行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
用利用基因選殖,表現和定點突變法對具分子保護者活性之
A-水晶體蛋白機制研究(3/3)
計畫類別: 個別型計畫 計畫編號: NSC91-2311-B-002-035- 執行期間: 91 年 08 月 01 日至 92 年 10 月 31 日 執行單位: 國立臺灣大學生化科學研究所 計畫主持人: 邱式鴻 報告類型: 完整報告 報告附件: 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處理方式: 本計畫可公開查詢中 華 民 國 93 年 6 月 10 日
行政院國家科學委員會補助研究成果報告
計劃名稱:利用基因選殖,表現和定點突變法對具分子保護者活性之
α
-水晶體蛋白機制研究(3/3)
。
計劃編號:NSC 91-2311-B-002-035
執行期限:91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日
主持人:邱式鴻 國立台灣大學生化科學研究所
一、中文摘要 蛋白凝集可能是引起光散射及水 晶體白內障形成的主因,由於 α-水晶 體蛋白具分子保護者活性,可能可以 保護其它水晶體蛋白,以避免水晶體 蛋白在長期受到紫外線、醣化及氧化 的影響下失去結構的穩定性,凝集產 生沉澱,暗示其與水晶體因老化而形 成白內障有重大關聯。除此之外,α B-水晶體蛋白在其它器官組織中,尤其 是心臟及骨骼肌,被發現與細胞骨架 (cytoskeleton) 尤 其 是 intermediate filaments 的穩定性有很大的關聯性, 為探討α-水晶體蛋白結構及功能的相 關性,因此我們選殖並表現豬 αB-及 土虱αB-水晶體蛋白,以比較重組α B-水晶體蛋白的熱穩定性及凝集性質的 差異與蛋白結構上的關聯性。在本計 畫年度中,由於α-水晶體蛋白 C 末端 的延伸區被認為與α-水晶體蛋白對水 溶液溶解度有決定性的影響(1,2),而 且 C 端的變異在生物體系統中則常見 於α-水晶體蛋白的重大破壞性的改變 (3);而這些改變很可能導致保護性 功能的喪失,甚至可能引發白內障的 形成,因此我們利用定點突變法進行 豬 αB-水晶體蛋白位於 C 末端的延伸 區胺基酸的突變。結果發現,去除尾 端具高保守性的兩個 Lysine 殘基後 在高溫下仍具有蛋白保護活性,除此 之外,利用圓二色偏光譜儀、動態光 散射光譜儀來探討蛋白質的立體結構 與聚集特性。另外,土虱由於其生活 環境之故,被認為其眼睛在退化中, 比較氨基酸序列的結果顯示在αB-水 晶體蛋白的 N 端有三個高保守性的氨 基酸缺失(圖十一),由於αB-水晶體蛋 白的 N 端與其形成聚合體有關,而且 土虱αB-水晶體蛋白的聚合體分子量 約在 400,000 Da,約為豬αB-水晶體蛋 白的 2/3,由此建構土虱多三個氨基酸 與豬少三個氨基酸的αB-水晶體蛋白 突變株,藉以了解這三個氨基酸對α B-水晶體蛋白聚合體分子量的影響。再 其次,土虱αB-水晶體蛋白的熱穩定性 研究中發現,其半凝集溫度比豬高 14.5 ℃,在蛋白保護活性研究中發現,土 虱 αB-水晶體蛋白的蛋白保護活性比 豬的來源高或相似,可能是因為魚類 接觸外來蛋白質變性物質的機會比哺乳類高的緣故。
關鍵詞:水晶體蛋白、分子保護者、 抗熱「保護者」活性、老年性白內 障、熱休克蛋白
ABSTRACT
α-Crystallin, a major protein of all vertebrate lenses, consisting of two subunits αA and αB, forms polymeric aggregates with an average molecular mass of about 800 kDa. In this study, we have employed various physical methods to study aggregate sizes and conformational properties of porcine
α-crystallin and homomultimeric aggregates of its purified αA, αB subunits and cloned recombinant αB subunit. From far- and near-UV CD spectra, native α-, αA-, αB- and recombinant αB-crystallins from porcine lenses all show similar β-sheet conformation to that from bovine and human lenses. By means of gel-filtration chromatography and dynamic light scattering, we have found that the molecular sizes of all four crystallin aggregates are polydispersedly distributed in the following order of aggregate sizes, i.e., native α > αA > αB
≈ recombinant αB. In contrast, the
molecular weights as determined from sedimentation velocity and equilibrium studies appear to indicate that the molecular size of native or recombinant
αB-crystallin is somewhat greater than
αA-crystallin. To further investigate the structural and functional relationship, we have also compared the chaperone activities of all four α-crystallin aggregates at different temperatures. From the results of chaperone-activity assays, ANS (8-anilo-1-naphthalene sulfonate) binding and thermal stability studies, there appeared to be at least two factors playing major roles in the chaperone-like activity of these lens proteins: one is the hydrophobicity of exposed protein surface and the other is the structural stability associated with each protein. We showed that
αA-crystallin is a better chaperone to protect γ-crystallin against UV-irradiation than αB-crystallin, in contrast to the observation that αB is generally a better chaperoning protein than αA for enzyme protective assays at physiological temperatures.
