第八型脊髓小腦運動失調症：ATXN8基因啟動子上多型性點之遺傳與功能性分析研究

全文

(1)國立台灣師範大學生命科學系碩士論文. 第八型脊髓小腦運動失調症： ATXN8 基因啟動子上多型性點之遺. 傳與功能性分析研究 Spinocerebellar ataxia type 8： Genetic and Functional Studies of ATXN8 Gene -62 G/A Promoter SNP. 研究生：楊修嘉 Siou-Jia Yang 指導教授：李桂楨博士 Guey-Jen Lee-Chen 中華民國一０一年六月.

(2) 致謝隨著本篇論文的完成，我在師大的碩士求學生涯也將劃下句點。這三年的日子一路走來，我要感謝太多人熱情的幫忙與關懷，在此致上我最真心的感謝！本論文能夠順利完成，首先要感謝我的指導教授李桂楨老師，李老師不只對於我的實驗以及論文指導上給予很大的幫忙以外，也教導了我許多待人處事的道理，讓我獲益良多。接著也感謝我的口試委員吳逸如醫師和陳瓊美醫師，因為有您們的教導與指正，讓我的論文修訂能夠更加完整。另外，也特別感謝長庚醫院吳逸如醫師及陳瓊美醫師所提供得來不易的臨床檢體，使本研究的進行能夠更加順利。在師大的求學期間，D311實驗室的生活是讓我最難忘的，感謝實驗室的大家：怡辰、雅今學姐是一起為SCA8打拼的夥伴，對我實驗上的指導上給予很大的幫忙與鼓勵；志信學長、李姐、芷英、雰茹、春嫻、婷中、明惠、婉玲、于婷、淑婷、慈蓬、佩茹、詩涵學姊等感謝您們在研究上的協助，沒有您們的幫忙與指正，就不能順利完成我的實驗；文騰、允麟兩位碩士班的同學，你們是我在研究生涯中不可或缺的好夥伴，多虧有你們的一起鼓勵，在我面臨實驗低潮時還能夠保有向上的動力堅持下去；學弟妹們品睿、逸琦、奕澂、鉦翔、皓君、奕勝、均如…等謝謝你們不管是在實驗上或是生活上大小事情的.

(3) 分享，都能讓我在實驗室的生活中感受到快樂的氛圍，使的這三年來 D311實驗室生活的回憶得以更加珍貴。最後要感謝一路支持我的家人以及親人們，在我的學習生涯上，幾乎都不會阻擋我想走的路，而且包容我一切的決定，讓我在大學以及研究所的求學路途上都可以毫無後顧之憂的去學習，我真心由衷的感恩。感謝這一路走來曾經幫助過我的人們，你們所給我的寶貴經驗都將留存在我的心中，並化作我努力的動力去追尋人生的理想，期待未來我有能力時能夠貢獻所學，將這一切恩惠回饋並傳承下去。.

(4) 目錄目錄............................................................................................................. I 摘要...........................................................................................................III Abstract ................................................................................................... IV 圖表目錄.................................................................................................... V 壹、緒論.....................................................................................................1 一、脊髓小腦運動失調症(SCA) .......................................................1 (一) 臨床病徵 ..............................................................................1 (二) 病因學 ..................................................................................2 二、第八型脊髓小腦運動失調症(SCA8).........................................3 三、SCA8 的致病機制 ......................................................................5 (一) 調節 KLHL1 基因表現 .......................................................5 (二) RNA gain-of function ............................................................6 (三) PolyQ 擴增蛋白 ....................................................................7 (四) 外遺傳改變 ..........................................................................8 貳、研究目的 ............................................................................................9 參、研究材料與方法 ..............................................................................10 一、ATXN8 -62 G/A 多型性的遺傳分析.......................................10 (一) 研究樣品 ............................................................................10 (二) ATXN8 -62 G/A 多型性檢測.............................................10 I.

(5) (三) 統計分析 ............................................................................ 11 二、ATXN8 -62 G/A 多型性功能分析 ...........................................12 (一) 電腦模擬 ............................................................................12 (二) 凝膠電泳遷移檢測(EMSA) ..............................................12 (三) cDNA 過度表現及螢光酵素報告基因檢測 .....................15 (四) 內生性 C/EBPA 表現及與 ATXN8 啟動子的結合.........17 肆、結果...................................................................................................19 一、ATXN8 -62 G/A 基因多型性分析...........................................19 二、ATXN8 -62 G/A 基因啟動子功能性分析 ..............................20 (一) 電腦模擬 ............................................................................20 (二) 凝膠電泳遷移檢測 ............................................................20 (三) cDNA 過度表現及螢光酵素報告基因檢測 .....................21 (四) 內生性 C/EBPA 表現及與 ATXN8 啟動子的結合 .........22 伍、討論...................................................................................................23 一、ATXN8 -62 G/A 基因多型性分析 ...........................................23 二、ATXN8 -62 G/A 基因啟動子功能性分析 ...............................23 陸、參考文獻 ..........................................................................................27 柒、附錄圖表 ..........................................................................................37. II.

(6) 摘要第八型脊髓小腦運動失調症(簡稱 SCA8)是一種會導致小腦運動能力失調的體染色體顯性遺傳之神經退化性疾病，但是其外顯率並不完全。SCA8 相關基因是在染色體 13q21 的位置，包含了 ATXN8OS CUG 重複擴增 RNA 及 ATXN8 多麩醯胺(polyQ)擴增的蛋白。先前本實驗室研究 SCA8 重複序列在台灣人族群中的分佈情形，結果發現在巴金森氏症族群中的等位基因的比例較正常人族群高(8/593=1.3%相較於 3/659=0.2%)，雖然未達顯著性(Wu et al., 2009)。另外，我們在 ATXN8 的啟動子上發現一新穎的-62 G/A 多型性，神經腫瘤細胞及胚胎腎細胞的螢光酵素報告檢測顯示，包含-62G 等位基因的啟動子轉錄活性顯著高於-62A 等位基因(Wu et al., 2009)。本論文探討-62 G/A 多型性對帕金森氏症感受性與分子機轉。首先針對此多型性點進行帕金森氏症患者及性別、年齡相當的正常人族群的病例-對照組研究，結果發現 AA 基因型者有顯著低的疾病罹患風險。其次探究-62 G/A 多型性對 ATXN8 基因的啟動子調控，cDNA 過度表現及 luciferase reporter 檢測顯示在 SK-N-SH 細胞中，轉錄因子 C/EBPA 會增強 ATXN8 啟動子的活性，但 CEBPA 與 ATXN8 -62G、-62A 啟動子的結合檢測，並未看出顯著的差異。關鍵字：小腦萎縮、神經退化、遺傳、帕金森氏症、脊髓 III.

(7) Abstract Spinocerebellar. ataxia. type. 8. (SCA8). is. a. hereditary. neurodegenerative disorder, manifesting itself as a slowly progressive cerebellar ataxia. The penetrance of SCA8 is incomplete. SCA8 involves the expression of a CTG/CAG expansion mutation from opposite strands producing CUG expansion transcripts (ATXN8OS) and a polyglutamine expansion protein (ATXN8) on chromosome 13q21 known to be pathogenic on other disorders. Previously we assessed the SCA8 repeat size ranges in Taiwanese population and found an increase (although not significant) in the proportion of the individuals carrying SCA8 larger alleles in Parkinson’s disease (PD) (8/593=1.3%) as compared to that in the control subjects (3/659=0.2%) (Wu et al., 2009). In addition, a novel -62 G/A promoter SNP was identified with significantly higher transcriptional activity in the luciferase reporter construct containing the -62G allele than that containing the -62A allele in both neuroblastoma and embryonic kidney cells (Wu et al., 2009). The purpose of this study is to investigate the ATXN8 -62 G/A polymorphism and the risk of Parkinson's disease using a case-control study. The results demonstrate that individuals carrying AA genotype exhibited a decrease risk of Taiwanese PD. cDNA over-expression and luciferase reporter assay revealed that CEBPA binds to the ATXN8 proximal promoter to up-regulate ATXN8 expression in neuroblastoma SK-N-SH cells. Nevertheless, no significant difference was observed upon examining the binding of CEBPA to ATXN8 -62G、-62A. Key words : SCA8、SNP、PD、AD、ATXN8 IV.

