2006年第十七屆國際生物奧林匹亞競賽

2006 年第十七屆國際生物奧林匹亞競賽

--實驗試題

(2)

中華民國生物奧林匹亞競賽代表團

實驗四：微生物學

細 菌 的 分 類 有 不 同 的 系 統 ， 但 最 常 用 的為在Bergey 的細菌學手冊中所記載的。 以 下 為 一 種 由 生 化 觀 點 鑑 定 細 菌 菌 株 的 方 法 之 概 要 ： 1. 分 離菌 株 並 取 得純 化 培 養 2. 取 活 細 胞 以 革 蘭 氏 染 色 後 以 顯 微 鏡 觀 察, 可 得 知 微 生 物 的 形 態 及 革 蘭 染 色 類 型, 並 根 據 其是 否 會 形 成菌 團、孢 子 及 其 他 形 態 學 上 的 特 性, 也 是 鑑 定 微 生 物 種 類 的 重 要 方 式 3. 判 斷 營 養 特 性 (通 常 需 先 行 分 離 、 純 化 培 養 菌 株)︰ 光 合 自 營 、 光 合 異 營 、 化 學 自 營 、 化 學 異 營 等 4. 進行先期試驗︰下列的試驗組稱為先期 試驗，用來判斷此種純化菌株的屬及科 分別為何。除了革蘭染色及形態觀察之 外，主要的先期試驗包括觸酶活性、氧 化酶活性、葡萄糖發酵活性和活動性等 【 試 劑 和 設 備 】 1. 滴 瓶--裝 有 龍 膽紫 2. 滴 瓶--裝 有 Lugol 3. 滴 瓶--裝 有 革 蘭去 色 劑 4. 滴 瓶--裝 有 Safranin 5. 滴 瓶--裝 有 蒸 餾水 6. 一 個試 管 架 7. 二 支 試 管 -- 含 有 生 長 在 Luria-Bertani 培 養 液 培 養 的 A 和 B 二 菌 種 8. 二 副手 套 9. 口 罩 10. 油 性標 示 筆 11. 紙 巾 12. 一 支本 生 燈 13. 顯 微鏡 14. 接 種環 15. 4 片 玻 片 16. 玻 片盤 17. 1 個 塑 膠瓶-裝 有洗 滌 用 的 水 18. 一 個拋 棄 式 小 杯 19. 一 滴瓶 礦 物 油 20. 一 滴 瓶 3% H2O2 21. 二 個 Luria-Bertani 洋菜 培 養盤--含 有 菌 種 A、B 22. 一 微量 離 心 管--含 有 2 片 氧化 酶 圓 片 23. 一 支鑷 子 24. 二 支試 管 25. 一 支有 蓋 的 試 管--含 有 無 菌蒸 餾 水 26. 一 支塑 膠 巴 斯 德吸 管 27. 三 盤 含 有 伊 紅 甲 基 藍 洋 菜 培 養 基 的 培 養 皿(一 盤 裝 有 菌種 A， 一 盤裝 有 菌 種 B， 另 一 盤 無 菌)

28. 三 管苯 丙 胺 酸(一管 裝 有 菌 種 A， 一 管 裝 有 菌 種 B， 另一 管 無 菌) 29. 一 個滴 瓶 含 10%氯 化鐵 30. 三根試管--含有 SIM (可測硫化氫，吲 哚，及活動性之試劑) 培養基(一管裝有 菌種 A，一管裝有菌種 B，另一管無菌) 31. 一 滴瓶--含 有 吲哚 試 劑 32. 三 試 管 --含 有 尿 素 培 養 液 (一 管 裝 有 菌 種A， 一管 裝 有菌 種 B， 另一 管 無 菌) 33. 三 試 管 --含 有 MIO (可 測 活 動 性 ， 吲 哚 ， 及 鳥 胺 酸) 培 養 基 ( 一 盤 裝 有 菌 種 A，一 盤 裝 有 菌 種 B， 另 一盤 無 菌) 34. 三 試管--含 有 Simmons 檸 檬 酸 (標 示 SC-A 、 SC-B 及 未接 種 SC) 35. 時 鐘--置 於 學 生可 看 到 處 【 注 意 】 心 操 作 培 養 基 和 試 劑, 這 些 試 劑 只 能 提 供 一 份!! 如 果 不 小 心 操 作 --如 動 作 太 突 然 ， 或 操 作 時 離 開 本 生 燈 太 遠 ， 你 就 會 因 培 養 基 污 染 而 無 法 得 到 好 的 結 果 。 生 化 試 驗 結 果 的 呈 現 需 根 據 操 作 培 養 基 ， 試 劑 所 得 之 結 果 ， 或 根 據 題 目 所 提 供 的 細 菌 資 訊(圖 和表)。 注 意：不 要 丟 棄 含 有 菌 種A 和 B 的 管 子 ， 在 實 驗2 中 仍 會 使 用 。

