法來探討蜂肽(Bee venom)對 MCF-7 凋亡相關蛋白表現. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 一、 粒腺體途徑. 42. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 二、 死亡接受體途徑. 42. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 42. 第六章 討論. 61. 第七章 結論. 64. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 66. 第八章 參考文獻. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. iii.
(5) 表目錄 表 1-1 中華民國九十五年癌症死因排名. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 表 2-1 蜂肽組成與特性. 2. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 表 4-1 ㄧ級抗體. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 20. 表 4-2 不同濃度蜂肽的配製. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 表 4-3 a,b,c 彗星試驗的試劑配製. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 表 4-4 蛋白表準品配製. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 7. 22. 31. 33. 表 4-5 SDS-PAGE 下層膠(separation gel)配製. 33. 表 4-6 SDS-PAGE 上層膠(stacking del)配製. 34. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 表 4-7 Running buffer(1.5 M Tris-HCl, pH8.8)配製 表 4-8 Stacking buffer(0.5 M Tris-HCl, pH6.8)配製 表 4-9 電泳緩衝液配製. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 34. 34. ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙. 35. 表 4-10 轉漬緩衝液配製˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙36. iv.
(6) 圖目錄 圖 2-1 人類乳癌細胞株(MCF-7)形態˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙5 圖 2-2 細胞週期調控蛋白˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙15 圖 2-3 細胞內抗氧化防禦系統˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙16 圖 4-1 MTT 形成 Formazan 反應機制˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙25 圖 4-2 轉漬夾內部組成˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙36 圖 5-1 以不同濃度之蜂肽培養 MCF-7 細胞 48 小時細胞形態的變化˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙43 圖 5-2 以 7.5μ g/ml 之蜂肽培養培 培養 MCF-7 細胞 72 小時細胞型態的變化˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙44 圖 5-3 不同濃度之蜂肽培養 MCF -7 細胞 24 小時之增生影響˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙45 圖 5-4 不同濃度之蜂肽培養 MCF -7 細胞 48 小時之增生影響˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙46 圖 5-5 不同濃度之蜂肽對 MCF -7 細胞細胞週期的分佈影響-24 小時˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙47 圖 5-6 不同濃度之蜂肽對 MCF -7 細胞細胞週期的分佈影響-24 小時(統計圖) ˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙ 48 圖 5-7 相同濃度之蜂肽培養 MCF-7 細胞不同時間細胞週期分佈的影響˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙49 圖 5-8 相同濃度之蜂肽培養 MCF-7 細胞不同時間細胞週期分佈的影響(統計圖) ˙˙50 圖 5-9. 蜂肽(7.5 μg/ml)對 MCF-7 細胞之 ROS 產生之影響˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙51. 圖 5-10 蜂肽(7.5 μg/ml)對 MCF-7 細胞之 MMP 之影響˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙52 圖 5-11 蜂 肽 (7.5 μg/ml) 對 MCF-7 細 胞 在 不 同 時 間 的 DNA damage-DAPI staining˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙53 圖 5-12 不同濃度之蜂肽對 MCF -7 細胞的 DNA damage-Comet assay˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙54 圖 5-13 以西方墨點法分析 MCF-7 經蜂肽(7.5μg/ml)培養後細胞中 GST、SOD(Mn)、SOD(Cu/Zn)、catalase 等蛋白的相對表現量˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙55 圖 5-14 以西方墨點法分析 MCF-7 經蜂肽(7.5μg/ml)培養後細胞中 p53、p27、Cdk2、p21、p16 等蛋白的相對表現量˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙56 圖 5-15 以西方墨點法分析 MCF-7 經蜂肽(7.5μg/ml)培養後細胞中 Bax、Bcl-2、Bcl-xl 等蛋白的相對表現量˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙57 圖 5-16 以西方墨點法分析 MCF-7 經蜂肽(7.5μg/ml)培養後細胞中 cytochrome c、AIF、Endo G 等蛋白的相對表現量˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙58 圖 5-17 以西方墨點法分析 MCF-7 經蜂肽(7.5μg/ml)培養後細胞中. v.
(7) Apaf、Pro-caspase-9、caspase-3、Pro-PARP 等蛋白的相對表 現量˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙59 圖 5-18 以西方墨點法分析 MCF-7 經蜂肽(7.5μg/ml)培養後細胞中 Fas、Pro-caspase-8、Bid 等蛋白的相對表現量˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙60 圖 7-1. 蜂肽誘導 MCF-7 細胞凋亡可能路徑圖˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙˙65. vi.
(8) 中文摘要. Apis Mellifera 品種的蜂肽(Bee venom)是一種具有多種藥理與生物 活性的複合物質。在一些研究中証實，蜂肽可以減輕疼痛減少過敏反 應。蜂肽已經被證實，可以抑制一些癌細胞增生與誘導凋亡，然而蜂肽 在誘導乳癌細胞凋亡的機制清楚。在本研究發現，Apis Mellifera 品種的 蜂肽能抑制乳癌細胞株(MCF -7)生長，具有濃度與時間效應。透過流式 細胞儀的分析，Apis Mellifera 品種的蜂肽在 1 小時就會使 MCF-7 活性 氧成份(Reactive oxygen species)釋出，並降低粒線體膜電位。經由 DAPI 染色法證實，Apis Mellifera 品種的蜂肽可以會造成 MCF-7 的細胞凋亡， 經由彗星試驗證實，Apis Mellifera 品種的蜂肽可以會造成 MCF-7 的 DNA 損傷。經由西方墨點證實，Apis Mellifera 品種的蜂肽可以活化 Bax 而抑 制 Bcl-2、Bcl-xL 的表現，使粒腺體膜電位下降，從粒腺體釋放出 cytochrome c，活化 caspase-9 並與 Apaf-1 結合，進而活化 caspase-3 ， 使 MCF-7 產生凋亡；Apis Mellifera 品種的蜂肽也會增加 Fas 的表現而 活化 caspase-8，進而活化 Bid，促使 caspase-3 活化。. 關鍵字： 蜂肽、細胞凋亡、粒腺體膜電位、活性氧成分. vii.
(9) Abstract Bee venom(BV) of Apis Melliferais(A.M.) an complex compound with pharmacology and biological activities. In some study has been confirmed that BV can alleviate pain and reduce allergy. Although, BV has been confirmed that inhibit proliferation and induce apoptosis in some cancer cell. However, the molecular mechanisms involved in BV-induced apoptosis are still unclear in human breast cancer cells. In this study, we find that BV inhibited proliferation of human breast cancer cell line (MCF-7) in the concentration-dependent and dose-dependent. The result of Flow cytometry demonstrated that BV decreased mitochondrial membrane potential(MMP) by releasing reactive oxygen species(ROS) in one hour.. Apoptosis was. also confirmed by DAPI staining of MCF-7 cells after exposed to different time of BV.. Based on the results from Comet assay, it was also indicated. that BV induced DNA damage in MCF-7 cells. Based on the result from western blotting, BV can reduce expression of Bcl-2 and Bcl-xL through Bax activation, and reduced mitochondria,. MMP lead cytochrome c releasing from. increase expression of caspase 9 , Apaf-1 and caspase 3. BV. also increase expression of Fas , caspase 8 and tBid. Key words：Bee venom,. Apoptosis,. Reactive oxygen species. viii. Mitochondrial membrane potential,.
