氯乙烯工人P53腫瘤蛋白研究

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告

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計畫類別：

√

個別型計畫　　□整合型計畫

計畫編號：NSC 89－2320－B－002－159－

執行期間：88 年 08 月 01 日至 89 年 7 月 31 日

計畫主持人：鄭尊仁

共同主持人：

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

執行單位：

國立台灣大學公共衛生學院職業醫學及工業衛生研究所

中　華　民　國　89 年　10 月　13 日

氯乙烯工人 p53 腫瘤蛋白研究

計畫編號:NSC 89-2320-B-002-159-執行期限:88 年 08 月 01 日至 90 年 07 月 31 日 主持人:鄭尊仁 執行機構及單位名稱:國立台灣大學公共衛生學院職業醫學及工業衛生研究所

中文摘要:

氯 乙 烯 是 已 知 的 肝 毒 性 致 癌 物 質 ， 會 導致 肝 臟 血 管 肉 瘤 和 肝 細 胞 癌。過去的文獻報告指出，氯乙烯暴 露相關之肝臟血管肉瘤病例，出現 p53 基因之突變，且此種突變專一性高。 此特性讓我們可以利用血清中的 anti-p53 抗體與 anti-p53 蛋白來作為研究氯乙烯 相關之致癌性研究之替代對象 本研究探討氯乙烯工人體內 p53 基因突變，與基因多型性 CYP2E1， ALDH，EH，和 GSTs。以及生活習慣 如年紀，抽煙，飲酒及體內微量維生 素間的關係。共計有 213 位氯乙烯工 人被納入分析，根據過去累積暴露氯 乙烯劑量分成高，低暴露組。利用問 卷訪視獲得其飲酒及吸煙習慣，工作 史及個人病史。氯乙烯工人的 p53 基 因突變是以 ELISA 的方式偵測，基因 多型性 CYP2E1，ALDH，EH，和 GSTs 是以聚合脢鎖鍊反應(PCR)來測定，微 量維生素則是以高效能液相色層層析 儀(HPLC)來偵測。 結果顯示 p53 突變蛋白或抗體陽 性 率 為 13.6% 。 P53 抗 原 陽 性 在 ALDH2 基因型有 40.9%的人為 wild type，而 p53 抗原陰性這組有 59.2%的 人為 wild type，利用邏輯式回歸分析 控制生活習慣，基因型及微量維生素 後可看到在基因型 ALDH2 和 P53 抗原 陽性有顯著相關(p<0.05)。而 P53 突變蛋白或抗體陽性這組我們可以看 到微量維生素維生素 A 在兩組有顯著 的差異(chi-square, p=0.05)。利用邏輯 式回歸分析控制生活習慣，基因型及 微量維生素後可看到在微量維生素維 生素 A 和 P53 抗原及抗體陽性有顯著 相關(p<0.05)。 關鍵詞：氯乙烯、P53、腫瘤蛋白、 CYP2E1、ALDH2

Abstr act:

Vinyl chloride workers are known to be at risk for the development of angio-sarcoma and hepato-cellular carcinoma of the liver. In a study of p53 gene mutations in the tumors of vinyl chloride exposed workers, 2 of 4 cases (50%) of angio-sarcoma of the liver examined contained the specific vinyl chloride induced p53 tumor suppressor gene mutation. Because of the specificity of the mutation, p53 antigen and anti-p53 antibodies can be used as surrogate for p53 mutation. This study was designed to investigate whether the metabolic genotypes, lifestyle and micronutrients affect VCM-induced p53 mutation. Two hundred and thirteen male VCM-workers were classified into high and low exposed groups. Questionnaires

were administered to obtain detailed histories of cigarette smoking, alcohol consumption, occupations, and medications. The mutant p53 protein and anti-p53 antibodies were detected by enzyme-linked immunosorbent assays. CYP2E1, ALDH2, EH and GSTs genotypes were identified using the polymerase chain reaction (PCR). Micronutrients were quantified by high-performance-liquid-chromatography (HPLC). The results showed that 29 of 213 vinyl chloride workers(13.6%) had mutant p53 antigen or antibodies. 40.9% of p53 antigen positive workers had ALDH wild type compared to 59.2% of p53 antigen negative. In logistic regression analysis after adjusted the lifestyle, genotypes and micronutrients, we can find that genotype ALDH2 had significant correlation with p53 antigen (p<0.05). A significant difference was observed between vitamin A and mutant p53 antigen or antibody groups.