We have also analyzed, expressed and characterized the catfish
αB-crystallin, which presents itself as a major structural component in eye lenses and as a small heat shock protein in other tissues of most mammals. Catfishes which reside generally in streams, ponds, ditches and reservoirs, always in the dark or underground environment, are good examples of nocturnal scavengers with atrophied eyes. Sequence comparison with homologues of distantly related taxa has revealed conservation of intron splicing sites and coding regions; however the two intron sequences, 5’ and 3’ untranslated regions of catfish
αB-crystallin are shorter than those reported for other vertebrates. The deduced amino-acid sequence of catfish
αB-crystallin gene was found to lack a segment of three amino acids (SPF, i.e. Ser-Pro-Phe) in the N-terminal region, which were conserved in all of its homologues characterized from other vertebrate classes. The phylogenetic analysis based on protein sequences indicated that the molecular evolution of
αB-crystallins of dogfish, zebrafish and catfish followed three independent evolutionary routes, distinct from
αB-crystallins of other vertebrate species. The wild type and insertion mutant (+SPF mutant) of catfish
αB-crystallins were expressed and characterized. The most striking feature was that the midpoint for aggregation (Ta) of the purified recombinant catfish
αB-crystallin was 15°C higher than that of porcine one, whereas Ta of +SPF mutant was slightly lower than that of wild type. The molecular mass of +SPF mutant as determined by analytical gel filtration is higher than that of the wild type (~440 kDa) and similar to porcine one (~600 kDa). The relative order of chaperone activity was found to be as follows: catfish wild type > catfish +SPF mutant > porcine wild type