(8) 圖表目錄. 圖一、ATXN8、ATXN8 OS 與 KLHL1 的基因構造圖。 .............37 圖二、ATXN8 -62 G/A 多型性檢測。 ............................................38 圖三、ATXN8 啟動子序列。 ..........................................................39 圖四、DNA 探針製備。 ...................................................................40 圖五、核蛋白萃取檢測。.................................................................41 圖六、凝膠電泳遷移檢測。.............................................................42 圖七、cDNA 過度表現及螢光酵素報告基因檢測。......................43 圖八、內生性 C/EBPA 表現及與 ATXN8 啟動子的結合。 .........44 表一、帕金森氏症患者(PD)與正常人族群(Control) ATXN8 -62 G/A 基因的多型性及罹病風險分析.................................................45. V.

(9) 壹、緒論一、脊髓小腦運動失調症(SCA) 脊髓小腦運動失調症(Spinocerebellar ataxia；簡稱SCA)是一種體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，簡稱「小腦萎縮症」。這類型疾病的共同症狀為小腦的萎縮退化造成運動功能的失調，所以SCA的病患會有漸進式的行動失調、步伐不穩等現象。另外除了小腦萎縮以外，這類疾病的病患在其中樞或周邊神經系統的其他部位亦會出現神經損傷的情形(Wullner, 2003)。雖然SCA存在典型病徵，但臨床上仍無法藉由病徵的判別，來判定為何種類型的SCA疾病患者，需要加上分子診斷來界定。目前僅能藥物或物理治療來減輕其症狀，尚無有效根治的方法(Schols et al., 2004; Teive, 2009)。. 截至目前共有超過30型的SCA被報導，包括SCA1 ~ SCA8、 SCA10 ~ SCA31型以及齒狀核紅核殼視丘下核萎縮症(DRPLA)等 (Sato et al., 2009; Teive, 2009)。SCA有高度的相異性(Manto, 2005)。目前最為普遍的SCA類型為SCA3；另外，SCA1、SCA2、SCA6、SCA7、 SCA8的普遍率亦超過2%，而台灣現在最常見的SCA類型也是SCA3 (Soong et al., 2001; Wu et al., 2004)。. 1.

(10) 在目前已知突變基因的SCA疾病類型中，大部分的SCA以CAG三核苷酸為重複的擴增單位。位於轉譯區的CAG可以轉譯出麩醯胺 (glutamine；簡稱Q)，所以經由轉錄、轉譯出來的蛋白質會包含一段多麩醯胺序列(poly-Q tract)，如SCA1、2、3、6、7、17、DRPLA等(Orr et al., 1993; Koide et al., 1994; Kawaguchi et al., 1994; Pulst et al., 1996; Zhuchenko et al., 1997; David et al., 1997; Koide et al., 1999)。當這個致病基因CAG三核苷酸重複擴增時，其擴增的次數會影響到病患發病的年齡以及臨床症狀，如果擴增次數愈多則發病年齡會愈早且愈嚴重，而在遺傳上也發現患者子女三核苷酸重複擴增的數目比父母多，導致患者子女提早發病且症狀加重的情形(Maltecca et al., 2003; Manto, 2005; Duenas et al., 2006)。在病人的腦部組織中可以染到polyQ蛋白質所累積形成的聚集物(inclusion)，根據研究發現這些inclusion中除了含有突變的polyQ蛋白以外，還包括proteasome、ubiquitin、heat shock protein 70 (HSP70)和轉錄因子等等(Michalik and Van Broeckhoven, 2003; Koeppen, 2005)。在細胞核中的inclusion可能對於神經細胞具有毒性(Perez et al., 1998; McCampbell et al., 2000; Yamada et al., 2001)而造成小腦運動失調的症狀。也有研究指出inclusion的形成可能扮演保護的機制(Ravikumar et al., 2004; Bowman et al., 2005)，這方面內容仍有待日後的研究查證。. 2.

(11) 除了上述的 polyQ 的 SCA 外，SCA10 是由於在疾病基因內含子 (intron)部分的 ATTCT 五核苷酸重複擴增所造成(Matsuura et al., 2000)，SCA12 是藉由在致病基因 5'端非轉譯區(5' UTR)的 CAG 三核苷酸重複擴增所導致(Holmes et al., 1999)，SCA8 則是藉由在致病基因 3'端非轉譯區(3' UTR)的 CTG 三核苷酸重複擴增所導致(Koob et al., 1999)。. 二、第八型脊髓小腦運動失調症(SCA8) 第八型脊髓小腦運動失調症(SCA8)最早在 1999 年被 Koob 等人首先報導，主要由於染色體 13q21 的 ATXN8OS (ataxin 8 opposite strand)基因 3' UTR 的 CTA/CTG 複合重複序列的不正常擴增所造成 (Koob et al., 1999)。SCA8 的患者在臨床上的症狀有步伐失調、呼吸緩慢、眼球震顫、發音困難、痙攣等情形，有時候也伴隨智能障礙的病徵。SCA8 疾病的發病年齡分布於 18 ~ 65 歲之間，平均為 39 歲，是屬於比較晚發性的遺傳性疾病，容易遺傳給子代，造成家族性遺傳疾病。臨床上 SCA8 性狀變異亦頗大，包括類似基底皮質(corticobasal) 退化(Baba et al., 2005)及在 T2-weighted 腦部核磁共振檢查圖像(MRI image)出現白質高訊號病變(white matter hyperintense lesions) (Kumar and Miller, 2008)等。. 3.

(12) 自從 SCA8 被報導之後，根據美洲、歐洲、亞洲各國學者的研究分析，顯示在正常人族群中，SCA8 基因的 CTA/CTG 三核苷酸數目多為 16 ~ 37，而在家族性遺傳或者偶發性運動失調患者中則發現 68~1000 的三核苷酸重複擴增數目(Koob et al., 1999; Stevanin et al., 2000; Ikeda et al., 2004)。在不同國籍的家族中，患者 SCA8 基因的 CTG 擴增數目差異性很大，其複合重複序列擴增不一定和疾病性狀共分離 (co-segregation)，並且在帕金森氏症(Parkinson's disease；簡稱 PD)、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease；簡稱 AD)、精神疾病(psychiatric disorder)和一些不明原因的運動失調症(ataxia)等神經退化性疾病患者，甚至是在少數的正常人，也可以見到異常的複合重複序列擴增現象(Koob et al., 1999; Moseley et al., 2000; Worth et al., 2000; Sobrido et al., 2001; Schols et al., 2003; Ikeda et al., 2004)。我們實驗室對來自長庚醫院神經內科的神經退化性疾病患者檢體進行 SCA8 複合重複序列分析，結果亦於 PD 及非典型的帕金森氏症(atypical parkinsonism)患者中發現異常的複合重複序列擴增(66 ~ 120 個重複) (Wu et al., 2004, 2009)。因此 CTA/CTG 的重複擴增和 SCA8 或其他神經退化性疾之關連還有待研究確定。. SCA8 的 CTA/CTG 複合重複序列一般常以(CTA)1-21(CTG)n 型式. 4.

(13) 來表示(Stevanin et al., 2000)。因此 CTA 與 CTG 重複有多型性 (polymorphism)的現象，一般而言(CTA)1-21 在遺傳上比較穩定，而 CTG 的重複次數比較不穩定，CTG 的重複次數會隨著子代的承傳而有所增減。研究也發現經由母系遺傳的 CTG 重複序列會有擴增的情形，有較強的外顯性(penetrance)，而來自父系遺傳的 CTG 重複序列會有縮減的情形，發生疾病的外顯性則相對減弱(Silveira et al., 2000)， SCA8 也會有 anticipation 的現象，當擴增的致病基因傳給子代時，子代的發病年齡可能會比親代還要提早而且病情也會較為嚴重。此外，在 SCA8 患者中可觀察到不間斷的 CTG 重複序列，或是在基因中插入一個或多個 CCG、CTA、CTC、CCA、CTT 等情形發生(Ikeda et al., 2000; Schols et al., 2000; Silveira et al., 2000; Juvonen et al., 2002)。. 三、SCA8 的致病機制 SCA8 的可能致病機制有很多種，包括 ATXN8OS 基因的 exon A 上有未轉錄的 CUG 重複擴增，從反向的 ATXN8 基因上轉譯出的 polyQ 擴增蛋白(Ikeda et al., 2008)，另外還有針對 KLHL1 基因的反義 (antisense)調控機制(圖一)以及外遺傳的改變等。. (一)調節 KLHL1 基因表現. 5.