(10) 第一章. 前言. 根據行政院衛生署的統計資料顯示，自民國 71 年來，癌症就一直 是我國國人主要的死亡原因，民國 95 年的國人的癌症死因排行榜中， 女性乳癌為癌症死因第四名。隨著國人飲食西化，攝取過多的動物脂肪 則會增加乳癌的罹患率，其生理機制為動情激素(estrogen)促使乳房細胞 增生進而癌化。 乳癌好發生在停經後婦女，一般是從 25 至 30 歲開始，40 歲較多，50 歲快速增加，但是老年以後增加的速度就變得緩慢，約只有停經前的 1/6。 蜂肽(Bee venom)，是一種具有多種藥理與生物活性的複合物質，。 在一些研究中証實，蜂肽可以減輕疼痛減少過敏反應。蜂肽已經被證實 可以抑制一些癌細胞增生與誘導凋亡。 在2003年，克羅埃西亞的學者 研究發現，乳癌的老鼠經由靜脈注射蜂肽增加老鼠的存活機率。但是蜂 肽如何對抗乳房腫瘤的分子機轉並不清楚，所以本實驗想探討蜂肽如何 抑制乳癌細胞株(MCF-7)增生與誘導MCF-7凋亡的分子機轉。. 1.
(11) 表 1-1、中華民國九十五年癌症死因排名(來自行政院衛生署網站). 2.
(12) 第二章 文獻探討 第一節. 人類乳癌. 乳癌的發生對台灣地區的婦女而言，一直是十分重要的公共衛 生問題，因為就婦女好發的癌症來看，乳癌在近年來一直是僅次於 子宮頸癌排名第二位的癌症。每年台灣地區的婦女，約有 2200 名 新發生的乳癌個案，另一方面，就婦女癌症的死亡率而言，也是排 名第四位的女性癌症。更令人值得加以特別注意的是，台灣地區婦 女乳癌發生率及死亡率的急速上升，在近二十年間，大概已上升二 至三倍之多，而且這個趨勢並未有減緩的情形。台灣地區乳癌發生 率上升的原因，一般認為和國人的生活習慣西化有十分密切的關 係。 一. 乳癌的成因 乳癌主要致癌機轉，是建立在女性荷爾蒙（主要是動情激素）對乳 房細胞（或乳癌細胞）的促進增生作用上。因此西化的生活飲食習 慣，包括營養的改善會進一步造成婦女初經年齡的提前、停經年齡 的延後以及停經後肥胖人口的增加，均會使得現代婦女相較於從前 有更多的機會暴露在荷爾蒙的影響下，進一步增加乳癌發生的危險 性。所以對於此一日益重要的公共衛生問題，我們應有立即採取行 動的必要。 乳房腫塊是乳癌最重要的臨床表徵，雖然大部份的乳房腫瘤均 是良性的，但是有乳房腫瘤都應該請教醫生判別良性與惡性。各種 乳房腫瘤的徵狀略述如下： 纖維腺瘤： 20 歲左右的女性最多。腫瘤會移動、實質性、像橡皮樣硬、邊. 3.
(13) 緣整齊、無壓痛也不會痛。 管內乳頭瘤： 40 歲左右的婦女較多，常是單側性發生，乳頭突然有黃色、淡 紅色水樣液體排出，此時並無疼痛也摸不到腫塊，通常這是一種較 大乳管內上皮增生所致。 乳腺膨脹（粉刺性乳房炎）： 多發現於 40 歲左右的婦女，乳頭排出顏色多變且較濃稠的液 體。兩側發生，且波及數條乳管，病人有灼熱、癢或乳暈隱隱作痛 之感，觸診時會發現乳暈下有彎曲腫大的乳管。若病情加劇，腫塊 出現，從外表看就好像第三期乳癌，併有漿細胞乳炎。 男性女乳症： 在青春期前或當青春期的男孩，在單側乳暈上會發生一硬且痛 的圓形腫塊，會變大或腫脹，使同邊乳房增大且疼痛。 乳癌： 常在單側乳房產生一硬而實質性、不移動、不痛且輪廓不規則 的腫塊，多見於乳房的外側上方。隨著癌細胞侵犯，其他症狀相繼 出現：如腋窩的淋巴結變硬、乳頭下陷或有血狀分泌物、乳房皮膚 如橘子皮。並不是所有乳癌都會出現上述症狀，有些僅是乳頭濕 疹、皮膚紅腫、皮下浸潤或摸起來可以移動、不硬的腫塊。 乳癌在醫學臨床上的分期 零. 期：即原位癌。. 第一期：腫瘤小於 2 公分。 第二期：腫瘤大於 2 公分，而且腋下淋巴轉移。 第 三 期 ： 腫瘤大於 5 公分， 且 腋 下 淋 巴 結 有 癌 轉 移 或 胸 壁. 4.
(14) 皮膚及乳房下的肌肉有癌轉移。 第四期：轉移到較遠的器官，譬如:骨骼、肺、肝、腦等。( 1 ). 第二節. 人類乳癌細胞株 MCF -7. MCF-7 是一種 Human breast adenocarcinoma, 生長為貼附型細 胞，培養在 RPMI-1640 陪養基中， 於 37℃、5%CO2 下培養. 圖 2-1 人類乳癌細胞株 MCF-7 形態(食品工業發展研究所) 第三節. 蜂肽(Bee Venom). ㄧ、蜂肽來源 義大利蜜蜂，學名為 Apis. mellifera(AM)， 節 足 動 物 門 、. 昆 蟲 綱 、 膜 翅 目 、 蜜 蜂 科 。 蜂 肽 (Bee Venom) 是 由 雌 蜂 腹 部之毒腺所分泌的淡黃色物質，為一種複合物，裡面含有 mellitin、 apamin、phospholipase A2 等 。 在古埃及、古印度、敘利亞、 古羅馬及中國的民間醫學中，用蜜蜂螫刺病人，治療風濕病、類風濕性 關節炎、痛風等病症。 二、 蜂肽組成與特性 蜂肽是由胜肽、酵素、胺類等組成且至少含有 18 種活性物質(表 2-2). 5.
(15) ，蜂肽之所以可用來治療關節炎與類風濕性關節炎，是因為蜂肽可以刺 激腎上腺分泌 cortisol，因此可以減緩發炎反應. (2, 3). 。而對抗關節炎和抗. 發炎的機轉，主要是因為 melittin 可以降低 COX-2 與 phospholipase 的表 現量，進而減少 tumor factor alpha，。interlukin-1、6，nitric oxide 與 reactive oxygen species (4-7)。Adolapin 可以對抗 prostaglandin 所誘導之大鼠後腳 掌水腫的發炎反應，同樣也是透過抑制 Cyclooxygenase 而降低 PG 的合 成(8, 9)。Apamin 是一個鈣離子傳導者，可以阻擋鉀離子通道，顯著的抑 制卵蛋白所誘發的氣管收縮與組織胺的釋放，可能是因為 apamin 可以 穩定 mast cell，也有可能是因為 mast- cell-degranulating (MCD) peptide 抑制 mast cell 釋放出組織胺，也可能是 MCD peptide 與 mast cell receptor ) 最近，更發現 melittin 可以藉由抑制 IκB 結合而阻止 IgE 的結合位置(10, 11。. 的磷酸化進而抑制 NF-κB 的轉錄。蜂肽可以減少巨噬細胞經由 LPS 刺 激所產生的一氧化氮，並且發現蜂肽可以降低發揚反應的相關蛋白 iNOS、COX-2、NF-κB 的 mRNA 表現量(12, 13)。. 6.
