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尋找SP1的小分子抑制劑以阻斷脊椎損傷病患使用methylprednisolone藥物造成的副作用: 新穎輔助治療藥物篩選

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Academic year: 2021

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尋找 SP1 的小分子抑制劑以阻斷脊椎損傷病患使用 methylprednisolone 藥物造成

的副作用: 新穎輔助治療藥物篩選

吳重孚

a,b

, 李元綺

a* a

臺北醫學大學醫學資訊研究所

b

中國化學製藥股份有限公司

*

通訊作者 E-mail: 李元綺, ycgl@tmu.edu.tw

摘要 (Abstract) 交通意外事件頻傳、高空作業頻繁與其他的意外傷害 的增加脊椎損傷 (spinal cord injury, SCI)患者數量,對 於患者自己以及其家人造成嚴重影響,藉由病理確 認、確認基因角色與電腦軟體提供新穎脊椎損傷患者 治療輔助藥物篩選過程資訊,進而提出對 SCI 患者在 methylprednisolone (簡稱 MP)治療下,開發新的輔助藥 物以提高 MP 治療效果或降低其副作用的新穎藥物開 發的研究與結果。

關鍵字: 脊椎損傷, spinal cord injury, SCI, 對接, docking, 輔助藥物

序論 (Introduction)

疾病與治療 (Diseases and therapy)

脊椎損傷 (Spinal Cord Injury, 簡稱 SCI) 屬於一 種嚴重的疾病與對人類健康造成相當程度的高度風 險。現代因為交通意外事件頻傳、高空作業頻繁與其 他的意外傷害數量的增加,導致 SCI 在臨床的個案持 續增加中,預後並非良好,往往造成肢體的跛行或殘 障結果 [1]。在國立急性脊椎損傷研究 (The National Acute Spinal Cord Injury Studies, 簡稱 NASCIS) II 與 III 級的患者,於 Cochrane 系統性資料庫回顧文獻中所有 隨機臨床試驗與其他發表的報告,當於受傷的患者於 8 小時內給予高劑量的 methylprednisolone,確認對於患 者有意義地增進運動與感覺功能 [2]。

治 療 用 藥 與 治 療 輔 助 劑 (Medicine and adjunct

agents)

最近的醫藥研究藥物或治療輔助劑中,包括糖皮 質類固醇 (glucocorticoids) 其中MP是美國食品藥物管

理局 (U.S. Food and Drug Administration, 簡稱FDA) 唯一許可治療SCI的用藥,但是長久以來SCI患者忍受 MP治療後所產生的副作用,如脂肪組織位移、體重增 加、高血壓、糖尿病、高血糖症、白血球增多、失眠、 水腫、心律不整、骨質疏鬆、肌肉無力、關節疼痛、 骨折等 [3]。所以醫學界思考其他相關輔助的成分或來 自天然的物質,企圖增加或補強MP的治療效果,例如 鴉片接受體拮抗劑 (opium receptor antagonists)、神經 節苷脂 (ganglioside (GM-1)、興奮性氨基酸接受體拮抗 劑 (excited amino acid receptor antagonists, 簡 稱 EAA)、腺苷 (adenosine) 及其擬似物(stimulators)、一 氧化氮合酶 (nitrous oxidases, 簡稱 NOS) 抑制劑、抗 氧化劑 (antioxidants) 與自由基清除劑 (free radical Scavengers)、傳統中藥萃取物-川芎嗪 (Ligustrazine)、 鈣離子阻斷劑 (calcium channel blockers)、促進神經元 再 生 的 藥 物 治 療 例 如 髓 鞘 相 關 抑 制 因 子 (myelin-associated growth inhibitors, 簡稱MAGI)、抑制 調亡藥物、免疫抑制劑、神經營養因子家族、其他藥 物例如促紅細胞生成素 (Erythropoietin, 簡稱 EPO) 等等 [4, 5, 6, 7]。

新藥的研究 (New entity research)