(14) KLHL1 (kelch-like 1)基因的 mRNA 5'端會和 ATXN8OS 基因的 mRNA 5'端會有互補性(Nemes et al., 2000)，此互補的情形也在小鼠的基因結構中可以發現(Benzow and Koob, 2002)，因此在演化上具有高度保留性。推測 ATXN8OS 可能利用 antisense RNA 的機制來調節 KLHL1 基因的表現。KLHL1 基因和果蠅中的 kelch 基因在蛋白質結構上具有高度相似性(Robinson and Cooley, 1997)因此命名。果蠅的 kelch1 蛋白能和肌動蛋白(actin)相結合，進而形成果蠅營養細胞(nurse cell)的環管(ring canal)。因此推測 KLHL1 基因的功能與 kelch1 藉由結合肌動蛋白來維持細胞骨架完整的功能類似。KLHL1 蛋白質包含 748 個胺基酸，會專一性的表現在包括小腦的腦部組織(Nemes et al., 2000)。研究證實 KLHL1 蛋白的功能主要和軸突的分枝有關(Seng et al., 2006)。若在小鼠的浦金埃細胞(Purkinje cell)神經中將 KLHL1 的基因去除掉，則會導致小鼠神經元的損傷、運動步伐的異常以及漸進式的運動協調能力喪失(He et al., 2006)。在人類組織及小鼠腦部， KLHL1 RNA 及 SCA8 RNA 亦共表現(Chen et al., 2008)。因此 ATXN8OS 基因對於細胞維持正常的功能具有很重要的影響。. (二) RNA gain-of function. CTG 重複擴增所造成的遺傳性神經退化疾病除了在 SCA8 疾病. 6.

(15) 患者以外，另外在第一型肌強直萎縮症(myotonic dystrophy type 1；簡稱 DM1)中也有同樣的現象。DM1 是由於 Dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK)基因的 3'端非轉譯區的 CTG 三核苷酸重複擴增所導致 (Brook et al., 1992; Fu et al., 1992; Mahadevan et al., 1992)。DM1 細胞模式的研究，擴增的 CUG mRNA 在細胞中會觀察到累積形成 ribonuclear foci，因而改變和 CUG 結合的蛋白質功能，包含 CUG-BP、 MBNL、MBLL、MBXL 等(Miller et al., 2000; Fardaei et al., 2002)，另外也會影響胰島素受器基因(Savkur et al., 2001)和氯離子通道基因 (Charlet-B et al., 2002)選擇性裁接(alternative splicing)的改變。因此認為 DM1 可能的致病機轉可藉由 RNA gain-of function 所導致。而在 SCA8 果蠅模式的研究，也發現到不正常表現的 ATXN8OS mRNA 會和一些 RNA 結合蛋白質相互作用，例如：staufen、muscle-blind、split ends 等，進而導致果蠅的視覺受器和色素細胞產生漸進式的退化 (Mutsuddi et al., 2004)。由於 SCA8 擴增的 CUG 亦導致 ribonuclear foci 的形成(Chen et al., 2009)，因此認為 RNA gain-of function 在對於 SCA8 的致病機轉中可能會有重要的影響。. (三) PolyQ 擴增蛋白. SCA8 基因轉殖鼠模式的研究中，發現從 CAG 擴增方向的. 7.

(16) ATXN8 基因所轉錄轉譯而來的 polyQ 蛋白，存在在浦金埃細胞和腦幹神經元中，並且對神經細胞會造成毒害(Moseley et al., 2006)。此被 1C2 抗體染色的 polyQ 蛋白亦見於 SCA8 病患的浦金埃細胞(Ito et al., 2006)。最近我們實驗室的研究則發現在 ATXN8 的啟動子第-62 號位置上的多型性點 G/A，螢光酵素報告基因的檢測顯示，G 等位基因的啟動子活性高於 A 等位基因的啟動子，GG 基因型的淋巴細胞株表現的 ATXN8 RNA 亦高於 GA 基因型者(Wu et al., 2009)。. (四)外遺傳改變. 外遺傳的染色體結構改變，會影響基因的表現。小鼠疾病模式的研究顯示，DM1 的 CTG 重複擴增及 Friedreich’s ataxia 的 GAA 重複擴增，影響連鎖的 transgene 的表現(Saveliev et al., 2003)。我們實驗室 SCA8 細胞模式的研究亦發現，SCA8 大的 CTG 三核苷酸重複擴增，會所改變組蛋白 H3-K9 and H3-K14 的修飾，而降低 SCA8 的表現 (Chen et al., 2009)。此現象或可解釋所觀察到的大的複合重複序列擴增的疾病低穿透性(reduced penetrance) (Mosemiller et al., 2003)。. 8.

(17) 貳、研究目的自 1999 年 SCA8 被報導以來，除了 ATXN8OS 基因表現的 RNA 外，亦發現 ATXN8 基因能表現出 polyQ 蛋白。臨床上 SCA8 性狀變異頗大。SCA8 的 CTG 重複擴增，除了出現在遺傳性和偶發性的運動失調患者外，也被報導於帕金森氏症、阿茲海默氏症、Friedreich’s 運動失調症等退化性神經疾病及精神病患者，和極少數正常人當中。先前我們實驗室的研究，亦於台灣的 PD 患者中發現 SCA8 的 CTG 重複擴增(Wu et al., 2004, 2009)，且在 ATXN8 基因啟動子上第-62 位置發現一新穎的多型性點(-62 G/A)，會影響 ATXN8 基因的表現量 (Wu et al., 2009)。本研究首先對這個多型性點進行帕金森氏症患者及性別、年齡相當的正常人族群進行病例-對照組研究，結果發現 AA 基因型者有顯著低的疾病罹患風險。其次，探究這個新穎的多型性點對於 ATXN8 基因的啟動子調控，包括電腦模擬、凝膠電泳遷移檢測、 cDNA 過度表現及螢光酵素報告基因檢測等實驗，找出調控 ATXN8 基因的啟動子的相關蛋白質。. 9.

(18) 參、研究材料與方法. 一、ATXN8 -62 G/A 多型性的遺傳分析. (一)研究樣品. 實驗所使用帕金森氏症患者與正常人血液的基因組 DNA 由林口長庚醫院神經內科吳逸如醫師及陳瓊美醫師所提供。帕金森氏症患者共 569 位，年齡 19 ~ 93 歲，48.0%女性，平均發病年齡 61.7 ± 11.6 歲。所有樣品均徵求患者或家屬同意始進行血液採樣。帕金森氏症患者樣品選取的標準需含有兩個以上帕金森氏症典型症狀：包括靜止性震顫、姿態反射障礙、僵直、和運動遲緩。具有家族病史及任何可能因腦部外傷、腦炎或服用抗精神性藥物等已知因子引起帕金森氏症候群的病例則排除在外。同時並蒐集年齡(20 ~ 90 歲，平均年齡 59.8 ± 12.9 歲)、性別比率(50.5%女性)相當的正常人共 547 位，作為控制組以供對照。. (二) ATXN8 -62 G/A 多型性檢測. 1.聚合酶連鎖反應(PCR) 取 100 ng 的基因組 DNA 樣品，置於 25 l 的 PCR 反應中，放大. 10.

(19) 包含 ATXN8 -62 G/A 基因多型性的片段。所使用的引子對為 5'-AACTAACTCAACATCCAGATAATTT-3' (-160 ~ -136，正向引子)、 5'-TGATGTTATAATTGTTATATATTTATGCA-3' (-33 ~ -61，反向引子，劃底線的鹼基為誤配，以引入 Mph1103I 限制酶切位)，PCR 反應的條件為 1.0 mM MgCl2、煉合溫度 47℃。PCR 的產物以 2%洋菜膠體電泳檢查片段大小。. 2.限制酶片段長度多型性分析(RFLP) 在 10 l 的切割反應中，取 2 μl PCR 產物，加入 0.1μl Mph1103I 限制酶，與反應緩衝溶液均勻混合，在 37℃水浴槽中反應 3 小時到隔夜。反應完成後以 2%洋菜膠體電泳檢查片段大小，並判別各樣品的多型性基因型。. (三)統計分析. 計算正常人族群、帕金森氏症患者族群多型性基因型數目，利用 Chi-square test (χ2)檢測多型性點是否符合哈溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)，並比較多型性基因型頻率、等位基因頻率，在兩群間是否有顯著差異。使用 JMP 5.1 軟體計算出罹病的相對危險程度(Odds ratio)。. 11.

(20) 二、ATXN8 -62 G/A 多型性功能分析. (一)電腦模擬. 以網路軟體(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)分析 -62. G/A. 鄰近區域的序列，並以網路軟體. (http://www-bimas.cit.nih.gov/cards//)分析可能結合的轉錄因子在人體各組織表現的情形。. (二)凝膠電泳遷移檢測(EMSA). 1. ATXN8 -62 G/A 基因啟動子質體製備取包含 ATXN8 -62 G/A 基因多型性點序列之質體 DNA (-6 ~ +99) (高, 2008)，以電穿孔(electroporation) (BIO-RAD, GENE PULSER II) 的方式轉形(transformation)入 E. coli 轉形勝任細胞內。挑選單一菌落，以鹼性溶菌法(Sambrook et al., 1989)小量抽取質體 DNA，進行上述誤配 PCR-限制酶切割圖譜分析。確認質體 DNA 無誤後，再利用 Plasmid Midi Kit (Geneaid)大量製備選殖成功的質體 DNA。. 2. Biotin 標記 DNA 探針取 2 ng 上述 ATXN8 -62 G/A 基因多型性序列質體 DNA，置於 25 l 的 PCR 反應作用，放大包含 ATXN8 -62 G/A 基因多型性的片 12.