Keywords: VCM、P53、Oncoprotein、 CYP2E1、ALDH2

背景:

氯 乙 烯 是 已 知 的 肝 毒 性 致 癌 物 質，會導致肝臟血管肉瘤和肝細胞癌 1_{。過去的文獻報告指出，氯乙烯暴露} 相關之肝臟血管肉瘤病例，出現 p53 基因之突變2,3_{，且此種突變專一性高，} 僅在 p53 之 codon249 及 255 發現，且 均為 A:T to T:A 之 mis-sense 突變。此 種突變不僅引起 p53 半衰期變長外4_， 亦因外觀結構的改變而引起人體的免 疫 反 應 ， 使 人 體 產 生 anti-p53 antibody5。由於前敘的研究，讓我們知 道血清中的 anti-p53 抗體與 p53 蛋白可 能可作為研究氯乙烯相關之致癌性研 究之替代對象。在法國的氯乙烯暴露 工人研究中可以發現氯乙烯暴露愈多 的工人體內產生 p53 突變的機率越 大，且呈現劑量-反應關係6_。 雖 然 從 事 氯 乙 烯 聚 合 的 工 人 頗 多，但並非每個人都會因為氯乙烯的 暴露而導致健康上的危害。除了氯乙 烯外，似乎還有其他輔助性因子和氯 乙烯所造成的健康危害有關，因此個 體的差異可能在其中扮演修飾性的角 色 ， 個 體 的 差 異 可 包 括 內 因 性 (endogenous)因子，如基因多型性。過 去 在 動物 實 驗中 看 到 氯 乙 烯 可 能 被 CYP2E1，ALDH2，EH，和 GSTs 酵素 所代謝7,8,9_{，而我們先前的研究已經證} 實了氯乙烯工人的 CYP2E1，GSTT1， 和 ALDH2 基因型與其肝功能異常有 關。或外因性(exogenous)因子，如年 紀，抽煙，飲酒等習慣或微量維生素 攝取的高低等差異。許多流行病學的 資料證實攝食含有多種微量維生素的 新鮮蔬果與癌症的預防有關 10,11,12_，而 微量維生素與氯乙烯所引起的健康危 害研究,目前相當缺乏。 因此。,我們的研究目標是探討氯 乙烯工人體內 p53 基因突變，與基因 多型性 CYP2E1，ALDH2，EH，和 GSTs。以及生活習慣如年紀，抽煙， 飲酒及體內微量維生素間的關係。

結果:

213 位氯乙烯工人的基本資料如 表一，29 人為 p53 突變蛋白或抗體陽

性,比例為 13.6%。高暴露組為過去累 積 暴 露 氯 乙 烯 劑 量 大 於 或 等 於 300ppm-month 共有 101 人，其中 p53 突變蛋白或抗體陽性率為 11.8%，p53 抗原陽性率為 9.9%，p53 抗體陽性率 為 5.0% 。低暴露組為過去累積暴露氯 乙烯劑量小於 300ppm-month 共有 112 人，其中 p53 突變蛋白或抗體陽性率 為 13.4%，p53 抗原陽性率為 10.7%， p53 抗體陽性率為 2.7%。高低暴露兩 組的年紀,工作年資和累積暴露濃度在 統計上有顯著的差異(t-test, p<0.05)。 以 p53 抗原陽性或陰性將 213 位 氯乙烯工人分成兩組(表二)來看其中 的差異， p53 抗原陽性這組共有 22 個 工人，比例為 10.3%，若將兩組相比可 以看到在 ALDH2 這項中，p53 抗原陽 性這組有 40.9%的人為 wild type，而 p53 抗原陰這組卻有 59.2%的人為 wild type，雖然這兩組的差別頗大，但在統 計上卻未達到顯著的差異(chi-square, p=0.11)。 以 p53 突變蛋白或抗體陽性或陰 性分成兩組(表三)，在 p53 突變蛋白或 抗體陽性這組我們可以看到微量維生 素維生素 A 在兩組有顯著的差異(chi-square, p=0.05)。 進一步多變項分析控制了年紀， 過去累積暴露，抽煙，喝酒，病毒性 肝炎，基因多型性及微量維生素後發 現基因多型性的 ALDH2 和 p53 抗原陽 性這組有顯著的相關(p=0.045)。同樣 的控制了年紀，過去累積暴露，抽煙， 喝酒，病毒性肝炎，基因多型性及微 量維生素後發現微量維生素的維生素 A 和突變蛋白或抗體陽性這組有顯著 的相關(p=0.045)。

討論:

