行政院國家科學委員會農業生物技術國家型計畫
成果報告
植物有用基因之利用—
轉殖反義基因改善苦瓜果實品質之研究
計畫編號：NSC89-2317-B-002-012
國立臺灣大學園藝學系
杜宜殷 助理教授
TEL: 02-23630231 轉 2535 FAX: 02-23627053
E-mail: yiyindo@ccms.ntu.edu.tw
中文摘要 利用已知 ACC 合成 胺基酸序列演化 保留區設計為寡核 酸引子，進行聚合 連 鎖反應，得到四個苦瓜 ACC 合成 基因片 段作為篩選互補 DNA 庫的探針。苦瓜 cDNA 庫 共 篩 選 一 百 四 十 萬 個 溶 斑 形 成 單 位 (plaque-forming unit, p.f.u.)，得到 89 個具雜 交反應的溶斑，純化後得到 39 個 cDNA 選 殖系。選取 cDNA 選殖系 pMACS1、pMACS7 及 pMACS15 進行全長的核酸定序分析，結 果顯示 cDNA 長度分別為 2,012 bp、2,403 bp 及 2,011 bp，開放解讀框架分別解碼、及個 胺基酸，分子量為 54.2、54.9 及 54.1kD。 選殖得到的 ACC 合成 cDNA 分別以正向 及反向連接於 CaMV 35S 啟動子後方，並於 基因末端加上終結子 (terminator)，構築於 含 報 導基 因 GUS 及篩選基因 NPTII 的 pRT99gus 質體中，形成苦瓜之順義及反義 ACC 合成 基因，目前正在進行中。 關鍵詞：基因轉殖、果實後熟、ACC 合成 反義基因 一、計畫緣起及目的 苦瓜 (Momordica charantia L.) 為葫 蘆科 (Cucurbitaceae) 果菜類，一年生蔓性 草本植物，原產於熱帶亞洲，世界主要栽培 地區分布於南非、印度、東南亞、中國大陸 和台灣等熱帶地區，為典型的東方蔬菜。苦 瓜之販售單價於夏季高居本省第一位，是重 要 夏 季 蔬 菜 之 一 。 苦 瓜 屬 更 年 性 (climacteric) 果實 (郭等, 1987)，綠熟的苦 瓜對於乙烯十分敏感，在後熟的過程中，其 乙 烯 釋 放 量 與 呼 吸 率 會 在 果 實 黃 化 前 上 升 ， 大 量 釋 出 的 乙 烯 造 成 果 實 過 熟 現 象 (over-ripening)；尤其在運輸與銷售過程中， 常因微量乙烯存在而提前後熟，使果肉變 黃，假種皮變紅，肉質酥軟易碰傷，且因失 水嚴重致果 皮皺縮 而 降低商品價 值 (黃, 1985)。苦瓜兼具食用、藥用與觀賞價值， 若能生產熱帶亞洲特產、高品質、耐貯運的 苦瓜，將可進軍國外市場，具有發展潛力。 故本計畫著手選殖與苦瓜後熟相關之乙烯 生合成途徑中的關鍵酵素 -- ACC 合成 基 因，利用反義 RNA 技術 (antisense RNA technology)，將與內生基因反向的基因，藉 由有效的基因轉殖系統，導入植物體內，使 其轉錄出與內生訊息 RNA 互補的產物，進而阻隔基因轉譯為蛋白質的步驟 (Inouye, 1988) ， 或 利 用 順 義 基 因 共 同 抑 制 (cosuppression) 的效果，達到抑制乙烯生合 成的目的。 二、執行成果 (一) 初步成果 A、苦瓜 cDNA 庫之構築 抽取苦瓜授粉後十六天果實組織之總 RNA，經由 oligo dT 親和層析管柱 (affinity column) 分離 poly(A)+ RNA，再利用反轉錄 (reverse transcriptase) 與 oligo dT 引子， 合成互補 DNA，以 RNase H 除去 mRNA， 再利用 DNA polymerase I Klenow fragment 合成第二股 cDNA，所得到之雙股 DNA 將 接 上 EcoRI linker ， 選 殖 於λZapII 載 體 (Stratagene) 內，所使用的寄主為 XL1-Blue MRF’。 