實驗

1：對菌種 A、B 進行革蘭氏染

色

【 實 驗 步 驟 】 《 操 作 》 革 蘭 氏 染 色 可 以 區 分 二 種 類 型 的 細 菌 之 細 胞 壁 ， 有 些 細 菌 因 其 細 胞 壁 的 化 學 特 性 ， 能 在 如 丙 酮 或 酒 精 等 脫 色 劑 的 處 理 後 ， 仍 能 夠 保 留 結 晶 紫 的 顏 色 。 【 革 蘭 氏 染 色 操 作 技 術 】 1. 將 待 研 究 的 材 料 於 玻 片 上 製 成 薄 的 抹 片 標 本 ， 並 風 乾 2. 將 玻片 於 本 生 燈上 過 火 三、四 次以 固 定 材 料 ， 避 免 在 染 色 過 程 中 被 洗 去 3. 將 玻 片 放 置 於 玻 片 染 色 架 上 ， 並 以 Gentian Violet (龍 膽 紫)染 劑蓋 過 材 料 4. 以 龍膽 紫 染 色 三十 秒 後 ， 以流 水 沖 洗 5. (lugol， 媒 染 劑)覆蓋 材 料 30 秒 6. 以 拇指 和 食 指 握住 玻 片，並 以數 滴 丙 酮 或 酒 精 清 洗 材 料，直 到 脫 色 劑 不 再 呈 現 紫 色 為 止 ， 此 過 程 約 需10 秒 鐘 7. 以 流水 沖 洗 後，再 將玻 片 放 置於 染 色 架 上，以 safranin(番紅 染 劑)覆 蓋 20 秒 以 進 行 對 比 染 色 ， 再 以 流 水 沖 洗 8. 將 玻片 豎 立 於 染色 架 上，流 去多 餘 的 水 分 ， 並 將 玻 片 風 乾 9. 於 100 倍 油 鏡 下以 顯 微 鏡 檢查 染 色 完 成 的 玻 片 樣 本 10. 當 對焦 完 成 後 ，請 監 試 人 員確 認 將 正 確 的 答 案 填 入 正 確 的 位 置 中 菌 種 Gram staining 監 試 人 員 確 認 A □ 陽 性 □ 陰 性 B □ 陽 性 □ 陰 性