MP在黃金治療時間的使用挽救SCI患者免於喪 命,MP有其存在的價值。在不幸的在意外發生後,SCI 患者為其家人帶來沉重負擔。許多研究者期待能為此 想出一些好方法,使得在黃金治療時間的藥物治療能 使得癒後能恢復的更好。研究者從基本的受傷機制去 了解,利用受試的實驗鼠在受傷過程中,實驗鼠身體 裡發生的生理變化或自我防禦機制,運用設計的各種 實驗企圖描繪出它的病理機轉,身體如何應付外在傷 害,身體如何啟動保護機制。多年以來,藉由實驗鼠

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模擬受傷的過程投予的實驗藥物,MP與EPO經常出現 在發表的期刊。近年以來,研究者運用新的技術與工 具,透過生物基因晶片 (microarray chips) 工具比較受 傷時,間隔時間的變化,投藥後的時間變化,依據以 上的變數透過生物基因晶片找出不同的表現量,藉此 拼湊出合理的作用機轉路徑 (pathway) [8, 9, 10, 11, 12]。 我們企圖由試驗中找出在MP治療情況下的相關 影響基因,由於SP1調控體內許多基因的轉錄因子。當 我們進行設計藥物時,必須考量到面對的對象所扮演 的角色,逕行設計成為拮抗劑 (antagonist)、致效劑 (agonist) 或阻斷劑 (blocker) 等等 [13, 14, 15, 16]。在 此我們企圖找出最能達到增強MP的治療效果或降低 MP所造成的副作用影響的小分子結構為目標。 新藥開發前的準備工作 (Prior work for developing

new entity) 藥品開發的新路徑 (Fig. 1),全球知名藥廠紛紛 設置相關部門研究如何縮短開發時間、降低投資成本 與提高成功率[17, 18]。運用計量模組方式運算出可能 的分子結構,而首要的是確認找出對的基因或接受 體,運用適當軟體找出可能的化學結構 [19, 20]。 Figure. 1 治療藥務開發流程

材料與方法 (Materials and Methods) 對接目標鑑別 (Drug target identification)

在完成確認 SCI 的 pathway 前,先行準備工作選 用與 SCI 有密切關係的基因 1sp1 作為對接目標鑑別基 因。 Figure. 2 1sp1 基因 於 NCBI 中找出有關 SP1 的資料 [21],RCSB PDB (http://www.rcsb.org/) 找出 sp1 (Fig. 2). 以作為對 接時的標的物。SP1 由 1sp1 與 1sp2 基因片段組合,SP1 於體內扮演的角色是廣泛性的調控體內許多基因的轉 錄因子,許多研究指出與細胞增生和調控細胞生長週 期具有相關性 [22]。

化學結構資料庫 (Chemical structure data bank)

由參考文獻中找出 MAYBRIDGE [23]用來執行 軟體對接的資料庫,資料庫包括以下內容:

Maybridge Ro3 500 Fragment Library.sdf, Maybridge Ro3 1000 Fragment Library.sdf Maybridge_Bromo-Fragment_Collection.sdf Maybridge_Fluoro-Fragment_Collection.sdf Maybridge_Fragment_Collection.sdf 合計 38,714 個小分子提供與基因對接。 數據分析 (Data analysis) 市面上有很多軟體能進行對接的試驗,其中經常 出現的軟體包括兩大類,學術研究用的版本與商業用 途的版本。學術研究用的版本有 UCSF 的 DOCK 6.4、 INRIA 的 Hex 、 The Scripps Research Institute 的 AutoDock 等等;商業用途的版本有 Molegro 的 Molegro Virtual Docker、Schrodinger 的 Glide、The Cambridge Crystallographic Data Centre 的 GOLD、BioSolveIT 的 Flex X、Cresset 的 Field Align 等等。