B、苦瓜後熟相關基因之選殖 (1) 探針之合成 利用已知 ACC 合成 胺基酸序列演化 保留區設計為寡核 酸引子，抽取苦瓜基因 組 DNA 作為模版，進行聚合 連鎖反應， 所得用的產物將作為篩選互補 DNA 庫的探 針。順利選殖得到四個苦瓜 ACC 合成 基 因片段，分別命名為 MAC11、MAC16、 MAC17 及 MAC19，長度約為 250 bp，經核 酸定序分析確定為 ACC 合成 基因片段。 (2) ACC 合成 cDNA 之選殖 以合成之四個基因片段為探針，利用溶 斑雜交法 (plaque hybridization) 篩選苦瓜 的 cDNA 庫，共篩選一百四十萬個溶斑形成 單位 (plaque-forming unit, p.f.u.)，得到 89 個具雜交反應的溶斑，挑選其中 39 個溶斑 進一步純化，最後得到 39 個 cDNA 選殖系。 根據區分選殖系的雜交結果得知，其中 29 個選殖系相對應於基因片段 MAC11，另 12 個 選 殖 系 則 相 對 應 於 MAC19 。 挑 選 pMACS1、pMACS7 及 pMACS15 進行全長 的核酸定序分析，結果顯示 cDNA 長度分別 為 2,012 bp、2,403 bp 及 2,011 bp。其中 pMACS1 及 pMACS15 的核酸及胺基酸序列 十分相近。將 pMACS1 cDNA 相對應基因命 名為 MCm-ACS1，pMACS7 cDNA 相對應基 因命名為 MCm-ACS2。 C、苦瓜 ACC 合成 基因之南方氏 雜交分析 抽 取 苦 瓜 基 因 組 DNA ， 分 別 以 BamHI、EcoRI、HindIII、SalI 組合進行 單切或雙 切後，以電泳分離後轉印至 轉漬膜，以 ACC 合成 cDNA pMACS1 為探針，進行南方氏雜交分析，結果顯 示此基因於苦瓜基因組中為單一拷貝。 D、反義基因之構築 將選殖得到的 ACC 合成 cDNA pMACS1 之正向及反向，分別連接於 CaMV 35S 啟動子 (promoter) 後方，並 於基因末端加上終結子 (terminator)，構 築於含報導基因 GUS 及篩選基因 NPTII 的 pRT99gus 質體中，形成苦瓜之順義及 反義 ACC 合成 基因。構築完成的質體 將抽取大量純化之質體 DNA，供農業試 驗所園藝系張有明博士，運用其建立之 苦瓜轉殖系統進行基因轉殖。 E、苦瓜採收後生理之探討 1. 收取授粉後十四至十六天之未轉殖 苦瓜果實，置於流通式呼吸缸內，於 20oC 測定 0、0.1、1、10、100 µl/L 乙烯濃度處理 24 小時後，苦瓜果實 呼吸率及乙烯生成量的變化。 a. 以 早 夏 作 苦 瓜 為 材 料 的 結 果 顯 示，未處理乙烯的苦瓜果實於第十 一天完全後熟；處理 0.1 µl/l 乙烯
的果實始終未出現明顯的乙烯生 成高峰，遲至處理後九天才完全黃 化腐爛，此乙烯濃度太低，促進果 實後熟的效果不大，不適合作為轉 殖果實分析用；1 µl/L、10 µl/L、 100 µl/L 乙烯處理的果實則於三天 後即黃化腐爛，CO2生成高峰均較 對照組高。 b. 以 晚 夏 作 苦 瓜 為 材 料 的 結 果 顯 示，未處理乙烯的苦瓜果實於第十 三天完全後熟；1、10、100 µl/L 乙烯處理的果實則於第八天出現 乙烯生成高峰，以 100 µl/L 乙烯處 理的果實有最高的乙烯生成量，並 於第十一天完全黃化腐爛。處理較 高濃度乙烯的果實呼吸率較大。轉 殖苦瓜果實將可以 10 µl/L 乙烯處 理分析果實對乙烯之敏感度。 2. 為比較乙烯類似物丙烯對苦瓜果實 的影響，並避免處理之乙烯殘留於呼 吸缸，影響果實乙烯生成之測定，以 晚夏作苦瓜為材料，分別處理 100、 1000 µl/L 丙烯，未處理乙烯的苦瓜 果實於第十三天完全後熟；處理 100 µl/L 丙烯的果實於第六天出現乙烯 生成高峰，以 1000 µl/L 丙烯處理的 果 實 則 於 第 五 天 即 進 入 乙 烯 生 成 期，並於第九天有最高的乙烯生成 量，約為 100 µl/L 丙烯處理之兩倍， 並於第十一天完全黃化腐爛。