實驗

2：菌種Ａ和Ｂ的生化特性

在這 部 分 請利 用 前 述 提供 的 資 訊 或以 下 操 作 的 實 驗 ， 來 判 定 A、 B 兩菌 種 所屬 的 科 及 屬 。 【 觸 酶 反 應 】 有 些 細 菌 具 有 黃 素 蛋 白 ， 可 還 原 氧 氣 產 生 具 有 毒 性 的 過 氧 化 物(H2O2或 O2－)， 因 它 們 是 強 氧 化 物 ， 會 破 壞 細 胞 的 構 造 。 因 此 許 多 細 菌 會 產 生 酵 素 來 分 解 這 些 有 毒 物 質 ， 以 保 護 自 己 。 《 操 作 》 對 菌 種A 和 B 進 行觸 酶 測 試，以 接 種 環 分 別 取 二 種 液 態 培 養 基 中 的 細 菌 懸 浮 液(標 示 LB-A 和 LB-B)水膜 三 次, 放 置 於 載 玻 片 上 ， 分 別 加 兩 滴 過 氧 化 氫 於 玻 片 上 的 細 菌 懸 浮 液 中 。 注 意: 將 所 得 的 結 果 ， 以 ＋ ( 表 示 有 反 應)、－(表 示 無反 應)寫 於 生化 反 應 的 表 格 中 。 《 問 題 》 觸 酶 可 催 化 下 列 何 項 反 應? 1) H2O2+NADH+H+  2H2O+NAD+ 2) 2H2O2  2H2O + O2 3) O2- + O2- + 2H+  H2O2 + O2 4) 4 O2- + 4H+  2H2O + 3 O2 將 答 案 以 數 字 寫 於 下 方 虛 線 處 --- 【 氧 化 酶 反 應 】 測 試 細 胞 色 素 c 氧 化 酶 (存 在 於 不 同 屬 細 菌 中，如Pseudomonas spp., Neisseria spp., Moraxella spp., Vibrio spp., Aeromonas spp.), 氧 化 酶 圓 片 (Oxidase discs) 中 含 有 細 胞 色 素 c 氧 化 酶 的 受 質 (dimethyl-para- phenylene-diamine)， 若 細 菌 具 有 此 種 酵 素 ， 在 有 氧 氣 的 環 境 中 ， 將 使 氧 化 酶 圓 片 呈 現 紅 紫 色 變 化 。 《 操 作 》 依 據 以 下 指 示 ， 進 行 氧 化 酶 測 試 於 菌 種 A 和 B 上 。 以 試 管 進行 氧 化 酶 測 試 ， 將 純 化 培 養 的 細 菌 ， 以 0.2ml 無 菌 蒸 餾 水 製 成 懸 浮 液(懸 浮 液 製 法 如 下 )， 並 加 入 一 片 氧 化 酶 圓 片 。 懸 浮 液 製 法：分 別 從 標 示 LB-A 和 LB-B 的 培 養 皿 中 ， 以 接 種 環 刮 取 三 個 菌 落 ， 分 別 配 置 成 細 菌 懸 浮 液 。 《 結 果 》 一 般 而 言 ， 室 溫 下 ， 多 可 於 一 分 鐘 內 呈 現 陽 性 反 應, 若 超 過 二 分 鐘 才 有 變 化 ， 則 視 為 無 反 應(陰 性 反 應)。 陽 性 反 應 ： 圓 片 呈 現 紅 紫 色 陰 性 反 應 ： 圓 片 無 變 化 注 意 ： 將 所 得 的 結 果 ， 以 ＋(表 示 有 反 應)、－(表 示 無反 應)寫 於 生化 反 應 的 表 格 中 。 【 伊 紅 甲 基 藍(EMB)洋 菜 培 養 基 】 此 種 培 養 基 可 用 來 篩 選 生 長 快 速 、 及 對 營 養 需 求 極 少 的 革 蘭 氏 陰 性 菌 ， 它 可 培 養 所 有 種 類 的 腸 內 菌 。 《 目 的 》 此培養基結合了Holt-Harris 及 Levine´s 兩 種 配 方 ， 來 增 進 腸 內 菌 及 其 他 革 蘭 氏 陰

