藉由基因體與蛋白質體的研究來探討台灣Glycine 亞屬染色體組間的遺傳關係 (2/3)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

藉由基因體與蛋白質體的研究來探討台灣 Glycine 亞屬染色

體組間的遺傳關係(2/3)

中 華 民 國 93 年 5 月 24 日

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

藉由基因體與蛋白質體的研究來探討台灣 Glycine 亞屬染色體組間的遺傳關係

(2/3)

Genomics and proteomics on the relationship among subgenus Glycine collected in Taiwan (2/3) 計畫編號：NSC 92-2313-B-002-040 執行期限：自民國92 年 8 月 1 日起至民國 93 年 7 月 31 日 主持人：謝兆樞 執行機構及單位：國立台灣大學農藝學系 一、中文摘要 台 灣 為 大 豆 屬 Soja 亞 屬 分 部 南 界 及 Glycine 亞 屬 分 佈 北 界 。 目 前 台 灣 發 現 共 五 種 大 豆 屬 植 物:G. max、G. S oja、G. t aba ci n a、

G. tomentel la 及 G.d olicho car pa。

其 中 由 台 灣 東 部 收 集 的 G. dolichocarpa， 一 般 認 為 是 G. toment ell a 的 生 態 型 ， 但 199 1 年 日 本 學 者 Tateishi 和 Ohashi 依 其 形 態 分 類 為 一 個 新 物 種 ， 這 個 分 類 的 合 適 度 長 久 以 來 一 直 沒 有 定 論 。 本 試 驗 使 用 栽 培 大 豆 、 野 生 大 豆 及 多 個 大 豆 遠 緣 種 品 系 ， 我 們 以 染 色 體 鏡 檢 定 出 每 個 搜 集 系 的 染 色 體 數 ， 以 細 胞 遺 傳 的 方 式 確 定 各 搜 集 系 的 染 色 體 的 倍 數 性 ， 。 另 外 我 們 以 其 中 十 種 大 豆 搜 集 系 的 種 子 蛋 白 質 ， 進 行 雙 向 電 泳 分 析 ， 進 而 比 較 我 們 有 興 趣 的 搜 集 系 ， 找 出 其 中 有 差 別 的 蛋 白 質 點 ， 以利後續的比對與分析。 關鍵詞：遠緣種、大豆種子蛋白、蛋 白質體分析 Abstract

Genus Glycine consists of two subgenus, subgenus Glycine and subgenus Soja. Taiwan is the

southernmost collection site of the subgenus Glycine and northernmost of subgenus Soja. Five species of the genus Glycine have been found in Taiwan, G. max 、 G. soja 、 G.

tomentella 、 G. tabacina and G.

dolichocarpa. G. dolichocarpa was first

separated from species G. tomentella in 1991 by Tateishi and Ohashi. However, this statement is not accepted by most of other scientists working on Glycine species.

The materials used included cultivated soybean, wild soybean and some perennial soybean relative accessions. We will also perform cytogenetic analysis in order to know the chromosome number of each accession. We also had established the 2D gel analysis system for the seed proteins of 10 accessions, and found out the different protein spots within or among interested accessions.

