行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※
※
※ 以酸鹼區域精鍊法分離蛋白質 ※
※ Protein separation using pH-zone-refining ※
※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※
計畫類別：□個別型計畫 □整合型計畫
計畫編號：NSC 89－2113－M－009 －016 －
執行期間： 88 年 08 月 01 日至 89 年 07 月 31 日
計畫主持人：余 艇
共同主持人：
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立交通大學應用化學系
中 華 民 國 89 年 10 月 8 日行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
計畫編號：NSC 89－2113－M－009 －016 －
執行期限：88 年 08 月 01 日至 89 年 07 月 31 日
主持人：余 艇 國立交通大學應用化學系
一、中文摘要 關鍵詞：酸鹼區域精鍊法，逆向流層析， 微胞，反微胞，蛋白質濃縮。 本研究是期望以逆向流層析最近發 展出來的一種新技術-酸鹼區域精鍊法，來 分離蛋白質。逆向流層析是一種液相/液相 層析，它的特點是分離管柱中沒有填充固 體支持物，分離所需的靜相是純粹的液 體，經由重力或是向心力將其滯留於管柱 中；由於靜相在管柱中的比例很高，以至 於分離樣品的量很大，是一種製備型的層 析，同時因為沒有固體支持物在管柱中， 樣品也不會因為永久吸附而損失，很適合 用於天然物的分離 酸鹼區域精鍊法，是以分析物在不同 酸鹼度之下，解離程度的改變，使得在靜 相（有機相）和動相（水相）中的分配係 數不同，而發生的層析現象。它的特點是， 分離的容量甚至大過一般的逆向流層析， 而且在層析過程中，有聚集濃縮的作用發 生，以至於分離的解析度很好。不過目前 這個技術還無法用於蛋白質的分離，原因 是蛋白質在有機相中幾乎不溶，所以無法 在靜相中有任何滯留，自然也就不能進行 層析。我們原先的計畫是要調整動靜相系 統，亦即加入介面活性劑，使得蛋白質也 可以溶在靜相中，如此，就有機會進行酸 鹼區域精鍊法。 本計畫研究之結果發現無法成功的使 用反微胞來實施酸鹼精鍊法，其原因是當 蛋白質進入反微胞相之後，調整酸鹼度， 使得蛋白質傾向返回到水相中，雖然在熱 力學上之預測蛋白質應該回到水相，可是 在動力學上的實際表現，我們卻發現其速 率非常慢，以至於無法滿足層析過程中分 析物在動靜相中質傳的速率，而導致嚴重 拖尾現象，不能達成區域精鍊的目的。但 是在實驗當中我們卻發現以反微胞相，加 上使用逆向流層析可以高效率的來濃縮水 中之蛋白質，因此本結案報告之內容，將 改變主題成為”在逆流層析中以反微胞溶 劑系統濃縮水溶液中的蛋白質分子”。 Abstract Keywor ds ： pH-zone-refining, countercurrent chromatography, micelle, reverse micelle, protein purification.This research anticipates involving in protein separation using pH-zone-refining technique. pH-zone-refining has been developed recently as a new technique in countercurrent chromatography. (CCC). CCC is a liquid-liquid chromatography that needs no solid-state support material in the column. The stationary phases are pure liquids that are retented in the separation column using gravity or centrifugal force. The sample capacity of CCC is relatively large due to its high stationary phase ratio in the column. Accordingly, CCC has been considered a preparative chromatography. Without solid-phase packing material in the column, sample loss due to permanent adsorption would not happen. It has been proved a good separation technique for natural products.
usually suitable only for ionizable analytes in CCC application. The partition coefficients of the analytes change along with different pH values. Separation occurs under controlled pH. The sample capacity of this technique can be even greater than the regular CCC. In addition, analytes are concentrated during elution. The band-breadth is not widened even the sample amount increases considerably; that results in good resolution and less cross-contamination between analytes. However, protein separation still cannot be carried out using this technique presently. Protein molecules can hardly be dissolved in any organic solvent, therefore no retention is expected in the stationary phase. Accordingly, separation cannot occur in the organic-aqueous system used in current pH-zone-refining methods at all. Originally we propose to modify the system by adding surfactants in the conventional organic-aqueous system. Since the solubilization of protein in the organic phase becomes possible due to micelle formation, it is conceivable to fulfill protein separation using the pH-zone-refining technique.