αB-crystallin for enzyme protection assay at 60°C and insulin reduction assay at 37°C. The surface hydrophobicity as determined by fluorescent dye-binding analysis for the wild type αB-crystallins of catfish is similar to that of porcine but higher than that of catfish +SPF mutant. Therefore both aggregate size and surface hydrophobicity of crystallin may play some role in the chaperone-like function
of αB-crystallin. 二、緣由與目的 從分子和結構層次瞭解水晶體蛋 白的多樣化是我們研究工作的主要目 的,它提供了一個架構以闡釋結構穩 定性與水晶體蛋白在演化下的複雜過 程。最近發現 α-水晶體蛋白具分子保 護者活性,暗示其與生物體因老化而 形成白內障有重大關聯。蛋白凝集可 能 是 引 起 光 散 射 及 白 內 障 形 成 的 主 因,而 α-水晶體蛋白的分子保護者活 性則可以保護水晶體避免在長期的蛋 白分子失去活性和凝集過程下產生混 濁。本研究室在水晶體蛋白的分離及 分析上有相當豐碩的成果,對於α-水 晶體蛋白的抗熱保護者活性也投以相 當多的關注(4,5,6,7)。近年來由於分 子生物學技術的快速演進,本實驗室 也持續性的由低等的魚類、兩棲類至 高等的哺乳類動物等不同種動物中, 進 行α- 水 晶 體 蛋 白 的 基 因 選 殖 及 分 析,也有相當多的進展。在前期計劃 實施期間,已針對豬的αB-水晶體蛋白 進 行 基 因 的 突 變 (mutagenesis) 及 表 現,輔以各種熱安定性的實驗測試, 瞭解αB-水晶體蛋白「抗熱保護者」之 結構-功能相關部位。另外也針對體溫 比哺乳動物高 (約 43.5℃)的鳥禽類與 眼睛幾乎退化的土虱中,進行α-水晶 體蛋白的基因選殖及蛋白表現分析, 藉比較α-水晶體蛋白氨基酸序列結構 與抗熱保護者功能之間的差異,以瞭 解α-水晶體蛋白抗熱保護者功能的分 子機制。 為進一步了解α-水晶體蛋白結構 與功能之間的關係,對α-水晶體蛋白 進 行 結 晶 研 究 是 一 件 必 須 進 行 的 工 作,由於許多研究發現α-水晶體蛋白 的次單元分子之間的交換相當頻繁, 以致於使其分子量不定,因此本實驗 室初步將對α-水晶體蛋白進行突變, 藉此不但可以進一步了解各氨基酸對 於α-水晶體蛋白抗熱保護者功能的貢 獻程度,也可藉此嘗試α-水晶體蛋白 的結晶工作。最近,Kim 等人成功獲 得古細菌 Mathanococcus janashii 的 小熱休克蛋白 MjHsp16.5 結晶並進行 X-ray 繞射分析,完成其結構的鑑定 (8)。由於 MjHsp16.5 與α-水晶體蛋 白 同 樣 屬 於 小 熱 休 克 蛋 白 大 家 族 (small heat shock protein superfamily) 的一員,兩者在α-crystallin domain 約 有近三成的相似度,因此 MjHsp16.5 的結晶成功提供α-水晶體蛋白結晶工 作的指引,及以 X-ray 繞射完成其結 構的鑑定之可能性。 三、結果與討論 我們利用已建構好的豬αB-水晶 體蛋白 DNA 進行人為突變,目前我們 的研究主要集中於其 C-末端的延伸 區,我們建構一系列的突變種蛋白(如 圖一所示),前人的研究報告指出此延 伸 區 可 能 與 該 蛋 白 的 對 水 溶 解 度 有 關,亦有報告指陳此延伸區可能環抱 其它次單位,或在分子保護作用時環 抱被保護分子。在計畫草擬之初,我 們建構的突變種蛋白混雜著兩個突變 區域包括 C-末端延伸區和 N-端的突 變,為釐清此兩區域各別的作用,我 們重新建構新的突變種蛋白來研究。 在完成 DNA 的定序後,我們進行表現 和純化的工作,表現和純化的方法依 計畫所提的 non-soluble fraction 純化