性 菌 的 篩 選 效 果 。 要 分 辨 能 夠 進 行 乳 糖 及(或 )蔗 糖 發 酵 的 菌 種 、 及 無 法 進 行 發 酵 的 菌 種 ， 可 藉 由 伊 紅(eosin)及 甲 基 藍 (methylene blue)來 辨 識 ， 而這 些 指 示 劑 也 會 抑 制 某 些 革 蘭 氏 陽 性 菌 生 長 。 培 養 許 多 品 系 的 大 腸 桿 菌 屬 和 檸 檬 酸 菌 屬 的 菌 落 時 ， 培 養 基 中 會 呈 現 出 綠 色 金 屬 光 澤 。 能 夠 進 行 乳 糖 及(或 )蔗 糖 發 酵 的 菌 種 ， 菌 落 的 中 央 會 呈 現 深 色 ， 而 周 圍 則 為 藍 色 或 粉 紅 色 ； 而 無 法 進 行 發 酵 的 菌 種 ， 菌 落 則 呈 現 無 色 。 這 種 培 養 基 除 了 可 以 培 養 腸 內 菌 外 ， 也 可 培 養 其 他 菌 種 ， 但 不 同 菌 種 所 形 成 的 菌 落 外 形 不 同 ， 可 用 來 區 分 之 。 《 指 示 》 使 用 EMB 培 養 基 ( 分 別 標 示 EMB-A 和 EMB-B 表示 菌種 A 和 B), 來 判 斷 菌 種 A 和 B 對蔗 糖 和(或)乳 糖 的 利 用 狀 況 。 注 意 ： 將 所 得 的 結 果 ， 以 ＋(表 示 有 反 應)、－(表 示 無反 應)寫 於 生化 反 應 的 表 格 中 。 《 問 題 》 發 酵 作 用 A) 結 果可 能 造 成 蔗糖 的 分 解，並 產生 酸 及 氣 體 B) 為 兼 氣 菌 於 硫 醣 (Thioglycollate, 一 種 還 原 劑)培 養 基 中 的 生 長 方 式 ； 在 無 氧 環 境 中，菌 落 的 生 長 狀 態 較 稀 疏 C) 通 常 與 菌 體 中 觸 酶 表 現 陽 性 反 應 有 關 將 答 案 以 英 文 字 母 寫 於 下 方 虛 線 處 --- 【 苯 丙 胺 酸 洋 菜 培 養 基(試 管 以 Ph 標 示 )】 苯 丙 胺 酸 培 養 基 可 用 來 測 定 苯 丙 胺 酸 經 去 胺 反 應 所產 生 的 苯 丙 酮 酸，在 滴 加 10%氯 化 鐵(ferric chloride)溶 液 後， 如 呈 現 綠 色 ， 即 表 示 有 反 應(陽 性 反 應)。 《 實 驗 指 引 》 加 4~5 滴 氯化 鐵 溶 液(ferric chloride) 於 含 有 苯 丙 胺 酸 的 斜 面 培 養 基 中 (試 管 標 示 Ph-A、 Ph-B 代 表菌 種 A、B)， 當 試 劑 加 入 後 ， 旋 轉 試 管 使 溶 液 接 觸 培 養 基, 若 在 十 分 鐘 內 呈 現 深 綠 色 ， 即 表 示 反 應 產 生 了 苯 丙 酮 酸 。 注 意 ： 將 所 得 的 結 果 ， 以 ＋(表 示 有 反 應)、－(表 示 無反 應)寫 於 生化 反 應 的 表 格 中 。 【SIM 培 養 基 (為 測 定 硫 化 氫、吲 哚 的 產 生 , 以 及 菌 體 活 動 性 的 培 養 基 ， 試 管 分 別 以 SIM A 和 SIM B 表 示 )】 此 種 培 養 基 可 用 來 測 定 硫 化 氫 及 吲 哚 的 產 生， 及 菌 體 的 活 動 性，(I)硫 化 氫產 生 為 硫 代 硫 酸 或 硫 酸 還 原 酶(thiosulphate or sulphate reductases)的 作 用，在 接 種 線周 圍 產 生 黑 色 ， 表 示 產 生 硫 化 氫(為 陽 性 反 應) ， 一 般 而 言， 需 要 在 接種 18~24 小時 後 ， 才 會 出 現 。(II)若菌 體在 SIM 培 養基 中 具 有 活 動 性 ， 則 菌 落 會 在 接 種 線 附 近 呈 現 輻 射 狀 的 分 布 ， 因 此 這 種 培 養 基 可 用 來 測 試 菌 種 是 否 具 有 Listeria's(一 種 桿 菌 )的