(21) 段。所使用的引子對為 5'-TAAATTCTTAAGTAAGAGATAAGC-3' (-99 ~ -76，正向引子) (5' ± biotin)、5'-GCTGCTGCATTTTTTAAAAATATAT-3' (+10 ~ -15，反向引子)，PCR 反應的條件為 1.0 mM MgCl2、煉合溫度 54℃。PCR 的產物以 2%洋菜膠體電泳檢查片段大小。之後進行電泳及膠體純化(Gel extraction kit，Viogene)，自洋菜膠中純化出擴增的 109 bp 片段(109G、109A、biotin-109G、biotin-109A)，做為凝膠電泳遷移檢測(electrophoresis mobility shift assay，簡稱 EMSA)的探針。. 3. 細胞培養及核蛋白萃取培養神經腫瘤細胞株 SK-N-SH (ATCC number: HTB-11)及胚胎腎細胞株 HEK-293 (ATCC number: CRL-1573)於含 10% FBS、1.0 mM sodium pyruvate、1.5 g/l sodium bicarbonate、100 U/ml penicillin、100 U/ml streptomycin 的 DMEM 培養液(Gibco)，培養箱溫度為 37℃、CO2 濃度為 5%且溼度穩定。待細胞生長至八分滿，以 1:5 ~ 1:10 的稀釋比例進行繼代培養。. 蒐集上述細胞(5 × 106)，以 PBS 清洗後，加入 300 l 不含清潔劑的低張溶液(hypotonic buffer)，置於冰上作用 30 分鐘後，利用 26G 的針筒來回推拉 25 ~ 30 次以打破細胞(取 2 ~ 3 µl 細胞懸浮液利用顯微. 13.

(22) 鏡觀察)。離心 2,500 rpm 之後取出上清液(細胞質溶液)，置於新的離心管中，沉澱物含未破細胞及細胞核。重複此步驟兩次後，留下沉澱物即為細胞核。加入 60 µl 的高張溶液(high salt buffer)，置於冰上 30 分鐘，中間每 5 分鐘震盪一次，來溶破細胞核。最後離心 12,000 rpm、 10 分鐘，取上清液(即細胞核蛋白)，保存在 -80 冰箱中。. 4.西方轉漬(Western blot)分析核蛋白純度上述細胞質及細胞核蛋白質溶液先經 Bio-Rad Protein Assay 定量後，再取等量蛋白質加入適量 sample buffer (50 mM Tris pH6.8 - 2% SDS. -. 10%. glycerol. -. 2.5%. β-mercaptoethanol. -. 0.005%. bromophenolblue)，在沸水中預熱 7 分鐘後取出，置於冰上冷卻、離心後，進行 10% SDS-PAGE 分離蛋白質。電泳完畢後，將蛋白轉漬至硝化纖維膜(nitrocellulose membrane, Whatman)上。之後浸泡於 blocking buffer (10% milk - wash buffer)置 4℃中隔夜。Blocking 完成後以 wash buffer (10 mM Tris-HCl pH8.0 - 0.05% Tween 20)清洗硝化纖維膜三次後，加入 poly ADP-ribose polymerase (PARP) (sc-7150， 1:500 稀釋，Santa Cruz Biotechnology)、β-actin (MAB-1501，1:5,000 稀釋，Chemicon)一級抗體，於室溫下作用 2 小時。再以 wash buffer 清洗膜三次後，加入 horseradish peroxidase (HRP) conjugated 二級抗體，於室溫作用 1.5 小時。再以 wash buffer 清洗膜三次後，加入冷光. 14.

(23) 呈色試劑(Millipore)於膜上，以冷光儀及 ImagerReader LAS-3000 軟體偵測蛋白表現。. 5.凝膠電泳遷移檢測(Electrophoresis mobility shift assay, EMSA) 取 2 µl 10 X binding buffer、1 µl poly[d(I-C)]、1 µl 50% glycerol、 1 µl MgCl2、1 µl NP40、10 µg 核蛋白質、2 µl (20 fmole)上述 biotin 標記探針，加入適量去離子水使總體積成為 20 µl，於常溫反應 30 min 後，加入 2 µl loading 染劑，作為非競爭組的處理。若再加入相對於 biotin 標記探針濃度 20、50 倍的未標記探針，與 biotin 標記探針競爭結合的核蛋白，作為競爭組的處理。反應之後將樣品置入 pre-run 半小時的 5% acrylamide 膠體的樣品槽中，於 0.5 X TBE buffer 中以 120 V 電泳 1.5 小時。之後將膠體上的 biotin 標記探針轉移到 NC 膜上，利用 Light shiftTM Chemiluminescent EMSA kit (Pierce)對於 biotin 標記做呈色，最後以冷光儀及 ImagerReader LAS-3000 軟體偵測 biotin 標記探針。. (三) cDNA 過度表現及螢光酵素報告基因檢測. 1. C/EBP cDNA 選殖 PCR 選殖 CEBPA cDNA (NM_004364，1242 bp)的引子對為 5'-AAGCTTCTCGCCATGCCGGGAGAACTCTAAC-3' (正向引子)、 15.

(24) 5'-AAGCTTGGCACCGGAATCTCCTAGTCCTGGC-3' (反向引子，底線標示的鹼基為 HindIII 限制酶的辨識序列)。取 100 ng 的 SK-N-SH cDNA，置於一 25 l 的反應中，反應溶液中包含 50 ng 的引子對、1.5 mM 之 MgCl2、200 M dNTP 及 0.5 U 熱穩定性 DNA 聚合酵素。PCR 煉合溫度為 60℃。反應完畢後進行 1.0洋菜膠體電泳檢查、純化，接合入 pGEM® -T Easy 載體(Promega)，並轉型入大腸桿菌。挑選菌株進行小量質體製備，取適量的質體 DNA 做酵素切割檢測，並委託源資生物科技股份有限公司做 DNA 定序，來確認選殖的 CEBPA cDNA 序列。將上述選殖的 CEBPA cDNA，以 HindIII 限制酶切出，置入 pcDNA3 (Invitrogen)載體上的 multiple cloning site 中，以限制酵素切割及洋菜膠體電泳分析，確定置入方向及選殖質體的正確性，即完成 pDNA3-CEBPA 的建構。選殖 CEBPB cDNA (NM_005194，1272 bp)引子對為 5'-TTCATGCAACGCCTGGTGGCCTGGGACC-3' (正向引子)、5'-TTAAATAACACCACGGGCGGGAGCCCCATCT-3' (反向引子)，PCR 反應的條件為 2.0 mM MgCl2、煉合溫度 68℃ (高, 2008)。. 2.螢光酵素報告基因檢測培養 SK-N-SH、HEK-293 細胞於 24 孔培養盤上(105 個細胞)，待細胞生長至 8 分滿時，用 1 µl Lipofectamine 2000 轉移 0.95 µg ATXN8 -62 G/A 多型性啟動子質體(-99 ~ -6, Wu et al., 2009)及 0.05 µg 16.

(25) phRL-TK 質體(作為轉移效率的內在控制組)進入細胞。若共轉 C/EBP cDNA，則各加入 0.5 µg ATXN8 啟動子質體及 cDNA 質體。48 小時後，蒐集細胞，加入 PLB 試劑(Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega)，混勻後以液態氮冰凍、解凍數次打破細胞，再離心 14,000 rpm 1 分鐘，取上清液，加入 firefly luciferase 的受質 LAR II 和 Renilla luciferase 的受質 Stop&Glo 作用後，以冷光儀(TD-20/20 Luminometer) 於不同波長測定 firefly 及 Renilla 的冷光強度。重複三次實驗，每次用兩個 clone 的質體 DNA 各二重復，得到平均值及標準差，並利用 t-test 分析相對活性的差異。. (四)內生性 C/EBPA 表現及與 ATXN8 啟動子的結合. 1. 西方轉漬分析內生性 C/EBPA 表現細胞蛋白質液萃取、定量、SDS-PAGE 分離、轉漬、blocking 等如上述。Blocking 完成、清洗後，加入 C/EBPA (GTX-61331，1:500 稀釋， GeneTex) 、 Tublin (sc-5286 ， 1:5,000 稀釋， Santa Cruz Biotechnology)一級抗體，於室溫下作用 2 小時。再以 wash buffer 清洗膜三次後，加入 HRP conjugated 二級抗體，於室溫作用 1.5 小時。後續清洗、呈色如上述。. 17.

