行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
以超臨界流體萃取及逆流層析技術分離親水性物質(1/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2113-M-009-026-執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立交通大學應用化學系 計畫主持人： 余艇 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中
華
民
國 92 年 5 月 26 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫結案報
告
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※ 以 超 臨 界 流 體 萃 取 及 逆 流 層 析 技 術
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※ 分離親水性物質(1/3)
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計畫類別：
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個別型計畫□□□整合型計畫
計畫編號：NSC
91-2113-M-009-026-3
執行期間：
91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日
計畫主持人：余 艇
共同主持人：
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立交通大學應用化學系
中 華 民 國 92 年 5 月 26 日行政院國家科學委員會專題研究計畫結案報告
計畫編號：NSC
91-2113-M-009-026-執行期限：91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日
主持人：余 艇 國立交通大學應用化學系
中文摘要
關鍵詞：蛋白質，金屬離子，超臨界流體 萃取，逆流層析，反微胞，介面活性劑 第一年度，我們的進度包括兩部分， 其一是以逆流層析結合反微胞萃取並濃 縮蛋白質分子，另一部分是在超臨界二氧 化碳中加入介面活性劑，以萃取親水性物 質。在第一個部分，我們成功的萃取並濃 縮了蛋白質分子 cytochrome c，其萃取回 收率，最高可達 95%，而且體積可以濃縮 十幾倍。在第二部分，我們測量了七種商 用離子型介面活性劑在修飾過的超臨界 二氧化碳中之溶解度，當修試劑乙醇之比 例為 20%時，didodecyldimethylammonium bromide (DDAB) 及 sodiumbis-2-ethylhexyl sulfosuccinate (AOT) 兩 種介面活性劑之溶解度於二氧化碳(225 bar and 350C)中高於 1.8×104 mg/L，可以 形成反微胞，嘗試以此反微胞相萃取親水 性物質，結果發現可以萃取出離子性染料 亞甲藍和甲基橙，但是無法萃取出蛋白質 分子 cytochrome c。 以下正文都分為上述兩個研究分別敘 述之。
英文摘要
Key Words: Protein, Metal ions, Supercritical fluid extraction, Reverse micelle, Surfactant
Countercurrent chromatography
This first-year progress report of this three-year research will be described in two parts. The first part involves concentration of proteins using reverse micelle phase in a countercurrent chromatograph, while the second part involves hydrophilic components extraction using surfactant-containing supercritical fluid carbon dioxide (SFCO2). We successfully
extracted and concentrated protein
cytochrome c using countercurrent chromatograph. The highest recovery yeild reached 95% and the sample volume was reduced more ten-folds. In addition, we measured solubilities of seven commercially available ionic surfactants in solvent-modified SFCO2. When carbon
dioxide (225 bar and 350C)modified with 20% (v/v) ethanol, solubilities of didodecyldimethylammonium bromide (DDAB) and sodium bis-2-ethylhexyl sulfosuccinate (AOT) were as high as 1.8×104 mg/L which exceeded the concentration required in forming reverse micelle. Three hydrophilic compounds were examined in the AOT-containing SFCO2. Methylene blue and methyl orange