Keywords： relatives, soybean seed

protein, proteomics analysis 二、緣由與目的

濟 作 物 之 一 ， 在 西 方 國 家 ， 大 豆 是 飼 料 與 油 料 重 要 原 料 ， 在 亞 洲 國 家 ， 大 豆 更 是 食 物 中 植 物 性 蛋 白 質 的 主 要 來 源 。 基 於 栽 培 種 大 豆 重 要 的 經 濟 地 位 ， 學 者 們 莫 不 亟 欲 改 良 大 豆 在 栽 培 育 種 上 一 些 不 良 性 狀 ， 諸 如 較 差 的 抗 旱 、 抗 蟲 、 抗 病 性 。 具 有 較 頑 強 的 抗 病 、 抗 蟲 、 抗 逆 境 等 特 性 而 與 栽 培 大 豆 同 屬 G l y c i n e 屬 的 多 年 生 大 豆 遠 緣 種 ， 一 直 被 學 者 視 為 改 良 栽 培 大 豆 基 因 庫 （ge n e p o o l ） 的 可 能 親 本 來 源 ， 育 種 學 們 家 試 圖 將 這 些 野 生 種 大 豆 及 多 年 生 大 豆 遠 緣 種 的 優 良 性 狀 轉 移 入 栽 培 種 大 豆 內 ， 但 卻 因 大 豆 在 細 胞 學 或 其 他 方 面 的 研 究 的 不 足 ， 而 遭 遇 種 種 困 難 ， 因 此 ， 關 於 栽 培 種 大 豆 及 其 他 多 年 生 大 豆 遠 緣 種 的 細 胞 學 及 系 統 關 係 （p h yl o ge n e t i c s ） 的 研 究 愈 發 顯 得 重 要 。 台 灣 除 栽 培 種 大 豆 外，共 發 現 有 四 種 大 豆 屬 物 種 ： G . s o j a 、 G . t a b a c i n a 、 G . t o m e n t e l l a 、 G . d o l i c h o c a r p a 。 G . d o l i c h o c a r p a 原 是 G . t o m e n t e l l a 的 一 個 族 群，日 本 學 者 T a t e i s h i 和 O h a s h i （ 1 9 9 1 ） 依 據 外 部 形 態 將 此 一 分 佈 於 台 灣 台 東 的 G . t o m e n t e l l a 族 群 命 名 為 G . d o l i c h o c a r p a 。 目 前 對 於 將 G . d o l i c h o c a r p a 分 類 的 適 當 性 ， 部 分 學 者 仍 有 不 同 意 見 ， 但 陸 續 在 外 部 形 態 、R A P D ( 曾 等 , 1 9 9 7 ) 、 種 子 成 熟 蛋 白 ( H s i n g e t a l . , 1 9 9 5 )、I T S ( H s i n g e t a l . , 2 0 0 1 ) 的 試 驗 證 據 顯 示 ， G . t o m e n t e l l a、G . d o l i c h o c a r p a 的 基 因 歧 異 度 高 ， 有 分 為 兩 物 種 的 必 要 。 此 外 由Doyle 及 Brown 等人 (2002,2004)最近的研究，大致已可推論 出台灣的 G. tomentella 的基因組組 成。例如分佈在屏東的 G. tomentella 為 T4 isozyme group，而其起源是由 D3 與 D5B 兩個二倍體 isozyme group 雜交產生，其genome 分別為 DD, D1D1，因此 T4 isozyme group 的 genome 應該是 DDD1D1。而 G. dolichocarpa 雖然在他們的文中沒有 被明確的指出，但是他們提到台灣有

T2 isozyme group 的 G. tomentella，加

上其起源是 D3 與 D4 isozyme group，其 genome 分別為 DD, D3D3， 而特別值得注意的是D3D3 gemone 在 ITS, Histone H3-D 序列比較及外形(長 莢)均與 AA genome 分在同一群，所以 可以初步判斷分佈在台東的 G. dolichocarpa 的基因組為 DDD3D3。 而 自 二 十 年 前 O'Farrell 和 Klose (1976) 提 出 這 項 技 術 以 來 ， 雙 向 電 泳 憑 藉 不 移 動 pH 梯 度 (immobilized pH gradients, IPGs) 的 發 展 和 改 善 溶 解 度 的 技 術 ， 在 一 個 雙 向 電 泳 膠 片 中 可 分 離 出 2000 個 以 上 (~5000) 的 蛋 白 質 點(spots)， 分 離 出 來 的 蛋 白 質 可 以 用 質 譜 儀 快 速 的 辨 認 。 而 且 ， 假 如 基 因 組 的 資 訊 可 以 獲 得 時， 那 麼 蛋 白 質 體 的 分 析 便 可 以 系 統 性 地 辨 識 基 因 組 內 所 有 的 蛋 白 質。 因 此 我 們 可 用 雙 向 電 泳 去 檢 測 數 百 種 基 因 的 表 現， 也 能 藉 由 專 門 的 軟 體 來 比 較 從 不 同 基 因 型、 外 在 狀 況 或 不 同 的 發 育 時 期 的 表 現 形 式 。 而 這 些 在 電 泳 膠 片 上 呈 現 的 數 百 個 蛋 白 質 點 可 以 視 為 遺 傳 上 或 生 理 上 的 標 誌 (markers)， 而 這 種 蛋 白 質 標 誌 的 應 用 有 助 於 評 估 遺