準備工作除了對接軟體的選定外,還包括篩選條 件的設定。對於產出的結果,按照實驗精神必需要有

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確效 (validation) 的過程,以確保實驗的品質。 結果 (Results) 以 1sp1 基因與 MAYBRIDGE 資料庫在對接軟體 的執行下,順利地有結果產出。目前進行對接中,執 行至 2,074 個小分子對接程序,先以最低能量與低於 500 的分子量為篩選門檻,得最低能量的小分子結構如 下: Figure 3. 結構 946 Figure 4. 結構 233 Figure 5. 結構 231 目前這三個小分子結構與 1sp1 對接是為最低能 量排序中之前三名。 Table 1 相關數據 結構編號 946 233 231 分子量 393.26 400.19 342.19 平均能量 -126.44 -119.8 -118.98

討論與結論 (Discussion and Conclusion) 作業系統

如前所敘述的數據分析軟體,有的只支援 Linux 版本,有的軟體提供支援 Windows, Linux 甚至 Mac 的 版本。無論哪種版本穩定性是特別重要,因為接合的 過程需要一日至數日以上,若穩定性不佳,可能產出 的數據不見,因此浪費寶貴時間而不能挽回。 軟體的選擇 一般在學術領域,Linux 因為主張軟體自由,強 調永久免費,無需支付授權費用,可以自由下載、使 用而毫無任何代價,所以大量使用。但在國內推廣程 度不如微軟的 Windows 系統,多數人不熟悉 Linux 系 統。因此,選用軟體時相對地產生無可避免的問題。 因為熟悉 Windows 系統而採用 Windows 版本,做出這 樣的決定必定付出慘痛代價。 選用建構在 Linux 系統的軟體是首要的推荐,穩 定度比 Windows 上相同的軟體比較,Linux 的軟體超 乎尋常地穩定,相對地 Windows 的軟體令人非常地失 望。 其次,由於國人不熟悉 Linux 系統,使用前期往 往要經過好長段時間的煎熬與痛苦學習,相信系統的 穩定與花費點時間相比是值得的。 篩選條件的設定 參照發表的論文期刊,將逐一嘗試與比對找出, 適合於進入篩選系統的最佳條件。一般而言,接合的 距離要接近 1.5~2.0A 之間、接合的能量是最小的、RMS (root mean square) 值等參數等等 [24, 25, 26, 27, 28]。 目前這三個小分子結構與 1sp1 對接,是最低能量排序 中之前三名。若持續進行中的對接作業,沒有低於此 三個能量者,這三個小分子結構即為 1sp1 可能的產生 影響的結構。Figure 6 是結構 946 與 1sp1 對接圖示。 Figure 6 結構 946 與 1sp1 對接圖示 初步找出可能影響的結構 藉由接合軟體的分析結果,初步篩選出符合條件 的小分子結構。在化學結構資料庫對接的分子結構總

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數多達 4 萬多筆資料,對比出的結果也只能選取排序 後的前 10~15 個分子結構。向國外廠商如 Aldrich、 Sigma 購買或自行合成出化合物,經過儀器分析確認結 構與純度(約 90%即可)。接著,進行 in vitro 確認活性 強度,收集結果以利下一步驟的執行。 未來展望 經過 in vitro 確認比對出的化合物結構對 SCI 的 影響,為對於 MP 的治療屬於協同作用或抑制作用的 影響活性強度。再經過思考對結構上進行修飾,修飾 後的結構,再次執行接合動作,由數據上比較前後的 差異程度。將活性最佳的修飾化合物結構再次進行合 成。再次在 in vitro 確認活性強度,收集結果以利下一 步驟的執行。 確效 許多的試驗必定要經過確效的過程,藉以證明試 驗的過程是足以被信任的。可惜在前人發表的期刊 中,並未詳細加以敘述過程。而實驗又必須執行這個 過程,所以可能以不同軟體執行相同的標的物與資料 庫的結果比較;或其他自行開發的確效過程來進行確 效。 謝誌 (Acknowledgement) 感謝軟體的提供廠商與學術單位。 參考文獻 (Reference)

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參考文獻

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