(16) 表 2-1 蜂肽的組成與特性(14) 來自 Therapeutic application of anti-arthritis, pain-releasing, and anti-cancer effects of bee venom and its constituent compounds. Pharmacology & Therapeutics 2007.. 7.
(17) 三、蜂肽對抗癌症的機轉 研究顯示，以蜂肽培養人類肝癌細胞株SMMC-7721，在體外實驗 以MTT (Methyl Thiazlyl Tetrazolium) assay實驗，發現蜂肽中的多胜肽可 以抑制此細胞株生長，而且具有時間與濃度的效應。利用HE (Haematoxylin & Eosin) staining，發現此細胞株的形態已經改變而且細胞 核皺縮、染色體縮合。經由流式細胞儀細胞儀分析，細胞週期停滯在 G0/G1期，以雙染(FITC-propidium,annexin V)模式發現凋亡的比例最 高。利用DNA fragmentation分析也產生DNA fagmentation。 在體內實 驗，將此肝癌細胞株植入裸鼠中，以皮下注射蜂肽，發現隨著濃度的增 加可以減緩腫瘤的生長(15)。 研究顯示，在體外實驗，利用MTT assay證實，蜂肽可以有效的抑 制老鼠黑色素瘤細胞株K1735M2的增生，而且具有時間與濃度的效應。 利用顯微鏡觀察，發現型態上也有明顯的改變，變的細長類似神經細胞 的突觸。以DNA fragmentation分析，也有DNA斷裂的情形發生。利用流 式細胞儀分析，蜂肽會誘導此細胞株停滯在G1期。在體內實驗，將老鼠 的黑色素瘤細胞B16移植到C57BL老鼠身上，每天以腹腔注射不同濃度 的蜂肽12天，然後犧牲，發現老鼠身上的腫瘤比起控制組還輕，在統計 上具有顯著差異，而且在這段時間給予老鼠注射蜂肽，老鼠的食慾不受 影響(16)。 研究顯示，在體外實驗，利用MTT assay證實，蜂肽可以有效 的抑制人類肺癌細胞珠NCI-H1299生長。利用流式細胞儀分析細胞週期 發現，蜂肽顯著的增加sub-G1(30%左右)，並且經由DNA fragmentation、 DAPI、TUNEL assay的實驗說明蜂肽可以誘導此株細胞凋亡(17)。 研究顯示，培養類風濕性關節炎病人的關節滑液膜纖維母細. 8.
(18) 胞，以蜂肽處理發現，經由MTT assay證實此細胞生長會受到抑制，再 經由TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling ) assay、DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) staining以及 DNA fragmentation assay證實蜂肽可誘導此細胞發生凋亡(18)。 第四節. 細胞凋亡. 一、 細胞凋亡 細胞凋亡(apoptosis)，又稱為計畫性的細胞死亡(programmed cell death) ，是由Kerr et al.所提出。細胞凋亡時不會產生發炎物質，所 以不會影響鄰近的細胞。體內的細胞死亡的方式有兩種，細胞壞死 (necrosis)與凋亡(apoptosis)，當細胞受到外來刺激時，如藥物、活性 氧成分、紫外線等刺激，導致細胞核內的DNA受損，當生物本身無 法修復時，此時細胞會發生一連串的訊息傳遞，此時細胞會自行死 亡，稱之為細胞凋亡(19, 20)。 二、 細胞凋亡的特徵 細胞發生凋亡的過程中，細胞的形態會有所變化，例如；細胞核 萎縮、DNA fragmentation、以及形成凋亡小體，但在這個過程中 並不會有發炎反應，所以不會影響週遭的細胞或組織，除此之外 還有一些生化變化，如下 1. DNA fragmentation 當細胞進入凋亡末期的時候，細胞核內的核酸內切酶會被活化， 而可以將DNA降解成小片段(21)。 2. 細胞內的活性氧成分(Reactive oxygen species；ROS)的改變 有研究指出，氧化壓力會誘導細胞發生凋亡，而活性氧成分(ROS) 是氧化壓力的主要來源，當細胞內ROS增加，會改變粒腺體外膜. 9.
(19) 的滲透壓，而使粒腺體膜電位(Mitochondrial membrane potential；MMP)下降，釋放出凋亡相關蛋白，如：AIF(Apoptosisinducing factor)、Endo G、cytochrome c等等(22-26)。 三、 細胞凋亡的機轉 目前的研究，大概將細胞凋訊息途徑分為內在途徑(粒腺體mitochondrial pathway)與外在途徑(死亡接受體途徑-death receptor pathway)。 1. 內在途徑---粒線體途徑(Mitochondrial pathway) 在細胞凋亡的過程中，粒腺體是一個很重要的角色，因為粒腺體 上面的Bcl-2 family蛋白會維持粒腺體內外膜的電位平衡，當內膜電位不 平衡時，cytochrome c、AIF、Endo G會由粒腺體釋放到細胞質中，而改 變粒腺體外膜的滲透壓。在dATP存在的情況，會使cytochrome c與 Apaf-1(apoptotic protease activating factor-1)結合，使caspase-9活化，進而 活化caspase-3，使細胞產生凋亡(27)。 (1). Bcl-2 family protein，因為次家族的蛋白可以維持粒腺體膜電位位的 平衡，所以此家族蛋白對於粒腺體途徑的凋亡是很重要的調控者，可以 分為促進凋亡與抑制凋亡。當DNA受損時，會活化促進凋亡蛋白成員， 使Bax由細胞質轉位到粒線體外膜，改變粒腺體膜電位，釋放出凋亡相 關蛋白，如AIF、cytochrome c、Endo G等。而抑制凋亡蛋白成員則是維 持粒腺體膜電位的平衡，而不改變粒腺體外膜的滲透壓，因此粒腺體不 會釋放出凋亡相關蛋白。 ① 促進凋亡蛋白成員：Bax、Bad、Bid、Bak、Bim、Bik、Bcl-xs等。 ① 抑制凋亡蛋白成員：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Bid等(28-30)。 (2). Caspase family proteins. 10.