傳 歧 異 度 以 及 建 立 遺 傳 距 離 和 進 一 步 研 究 品 系 間 、 物 種 間 和 屬 間 得 系 統 發 生 的 親 緣 關 係 。 由於本年度的工作需處理的大豆 種子蛋白是尚未清楚功能且數量、種 類很多的蛋白。因此，我們必須加強 我們原有的雙向電泳技術，並且使每 次的跑膠規格化，以利後續的比對與 分析。所以在 第 二 年 度，我 們 學 習 建 立 穩 定 的 雙 向 電 泳 系 統 ， 並 且 使 每 次 的 跑 膠 規 格 化 ， 以 利 後 續 的 比 對 與 分 析 。 並 練 習 影 像 分 析 辨 識 那 些 蛋 白 質 點 才 是 真 正 有 意 義 且 值 得 進 一 步 用 質 譜 儀 或 N 端 定 序 分 析 的 樣 品 ， 進 而 用 來 檢 驗 台 灣 不 同 Glycine 亞 屬 物 種 的 差 異 性 。 三 、 結 果 與 討 論 大豆種原搜集系根端細胞進行細胞染 色體鏡檢 仔細的觀察各染色體的形態且有 效地分辨將可探究各搜集系間是否有 同源性。但是大豆體細胞分裂中期染 色體非常小，很難確實區分彼此。 Kurata 和 Omura (1978) 發展出製備水 稻根端細胞分裂前中期染色體的技 術，根端組織經以75mM KCl 配製含 6%纖維素酶和 6%果膠酶的酵素溶液 處理後軟化，應用火燄乾燥法製片， 以Giemsa 染劑染色，可得到前中期細 胞供作分析之用。大豆也可以依照此 法來進行根端細胞分裂前中期染色體 的製備。各搜集系種子發芽兩天後， 切取長約1 公分的根尖，以 8-HQ(8 hydroxyquinoline)進行前處理及用 Carnoy’s solution I(乙醇：冰醋酸 = 3:1) 固定液使染色體停在前中期(prophase -metaphase)，方便進行染色體計數及觀 察。 結果我們證實台灣地區所採集到 的一年生的栽培種 G. max 與野生近緣 種 G. soja 的染色體數均為 2n = 40，而 多年生野生大豆遠緣種包括 G. tabacina、G. tomentella 及 G. dolichocarpa 的染色體數均為 2n = 80。這說明 G. tomentella 與 G. dolichicarpa 兩物種的差別至少不是因 為染色體倍數性的差異所造成。 選定十種台灣及外國有代表性的搜集 系 本試驗共抽取十個野生大豆種原 搜集系的剝皮種子heat-unstable protein，包括十石、Soja001、MSF2-9 (Max × Soja001 的 F2 個體上的 F3 種 子)、Tom034、Tom037、Tom039、 Tom056、Can003、Can007、Tab019。 選用這些accessions 的目的為進行兩 兩或多accessions 的比較，分別為(1). Max(十石)、Soja001、MSF2-9；比較 親本與F3。(2). Tom039、Tom056；台 灣長莢(G. dolichocarpa)與澳洲長莢(G. tomentella)的比較。(3). Tom034、 Tom037；兩者均分佈於台灣屏東，但 Tom037 外形與其他台灣的 G. tomentella 有明顯差異。(4). Tom034、 Tom039；台灣屏東 G. tomentella 與台 灣台東 G. dolichocarpa 的比較。(5). Can003、Can007；兩個 G. canescens 物種搜集系的比較，此一物種可能是 某些多倍體 G. tomentella 的二倍體親 本，兩者種子及植株外形均明顯有 異。(6). Soja001、Tom034、Tom039、 Tab019；不同物種間的比較。 結果一年生的物種(G. max 與 G.

soja)彼此的 pattern 相近似，但是一年 生物種與多年生遠緣種的2D pattern 有明顯的差別。多年生的不同物種間 也存在明顯差異。而其中的一組比較 中(Tom039 與 Tom056)則顯示兩個分 佈地相隔甚遠的搜集系(台灣與澳 洲)，所呈現的蛋白質點圖形是幾乎一 致的，這樣的資訊配合先前以這兩個 搜集系作為親本進行雜交而能獲得可 稔後代的實驗結果，為Hymowitz 等人 (1990)認為台灣的野生大豆遠緣種係 由遷徙的候鳥從澳洲攜帶而來的看法 提出了良好的佐證。 在之後的研究中我們預計會再添 加2n=38,40,78 的 G. tomentella accessions，以便更深入探討整個複雜 的 G. tomentella species complex，相信 也更能釐清這個複雜物種的分類與親 緣關係。 建 立 穩 定 的 雙 向 電 泳 系 統 由 於 在 單 向 電 泳 (SDS- PAGE， 依 照 分 子 量 大 小 而 分 離 ) 中 已 經 可 以 觀 察 到 不 同 的 大 豆 種 源 搜 集 系 具 有 多 形 性(Hsieh et al. 2001)，因 此 我 們 可 以 推 論 在 經 過 雙 向 電 泳 (依 照 等 電 點 和 分 子 量 大 小 來 分 離) 之 後 ， 膠 片 上 會 呈 現 出 更 多 的 差 異 ， 這 是 因 為 有 些 分 子 量 相 同 但 帶 電 荷 不 同 的 蛋 白 質 會 因 此 而 分 離 開 來。雙向電泳則 按O’Farrell (1975)的方法進行，步驟包 括 (1).樣品製備 在依據抽種子的全蛋白過程中，取加 熱後離心會凝集沉澱的heat-unstable protein，取樣過程中小心避開澱粉團 塊，所取得的蛋白經過TCA/acetone 法抽取，且wash 過程中先以 80% acetone(with β-ME)洗三次，再以 100% acetone ( withβ-ME)洗兩次，之後真空 抽乾。此法由前人研究據信可去油、 去多醣體、去核酸、去酚類物質等等， 可降低蛋白分析的背景。 蛋白定量：以Bio-Rad 的 RC protein assay reagent 進行定量(750 nm 吸收光 譜)。