(26) 2. C/EBPA 蛋白與 ATXN8 啟動子的結合分析培養 HEK-293 細胞於 24 孔培養盤上(105 個細胞)，待細胞生長至 8 分滿時，用 1 µl Lipofectamine 2000 轉移 1 µg C/EBPA cDNA 質體進入細胞。48 小時後，蒐集細胞並抽取細胞核(如上述)，定量後將核蛋白與上述以 biotin 標定的 109G、109A 探針進行 DNA pull down assay 實驗，並且以未標定 biotin 的 109A 探針當作實驗的負控制組。實驗方法如下：取 80 µl 5 X binding buffer、4 µl poly[d(I-C)]、1 µl ssDNA、 300 µg 上述核蛋白、1.5 µg 上述 DNA 探針，加入適量去離子水使總體積成為 400 µl，於常溫反應 30 min。於等待時另外準備具有 biotin-streptavidin 的磁珠溶液： 70 µl bead 、 10 µg BSA 、 1 µl poly[d(I-C)]、1 µl ssDNA，加入適量去離子水使總體積成為 400 µl。待前述核蛋白質-DNA 探針結合反應完之後，將磁珠溶液與蛋白質 -DNA 結合液混合，放置立體旋轉台作用 4 小時。4 小時後取出管子，利用磁鐵座吸住管中磁珠，清除上清液後加入 400 µl 1 X binding buffer 重複清洗 3 次。最後將底層磁珠加入適量 sample buffer，沸水煮沸 7 分鐘後取出，置於冰上冷卻、離心後，進行 10% SDS-PAGE 分離蛋白質。利用 C/EBPA 抗體檢測 C/EBPA 和 DNA 探針的結合情形。. 18.

(27) 肆、結果一、ATXN8 -62 G/A 基因多型性分析針對台灣帕金森氏症患者與正常人的 ATXN8 -62 G/A 基因多型性檢測，本研究分析了 569 位帕金森氏症患者及 547 位正常人。誤配引子 PCR 擴增的 128 bp DNA 片段，經限制酶 Mph1103I (辨識 ATGCAT)切割後，多型性的-62A 等位基因會新增切位，將 128 bp 的片段切割成 99 bp 和 29 bp 兩片段(圖二)。. 台灣帕金森氏症患者患者與正常人族群的 ATXN8 -62 G/A 基因多型性分析結果詳見於表一。依照等位基因頻率及樣品總數(觀察值)，算出期望之基因數(預期值)，經由 chi-square 分析後，顯示此基因的多型性遺傳情形處於哈溫平衡(P > 0.05)。ATXN8 -62 G/A 之 GG、GA、AA 基因型頻率或 G、A 等位基因頻率，在正常人與病人族群間並無顯著差異(P 值分別為 0.103、0.146)。但若以隱性遺傳模式(recessive model)來看，AA、GG+GA 基因型頻率在正常人與病人族群間呈顯著差異(P = 0.035)，且 AA 基因型和低帕金森氏症感受性相關(odds ratio: 0.73, 95% CI: 0.55-0.98, P = 0.035)。此外若將樣品之年齡限制在 60 歲以上，GG、GA、AA 基因型頻率在正常人與病人族群間呈顯著差異(P = 0.025)，AA 基因型頻率與 GG、GA 基因型頻率 19.

(28) 相較，其差異顯著性在正常人與病人族群間變大(P = 0.025)，且 AA 基因型和低帕金森氏症感受性亦增大 (odds ratio: 0.64, 95% CI: 0.43-0.96, P = 0.030)。. 二、ATXN8 -62 G/A 基因啟動子功能性分析. (一)電腦模擬. 以網路軟體(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)分析 -62 G/A 鄰近區域的序列，發現這一段序列上包含轉錄因子 GATA1、 C/EBP 的可能結合部位 ( 圖三 ) 。此兩轉錄因子在腦部均有表現 (http://www-bimas.cit.nih.gov/cards//)。. (二)凝膠電泳遷移檢測. 1. Biotin 標記探針製備 ATXN8 -62 G/A 基因啟動子質體的誤配引子 PCR 檢測顯示於圖四 A。以此質體為模板所製備的包含-62 G/A 多型性的 109 bp 片段，分別有 biotin 標定 (biotin-109G 、 biotin-109A) 及沒有 biotin 標定 (109G、109A) (圖四 B)，做為凝膠電泳遷移檢測的探針，來分析-62 G/A 多型性核酸序列與蛋白質的結合情形。 20.

(29) 2.核蛋白純度及凝膠電泳遷移檢測核蛋白的部分是選用 HEK-293 (人類胚胎腎細胞)及 SK-N-SH (人類神經腫瘤細胞)的核蛋白，PARP 抗體的西方轉漬分析結果顯示於圖五。凝膠電泳遷移檢測實驗結果顯示，HEK-293 及 SK-N-SH 的核蛋白和-62 G/A 序列均有結合的現象，加入 20~50 倍沒有 biotin 標定的探針後，biotin 標定探針的電泳遷移減弱，顯示有核蛋白接上這一段 ATXN8 -62 G/A 基因啟動子序列(圖六)。. (三) cDNA 過度表現及螢光酵素報告基因檢測. 使用選殖的 PGL3_ATXN8 -62 G/A (高, 2008)，與 C/EBP cDNA 質體共轉入 HEK-293 及 SK-N-SH 細胞。轉入 C/EBP cDNA 質體的方法有共轉 C/EBPA 或 C/EBPB cDNA，或同時共轉 C/EBPA、C/EBPB cDNA，來看轉錄因子 C/EBPA、C/EBPB 是否影響 ATXN8 -62 G/A 啟動子活性表現。之後收取細胞偵測螢光酵素活性，藉此判定 ATXN8 -62 G/A 啟動子活性表現，結果顯示於圖七。實驗結果顯示在 SK-N-SH 細胞株中，轉錄因子 C/EBPA、C/EBPB 皆會增強 ATXN8 -62 G/A 啟動子的活性，其中 C/EBPA 增強的程度大於 C/EBPB ，然而在 C/EBPA、C/EBPB 兩者皆共轉的情況下則並沒有明顯的加成效果。. 21.

(30) 另外在 HEK-293 細胞株中，共轉轉錄因子 C/EBPA、C/EBPB 並未增強 ATXN8 -62 G/A 啟動子的活性。上述不同的多型性點實驗中，對於 ATXN8 啟動子的活性影響，皆沒有看出顯著的差異。. (四)內生性 C/EBPA 表現及與 ATXN8 啟動子的結合. 以 C/EBPA 抗體進行西方轉漬，分析內生性 C/EBPA 的表現，結果發現 HEK-293 及 SK-N-SH 中的 C/EBPA 蛋白量相近(圖八 A)。將 C/EBPA cDNA 轉染入 HEK-293 細胞後，分離核蛋白，以 biotin 標定的 109G、109A 探針進行 DNA pull down 實驗及西方轉漬分析，來檢測不同的多型性點與 ATXN8 啟動子結合的情形，但亦未看出差異性 (圖八 B)。. 22.

(31) 伍、討論一、ATXN8 -62 G/A 基因多型性分析本研究針對台灣帕金森氏症患者與正常人的 ATXN8 -62 G/A 基因多型性檢測，分析了 569 位帕金森氏症患者及 547 位正常人，結果顯示 ATXN8 -62 G/A 之 GG、GA、AA 基因型頻率或 G、A 等位基因頻率，在正常人與病人族群間並無顯著差異。但若以隱性遺傳模式來看，AA、GG+GA 基因型頻率在正常人與病人族群間則有呈現顯著差異，且 AA 基因型和低帕金森氏症感受性相關。此外若將樣品之年齡限制在 60 歲以上，GG、GA、AA 基因型頻率在正常人與病人族群間呈顯著差異，且 AA 基因型和低帕金森氏症感受性亦增大。結果顯示帶有 AA 基因型的人，對於帕金森氏症之感受性較低，故進一步探討此多型性點在功能上的意義。. 二、ATXN8 -62 G/A 基因啟動子功能性分析根據凝膠電泳遷移檢測實驗結果顯示，HEK-293 及 SK-N-SH 的核蛋白和-62 G/A 序列均有結合的現象(圖六)。根據 TF search 網站所預期，此多型性位置會有 C/EBP 蛋白結合上去，但凝膠電泳遷移實驗加入 C/EBPB 抗體後，結果並未觀察到 super shift (data not shown)，. 23.