特 徵(傘 狀 活 動 性)。(III)培 養基 中 含 有 高濃 度 的trypteine，也 可用 於 測 定吲 哚(indole) 的 產 生 。

《 實 驗 指 引 》

使 用 SIM 試 管(分別 標 示 SIM-A 和 SIM-B 表 示 菌 種 A、B), 用以 測 定 A、B 二 菌 種 產 生 硫 化 氫 、 吲 哚 的 情 形 及 其 活 動 性 。 測 定 吲 哚 的 產 生 ， 可 加 五 滴 試 劑 (於 管 上 標 示 吲 哚 indole)於 含 有 高 濃 度 細 菌 的 SIM 培 養液 試 管 中，若 立 即 變 為 粉 紅 色 ， 則 表 示 有 吲 哚 存 在 。 注 意 ： 將 所 得 的 結 果 ， 以 ＋(表 示 有 反 應)、－(表 示 無反 應)寫 於 生化 反 應 的 表 格 中 。 《 問 題 》 活 動 性 的 陰 性 反 應(即 無 活 動性)… A) 表 示以 穿 刺 接 種於 培 養 基 時，菌種 只 會 沿 線 生 長 B) 將 菌液 滴 於 固 態培 養 基 上，可 根據 其 生 長 過 程 來 判 斷 C) 可 呈 現 出 覆 蓋 於 培 養 基 表 面 的 生 長 情 形 D) 好 發於 絕 對 好 氧性 及 活 動 性的 菌 種 將 答 案 以 英 文 字 母 寫 於 下 方 虛 線 處 --- 【 西 門 氏 檸 檬 酸 洋 菜 培 養 基 】 這 是 一 種 用 來 判 斷 菌 種 能 否 利 用 檸 檬 酸 滲 透 酶 的 培 養 基 。 《 實 驗 指 引 》 使 用 西 門 氏 檸 檬 酸 培 養 基 試 管 (分 別 標 示SC-A 和 SC-B 表 示 菌 種 A、B)， 來 判 斷 菌 種A 和 B 是否 生 長。 注 意 ： 將 所 得 的 結 果 ， 以 ＋(表 示 有 反 應)、－(表 示 無反 應)寫 於 生化 反 應 的 表 格 中 。 【 活 動 吲 哚 鳥 胺 酸(MIO)培 養 基 】 於 此 培 養 基 中 可 觀 察 到 以 下 的 反 應 ： 鳥 胺 酸 去 碳 酸 反 應(ODC)： 藉 由 酸 鹼 指 示 劑 觀 察 試 管 底 部 培 養 基(下 方 3/4 的 無 氧 區 域)變 色 情 形，細菌 可 於此 區 生 長，而 其 能 否 產 生ODC 酵 素 可 由 以下 結 果 判 斷： ‧ 呈 現 灰 色 、 藍 色 或 紫 色 ： 陽 性 反 應 ， 表 示 發 生 ODC 反 應 ，產 生 強 鹼 性 產 物 ， 可 過 度 中 和 由 葡 萄 糖 發 酵 所 產 生 的 酸 ， 並 使 溶 液 呈 現 鹼 性 。 ‧ 黃 色 ： 陰 性 反 應 ， 呈 現 原 本 的 顏 色 ， 由 葡 萄 糖 發 酵 產 生 酸 所 造 成 。 《 實 驗 指 引 》 使用 含 有 MIO 培 養 基的 試 管(分 別 標 示MIO-A 和 MIO-B 表 示 菌 種 A、B)， 判 斷 菌 種 A、B 產 生 ODC 酵 素 的 情 形 。 注 意 ： 將 所 得 的 結 果 ， 以 ＋(表 示 有 反 應)、－(表 示 無反 應)寫 於 生化 反 應 的 表 格 中 。 【 實 驗 結 果 】 填 入 生 化 反 應 的 結 果 於 以 下 的 表 格 中 (11 分)：

以 下 何 種 測 試 可 區 分 Bacillus 和 Staphylococcu 兩 菌屬 ， 並 能 藉此 區 別 此 兩屬 與 其 他 三 菌 屬 ： A) 葡 萄糖 發 酵 B) 檸 檬酸 利 用 C) 觸 酶反 應 D) 革 蘭氏 染 色 將 答 案 以 英 文 字 母 寫 於 下 方 虛 線 處 --- Organism 觸 酶 乳 糖 蔗 糖 活 動 性 吲 哚 硫 化 氫 苯 丙 胺 酸 ODC 尿 素 酶 檸 檬 酸 氧 化 酶 A B 利 用 附 表 中 的 資 訊 判 斷 菌 種A、 B 之 科及 屬 分 別 為何? (9 分) 《 問 題 》 1. 若 你培 養 下 列 五種 細 菌 ， 但含 有 培 養 基的 試 管 上 的標 籤 脫 落 ，需 要 重 新 標示 。 因 此 ， 請 根 據 下 表 所 列 之 試 劑 反 應 ， 回 答 下 列 問 題 ： Genus 屬 Gram stain 革 蘭 染 色 Shape 形 狀 Catalase reaction 觸 酶 反 應 glucose fermentation 葡 萄 糖 發 酵 lactose fermentation 乳 糖 發 酵 phenylalanine deaminase 苯 丙 胺 酸 去 胺 酶 Citrate utilization 檸 檬 酸 利 用 Bacillus + Rod 桿 狀 + + or – ? ? ? Staphylococcus + Coccus 球 狀 + + ? ? ? Enterobacter – Rod + + + – + Morganella – Rod + + – + – Pseudomonas – Rod + – – – ? Family 科 Genus 屬 Organism A Organism B