(2).First dimension：使用 sample buffer (7M urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 2%DTT, 0.2% ampholyte pH 3-10 和 0.001%BPB)溶解 50μg 蛋白樣品。分 析用和製備用的膠片做前處裡，將每 條17 公分的 IPG 膠片(pH5-8)置於裝有 350uL 蛋白質樣本的 sample buffer 的 回潤(rehydration)盒中，在 18 ℃下以 50 mV 處理隔夜(12 小時)讓其恢復水 分。 之後進行IEF，所使用的 program 為 20℃下，每條 strip 最大電流為 50µA， 提供電壓500V，1h；1500V，1h； 3500V，1h；6000V，1h；8000V， 45000Vh。 (3).Second dimension：採用 1.5mm、 8%-16%梯度 SDS-PAGE。35mA/gel for 6.5 h。 (4).銀染：為了後續質譜的分析，我們 採用Shevchenko et al.(1996)的方法進 行。 在整個雙向電泳系統的建立過程中我 們做過一系列的測試與修正，包括 使用heat-unstable protein、蛋白質的純 化(TCA/spermidine 的使用)、使用 pI 5-8 的 strip、lysis buffer 的成分、IEF buffer 的成分、IEF 條件的設定、平衡 的條件、銀染的方法等等。例如為了

(黏附核酸，以消除膠片上的橫紋)，不 過結果與對照組相似。因為處理 TCA，就已經有去除核酸的作用，其 實就不必另外加spermine 來去除核酸。

另外想知道的是對於pI 5-8 的 strip，在 IEF buffer 應該使用哪一種 ampholyte(3-10 或是 3-10+5-7+6-8 的組 合)，由於結果兩者類似，因此我們在 往後的實驗選擇使用pI 3-10 的 ampholyte。在 IEF 電泳聚焦的條件方 面，經過測試後，選擇45000VHr，在 這個條件下，除了原本含量多的儲存 性蛋白外，大部分的蛋白質均能聚焦 良好。又如銀染方法的選擇，我們測 試過三種銀染方法，其中兩種在呈色 過程中使用戊二醛(glutaraldehyde)，這 種藥品會影響後續的質譜分析，因此 最終選用不含戊二醛的方法。 影像分析 (image analysis)與再現性的 要求 我們利用平台式膠片掃描器 (flatbed scanner) 及 PDquest 軟體， 來將不同搜集系大豆種子蛋白的雙向 電泳膠片進行掃描分析。這需要使用幾 次規格化的膠片來定出兩個方向的 landmarks 的雙向電泳圖譜，它可以作 為後續的雙向電泳膠片上影像的比對 (align and match)的判定。雙向電泳 圖譜上的蛋白質點，均會賦予一個固定 的編號。 在再現性的確認方面，我們選用 兩三個搜集系作代表，每種跑兩片良 好的膠片，進行掃圖存檔，並且注意 要存成灰階及tif 檔，才能使用 PDquest 這個比對軟體。用PDquest 軟體確認 每個spot 的座標，使兩張膠片上的應 該一樣的spot 的值，能在比較時落在 斜角線上一定的範圍內，如此可確認 再現性。目前我們的結果再現性程度 極高，將有助於之後的比較與分析。 未來要做的將是不同物種的比較 (步驟類似再現性測試)，找出落在協角 線範圍外的點的比例(即兩物種的不同 處)，再以特定的估算法如主成分分析 估算親緣關係，以達成探討台灣 Glycine 亞屬染色體組間的遺傳關係的 目標。 四、計畫成果自評 五、參考文獻 曾 富 生、蔡 憲 宏、吳 詩 都。1997。 台 灣 野 生 大 豆 族 群 之 變 異 研 究 V.

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