(32) 推測可能的原因是其他 C/EBP 蛋白結合在探針片段上，或是這一段大小 109 鹼基探針上面結合的蛋白質已經有很多，因此再多加上 C/EBPB 蛋白質，也看不出明顯的 super shift。進一步的 C/EBPA 抗體的 super shift，或是縮短探針片段長度至僅包含 C/EBP 蛋白結合序列，將有助於釐清此疑點。. 根據 cDNA 過度表現及螢光酵素報告基因檢測實驗結果顯示，在 SK-N-SH 細胞株中，轉錄因子 C/EBPA、C/EBPB 皆會提升 ATXN8 -62 G/A 啟動子的活性，其中 C/EBPA 增強的程度大於 C/EBPB，然而在 C/EBPA、C/EBPB 兩者皆共轉的情況下則並沒有明顯的加成效果(圖七)。另外在 HEK-293 細胞株中，並沒有發現轉錄因子 C/EBPA、 C/EBPB 會影響 ATXN8 -62 G/A 啟動子的活性的情形。推測可能的原因是 SK-N-SH 細胞株中轉錄因子 C/EBPA、C/EBPB 含量較低，因此當 cDNA 過度表現時可促進提升 ATXN8 -62 G/A 啟動子的活性。 HEK-293 細胞株中可能不缺少轉錄因子 C/EBPA、C/EBPB，因此 cDNA 過度表現時不會影響 ATXN8 -62 G/A 啟動子的活性。進一步檢查 HEK-293、SK-N-SH 細胞中 C/EBPA、C/EBPB 的表現量，結果發現兩者含量相近(圖八)，故可排除以上推測。另外也可能因為有其他的轉錄因子參與 ATXN8 -62 G/A 啟動子調節作用。根據先前研究指出有一些轉錄因子和 C/EBPA 會有交互作用，包含 nuclear receptor 24.

(33) coactivator 6 (NCOA6)、E1A binding protein p300 (EP300)、ELK1 (Hong et al., 2001; Erickson et al., 2001; Hung et al., 2010)。從網路資料庫 Gene cards (http://www-bimas.cit.nih.gov/cards/index.shtml) 搜尋得知 NCOA6 和 ELK1 這兩種轉錄因子在腦部神經中的含量比腎臟中的含量來的高，因此推測 NCOA6、ELK1 在 SK-N-SH 細胞中含量比 HEK293 細胞中含量還要高，使得在 SK-N-SH 細胞株中轉錄因子 C/EBPA 會和較多的 NCOA6 以及較多的 ELK1 這兩種轉錄因子會有交互作用而進一步造成較高的轉錄表現，所以 HEK-293、SK-N-SH 兩種細胞在 cDNA 過度表現及螢光酵素報告基因檢測中才會出現不一致的實驗結果。進一步的二維電泳及質譜分析結合的蛋白質，將有助於釐清此疑點。. 除凝膠電泳遷移檢測實驗、cDNA 過度表現及螢光酵素報告基因檢測實驗外，本研究亦嚐試進行 DNA pull down 及西方轉漬分析實驗，來檢測不同的多型性點與 ATXN8 啟動子結合的情形，但亦未看出差異性(圖八)。. 總結之，本篇研究結果顯示 ATXN8 -62 G/A 基因啟動子序列可能受到轉錄因子 C/EBPA 之調控，然而 C/EBPA 對不同之多型性點-62. 25.

(34) G/A 的調控機轉以及為什麼帶有 AA 基因型的人對於帕金森氏症之感受性較低的原因仍有待進一步的實驗證實。. 26.

(35) 陸、參考文獻. 高士寰, 第八型脊髓小腦運動失調症：遺傳及啟動子功能性分析. 國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 2008 年 11 月. Baba, Y., Uitti, R. J., Farrer, M. J., and Wszolek, Z. K. (2005). Sporadic SCA8 mutation resembling corticobasal degeneration. Parkinsonism Relat Disord 11, 147-150. Benzow, K. A., and Koob, M. D. (2002). The KLHL1-antisense transcript (KLHL1AS) is evolutionarily conserved. Mamm Genome 13, 134-141. Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., and Zoghbi, H. Y. (2005). Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum Mol Genet 14, 679-691. Brook, J. D., McCurrach, M. E., Harley, H. G., Buckler, A. J., Church, D., Aburatani, H., Hunter, K., Stanton, V. P., Thirion, J. P., Hudson, T. (1992). Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell 68, 799-808. Charlet-B, N., Savkur, R. S., Singh, G., Philips, A. V., Grice, E. A., and Cooper, T. A. (2002). Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell 10, 45-53.. 27.

(36) Chen, W. L., Lin, J. W., Huang, H. J., Wang, S. M., Su, M. T., Lee-Chen, G. J., Chen, C. M., and Hsieh-Li, H. M. (2008). SCA8 mRNA expression suggests an antisense regulation of KLHL1 and correlates to SCA8 pathology. Brain Res 1233, 176-184. Chen, I. C., Lin, H. Y., Lee, G. C., Kao, S. H., Chen, C. M., Wu, Y. R., Hsieh-Li, H. M., Su, M. T., and Lee-Chen, G. J. (2009). Spinocerebellar ataxia type 8 larger triplet expansion alters histone modification and induces RNA foci. BMC Mol Biol 10, 9. David, G., Abbas, N., Stevanin, G., Duerr, A., Yvert, G., Cancel, G., Weber, C., Imbert, G., Saudou, F., Antoniou, E., Drabkin, H., Gemmill, R., Giunti, P., Benomar, A., and Brice, A. (1997). Cloning of the SCA7 gene reveals a highly unstable CAG repeat expansion. Nat Genet 17, 65-70. Duenas, A. M., Goold, R., and Giunti, P. (2006). Molecular pathogenesis of spinocerebellar ataxias. Brain 129,1357-1370. Erickson, R. L., Hemati, N., Ross, S. E., and MacDougald, O. A. (2001). p300. coactivates. the. adipogenic. transcription. factor. CCAAT/enhancer- binding protein alpha. J Biol Chem 276, 16348-16355. Fardaei, M., Rogers, M. T., Thorpe, H. M., Larkin, K., Hamshere, M. G., Harper, P. S., and Brook, J. D. (2002). Three proteins, MBNL, MBLL and MBXL, co-localize in vivo with nuclear foci of expanded-repeat transcripts in DM1 and DM2 cells. Hum Mol Genet 11, 805-814. Fu, Y. H., Pizzuti, A., Fenwick, R. G., Jr., King, J., Rajnarayan, S., Dunne, P. W., Dubel, J., Nasser, G. A., Ashizawa, T., and de Jong, P. (1992). An unstable triplet repeat in a gene related to myotonic muscular 28.

(37) dystrophy. Science 255, 1256-1258. He, Y., Zu, T., Benzow, K. A., Orr, H. T., Clark, H. B., and Koob, M. D. (2006). Targeted deletion of a single Sca8 ataxia locus allele in mice causes abnormal gait, progressive loss of motor coordination, and Purkinje cell dendritic deficits. J Neurosci 26, 9975-9982. Holmes, S. E., O'Hearn, E. E., McInnis, M. G., Gorelick-Feldman, D. A., Kleiderlein, J. J., Callahan, C., Kwak, N. G., Ingersoll-Ashworth, R. G., Sherr, M., Sumner, A. J., Sharp, A. H., Ananth, U., Seltzer, W. K., Boss, M. A., Vieria-Saecker, A. M., Epplen, J. T., Riess, O., Ross, C. A., and Margolis, R. L. (1999). Expansion of a novel CAG trinucleotide repeat in the 5' region of PPP2R2B is associated with SCA12. Nat Genet 23, 391-392. Hong S., Lee M. Y., and Cheong J. (2001). Functional interaction of transcriptional coactivator ASC-2 and C/EBPalpha in granulocyte differentiation of HL-60 promyelocytic cell. Biochem Biophys Res Commun 282, 1257-1262. Hung C. C., Liu X, Kwon M. Y., Kang Y. H., Chung S. W., and Perrella M. A. (2010). Regulation of heme oxygenase-1 gene by peptidoglycan involves the interaction of Elk-1 and C/EBPalpha to increase expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 298, L870-L879. Ikeda, Y., Shizuka, M., Watanabe, M., Okamoto, K., and Shoji, M. (2000). Molecular and clinical analyses of spinocerebellar ataxia type 8 in Japan. Neurology 54, 950-955. Ikeda, Y., Dalton, J. C., Moseley, M. L., Gardner, K. L., Bird, T. D., Ashizawa, T., Seltzer, W. K., Pandolfo, M., Milunsky, A., Potter, N. T., 29.