(20) 當細胞凋亡時，會活化細胞內的蛋白水解酵素(cysteine dependent aspartate specific protease)，進而使其它酵素裂解，而改變細胞形態(31, 32)。此系列蛋白有類似的胺基酸序列及結構，為 single-chain protease， 含有 3 個 Domain：NH2 terminal、large subunit(20) KDa、small subunit(10 KDa)。上游的活化態的 caspase 會裂解將下游未活化的 caspase 的 domain，而使下游未活化的 caspase 活化(33) 2. 外在途徑—死亡接受器途徑(Death receptor pathway) 此途徑是經由活化細胞膜表面上的接受器(Fas)，當 Fas 與 Fas ligand 結合之後，將 Fas 活化成三聚化，變成有活性的受體，此活化的 受體的末端 death domain 與 Fas-associated death domain 的 death domain 結合，然後與下游的 Pro-caspase 8 結合，形成蛋白複合體，此訊息稱為 Death- inducing signaling，接著再與 Pro-caspase 8 結合形成 death-inducing signaling complex，此時 caspase 8 具有活性，可以直接活化 caspase 3； 或者使 Bid 活化成 tBid，tBid 轉位到粒腺體外膜，影響粒腺體膜的滲透 壓，釋放出 cytochrome c，然後活化 caspase 9 與 caspase 3(34, 35)。 第五節 細胞週期調控 一、 細胞週期(Cell cycle) 哺乳類動物動物的細胞週期大約 12-24 小時不等。細胞週期指的 是細 胞從剛開始的有絲分裂到下次有絲分裂開始之前，代表細胞進行一次的 增生。細胞週期大概可以分為：間期(inter phase)與有絲分裂期(M phase)。又可以細分成 G0、G1、S、G2、M phase。 1. G0 phase：此時細胞休眠不生長。 2. G1 phase：此時細胞開始分裂，體積開始變大，染色體數目為 2N。. 11.
(21) 3. S phase：此時細胞內 DNA 進行複製，將染色體數目變成 4N。 4. G2 phase：此時染色體數目為 4N。 5. M phase: 此時細胞會分裂成 2 個細胞。 M phase 可分為四個時期 ①前期：複製的染色體縮短變粗，紡錘體形成，核膜、核仁消失且 著絲點附著在紡錘絲上。 ①間期：染色體之著絲點排列在赤道板上。 ①後期: 同源染色體往細胞兩極分開。 ①末期：染色體恢復絲狀，核膜、核仁出現。 G1 期進入到S期或者G2 期進入到M期之間都有檢查點，會檢查 DNA複製是否有問題。已有文獻指出，當DNA受損時，就無法通過 檢查點而導致細胞週期停止不前，此時細胞會自行修復有問題的，假 如修復完成就可以繼續進行細胞週期，但是無法修復的話，細胞就會 走向凋亡途徑(36)。 二、 細胞週期調控蛋白 真核細胞中，調控細胞週期的蛋白稱為cyclin，而使cyclin活化的酵 素稱為cyclin-dependent protein kinase (Cdk)藉由cyclin與Cdk的結合使細 胞周期得以運行，細胞才可以增生。當細胞發生DNA damage、分化、 老化時，會產生Cyclin dependent protein kinase inhibitor (CdkI)來抑制 cyclin的活化，阻止細胞週期的運轉(37)。 1. Cyclin和Cdk Cyclin family 與 Cdk family 參與細胞週期的調控，當兩者形成複 合體時，Cdk 就會活化，使下游的調控因子磷酸化，使細胞週期運行(38)。 目前所發現到並且有名字的 Cdk 有 7 個：Cdk 1 (cdc2)、Cdk 2、Cdk 3、. 12.
(22) Cdk 4、Cdk 5、Cdk 6、Cdk 7，這些命名是依照發現時間排序的，在細 胞週期中各時期有各自的 Cyclin-Cyclin dependent protein kinase complex 使細胞週期可以順利運行，例如：當細胞由 G0 phase 進入到 G1 phase， 此時 Cyclin D 會與 Cdk 4、Cdk 6 結合；當細胞由 G1 phase 進入 S phase， 此時 Cyclin E 會與 Cdk 2 結合；當細胞由 S phase 進入到 G2 phase，此時 Cyclin A 會與 Cdk2 結合；當細胞由 G2 phase 進入到 M phase，此時 Cdk1 會與 Cyclin A、Cyclin B 結合(39, 40)。 2. Cyclin-dependent protein kinase inhibitor (CdkI) 顧名思義，這類的蛋白可以抑制 Cdk，此家族可以分成兩類：(1)INK4 (Inhibitor of Cdk4)：此類蛋白含有 p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d， 會與 Cdk4、Cdk6 結合，使 CdK4 和 Cdk6 無法活化，使細胞停滯在 G0/G1 phase。 (2)CIP/KIP：此類蛋白含有 p21CIP1、p27KIP1、p57KIP2，這 3 種蛋白結構上 的胺基酸末端會有特定的構型會與特定的 Cyclin 及 Cdk 結合而抑制 Cdk 活化，如：G0 phase 進入 G1 phase 的 Cyclin D-Cdk4/6 compex，G1 phase 進入 S phase 的 Cyclin E-Cdk2 complex，S phase 進入 G2 phase 的 Cyclin A-Cdk2 complex(39, 41, 42)。. 13.
(23) 第六節 活性氧成分(Reactive oxygenase；ROS)與抗氧化酵素 一、 活性氧成分 (ROS) ROS 可以分成內源性與外源性，內源性 ROS 的來源有巨噬細胞 吞噬作用、氧化作用與粒腺體的電子傳遞鏈等；外源性 ROS 來源有廢 氣排放污染、抽菸、油煙等。當細胞受到外來刺激，如藥物、UV 等， 細胞內 ROS 增加，會造成氧化壓力，當細胞內的抗氧化酵素無法負荷 時，會氧化細胞膜上的脂質與使粒腺體氧化壓力上升，然後使細胞走向 凋亡(43)。 二、抗氧化防禦系統 生物體內的防禦系統可以分為：一級防禦系統(Primary defense system)，如 β-carotene、Vitamin C、Vitamin E 以及一些抗氧化酵素等； 二級防禦系統(Secondary defense system)，包括脂質分解酵素(lipolytic enzyme)、蛋白質分解酵素(proteolytic enzyme)以及 DNA 修復酵素(DNA repair enzyme)等，可以清除 ROS 之氧化產物，或ㄧ級防禦系統無法清 除的自由基(44)。 三、ROS 與細胞凋亡 文獻指出， ㄧ般的抗癌藥物可以分成產生多量的 ROS 和少 量的 ROS，ROS 造成凋亡時，會釋放出 cytochrome c，NADH dehydrogenase 與還原態 coenzyme Q10 會使電子經過電子傳遞鏈 形成氧氣，過多氧氣則會變成超氧自由基並且在細胞的其他胞器 形成 ROS(19)。有學者將 Bcl-2 轉染到小鼠的表皮細胞，比較正常 的老鼠表皮細胞與有轉染 Bcl-2 的老鼠表皮細胞的生長情況，發現 轉染 Bcl-2 的這一組可以干擾自由基(hydrogen peroxide 、 superoxide)的生成且延遲細胞死亡。但是 Bcl-2 並不會改變細胞內. 14.
(24) 抗氧化酵素(superoxide dismutase、 catalase 、 glutathione peroxidase)的活性，而是增加 glutathione 的濃度，因此可以部份調 節氧化所導致的細胞死亡(45)。. 圖 2-2 細胞週期調控蛋白(46) 來自 Collins IG, Michelle D Targeting the cell division cycle in cancer: CDK and cell cycle checkpoint kinase inhibitors. Current Opinion in Pharmacology 2005;5(4):366-73.. 15.
(25) 圖 2-3 細胞內抗氧化防禦系統(47) 來自 Curtin JF DM, Cotter TG. , Articles R. Regulation and measurement of oxidative stress in apoptosis.265 2002 Jul 1;265(1-2):49-72.. 16.