were found solubilized in SFCO2, while
cytochrome c was found insoluble.
The progress will be expressed in two parts throughout the entire text.
一 前言
（一）隨著基因重組與遺傳工程的發展， 研發如何能夠有效地在發酵液及細胞培養 基質中進行大量且連續分離、純化蛋白質 的技術是愈來愈受到重視。近年來發展出 以形成反微胞的方法，來萃取水基質中的 蛋白質，可是在純化以及濃縮方面，並未 發展出有實用的價值。 （二）反微胞的形成為改善超臨界二氧化 碳萃取極性物質的一個策略，但是幾乎所 有商業上可購買到的界面活性劑在超臨界 二氧化碳中溶解度皆不理想。然而，在超臨界二氧化碳中加入有機修飾劑可以有效 改善這些界面活性劑的溶解度，當溶解度 到達臨界微胞濃度時，界面活性劑於超臨 界二氧化碳中會形成反微胞，進而溶解親 水性物質。
二 研究目的
（一）逆流層析是一種分析型與製備型兼 具的分離兼濃縮技術。其應用包括了農業 化學、食品化學、藥物研發、生化等方面。 由早期發展到現在，高轉速逆流層析儀 (HSCCC)是目前最常用的製備型 CCC 儀 器，其優點是可提高分離效率且縮短分離 時間。除了可應用於層析之外，CCC 儀器 也可作為一具高效能的萃取設備，此研究 即是使用此一特性。 與傳統反微胞萃取法不同的地方是， 本實驗的主要目標是將較低濃度且大量的 蛋白質水溶液，利用分離管柱內的反微胞 相萃取並濃縮成小體積且高濃度的蛋白質 水溶液。藉著逆流層析儀的特點，提供反 微胞萃取技術研究學者另外一種構思及應 用的空間。 （二）應用界面活性劑於超臨界二氧化碳 萃取親水性物質，我們發現界面活性劑 DDAB 和 AOT 在壓力高於 225 bar、修飾 劑乙醇濃度 20% v/v 之下溶解度甚高，應 該可以於超臨界二氧化碳中形成反微胞， 進而萃取親水性物質。因此，我們進行系 統化，介面活性劑於超臨界二氧化碳溶解 度之研究，並嘗試一些親水性物質之萃取。三 文獻探討
（一）1941 年，逆流層析的技術已經應用 在層析以及萃取，直到 70 年代，Ito 和 Conway 等人對於這項技術的理論基礎加 以研究探討，進而開發出多樣的儀器結構 後，並大幅改進其分離效能，其主要應用 於樣品的分離、純化、萃取與製備。 高 速 逆 流 層 析 (High Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC) 在高轉速之下可使得動靜相之間可充分混 和；同時高轉速的旋轉使得動相的流速既 能增快又能保持比傳統逆流層析還高的靜 相滯留量，因而增加樣品分離時的解析度 及效率。 反微胞技術發展至今，絕大多數的文 獻仍然採用單一成分的蛋白質為萃取的樣 品，而且實用之分離效果不佳。尤其若要 將反微胞技術推廣至工業界實際應用的層 面，所處理的樣品組成必須更複雜和多樣 化，例如從真實的發酵液當中萃取出某種 對於生物醫學上有幫助的蛋白質。 本實驗室，將逆流層析和反微胞技術 結合，尚未見諸文獻，我們希望能將反微 胞萃取技術實用化。 （二）上個世紀末，研究人員發現，一些 含氟的介面活性劑在超臨界二氧化碳中有 很高的溶解度，他們並且證實，此溶劑系 統甚至可以溶解分子量很大的蛋白質。除 此之外，Ihara 等人證實了在二氧化碳中加 入乙醇為輔助溶劑可以溶解商業上可購得 的界面活性劑 AOT，Hutton 更進一步證實 了 AOT 可在超臨界二氧化碳中形成反微 胞，溶解甲基橙（methyl orange）與核黃 素（riboflavin）。但是我們仍然缺乏 AOT 這類在商業上可購得的界面活性劑於修飾 極性後二氧化碳中的溶解度資訊。而且， 大量文獻只報導親水性物質可溶解於超臨 界二氧化碳中，少見有實質探討親水性物 質萃取之研究。四 研究方法
（一）包含正向萃取與反向萃取之完整反 微胞萃取。簡單說明實驗步驟，先將含介 面活性劑 AOT 的有機溶劑（例如正己烷） 和含鹽類分子（例如氯化鉀）之水溶液互 相飽和之後靜置分離。之後將反微胞相（有 機相）注入逆流層析轉體中，之後，將含 有蛋白質分子（例如 cytochrome c）的水 溶液，以一般逆流層析注入動相的模式注 入管柱中，在適當的酸鹼度之下，蛋白質 會從水樣品轉移至有機反微胞相中，此即2 是所謂正向萃取，之後從樣品閥門注入一 段（例如 10 mL）不同酸鹼度（例如 pH 12） 之水溶液進入管柱，在這個酸鹼度中，蛋 白質分子會傾向於回到水相中，此即是反 向萃取。經過正反向萃取，可以達到純化 以及濃縮的。 （二）本實驗測量了數種介面活性劑在加 入有機修飾劑後之溶解度。由於溶解度大 於可形成反微胞之濃度，因此我們也嘗試 了使用這個系統來測試，是否可以用來溶 解親水性物質。實驗條件大致如下：臨界 二氧化碳壓力 225 bar、溫度 35 、20 ％ v/v 乙醇為修飾溶劑。
五 結果與討論