(38) Shoji, M., Vincent, J. B., Day, J. W., and Ranum, L. P. (2004). Spinocerebellar ataxia type 8: molecular genetic comparisons and haplotype analysis of 37 families with ataxia. Am J Hum Genet 75, 3-16. Ikeda, Y., Daughters, R. S., and Ranum, L. P. (2008). Bidirectional expression of the SCA8 expansion mutation: one mutation, two genes. Cerebellum 7, 150-158. Ito, H., Kawakami, H., Wate, R., Matsumoto, S., Imai, T., Hirano, A., and Kusaka, H. (2006). Clinicopathologic investigation of a family with expanded SCA8 CTA/CTG repeats. Neurology 67, 1479-1481. Juvonen, V., Kairisto, V., Hietala, M., and Savontaus, M. L. (2002). Calculating predictive values for the large repeat alleles at the SCA8 locus in patients with ataxia. J Med Genet 39, 935-936. Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., and Kakizuka, A. (1994). CAG expansions in a novel gene for machado-joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat Genet 8, 221-228. Koeppen, A. H. (2005). The pathogenesis of spinocerebellar ataxia. Cerebellum 4, 62-73. Koide, R., Ikeuchi, T., Onodera, O., Tanaka, H., Igarashi, S., Endo, K., Takahashi, H., Kondo, R., Ishikawa, A., Hayashi, T., Saito, M., Tomoda, A., Miike, T., Naito, H., Ikuta, F., and Tsuji, S. (1994). Unstable. expansion. of. CAG. repeat. in. hereditary. dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA). Nat Genet 6, 9-13. Koide, R., Kobayashi, S., Shimohata, T., Ikeuchi, T., Maruyama, M., Saito, M., Yamada, M., Takahashi, H., and Tsuji, S. (1999). A 30.

(39) neurological disease caused by an expanded CAG trinucleotide repeat in the TATA-binding protein gene: A new polyglutamine disease? Hum Mol Genet 8, 2047-2053. Koob, M. D., Moseley, M. L., Schut, L. J., Benzow, K. A., Bird, T. D., Day, J. W., and Ranum, L. P. (1999). An untranslated CTG expansion causes a novel form of spinocerebellar ataxia (SCA8). Nat Genet 21, 379-384. Kumar, N., and Miller, G. M. (2008). White matter hyperintense lesions in genetically proven spinocerebellar ataxia 8. Clin Neurol Neurosurg 110, 65-68. Mahadevan, M., Tsilfidis, C., Sabourin, L., Shutler, G., Amemiya, C., Jansen, G., Neville, C., Narang, M., Barcelo, J., and O'Hoy, K. (1992). Myotonic dystrophy mutation: an unstable CTG repeat in the 3' untranslated region of the gene. Science 255, 1253-1255. Maltecca, F., Filla, A., Castaldo, I., Coppola, G., Fragassi, N. A., Carella, M., Bruni, A., Cocozza, S., Casari, G., Servadio, A., and De Michele, G. (2003). Intergenerational instability and marked anticipation in SCA-17. Neurology 61, 1441-1443. Manto, M. U. (2005). The wide spectrum of spinocerebellar ataxias (SCAs). Cerebellum 4, 2-6. Matsuura, T., Yamagata, T., Burgess, D. L., Rasmussen, A., Grewal, R. P., Watase, K., Khajavi, M., McCall, A. E., Davis, C. F., Zu, L., Achari, M., Pulst, S. M., Alonso, E., Noebels, J. L., Nelson, D. L., Zoghbi, H. Y., and Ashizawa, T. (2000). Large expansion of the ATTCT pentanucleotide repeat in spinocerebellar ataxia type 10. Nat Genet 26, 191-194. 31.

(40) McCampbell, A., Taylor, J. P., Taye, A. A., Robitschek, J., Li, M., Walcott, J., Merry, D., Chai, Y., Paulson, H., Sobue, G., and Fischbeck, K. H. (2000).. CREB-binding. protein. sequestration. by. expanded. polyglutamine. Hum Mol Genet 9, 2197-2202. Michalik, A., and Van Broeckhoven, C. (2003). Pathogenesis of polyglutamine disorders: aggregation revisited. Hum Mol Genet 12 Spec No 2, R173-186. Miller, J. W., Urbinati, C. R., Teng-Umnuay, P., Stenberg, M. G., Byrne, B. J., Thornton, C. A., and Swanson, M. S. (2000). Recruitment of human muscleblind proteins to (CUG)(n) expansions associated with myotonic dystrophy. EMBO J 19, 4439-4448. Moseley, M. L., Schut, L. J., Bird, T. D., Koob, M. D., Day, J. W., and Ranum, L. P. (2000). SCA8 CTG repeat: en masse contractions in sperm and intergenerational sequence changes may play a role in reduced penetrance. Hum Mol Genet 9, 2125-2130. Moseley, M. L., Zu, T., Ikeda, Y., Gao, W., Mosemiller, A. K., Daughters, R. S., Chen, G., Weatherspoon, M. R., Clark, H. B., Ebner, T. J., Day, J. W., and Ranum, L. P. (2006). Bidirectional expression of CUG and CAG expansion transcripts and intranuclear polyglutamine inclusions in spinocerebellar ataxia type 8. Nat Genet 38, 758-769. Mosemiller, A. K., Dalton, J. C., Day, J. W., and Ranum, L. P. (2003). Molecular genetics of spinocerebellar ataxia type 8 (SCA8). Cytogenet Genome Res 100, 175-183. Mutsuddi, M., Marshall, C. M., Benzow, K. A., Koob, M. D., and Rebay, I. (2004). The spinocerebellar ataxia 8 noncoding RNA causes neurodegeneration and associates with staufen in Drosophila. Curr 32.

(41) Biol 14, 302-308. Mutsuddi,. M.,. and. Rebay,. I.. (2005).. Molecular. genetics. of. spinocerebellar ataxia type 8 (SCA8). RNA Biol 2, 49-52. Nemes, J. P., Benzow, K. A., Moseley, M. L., Ranum, L. P., and Koob, M. D. (2000). The SCA8 transcript is an antisense RNA to a brain-specific transcript encoding a novel actin-binding protein (KLHL1). Hum Mol Genet 9, 1543-1551. Orr, H.T., Chung, M., Banfi, S., Kwiatkowski, T. J., Jr, Servadio, A., Beaudet, A. L., McCall, A. E., Duvick, L. A., Ranum, L. P. W., and Zoghbi, H. Y. (1993). Expansion of an unstable trinucleotide CAG repeat in spinocerebellar ataxia type 1. Nat Genet 4, 221-226. Perez, M. K., Paulson, H. L., Pendse, S. J., Saionz, S. J., Bonini, N. M., and Pittman, R. N. (1998). Recruitment and the role of nuclear localization in polyglutamine-mediated aggregation. J Cell Biol 143, 1457-1470. Pulst, S. M., Nechiporuk, A., Nechiporuk, T., Gispert, S., Chen, X., Lopes-Cendes, I., Pearlman, S., Starkman, S., Orozoco-Diaz, G., Lunkes, A., DeJong, P., Rouleau, G. A., Auburger, G., and Sahba, S. (1996). Moderate expansion of a normally biallelic trinucleotide repeat in spinocerebellar ataxia type 2. Nat Genet 14, 269-276. Ravikumar, B., Vacher, C., Berger, Z., Davies, J. E., Luo, S., Oroz, L. G., Scaravilli, F., Easton, D. F., Duden, R., O'Kane, C. J., and Rubinsztein, D. C. (2004). Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nat Genet 36, 585-595. Robinson, D. N., and Cooley, L. (1997). Drosophila kelch is an 33.

(42) oligomeric ring canal actin organizer. J Cell Biol 138, 799-810. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor. Sato, N., Amino, T., Kobayashi, K., Asakawa, S., Ishiguro, T., Tsunemi, T., Takahashi, M., Matsuura, T., Flanigan, K. M., Iwasaki, S., Ishino, F., Saito, Y., Murayama, S., Yoshida, M., Hashizume, Y., Takahashi, Y., Tsuji, S., Shimizu, N., Toda, T., Ishikawa, K., and Mizusawa, H. (2009). Spinocerebellar ataxia type 31 is associated with "inserted" penta-nucleotide repeats containing (TGGAA)n. Am J Hum Genet 85, 544-557. Saveliev, A., Everett, C., Sharpe, T., Webster, Z., and Festenstein, R. (2003). DNA triplet repeats mediate heterochromatin-protein-1sensitive variegated gene silencing. Nature 422, 909-913. Savkur, R. S., Philips, A. V., and Cooper, T. A. (2001). Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet 29, 40-47. Schols, L., Szymanski, S., Peters, S., Przuntek, H., Epplen, J. T., Hardt, C., and Riess, O. (2000). Genetic background of apparently idiopathic sporadic cerebellar ataxia. Hum Genet 107, 132-137. Schols, L., Bauer, I., Zühlke, C., Schulte, T., Kölmel, C., Bürk, K., Topka, H., Bauer, P., Przuntek, H., and Riess, O. (2003). Do CTG expansions at the SCA8 locus cause ataxia? Ann Neurol 54, 110-115. Schols, L., Bauer, P., Schmidt, T., Schulte, T., and Riess, O. (2004). Autosomal dominant cerebellar ataxias: clinical features, genetics, and pathogenesis. Lancet Neurol 3, 291-304.. 34.