本研究中 213 個氯乙烯工人中有 29 個人為 p53 突變蛋白或抗體陽性, 比例為 13.6%(表一)。這個數字和法國 的氯乙烯工人的研究相比，法國的研 究中6_{顯示其氯乙烯工人 225 人中有 91} 個人為 p53 突變蛋白或抗體陽性，其 比例為 40.4%。兩個研究中有關 p53 突變蛋白或抗體陽性率差別頗大，原 因可能是兩邊工人年紀，工作年資和 暴露濃度差異頗大的關係。本研究中 工 人 的 平 均 年 紀 為 41.1 歲 (range=24~65)，抽煙率為 58.2%，喝酒 率為 5.2%，平均暴露濃度為 1468ppm-月(range=4~34621)。而法國的研究中 工 人 的 平 均 年 紀 為 53.8 歲 (range=35~78)，抽煙率為 42.2%，喝酒 率 為 25.3% ， 平 均 暴 露 濃 度 為 44820ppm-月(range=48~560424)。顯示 法國工人的年紀以及暴露濃度遠大於 我們的工人。 動 物 實 驗 指 出 氯 乙 烯 可 能 被 CYP2E1，ALDH2，EH 和 GSTs 酵素 所代謝7,8,9_{，在基因多型性的研究中(表} 二 )p53 抗 原 陽 性 或 陰 性 兩 組 中 ALDH2，GSTT1，GSTM1 wild type 在 p53 抗原陽性皆較少，但尚未達到 統計上顯著的差異。EH3 或 EH4 在兩 組中並沒有差別，而 CYP2E1 則相反， wild type 在 p53 抗原陽性反而較多。 p53 突變蛋白或抗體陽性或陰性的結 果也類似。雖然兩者的結果類似，但 在統計上皆未達到顯著的差別。推測 其原因應該是本研究中的 p53 突變蛋 白或抗體陽性率太低所致。 維生素 A 在 p53 抗原陽性(表二) 這組較低,而在 p53 突變蛋白或抗體陽 性這組(表三)更是有統計上顯著的差 異(chi-square p=0.05)。但其他的微量營

養素則看不到此種差別。過去的研究 發現，在體外的實驗維生素 A 會增加 p53 腫瘤抑制基因的表現使人類肺癌 細胞的轉移能力下降 13_{。維生素 A 在} 氯乙烯工人產生 p53 突變蛋白或抗體 中可能扮演一保護的角色。

參考文獻

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(表一)氯乙烯工人基本資料 高 暴 露 組 ( 累積 暴露 計 量>=300 ppm-month) 低暴露組(累積暴露計量 <300 ppm-month) 人數 101 112 年紀(歲) 44.6±9.8 (25 to 65) 38.0±9.3 (24 to 61) 工作年資(年) 20.2±9.8 (2.3 to 36.1) 13.3±9.9 (1.8 to 37.8) 累積暴露濃度(ppm-month) 2973.1±4461.2 (301 to 34621) 110.0±84.4 (4 to 295) 抽煙者 56 (55.5%) 68 (60.7%) 習慣性飲酒 6 (5.9%) 5 (4.5%) 肝炎病毒感染 27 (26.7%) 20 (17.9%) P53 抗原及抗體陽性 14 (13.9%) 15 (13.4%) P53 抗原陽性 10 (9.9%) 12 (10.7%) P53 抗體陽性 5 (5.0%) 3 (2.7%) (表二) 氯乙烯工人 p53 抗原特徵基本資料 P53 抗原陽性 N=22 P53 抗原陰性 N=191 Odds ratio (95 % C.I.) 年紀(歲) 42.6±9.3 (28 to 56) 41.0±10.2 (24 to 65) 工作年資(年) 17.9±9.5 (1.9 to 31.4) 16.5±10.5 (1.8 to 37.8) 累積暴露濃度 (ppm-month) 2266.5± 7311.1 (8 to 34621) 1375.6± 2603.9 (4 to 18671) 抽煙* 4 (18.2%) 63 (33.3%) 0.44 (0.14~1.37) 慣性喝酒者 0 (0%) 11 (5.8%) 0.00 肝炎病毒感染 4 (18.2%) 43 (22.5%) 0.77 (0.25~2.38) ALDH2 (wild type) 9 (40.9%) 113 (59.2%) 0.48 (0.20~1.17) CYP2E1 (wild type) 15 (68.2%) 102 (53.4%) 1.87 (0.73~4.79) EH (fast type) 8 (36.4%) 70 (36.7%) 0.99 (0.40~2.47) EH3 (wild type) 8 (36.4%) 51 (26.7%) 1.57 (0.62~3.96) EH4 (wild type) 17 (77.3%) 151 (79.1%) 0.90 (0.31~2.59) GSTT1 (wild type) 8 (36.4%) 94 (49.2%) 0.59 (0.24~1.47) GSTM1 (wild type) 11 (50.0%) 116 (60.7%) 0.65 (0.27~1.57) α-胡蘿蔔素(>=5.27µg/dl) 13 (59.1%) 101 (52.9%) 1.29 (0.53~3.15) β-胡蘿蔔素(>=0.19µg/dl) 14 (63.6%) 109 (57.1%) 1.32 (0.53~3.29) 維生素-A (>=0.57µg/ml) 9 (40.9%) 100 (52.4%) 0.63 (0.26~1.54) 維生素-E (>=7.19µg/ml) 13 (59.1%) 94 (50.8%) 1.40 (0.57~3.43) *以總吸煙包數大於 1000 包, 所列為大於等於 1000 包以上的氯乙烯工人 (表三) 氯乙烯工人 p53 抗原及抗體特徵基本資料 P53 抗 原 及 抗 體陽性 N=29 P53 抗 原 及 抗 體 陰 性 Odds ratio (95 % C.I.)