處理較 高濃度乙烯的果實呼吸率較大。 3. 收取授粉後十六天之未轉殖苦瓜果 實，置於流通式呼吸缸內，於 15、 20、25oC 使自然後熟，分別測定苦 瓜 果 實 呼 吸 率 及 乙 烯 生 成 量 的 變 化。結果顯示苦瓜於 25o C 溫度下放 置 4 天即出現乙烯生成高峰，且很快 腐爛；於 20o C 則遲至第 8 天才出現 乙烯生成高峰，但乙烯生成量較於 25oC 多；於 15oC 下，乙烯高峰並 不明顯，約於第 13 天始出現小幅度 上升。貯存溫度越高，苦瓜後熟速度 越快，轉殖苦瓜果實將可以 20o C 貯 存分析果實自然後熟的情形。 F、苦瓜採收後基因表現情形 分別抽取於 20o C 下，以 0、0.1、1、 10、100 µl/l 乙烯、100、1000 µl/l 丙烯處理 24 小時之授粉後十四至十六天未轉殖苦瓜 果實的 poly(A)+ RNA 20 µg，以苦瓜 ACC 合成 cDNA pMACS1 及 pMACS7 為探 針，進行北方雜交分析，結果顯示 0.1 µl/l 乙烯處理 24 小時的苦瓜果實中 ACC 合成 基因之 mRNA 累積量最高，概其他乙烯濃 處理的果實中 mRNA 累積高峰短於 24 小 時，且高峰後逐漸降解，故累積量較低。 MCm-ACS1 在授粉後 3 天即有表現，並在第 6 天達到高峰，隨後逐漸減少其表現量，至 第 21 天的 mRNA 累積量些微提高；而 MCm-ACS2 在 果 實 發 育 前 期 的 表 現 量 與 MCm-ACS1 的表現情形一致，但表現量極 少，並在果實發育後期無法偵測到其 mRNA 的累積。苦瓜果實貯存在 15℃下於第 18 天 達到乙烯生成高峰，並在第 23 天後熟；而 MCm-ACS1 在貯藏前期並無基因表現，但在 第 9 天可偵測到 mRNA 的累積，並持續表 現至果實完全後熟；MCm-ACS2 同時在第 9 天有基因表現，相較於其他溫度的結果顯 示，會受到低溫的誘導而在後熟階段中表 現。果實貯存在 20℃下，在第 8 天有乙烯高 峰出現，並於 12 天黃化腐爛；在 25℃下貯 存苦瓜果實則在第 4 天有乙烯高峰，於第 8 天完全後熟。比較 MCm-ACS1 基因表現與 果實乙烯生成量的結果可知，兩者在時間上 具有相關性。而 MCm-ACS2 在 20℃及 25℃ 下的表現量極少。若以 10 µl/l 乙烯於 20℃ 下分別處理苦瓜果實 1、2、4、8、12、24 小時，由結果可知，隨著乙烯處理時間的增 加，會使果實後熟的時間提早，並使乙烯生
成量提高。MCm-ACS1 基因經乙烯處理 1 小 時即有表現，並在第 8 個小時達到乙烯高 峰，並隨後逐漸減少 mRNA 的累積。而 MCm-ACS2 的表現亦會受到乙烯誘導，但 mRNA 的累積量仍舊稀少。 G、反義基因之轉殖 將構築好的順、反義基因交由農業試驗 所張有明博士，運用已建立之花粉電穿孔轉 殖法導入苦瓜，收穫轉殖後代種子。目前收 得轉殖種子約一千多粒，已播種於穴盤使其 發芽長葉，將分別抽取轉殖植株之基因組 DNA，以聚合 連鎖反應進行篩選。 (二) 達到預定進度 (三) 預算已完全執行 一、 參考文獻 1. 郭純德、蔡平里、林宗賢. 1987. 採收後苦 瓜果實之呼吸型式及乙烯自動催化生成. 中國園藝 33(3):161-171. 2. 黃鵬. 1985. 溫度、塑膠袋包裝及乙烯吸收 劑對採收後苦瓜品質之影響. 中國園藝 31(4):226-231. 3. Destefano-Beltran, L. J. C., W. V. Caeneghem, J. Gielen, L. Richard, M. van Montagu, and D. van der Straeten. 1995. Characterization of three members of the ACC synthase gene family in Solanum
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