2. 應 用以 下 的 稀 釋方 法

a. Report the total number of CFUs (colony forming units 形 成 多 少個 菌 株) in the entire 100 ml amount of the original lake water sample. (TNTC=too numerous to count.數 量 太 多以 至 於 無 法計 數)， 請 問原 本 100ml 湖 水 中 之 總菌 株 數(CFU)為何? A) 5.8 x 10 7 _{cfu / 100 ml} B) 4.25 x 10 8 _{cfu / 100 ml} C) 1.2 x 10 9 _{cfu / 100 ml} 將 答 案 以 英 文 字 母 寫 於 下 方 虛 線 處 --- b. 若 於第 一 次 稀 釋時，加 1ml 樣 本 於 9ml 稀 釋 液 中，你認 為 上 述的 答 案 是 否可 能 改 變? A) Yes B) No 將 答 案 以 英 文 字 母 寫 於 下 方 虛 線 處 --- 湖 水 菌 株 數

Annex 1 附表 1

Gram stain (fresh culture) 革 蘭 染 色

+ + + + + + + + – – – – –

Shape 形 狀 coccus coccus coccus coccus rod rod Rod rod rod rod rod rod coccus

Grouping 聚 合 方 式 Cluste rs 群 聚 Cluste rs 群 聚 Chains 鏈 狀 Tetrads 四 聯 體 Pairs 成 對 aerobic growing 有 氧 生 長 情 形 + + + + + – + + + + + + + anaerobic growing 無 氧 生 長 情 形 – + + + + + + – – – + + – motility 活 動 性 – – – – – + or – + or – + or – + or – + or – + or – + – catalase 觸 酶 + + – – – – + + + + + + + oxidase 氧 化 酶 + + – + + fermentation of glucose to acid or acid+gas 葡 萄 糖 發 酵 產 生 酸 – + + + + + (or –) + – – – + + – Micrococcus X Staphylococcus X Streptococcus X Lactococcus X Enterococcus X Clostridium X Bacillus X X Alcaligenes X Pseudomonas X Enterobacterias X Aeromonas X Chromobacterium X Neisseria X

Indole + citrate + Citrobacter citrate - Escherichia Klebsiella Urea + Enterobacter Urea - Indole -Salmonella Shigella Proteus Providencia Morganella Glucosa + Glucosa - Pseudomonas Alcaligenes Lactose - Lactose fermentation

Gram-Negative cocci and bacilli

Group VIII Pseudomonas, Alcaligenes Halobacterium Aerobic Non-motile Group X Shigella Klebsiella Group IX Escherichia Proteus Enterobacter Prividencia Citrobacter Morganella Erwinia Salmonella Group XI Neisseria Veillonella Cocci Facultative anaerobic 球 菌 桿 菌 好 氧 兼 氣 Bacilli motile Lactose +

citrate + Lactose Lactose -Citrobacter Enterobacte r Salmonella Erwinia motile Lactose + Ureasa - Escherichia Lactose - Ureasa + Proteus Providencia Morganella Shigella citrate - Non-motil citrate - Motility citrate + Klebsiella

(完)

轉 載 自 ： 中華民國生物奧林匹亞委員會網站National Biology Olympiad, Taiwan, R.O.C

http://www.ibo.nsysu.edu.tw/

Family Genus Oxidation _氧化

catalase lactose sucrose motility indole SH2 _alaninePhenyl ODC Ureasa citrate Oxidase

Enterobacteriaceae Escherichia _{+ + + + + - - - - - -} Shigella _{+ - - - + - - - - - -} Salmonella + - - + - + - + - - - Citrobacter _{+ +/- - + + + - + - + -} Proteus + - + + +/- + + + + +/- - Morganella _{+ - - + + - + + + - -} Enterobacter _{+ + +/- + - - - + +/- + -} Serratia + +/- +/- + - - - +/- + + - Klebsiella _{+ + + - - - - - + +/- -} Pseudomonaceae Pseudomonas + ? - + - - +/- +/- +/- +/- +