方式,以膠體分子篩管柱層析和逆相 液態高壓層析分離。分離純化後所得 之蛋白樣品其 SDS-PAGE 如圖二所 示,同時以 ES-Mass 進行質量的鑑 定,其理論分子量與測出分子量的比 較列出如表一。 在確定突變種蛋白的分子量與純 度後,我進行結構的相關鑑定,由遠 紫 外 線 圓 二 極 光 譜 ( Far UV-CD spectra)可知這些突變種蛋白基本的結 構相近,如圖三所示均以 Beta-sheet 結 構為主,由程式估計其二級結構所得 如表二所列。由圖三可知 T5 的二級結 構與 wild-type αB-水晶體蛋白有相當 的差異,顯示 T5 的突變已略為影響二 級結構的完整性。由該突變種蛋白的 前處理過程中發現 T5 的對水溶液溶 解度較差,餘者其對水溶液溶解度相 近 尚 可 。 在 進 行 其 二 級 結 構 的 鑑 定 後 , 我 們 進 行 其 三 級 結 構 的 相 關 鑑 定,由螢光光譜初步得知其 Tryptophan 螢光光譜相近,因該蛋白的 Tryptophan 主要位於 N-端,可見一系列的突變對 N-端的影響甚小,關於螢光光譜的部 分我們將再詳細鑑定。除螢光光譜外 我們也以圓二極光譜對突變種蛋白的 三級結構進行偵測,近紫外線圓二極 光譜(Near UV-CD spectra)可知其 Tryptophan,Tyrosine 和 Phenylalanine 的訊號變化差異不大,除 T5 的突變莫 耳橢圓率值較低外,其餘相近(見圖 四)。因此我們推論這些突變蛋白其三 級結構相近。 四級結構的部分,我們目前完成 動態光散色(Dynamic Light Scattering) 的測定,除 T5 的樣品在同樣的條件下 仍無法得到較佳的測定值外,其餘各 樣品的大小測定值列於表三。由此資 料來看突變與四級結構的關係尚缺明 顯的相關性,因此我們將以離心速度 和平衡的實驗和膠體分子篩管柱層析 定分子量對四級結構進行研究。根據 上述的觀察目前我們選定以 T4 的突變 蛋白為初步嘗試結晶的蛋白樣品,以 九十六種蛋白結晶條件進行測試,然 而於九十六種常見的條件中,大多數 條件均呈現沉澱,少數為澄清狀,在 數個星期的觀察後仍無任何結晶。 由於無法獲得結晶,因此,我們 著重於結晶外的研究,在功能上的研 究方面,我們已完成對γ-水晶體蛋白在 高溫下(70℃)的保護作用測定,T1, T2,T3 和 T4 在高溫下仍然保有其保 護者活性,而 wild-type αB-水晶體蛋 白和 T5 則在相同條件下喪失其保護者 活性(見圖五)。我們陸續進行其他的 活性測試,目前,我們已完成對β-水晶 體蛋白在 60℃下(見圖六)和對酒精去 氫酵素在 45℃下(見圖七)的保護作 用。由上述的活性測試初步猜測突變 影響到蛋白的熱穩定性,因此,我們 進 行 熱 穩 定 性 相 關 的 實 驗 。 在 同 濃 度、同體積的情況下,於不同溫度下 加熱十分鐘後測其混濁度(O.D.340 nm),由圖八中可知 wild-type αB-水晶 體蛋白與 native purified αB-水晶體蛋 同樣在 62℃後去自然,T1,T2,T3 和 T4 在 62℃後同樣去自然,但是其 所造成的混濁度則較低。而 T5 則於 55 ℃ 後 去 自 然 並 造 成 明 顯 的 混 濁 度 上 升。在更詳細測量持續加溫並監測其 混濁度後(見圖九),我們發現 T1, T2,T3 在 70℃後去自然,T4 在 64℃ 後同樣去自然而 T5 則於 57℃後去自 然。因此,去除 C-末端的延伸區將造 成其熱穩定性變差,但是去除部分的
C-末端延伸區則否。我們進一步於不 同溫度下測定其遠紫外線圓二極光譜 (見圖十),我們以程式計算每個突變蛋 白的 Tm 值,然而程式計算結果紛亂 難以歸納。因此無法由遠紫外線圓二 極光譜在 217nm 的光譜改變來進一步 確認,僅能肯定 T5 突變蛋白特別不穩 定。由於突變蛋白刪除了數個帶電氨 基殘基,因此我們進一步確認其等電 點差異,透過非破壞性的等電點電泳 (見圖十一),我們可知數個蛋白的等電 點差異不大,均位於 5.8 左右。因此突 變對蛋白整體的等電點影響不大,但 我們不排除突變對蛋白局部的影響。 在 土 虱αB- 水 晶 體 蛋 白 的 研 究 中,從氨基酸組成的分析中發現在 N 端 有 三 個 連 續 的 氨 基 酸 缺 失 ( 圖 十 一),由此建構土虱多三個氨基酸與豬 少三個氨基酸的αB-水晶體蛋白突變 株,利用前述表現純化及活性分析系 統進行與豬αB-水晶體蛋白之蛋白保 護活性的比較,結果發現,土虱α B-水晶體蛋白的熱穩定性比豬高 14.5℃ (圖十二),而且蛋白保護活性比豬α B-水晶體蛋白或高或相似(見圖十三及 十四),意味著與水中蛋白質變性物質 接觸機會的高低與蛋白保護活性可能 相關。 五、參考文獻
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