Unfortunately, we were unable to achieve pH-zone-refining using the reverse micelle solvent system. After protein molecules entered the micellar stationary phase, it was found that the backward process, i.e., returning to aqueous mobile phase, became very slowly. Even the pH value was adjusted to favor the solute distribution to the aqueous mobile phase thermodynamically. The solute mass transfer between the two phases was so slow that peak tailing was very phenomenal. Accordingly, we failed to carry out pH-zone refining in CCC. However, we explored that it was possible to efficiently concentrate protein molecules in aqueous solution using CCC. Therefore, we will switch our subject to “protein concentration using reverse micelle solvent system in CCC” in this report. 二、 緣由與目的 最近幾年，逆向流層析有一種新的方法出 現 ， 稱 作 酸 鹼 區 域 精 鍊 法 （ pH-zone-refining）它的特性是分離樣品的量非常的 大，遠超過傳統逆向流層析所可處理的 量，而且因為分析物在分離過程，還會產 生濃縮的效應，其層析圖譜呈區塊狀，而 且帶寬遠小於一般逆向流層析相同滯留時 間所應該顯現的帶寬；由於帶寬減小，所 以區塊不易重疊，因而可以得到高純度的 分離。由於以上的特性，酸鹼區域精鍊法 已被應用於天然物的製備分離。酸鹼區域 精鍊法的一個先決條件，就如同所有的層 析一般，待分離物必需在動靜相中都有適 當的溶解度，否則不可能產生分離。對於 高極性的化合物如胜太，可以加入相對離 子(counterion)，形成所謂的離子對（ion-pairing），因而降低其極性，能在動（極 性）靜（低極性）相間有合理的分配係數， 而進行酸鹼區域精鍊。對於蛋白質這樣大 分子量的極性物質，不易形成離子對，如 果要進行酸鹼區域精鍊法的分離，必需另 想辦法。要將高極性物質溶於低極性的溶 劑，可以使用介面活性劑，例如 sodium bis(2-ethylhexyl)sulphosuccinate (AOT)，形 成反微胞，而溶於非極性溶劑中，再加上 酸鹼值的調配，則可以讓蛋白質分子優遊 於動靜相之間，而發生酸鹼區域精鍊的現 象。酸鹼區域精鍊法分離的機制，可以用 圖二來簡單說明，假設一樣品中有四個化 合物，注入分離管柱中，同時一個大體積 的有機酸也被注入，這四個化合物在動相 （極性）和靜相（非極性）中之分配常數 （partition coefficient）隨著酸鹼值而有所 不同，如果滿足如圖中所示 Kb<KpH<Ka則 分析峰 2 和 3 就會發生聚集的現象，亦即 其帶寬會小於分析峰 1 和 4，即使此二者 的滯留時間長過分析峰 1。當化合物 2 和 3
處在位置 1（圖 1Ａ）時，會因為在酸性中， 抓氫離子，變成非解離狀態，而較易進入 非極性的靜相，亦即位置 2，進入位置 2 後，因為 KpH<Ka，對靜相比較有親和力， 所以在管柱中移動速度，不及那個有機酸 快，等於被推進了位置 3，相當於在高酸 鹼值（鹼性）的區域，在這個區域，化合 物 2 和 3 會產生解離，比較溶於高極性的 動相，於是進入區域 4；之後因為 Kb<KpH， 亦即在水相中之位移超過該有機酸，於是 又進入區域 1；以上所敘述的過程，在整 個沖提的期間，循環不已，本來正常發生 的擴散現象，就會被壓縮而達到減小帶寬 結果。而且，當樣品的量大幅增加時，只 會增加分析峰的高度，而不增加帶寬，所 以可以處理大量樣品，而且保持原有的解 析度。 蛋白質分子的分離，是生物科技研究 中，一個經常必要的過程，本研究原本期 望提供一個新的方法，其特性是分離容量 很大，靜相是純粹的液體，沒有固態的吸 附劑，不會發生吸附而損失樣品。同時這 個方法，也可以當作蛋白質純化之用，將 蛋白質和其他物質分離的一種技術。 三、 結果與討論 要能夠進行酸鹼區域精來分離蛋白 質，首先要讓蛋白質能夠合理的分配於動 靜兩相，在有機溶劑中加入介面活性劑之 後，我們確定蛋白質可以在兩相中做合理 的分配，可是實驗卻不如預期之結果。一 般酸鹼精鍊法，得出的層析圖，都會呈現 如長方形的塊狀圖，但是我們所得到的卻 很像吸附型的層析圖，呈現拖尾的高斯圖 形。經過進一步分析，確定是由於蛋白質 一但進入有機微胞相中之後，要再回到水 相中，其速率非常緩慢，亦即如圖（1A） 中所示從第三區間回到第四區間速率極慢 而造生問題，因此無法達成原先所預期蛋 白質分子會在四個區間循環運動時所應該 達成的聚集效應。 但是在研究此主題時，我們發現，使 用逆向流層析系統，可以用來濃縮水溶液 中之蛋白質，因此下面我們將記錄此項結 果。過去十年間，大量的文獻記載使用反 微胞法萃取水中蛋白質。其過程可以由圖 二說明之，首先調整水樣品之酸鹼度，使 得蛋白質傾向進入微胞相中，此過程稱之 為正向萃取；之後以另一酸鹼度之水溶液 做反向萃取，亦即將蛋白質溶回水相，在 正反向萃取過程中，就可能可以將蛋白質 和其他物質分離。但是在文獻中直到目前 為止，都只是研究使用不同介面活性劑來 完成正反向萃取，可是並無法達到濃縮的 目的，如果在萃取分離的過程中同時又可 以達到濃縮的效果，相信可以拓展反微胞 萃取蛋白質的應用價值。 