(26) 第三章 研究架構. 17.
(27) 第四章 材料和方法 第一節 實驗材料 一、細胞株來源 本實驗使用的細胞株：人類乳癌上皮細胞株 (Human breast adenocarcinoma epithelial cell line) — MCF 7，購自新竹食品發 展工業研究所(Food Industry Research and Development Institute) 二. 藥品與試劑 1.. Bee Venom (BV)：購自 Sigma Chemical Co.. 2.. RPMI medium：購自 HyClone Co.. 3. Fetal bovine serum (FBS)：購自 Gibco 4.. L-glutamin(LG)：購自 Gibco. 5. Penicillium Streptomycin(PS)：購自 Gibco 6.. Typsin-EDTA：購自 Amerso. 7.. Trypan blue：購自 Sigma Chemical Co.. 8.. Etanol：購自 TEDIA. 9. Formaldehyde：.購自 Merck 10. Dimethyl sulfoxide(DMSO)：購自 Sigma Chemical Co. 11. Disodium hydrogen phosphate(Na2HPO4)：購自 Merck 12. Sodium chloride ( NaCl )：購自 Merck 13. Potassium dihydrogen phosphate ( KH2PO4 )：購自 Merck 14. Potassium chloride ( KCl )：購自 Merck. 18.
(28) 15. Propidium iodide ( PI )：購自 Sigma Chemical Co. 16. RNase A ( Ribonuclease )：購自 Amersco 17. Triton X-100：購自 Sigma Chemical Co. 18. DiOC6 ( MMP 試劑 )：購自 calbiochem 19. H2DCFDA ( ROS 試劑 ) ： 購自 calbiochem 20. Indo-1 ( calcium 試劑 ) ：購自 calbiochem 21. 蛋白質萃取試劑 ( protein extraction solution ) ( PRO-PREP ) ： 購 自 iNtRON Biotechnology, INC. 22. Bovine serum albumin ( BSA ) ： 購自 Merck 23. Protein assay-Dye reagent concentrate ：購自 Bio-Rad 24. Ammoniun persulfate (APS ) ： 購自 Amersco 25. Acrylamide/Bis 40% solution ( ACRYL/BIStm29：1 ) ： 購自 Amersco 26. SDS (Sodium dodecyl sulfate ) ： 購自 Amersco 27. TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine ) ： 購自 Amersco 28. Tris (Tris (hydroxymethyl) –aminomethane ) ： 購自 Amersco 29. Glycine ： 購自 Amersco 30. Methanol：購自 TEDIA 31. Protein marker ：購自 Femantas 32. Tween 20 ：購自 Amersco 33. ECL kit ( Enhanced chemiluminescent kit ) ：購自 Amersham 34. 顯影劑 ： 購自 Kodak 35. 定影劑 ： 購自 Kodak. 19.
(29) 36. BioMax Flim ： 購自 Kodak 37. 核酸純化試劑組 ( DNA purification kit ) ： 購自 Gene Mark 38. Agarose I ：購自 Amersco 39. 5× TBE buffer ：購自 Amersco 40. PhiPhiLux-G1D1 kit ：購自 OncoImmunin (Gaithersburg, MD，USA) 。. 41. 1 抗體 表 4-1 Antibody. Brand. Antibody. Brand. Alpha-tublin. Oncogen. anti-caspase 3. upstate. anti-p53. Sata cruz. anti-p27. Sata cruz. Biotechology. Biotechology. anti-p21. Calbiochem. anti-Fas. upstate. anti-PARP. upstate. anti-catalase. Calbiochem. anti-SOD (Mn). Calbiochem. anti-caspase 8. Calbiochem. anti-SOD (Cu/Zn). Calbiochem. anti-Bid. Calbiochem. anti-cytochrome c. Calbiochem. anti-Bax. upstate. anti-AIF. upstate. anti-Cdk2. Calbiochem. anti-endo G. Calbiochem. anti-Bcl-2. upstate. anti-caspase 9. upstate. anti-p16. Calbiochem. anti-GST. Calbiochem. Anti-Bcl-xL. upstate. 。. 42. 2 抗體 43. (1) Goat anti-mouse IgG(HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody ： 購自 Chemicon ； AP124P (2). Goat anti-rabbit IgG （HRP） horseradish peroxidase conjugated antibody ： 購自 Chemicon. 20.
(30) (3). Goat anti-sheep IgG ( HRP ) horseradish peroxidase conjugated antibody ： 購自 Chemicon. 三. 儀器設備、器材 1. 無菌操作台：Lian Shen 2. 細胞培養箱：購自 Nuaire 3. 細胞培養皿(基) ：購自 FALCON 4. 細胞培養盤 ：購自 FALCON 5. 倒立式位像差顯微鏡（phase-contrast microscope） ：購自 Olympus 6. 細胞計數器（Heamocytometer）：購自 Boeco 7. 高速離心機：購自 HERMLE 8. 流式細胞技術儀：購自 Becton Dickinson 9. 微量天平（TE-200 ； MILLTER） 10. 去離子水製造機：購自 Minipore 11. 電源供應器：購自 Amersham 12. 酸鹼值測定計（C831） ：購自 Consort 13. 加熱板：購自 Lab-Line 14. 酵素免疫分析儀（anthos 2020）：購自 Anthos Labtec , Australia 15. Mini-3D Shaker：購自 Boeco 16. PVDF membrane：購自 Minipore 17. SDS-PAGE 電泳槽套組：購自 Bio-Rad 18. Transfer Cell Blot 套組：購自 Bio-Rad 19. DNA 電泳槽：購自 Mupid-2 20. 冷凍管：購自 TPP. 21.
(31) 第二節 實驗方法 一. 藥品配製 將購買之蜂肽(Bee Venom) 100 mg 溶於 10ml 之 1XPBS，配製 成 10mg/ml 的 stock solution，再從 stock solution 稀釋配製本實驗所 使用的各種濃度，之後儲存於 -20 ℃冰箱。 配製濃度如下： 表 4-2 不同濃度蜂肽的配製 Working solution. Stock solution (μl). 1 × PBS (μl). 0.25. mg/ml. 2.5. 97.5. 0.5. mg/ml. 5. 95. 0.75. mg/ml. 7.5. 92.5. 1. mg/ml. 10. 90. 1.25. mg/ml. 12.5. 87.5. 將各個濃度的藥加入培養基中，稀釋倍率為 100X 爾後的藥物濃度以稀釋的濃度(最終濃度)稱之，分別為： 2.5、5、7.5、10、12.5 μg/ml. 二、. 細胞培養. 1. 冰凍細胞的活化： 將冰凍管從液態氮桶中小心取出，迅速放入 37℃水浴槽中回溫， 輕搖冰凍管使其融化剩下一小塊冰，以 70％酒精噴衛生紙，再以衛 生紙擦拭冰凍管外部，移入無菌操作台內。將解凍的細胞懸浮液取 出，放入有 50 ml 離心管中，以 pipetmam 取 5 ml 培養基慢慢加入此 離心管中，離心 1500 rpm、5 分鐘。之後再將上清液倒掉，加入新 的 6 ml 培養基，混合均勻，緩緩放入 25 cm2 培養容器中，移置培養. 22.