（一）本實驗的第一部分將實驗室過去所 選用的 10mg/L cytochrome c 樣品濃度進 而提升至 20、50 直到 100mg/L，同時配合 蛋白質濃度的變化，也選用由 50、70 及 90mM 不同濃度的陰離子型界面活性劑所 形成的反微胞相，結合上述兩項變因歸納 出以下結論：在固定界面活性劑濃度的情 況下，若提高欲萃取之蛋白質濃度，在進 行正向萃取時能夠從水溶液中被萃取進入 反微胞內的蛋白質量會相對的增加，因此 回收率大致上也會相對地提昇；若固定欲 萃取之蛋白質濃度，發現反向萃取過後之 樣品回收率與界面活性劑濃度呈現反比的 關係。 實驗的第二部分，採用未事先平衡處 理之動/靜相溶劑系統進行反微胞萃取，我 們發現：此溶劑系統所得到的萃取回收 率，高於過去所使用經過平衡的溶劑系 統，同時，系統的靜相滯留量雖然降低約 10mL，但是對萃取效果不會造成負面的影 響。由於實驗數據過多，我們在此將一部 份數據列出，作為代表，見表一。 接下來，我們計畫從發酵槽中，實際 的來嘗試是否可以萃取出生產出來的酵 素，並且測試以此種方法所分離出來的酵 素，是否能夠維持活性。 （二）我們測量了七種商用介面活性劑， 其中，DDAB 和 AOT 兩種之溶解度高過 於形成反微胞之濃度，其實驗結果，列表 於表二及表三。此外，我們也嘗試應用離 子型界面活性劑來進行染料及蛋白質的萃 取，結果染料可成功萃取出來，蛋白質在 本實驗中沒有被萃取出來。我們也嘗試利 用在二氧化碳中溶解度較好的非離子型界 面活性劑來進行染料及蛋白質的萃取。結 果蛋白質沒有被萃取出來，但是可以成功 地將染料萃取出來。 六參考文獻
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16. 李心怡，”利用反微胞相在高速逆向流 層析儀上萃取蛋白質”，國立交通
大學，碩士論文，民國 90 年 6 月。 17. Y. Ito and W.D. Conway, “High-Speed
Countercurrent Chromatography”
John Wiley & Sons, New York, 1995. 18. A.P. Foucault , “Countercurrent
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計畫成果自評
依照目前的進度，大體上都合乎第一年的 規劃。本實驗室兩種技術都有相當的進 展，其一，是使用逆流層析儀來純化蛋白 質，的確可以達到純化和濃縮於同一設 備，之後有兩方面研究需要確認，其一是， 此方法是否有普遍性，亦即可使用於不同 蛋白質樣品，其二是，是否真的有實用價 值，亦即應用於發酵槽中酵素之萃取。 另一技術是超臨界流體萃取，我們的確可 以使用含介面活性劑之二氧化碳萃取出甲 基籃和甲基橙，但是尚無法溶解蛋白質分 子，可能需要修飾一些條件來達成。 此兩部分之研究，略做調整以及補做數據 之後，將寫成論文，投稿至 SCI 期刊。4
表(一) 分別以 50、70、90 mM AOT / n-hexane 萃取濃縮 100 mg/l cytochrome c
50 mM AOT / n-hexane 萃取濃縮 100 mg/l cytochrome c
Volume(ml) 10 20 30 40 50 60
Recovery(%) 33.7 92.5 93.8 94.5 94.9 95.4
Conc. factor 10.1 13.9 9.4 7.1 5.7 4.8
7
0 mM AOT / n-hexane 萃取濃縮 100 mg/l cytochrome cVolume(ml) 10 20 30 40 50 60
Recovery(%) 24.9 84.3 85.6 86.3 87.5 87.9
Conc. factor 7.5 12.6 8.6 6.5 5.2 4.4
9
0 mM AOT / n-hexane 萃取濃縮 100 mg/l cytochrome cVolume(ml) 10 20 30 40 50 60 Recovery(%) 17.4 82.3 85 86.4 87.5 87.9 Conc. factor 5.2 12.3 8.5 6.5 5.2 4.4
＊表(一)實驗條件：靜相為 70~90 mM AOT/n-Hexane；動相為 0.2 M KCl； 樣品為 100 mg/l cytochrome c/0.2 M KCl 水溶液；流速 為 1 ml/min；靜相滯留率約 65％；每組數據測定 1 次。
表（二） AOT 在不同條件下於超臨界二氧化碳的溶解度 AOT Pressure (bar ) Temper ature ( )
modifier Mean solubility (mg/L) RSD (% ) 1 200 35 Ethanol 20%v/v 1.99×101 21.3 2 200 35 Ethanol 40%v/v 1.39×104 14.8 3 200 35 Methanol 20%v/v 2.64×101 15.4 4 225 35 Ethanol 20%v/v 1.85×104 9.78 5 250 35 Ethanol 20%v/v 2.05×104 2.32 6 250 35 Ethanol 10%v/v 1.16×104 0.860 註：Mean solubility 為三次實驗平均 表（三） DDAB 在不同條件下於超臨界二氧化碳的溶解度 DDAB Pressure (bar ) Temper ature ( )
modifier Mean solubility (mg/L) RSD (% ) 1 200 35 Ethanol 20%v/v 8.97×101 3.96 2 200 35 Ethanol 40%v/v 2.04×104 4.83 3 200 35 Methanol 20%v/v 9.77×101 0.830 4 225 35 Ethanol 20%v/v 2.09×104 9.63 5 250 35 Ethanol 20%v/v 2.18×104 2.92 6 250 35 Ethanol 10%v/v 3.37×103 1.83