簡單而言，我們是將有機反微胞相先 注入分離管柱中，然後開始打入蛋白質水 樣品，其體積可以遠大於反微胞相之體 積；此時水樣品之酸鹼度要調成適合蛋白 質進入反微胞相中。水樣品完全注入之 後，打入一段（例如 1-10 mL）水溶液， 其酸鹼度適合蛋白質會到水相，收集流出 管柱的水相，測其濃度，就可以知道回收 蛋白質的總量，比較原先水樣品和回收水 相之體積，可以計算濃縮之比例。和文獻 中批式(batch)的實驗方式相比，我們的萃 取過程是連續性的，分離管柱之作用，可 以想像成一系列的分液漏斗，因此萃取的 效率很高，可以達成濃縮的效果。 我們試驗了數種蛋白質和胺機酸，此 處只列出對蛋白質 cytochome c 之結果， 見表一，其中例如當水樣品之體積為有機 反微胞相十倍時，我們所得到最好的結果 為，蛋白質回收 95%，體積濃縮 25 倍， 亦即 700 mL 之水樣品濃縮成為 28 mL。 四、 、計畫成果自評 我們原先是希望能達成高效能的分 離，亦即所謂酸鹼區域精鍊法，不過目前 暫時由於動力學上的障礙，因而無法成 功，但是這個計畫本身還是值得嘗試及保 留到以後，因為最近文獻出現一些研究，
可能可以突破動力學上的障礙，舉例來 說，有人在微胞相中加入第二種介面活性 劑（co-surfactant），發現可以增快蛋白質 在兩相中的質傳速率，如果類似的研究繼 續有突破的發展，我們原先所提出之構 想，又有可行的一天；歷史上很多研究也 是如此，往往因為相關領域的發展，而導 致原先有價值卻無法成功的構想又起死回 生。 此外，我們在進行原計畫時，發現另 外一個應用，亦即濃縮水溶液中的蛋白 質，雖然和原計畫不同，卻衍生出新的領 域，這項成果，我們將會發表於國際期刊。 五、參考文獻
1. Y. Ito and W.D. Conway, “High-Speed Countercurrent Chromatography” John Wiley & Sons, Inc. (1996)
2. A. Weisz, A.L. Scher, K. Shinomiya, H.M. Fales, Y. Ito, J. Am. Chem. Soc.,
116, 704 (1994)
3. Y. Ma, Y. Ito, J. Chromatogr. A,
702,197 (1995)
4. K.E. Goklen, T.A. Hatton, Sep. Sci. Tech., 22, 831 (1987)
5. Y. Yamada, R. Kuboi, I. Komasawa,
Biotechnol. Prog., 11, 682 (1995)
6. R. Rahaman, T.A. Hatton, J. Phys. Chem., 95, 1799 (1991)
7. F.Q. Yang , J. Quan, T.Y. Zhang, Y. Ito,
J. Chromatogr. A, 822, 316 (1998)
8. Luisi, P. L., "Enzymes hosted in reverse micelles in hydrocarbon solution",
Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 24, 439
(1985)
9. Goklen, K. E., and Hatton, T. A., "Protein extraction using reverse micelles", Biotech. Prog., 1, 69 (1985)
10. Dekker, M., Riet, K. V. and Weijers, S.
R., Chem. Eng. J., 33, B27 (1986).
11. Pires, M. J., Aires-Barros, M. R., and Cabral, J. M. S., Biotechnol. Prog., 12,
290 (1996)
12. Luisi, P.L., and Magid, L.J., Crit. Rev. Biochem., 20, 409 (1986).
13. Dekker, M., Hilhorst, R., and Laane, C.,
Anal. Biochem., 178, 217 (1989).
14. Leodidis, E. B., and Hatton, T. A., J. Phys. Chem., 94, 6400 (1990).
15. Leodidis, E. B., and Hatton, T. A., J. Phys. Chem., 94, 6411 (1990).
16. Pires, M. J., Martel, P., Baptista, A., Petersen, S. B, Willson, R., and Cabral, J. M. S. Biotechnol. Bioeng. 44, 773
(1994).
17. Göklen, K. E, and Hatton, T. A., Sep. Sci. Technol., 22, 831 (1987).
表一 Cytochrome c 萃取重量回收率及體積濃縮比
（註）管柱內有機靜相體積皆為 70 ml。
樣品體積/靜
相體積
2
4
7
10
正向萃取打入
的蛋白質溶液
(mg / mL)
1.65 / 140
2.70 / 280 4.17 / 490 4.74 / 700
反向萃取回收
的蛋白質溶液
(mg / mL)
1.41 / 24
2.34 / 23
3.92 / 28
4.50 / 28
重量回收率
（％）
85.5
86.7
94.0
94.9
體積濃縮比率
(回收的體積
/打入的體積)
1 / 5.8
1 / 12.2
1 / 17.5
1 / 25
圖一 酸鹼區域精鍊法示意圖(取自 p128,”High-speed Countercurrent