N=184 年紀(歲) 41.7±10.1 (25 to 59) 41.0±10.1 (24 to 65) 工作年資(年) 17.2±10.1 (1.9 to 32.8) 16.5±10.5 (1.8 to 37.8) 累積暴露濃度(ppm-month) 2419.6± 7109.1 (5 to 34621) 1317.6± 2315.1 (4 to 16180) 抽煙* 6 (20.7%) 61 (33.5%) 0.52 (0.20~1.34) 慣性喝酒者 0 (0%) 11 (6.0%) 0.00 肝炎病毒感染 4 (13.8%) 43 (23.4%) 0.53 (0.17~1.39) ALDH2 (wild type) 14 (48.3%) 108 (58.7%) 0.66 (0.30~1.44) CYP2E1 (wild type) 18 (62.1%) 99 (53.8%) 1.41 (0.63~3.14) EH (fast type) 9 (31.0%) 69 (37.5%) 0.75 (0.32~1.74) EH3 (wild type) 8 (27.6%) 51 (27.2%) 0.99 (0.41~2.39) EH4 (wild type) 23 (79.3%) 145 (78.8%) 1.03 (0.39~2.71) GSTT1 (wild type) 11 (37.9%) 91 (49.5%) 0.63 (0.28~1.40) GSTM1 (wild type) 16 (55.2%) 111 (60.3%) 0.81 (0.37~1.79) α-胡蘿蔔素(>=5.27µg/dl) 17 (58.6%) 97 (52.7%) 1.27 (0.58~2.81) β-胡蘿蔔素(>=0.19µg/dl) 19 (65.5%) 104 (56.5%) 1.46 (0.64~3.32) 維生素-A (>=0.57µg/ml) 10 (34.5%) 99 (53.8%) 0.45 (0.20~1.03) 維生素-E (>=7.19µg/ml) 14 (48.3%) 96 (52.2%) 0.86 (0.39~1.87) *以總吸煙包數大於 1000 包, 所列為大於等於 1000 包以上的氯乙烯工人 邏輯式回歸分析氯乙烯工人 P53 抗原陽性以及 p53 突變蛋白或抗體陽性 P53 抗原 陽性:22 人,陰性:189 人 p53 突變蛋白或抗體 陽性:29 人,陰性:182 人 Odds ratio (95%C.I.) Odds ratio (95%C.I.) 年紀* 1.74 (0.67~4.73) 1.74 (0.74~4.22) 累積暴露濃度(ppm-month) 0.50 (0.13~1.57) 0.54 (0.16~1.51) 抽煙** 0.44 (0.12~1.31) 0.56 (0.19~1.45) 慣性喝酒者 0.00 (0.00~4.32) 0.00 (0.00~3.21) 肝炎病毒感染 0.86 (0.22~2.73) 0.54 (0.14~1.60) ALDH2(wild type) 0.38 (0.14~0.97)*** 0.55 (0.23~1.26) CYP2E1(wild type) 2.05 (0.80~5.72) 1.56 (0.68~3.70) EH (fast type) 0.91 (0.34~2.35) 0.68 (0.27~1.60) 維生素-A 0.61 (0.23~1.55) 0.42 (0.17~0.96)*** *以四十歲分組,所列為大於等於四十歲以上的氯乙烯工人 **以總吸煙包數大於 1000 包, 所列為大於等於 1000 包以上的氯乙烯工人 ***p<0.05