(32) 箱中培養( 5％ CO2、37 ℃ )。翌日細胞貼附後更換培養基。 2. 細胞冰凍保存： 冰凍前應觀察細胞狀況並於前一日更換培養基。冰凍細胞前應 先配置冰凍保護劑：將 DMSO 加入新鮮的培養基中，混合均勻，最 終濃度為 7％，置於室溫下待用。取少量細胞懸浮液（約 100 μl） 計數細胞濃度及凍前存活率。離心後去除上清液，加入事先以配置 好的冷凍保護劑，使其細胞數為 2-5 ×106 cells/ml，混合均勻，分裝 於標示完全之冰凍管中（1 ml/bot）。再將冰凍管放入冰凍盒中放入 -80 ℃冰箱中，翌日再將冰凍管取出放入液態氮桶中保存 3. 細胞繼代培養： 將 MCF-7 培養在 RPMI 1640 培養液(含有 10% Fetal bovine serum、1% Penicillin Streptomycin、1% L-Glutamin)，放置於 5% CO2、 37 ℃培養箱培養。每 2-3 天更換新的培養液，等到細胞生長到 9 分 滿時，將舊的培養液吸出丟棄到廢液桶，然後加入 10 毫升的 1× PBS 輕輕搖晃並吸出丟棄到廢液桶，再加入 3 毫升的 trypsin，靜置約 2-3 分鐘，輕輕拍打 flask，等到大部分的細胞懸浮於液體中，加入 10 毫升的培養液與 trypsin 中和，取置於 50 毫升的離心管，以 1500 rpm 離心 5 分鐘，將上清液輕輕倒入廢液桶，以另 1 管 50 毫升離心管拍 打下層 pellet，加入 3 毫升的培養液混勻 pellet 再加入 10 毫升的培 養液，置於 75 cm2 flask 培養。 4. 計數細胞： 利用 Trypan blue 當作染劑，因為死細胞的細胞膜不完整而會被 trypan blue 滲入而呈色，而活細胞則反之。將混勻的細胞液取 300-800 微毫升到 1.5 毫升的 eppendrof ，再取出含有細胞的 100. 23.
(33) 微毫升的液體與 10 微毫升的 Tryopan blue 混勻，取 10 微毫升 的混勻液到血球計數器，以倒立式相位差顯微鏡計算四個角落 與中間共五個方格的細胞數總和，每個小方格的體積為 1×10-4 cm3，將總細胞數除以 5 再乘以 104 代表每毫升所含有的細胞 數。(48). 三. 細胞形態的觀察-利用倒立式相位差顯微鏡觀察 將 MCF-7 細胞培養在 6-well 培養盤中，將細胞數調整為 2×105/well，然後培養在 5% CO2、37℃的培養箱中培養 24 小時並更換 新的培養皿，分別加入不同濃度的蜂肽(最終濃度 0、2.5、5、7.5、10、 12.5 μg/ml)培養 48 小時，加入 7.5μg/ml 的 蜂肽培養 0、6、12、24、48、 72 小時，以倒立式相位差顯微鏡觀察並拍照，來觀察蜂肽對 MCF-7 細 胞形態的影響。. 四. 細胞存活率的測定 1. 原理： MTT((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assy 根據 Mosmman 所提出的方法， MTT 為一種黃色的 tetrazolium，會被活細胞粒腺體上的 Succinate dehydrogenase 還原 成紫藍色的 formazan，在 500~600 nm 具有較高的吸光值，以此吸光 值的比較來表示細胞存活率。(48, 49). 24.
(34) MTT reagent. Formazan. 圖 4-1 MTT 形成 Formazan 反應機制 2. 實驗步驟： 將 MCF-7 細胞，種殖在 96-well 培養盤中，每個 well 種殖 1×104，將細胞培養在 5% CO2、37℃的培養箱中培養 24 小時，加入 不同濃度的蜂肽(0、2.5、5、7.5、10、12.5 μg/ml)培養 24 和 48 小時， 將培養液吸出丟棄，每個 well 加入 200μl 的 MTT (0.5 mg/ml)，放置 於 5% CO2、37℃的培養箱反應 4 小時，加入 10% SDS，放入 5% CO2、 37℃的培養箱反應 16 小時，以 ELISA reader 測定在 595 nm 的吸光 值。. 五. 細胞週期測定： 1. 原理： 利用 PI (Propidium Iodide)染劑會與核酸鍵結，當細胞膜被酒精打 開固定，PI 螢光染劑就可以進入細胞與核酸鍵結，利用流式細胞儀 進行細胞週期的分析。(50) 2. 實驗步驟： 將 MCF-7 細胞，種殖在 6-well 培養盤中，每個 well 種殖 2×105， 將細胞培養在 5% CO2、37℃的培養箱中培養 24 小時並更換新的培. 25.
(35) 養皿，加入不同濃度的蜂肽(最終濃度 0、2.5、5、7.5、10、12.5 μg/ml) 培養 24 小時；加入蜂肽(最終濃度 7.5 μg/ml)培養 0、6、12、24、48、 72 小時。之後將細胞液吸出到 15 毫升的離心管，以 1×PBS 清洗 well 並吸入離心管中，加入 trypsin 0.5 ml/well 靜置 1-2 分鐘，輕輕拍打 培養盤，等到大部份的細胞懸浮，每個 well 加入 3 ml 的 1×PBS 清 洗，將細胞懸浮液吸至離心管中，放入離心機中離心，1500 rpm、5 mins，等待離心的同時，加入 3 毫升的 1×PBS 到 well 中，離心之後 將上清液倒入廢液桶，輕輕刮散底部的 pellet，再將 well 中的細胞 懸浮液吸到離心管中，再離心一次，將上清液倒入廢液桶，輕輕刮 散底部的 pellet，慢慢的滴入 70%的酒精到離心管中(2 ml/tube)，將 所有離心管蓋蓋子並冰入-20℃的冰箱至少隔夜，冰箱儲存最好不要 超過 2 個星期，上機前，先將酒精離心去除，並刮散底部的 pellet， 加入 1×PBS 到離心管(5 ml/tube)再離心一次，倒掉上清液，每管離 心管加入 500 μl 的染劑 (0.002% propidium iodide 10 ml、5% triton 10 ml、2 mg/ml Rnase 2.5 ml、1×PBS 27.5 ml)，室溫避光反應 30 分鐘， 再以流式細胞儀進行分析，分析時每秒的細胞數不要超過 150 顆(最 好每秒低於 100 顆)，細胞太多可以用染劑稀釋，數據以 Cell Quest 進行分析，記下 G0G1、S、G2M 以及 SubG1 的比例 。. 六. 粒腺體膜電位(Mitochondrial membrane potential；△Ψm)測定： 1. 原理： DioC6(3,3’-Dihexyloxacarboxyanine iodine)是一種親脂性的螢 光染劑，而此染劑可以與粒線體基質結合，依照結合螢光的多寡來 判別粒腺體膜電位上升還是下降。(51). 26.
(36) 2. 實驗步驟： 將 MCF-7 細胞，種殖在 6-well 培養盤中，每個 well 種殖 2×105，將細胞培養在 5% CO2、37℃的培養箱中培養 24 小時並更換 新的培養皿，加入蜂肽(最終濃度 7.5 μg/ml)培養 0、1、3、6、12、 24、48 小時，之後將細胞液吸出到 15 毫升的離心管，以 1×PBS 清 洗 well 並吸入離心管中，加入 trypsin 0.5 ml/well 靜置 1-2 分鐘，輕 輕拍打培養盤，等到大部份的細胞懸浮，加入 3 ml/well 的以 1×PBS 清洗，將細胞懸浮液吸至離心管中，放入離心機中離心，1500 rpm、 5 mins，等待離心的同時，加入 3 毫升的 1×PBS 到 well 中，離心之 後將上清液倒入廢液桶，輕輕刮散底部的 pellet，再將 well 中的細 胞懸浮液吸到離心管中，再離心一次，將上清液倒入廢液桶，輕輕 刮散底部的 pellet，每管加入 500 μl 的 MMP 染劑(10 μl 的 1 mM 的 MMP 試劑+500 μl 的 1×PBS)混勻，0 小時中有一管只加入 500 μl 的 1×PBS(當作 Blank)，放入 37 ℃的水浴槽反應 30 分鐘，以流式細胞 儀進行分析，使用 MMP 軟體，將 blank 的 M1 調成約 100%，然後 分析 0 小時，將 M1 與 M2 調成約各為 50 %，之候不能再調整計續 上機，波峰往左移動代表粒線體膜電位下降；波峰往右移動代表粒 腺體膜電位上升). 七. 活性氧成分測定(Reactive oxygen species；ROS) 1. ,原理： H2DCF-DA (2`,7`-dichlorofluorescein diacetate)為一種螢光物 質，可以通過細胞膜進入細胞內，此時會被細胞內的 esterase 分解， 形成 H2DCF， H2DCF 會被細胞內的過氧化氫氧化形成具有螢光的. 27.
(37) HDCF，並聚集在粒腺體中，可藉由螢光的強度來評估活性氧化物的 產生與否。(52) 2. 實驗步驟： 將 MCF-7 細胞，種殖在 6-well 培養盤中，每個 well 種殖 2×105，將細胞培養在 5% CO2、37℃的培養箱中培養 24 小時並更換 新的培養皿，加入蜂肽(最終濃度 7.5 μg/ml)培養 0、1、3、6、12、 24、48 小時，之後將細胞液吸出到 15 毫升的離心管，以 1×PBS 清 洗 well 並吸入離心管中，加入 trypsin 0.5 ml/well 靜置 1-2 分鐘，輕 輕拍打培養盤，等到大部份的細胞懸浮，加入 3 ml/wll 的以 1×PBS 清洗，將細胞懸浮液吸至離心管中，放入離心機中離心，1500 rpm、 5 mins，等待離心的同時，加入 3 毫升的 1×PBS 到 well 中，離心之 後將上清液倒入廢液桶，輕輕刮散底部的 pellet，再將 well 中的細 胞懸浮液吸到離心管中，再離心一次，將上清液倒入廢液桶，輕輕 刮散底部的 pellet，每管加入 500 μl 的 ROS 染劑(1 μl、 200 μM 的 ROS 試劑+500 μl 的 1×PBS)混勻，0 小時中有一管只加入 500 μl 的 1×PBS(當作 Blank)，放入 37 ℃的水浴槽反應 30 分鐘，以流式細胞 儀進行分析，使用 ROS 軟體，將 blank 的 M1 調成約 100%，然後分 析其餘 0 小時，將 M1 與 M2 調成約各為 50 %，之後不能再調整繼 續上機，波峰往左移動代表蜂肽可能具有抗氧化的物質；波峰往右 移動代表有活性氧成分的生成)。. 八. DAPI(4`-6-diamidine-2phenyl indole)染色 1. 原理： DAPI(4`-6-diamidine-2phenyl indole)是一種螢光染劑，可以專. 28.
(38) 一性與 DNA 雙股螺旋的小溝(minor groove)鍵結，當細胞凋亡時， DNA 會斷裂，DNA 斷裂越嚴重，DAPI 染劑可以鍵結的位置就越多， 顯微鏡下觀察的螢光亮度越亮。(53) 2. 實驗步驟： 將 MCF-7 細胞，種殖在 6-well 培養盤中，每個 well 種殖 1×105，將細胞培養在 5% CO2、37℃的培養箱中培養 24 小時並更換 新的培養皿，加入蜂肽(最終濃度 7.5 μg/ml)培養 0、6、12、24、48 小時，將培養液吸出至廢液桶，滴入 1×PBS 3 ml/well 輕輕清洗兩 次，加入 3% Formaldehyde/ 1 ml/well 室溫空氣流通處固定細胞 20 分鐘，之後再滴入 1×PBS. 3 ml/well 輕輕清洗兩次，再加入 0.1%. triton X-100 1 ml/well 反應 20 分鐘，再滴入 1×PBS 3 ml/well 輕 輕清洗兩次，避光加入 DAPI 染劑 500 μl/well，置於培養箱反應 30 分鐘，將 DAPI 染劑吸出至廢液桶，再滴入 1×PBS 3 ml/well 輕輕 清洗兩次，以螢光顯微鏡觀察並拍照。. 九. 彗星試驗(Comet assay) 1. 原理： 彗星試驗是來檢測 DNA 損傷的程度，利用電泳的特性，當 DNA 受到損傷，DNA 會從細胞核游離出來而拖尾，類似彗星的形 狀，拖尾越長表示 DNA 受損得程度越嚴重。. (54). 2. 實驗步驟： 將 MCF-7 細胞，種殖在 6-well 培養盤中，每個 well 種殖 2×105， 將細胞培養在 5% CO2、37℃的培養箱中培養 24 小時並更換新的培 養皿，加入蜂肽(最終濃度 0、2.5、5、7.5、10、12.5 μg/ml)培養 24. 29.
(39) 小時。將細胞液吸出到 15 毫升的離心管，以 1×PBS 清洗 well 並吸 入離心管中，加入 trypsin 0.5 ml/well 靜置 1-2 分鐘，輕輕拍打培養 盤，等到大部份的細胞懸浮，加入 3 ml/wll 的以 1×PBS 清洗，將細 胞懸浮液吸至離心管中，放入離心機中離心，1500 rpm、5 mins，等 待離心的同時，加入 3 毫升的 1×PBS 到 well 中，離心之後將上清液 倒入廢液桶，輕輕刮散底部的 pellet，再將 well 中的細胞懸浮液吸 到離心管中，再離心一次，將上清液倒入廢液桶，輕輕刮散底部的 pellet，加入 1 ×PBS 40 μl/tube 混勻取至 eppendorf 至於冰上備用。以 鉛筆將磨砂面的載玻片寫上組別，將下膠(70 μl 的 0.5% LMA+ 0.5% NMA)置於載玻片，將蓋玻片以 45°蓋上，等到下膠凝固，輕輕撥離 蓋玻片。取 10 μl 的細胞液與 70 μl 的 0.5% LMA 混合均勻，將此含 有細胞上膠置於下膠上方並蓋上蓋玻片，等到凝固將蓋玻片輕輕撥 離。 將整個裝了玻片的架槽小心的浸入 Lysis buffer solution 一個小 時(冰上，需新鮮配製)。 將整個架槽移到 Alkaline buffer solution 二 十分鐘。 跑膠：將玻片放在以 Alkaline 做為電泳液，以 300mA 跑 30 分鐘。將玻片再放入架槽進入 0.4 M Tris buffer solution 三十分 鐘，使 pH 變回中性。將架槽進入 methanol 五分鐘，使膠脫水。加 PI 染劑(2.5 μg/ml)40μl，以螢光顯微鏡觀察並拍照。 3. 溶液配方： (1). Lysis buffer solution (需新鮮配製)，調整 pH = 8~10，需混合 均勻，添加 NaOH(l)可以幫助 EDTA 溶解。 作用：可將細胞膜通道打開 Comet assy 試劑配製. 30.
(40) 表 4-3 a 材料. 體積(毫升). 5 M NaCl. 100. 1 M Tris-HCl. 2. 0.5 M EDTA. 40. Triton. 2. DDW. 56. Total volume. 200. (2). Alkaline buffer solution，調整 pH = 13 4-3 b. 作用：解開 DNA 雙股螺旋 材料. 體積/重量. NaOH. 12 g. EDTA. 0.3724 g. DDW. 1000 ml. (3). 0.4 M Tris buffer solution，以 HCl(l)調整 pH = 7.5 作用：使膠變回中性 4-3 c 材料. 體積/重量. Tris. 48.456 g. DDW. 1000 ml. 註解： LMA：low melting agarose NMA：normal melting agarose. 31.
(41) 十. 西方墨點法(Western blotting)(55, 56) 1. 粗萃取細胞蛋白質 2. 定量蛋白質 3. SDS-PAGE 電泳分析 4. 轉漬 5. 壓片 1. 粗萃取細胞蛋白質 將 MCF-7 細胞，種殖在 10 公分的培養盤中，每盤種殖 3×106，將 細胞培養在 5% CO2、37℃的培養箱中培養 24 小時並更換新的培養皿， 加入蜂肽(最終濃度 7.5 μg/ml)培養 6、12、24、48 小時，之後將細胞液 吸出到 50 毫升的離心管，以 1×PBS 清洗 dish 並吸入離心管中，加入 trypsin 3 ml/dish 靜置 1-2 分鐘，輕輕拍打培養盤，等到大部份的細胞懸 浮，加入 10 ml/dish 的以 1×PBS 清洗兩次，將細胞懸浮液吸至離心管中， 放入離心機中離心，1500 rpm、5 mins，將上清液倒入廢液桶，取 1×PBS 1 ml/tube 混合均勻到 eppendorf ，以高速離心機離心 1500 rpm、5 mins， 小心以 pipetman 吸掉上清液。加入適量 protein extraction solution(視 pellet 多寡而定)，以 pipetman 混合均勻並以震盪機震盪 2 分鐘，移到-20 ℃冰 箱儲存隔夜，以高速離心機離心 14000rpm、20 分鐘，取上清液存放於 -20 ℃冰箱。 2. 定量蛋白質 (1). 定量蛋白質標準品 以胎牛血清白蛋白(Bovine serum albumin：BSA)當作蛋 白質標準品。取 2 毫升的 Bradford 染劑與 8 毫升 DDW (Double distilled. 32.
(42) water)混合備用，然後取 15 μl 的蛋白質標準品與 735 μl 的 Bradford 染劑混和均勻取到 eppendorf 中，從各個蛋白質標準品中取 出 200 μl/wel(三重複)到 96 well plate 中，利用酵素免疫分析儀 (ELISA Reader)在 595 nm 測定各蛋白質標準品的吸光值並算除平均 值。利用 Microsoft office excel 軟體計算出蛋白質標準品吸光值與 濃度之間的標準檢量線，並計算出趨線方程式以及 r2 (r2>0.99 )。 蛋白質標準品的製備 將 3 毫克的 BSA 溶於 3 毫升的 DDW，配成 1000 μg/ml，當成 stock 表 4-4 BSA 濃度 (μg/ml) 1000 μg/ml BSA (μl) DDW (μl). 1000. 800. 600. 400. 200. 0. 1000. 800. 600. 400. 200. 0. 0. 200. 400. 600. 800. 1000. (2) 樣品蛋白質定量 取 15 μl 的各樣品蛋白質與 735 μl 的 Bradford 染劑混 和均勻取到 eppendorf 中，從各樣品蛋白質中取出 200 μl /wel(三重複)到 96 well plate 中，利用酵素免疫分析儀(ELISA Reader)在 595 nm 測定各樣品蛋白質的吸光值並算除平均值。 將平均值帶入趨勢線方程式，可以計算出該樣品蛋白質的濃度。. 3. 電泳膠片製作 表 4-5 下層膠（Separation gel）的配製（6 片膠） 12％ Separation gel. 材料 DDW. 12.9 ml. Running buffer. 7.5ml. 33.
(43) 9ml. 40％ Acrylamide/Bis (29：1) 10％ SDS. 0.3 ml. 10％ APS. 0.3 ml. TEMED. 13 μl. 表 4-6 上層膠（Stacking gel）之組成及配製（6 片膠） Stacking gel. 材料 DDW. 6.09 ml. Stacking buffer. 1.59 ml. 40％ Acrylamide/Bis (29：1). 1.63 ml. 10％ SDS. 0.3ml. 10％ APS. 0.3 ml. TEMED. 10 μl. 表 4-7 Running buffer（1.5M Tris- HCl, pH8.8）的配製 材料. 重量/體積. Tris. 36.3 g. DDW. 150 ml. HCl. 調整 pH=8.8. 調整 pH=8.8 之後加 DDW 使總體積等於 200 毫 升. 表 4-8 Stacking buffer（0.5M Tris- HCl, pH6.8）的配製 組成. 重量/體積. Tris. 3g. 34.
(44) DDW. 40 ml. HCL. 調整 pH=6.8. 調整 pH=6.8 之後加 DDW 使總體積等於 50 ml. 將配置好的下層膠注入鑄膠台後，再加入 isopropanol 將膠壓平，靜 置到 50 毫升離心管中的下膠凝固，將鑄膠台傾斜，使 isopropanol 流出， 加入上層膠並插上梳子，要避免有氣泡產生。靜置到 15 毫升離心管中 的下膠凝固，小心將梳子拔出，再將做好的膠放入電泳槽中，加入 Running buffer 以 70V 先預跑 30 分鐘。將樣品蛋白和 5x protein loading dye 混合並以 100℃加熱 10 分鐘後，取 4 μl 分子量標準品 ( maker )和 18 μl 配置好的樣品由左而右分別 loading 到樣品槽中。剛開始以 70V 跑 到上層膠與下層膠的界線，再以 100V、跑 90 分鍾。. 表 4-9 電泳緩衝液的配製 材料. 體積 (ml). 10× SDS buffer. 200. DDW. 1800 總體積 2000 ml. 4. 轉漬 先將轉漬夾打開後黑色面朝下，取出一片泡過轉漬緩衝液（Transfer buffer）的海綿墊片放於其上面，之後並依序在海綿墊片放上 3M 濾紙、 SDS-PAGE gel、PVDF 轉漬膜（先泡過甲醇 5 分鐘，再放入轉漬緩衝液. 35.
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