(43) Seng, S., Avraham, H. K., Jiang, S., Venkatesh, S., and Avraham, S. (2006). KLHL1/MRP2 mediates neurite outgrowth in a glycogen synthase kinase 3beta-dependent manner. Mol Cell Biol 26, 8371-8384. Silveira, I., Alonso, I., Guimaraes, L., Mendonca, P., Santos, C., Maciel, P., Fidalgo De Matos, J. M., Costa, M., Barbot, C., Tuna, A., Barros, J., Jardim, L., Coutinho, P., and Sequeiros, J. (2000). High germinal instability of the (CTG)n at the SCA8 locus of both expanded and normal alleles. Am J Hum Genet 66, 830-840. Sobrido, M. J., Cholfin, J. A., Perlman, S., Pulst, S. M., and Geschwind, D. H. (2001). SCA8 repeat expansions in ataxia: a controversial association. Neurology 57, 1310-1312. Soong, B. W., Lu, Y. C., Choo, K. B., and Lee, H. Y. (2001). Frequency analysis of autosomal dominant cerebellar ataxias in Taiwanese patients and clinical and molecular characterization of spinocerebellar ataxia type 6. Arch Neurol 58, 1105-1109. Stevanin, G., Herman, A., Durr, A., Jodice, C., Frontali, M., Agid, Y., and Brice, A. (2000). Are (CTG)n expansions at the SCA8 locus rare polymorphisms? Nat Genet 24, 213; author reply 215. Teive, H. A. (2009). Spinocerebellar ataxias. Arq Neuropsiquiatr 67, 1133-1142. Worth, P. F., Houlden, H., Giunti, P., Davis, M. B., and Wood, N. W. (2000). Large, expanded repeats in SCA8 are not confined to patients with cerebellar ataxia. Nat Genet 24, 214-215. Wu, Y. R., Lin, H. Y., Chen, C. M., Gwinn-Hardy, K., Ro, L. S., Wang, Y. C., Li, S. H., Hwang, J. C., Fang, K., Hsieh-Li, H. M., Li, M. L., Tung, 35.

(44) L. C., Su, M. T., Lu, K. T., and Lee-Chen, G. J. (2004). Genetic testing in spinocerebellar ataxia in Taiwan: expansions of trinucleotide repeats in SCA8 and SCA17 are associated with typical Parkinson's disease. Clin Genet 65, 209-214. Wu, Y. R., Chen, I. C., Soong, B. W., Kao, S. H., Lee, G. C., Huang, S. Y., Fung, H. C., Lee-Chen, G. J., and Chen, C. M. (2009). SCA8 repeat expansion: large CTA/CTG repeat alleles in neurological disorders and functional implications. Hum Genet 125, 437-444. Wullner, U. (2003). Genes implicated in the pathogenesis of spinocerebellar ataxias. Drugs Today 39, 927-937. Yamada, M., Sato, T., Shimohata, T., Hayashi, S., Igarashi, S., Tsuji, S., and Takahashi, H. (2001). Interaction between neuronal intranuclear inclusions and promyelocytic leukemia protein nuclear and coiled bodies in CAG repeat diseases. Am J Pathol 159, 1785-1795. Zhuchenko, O., Bailey, J., Bonnen, P. Ashizawa, T., Stockton, D. W., Amos, C., Dobyns, W. B., Subramony, S. H., Zoghbi, H. Y., and Lee, C. C. (1997). Autosomal dominant cerebellar ataxia (SCA6) associated with small polyglutamine expansions in the alpha 1A-voltage-dependent calcium channel. Nat Genet 15, 62-69.. 36.

(45) 柒、附錄圖表. 圖一、ATXN8、ATXN8OS與KLHL1的基因構造圖。ATXN8OS與 KLHL1兩個基因的啟動子、表現子1及部分intron 1重疊，導致mRNA 5' 端分別表現自同一段DNA的兩股，且ATXN8OS mRNA有選擇性裁接的現象，CTG重複位於可以被選擇性裁接的表現子A上。此外，ATXN8 與KLHL1的轉錄為同一方向，CAG重複位於表現子A上，可轉錄出 polyQ蛋白(圖形修改自Mutsuddi and Rebay, 2005)。. 37.

(46) 圖二、ATXN8 -62 G/A多型性檢測。多型性的-62A等位基因會新增限制酶Mph1103I (辨識ATGCAT)切位，誤配引子PCR擴增的128 bp DNA片段經切割後的2.0%洋菜膠體電泳照片。Lane M為pGEM-4質體以限制酶HinfI切割的結果，作為片段大小標記。. 38.

(47) 圖三、 ATXN8 啟動子及鄰近 5’ 端序列 (-160~+60) 。以網路軟體 (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)分析-62G/A鄰近區域的序列，發現這一段序列上包含轉錄因子GATA1、C/EBP的可能結合部位。紅色箭頭(+99~-6)是cDNA過度表現及螢光酵素報告基因檢測所使用之ATXN8啟動子片段。*為終止密碼子TAA、TAG所在位置。 +1是起始密碼子開始之轉錄起點。M為起始密碼子ATG所對應之胺基酸methionine (Met)，Q為密碼子CAG所對應之胺基酸Glutamine (Gln). 39.

(48) 圖四、DNA探針製備。(A) ATXN8 -62 G/A基因啟動子質體的誤配引子PCR檢測。(B)以此質體為模板所製備的包含-62 G/A多型性的109 bp片段，分別有biotin標定(biotin-109G、biotin-109A)及沒有biotin標定 (109G、109A)。. 40.

(49) 圖五、核蛋白萃取檢測。選用HEK-293 (人類胚胎腎細胞)及SK-N-SH (人類神經腫瘤細胞)的細胞核(Nuclear)及細胞質(Cytosol)蛋白，PARP 抗體以及Actin抗體的西方轉漬分析結果。. 41.

(50) 圖六、凝膠電泳遷移檢測。分別使用HEK-293及SK-N-SH的核蛋白與 biotin標定的109A、109G探針做結合，並加入20~50倍沒有biotin標定的探針與之競爭。. 42.

(51) 圖七、cDNA過度表現及螢光酵素報告基因檢測。使用HEK-293及 SK-N-SH細胞做ATXN8 -62 G/A啟動子活性分析，並且共轉C/EBPA 或C/EBPB cDNA，或同時共轉C/EBPA、C/EBPB cDNA。. 43.

(52) 圖八、內生性 C/EBPA 表現及 C/EBPA 與 ATXN8 啟動子的結合檢測。 (A) HEK-293 及 SK-N-SH 的細胞總蛋白，利用 Tublin 抗體以及 C/EBPA 抗體的西方轉漬分析。(B)共轉 C/EBPA cDNA 質體之 HEK-293 核蛋白與 biotin 標定的 109A、109G 探針結合分析，沒有 biotin 標定的 109A 探針為實驗負控制組。. 44.

(53) 表一、帕金森氏症患者(PD)與正常人族群(Control) ATXN8 -62 G/A 基因的多型性及罹病風險分析 Genotype/allele No.. (%). PD (569). No.. (%). Odds ratio (95% CI). P-value. Control (547). GG. 167. (29.3). 155. (28.3). 1.00. GA. 298. (52.4). 264. (48.3). 1.05 (0.80-1.38). 0.739. AA. 104. (18.3). 128. (23.4). 0.75 (0.54-1.06). 0.103. G. 632. (55.5). 574. (52.5). 1.00. A. 506. (44.5). 520. (47.5). 0.88 (0.75-1.04). GG+GA. 465. (81.7). 419. (76.6). 1.00. AA. 104. (18.3)*. 128. (23.4). 0.73 (0.55-0.98). Age at onset, y. 0.141. 0.035. 19~93 (61.7±11.6) 20~90 (59.8±12.9) PD>60 (334). Control>60 (281). GG. 93. (27.8). 87. (31.0). 1.00. GA. 186. (55.7). 128. (45.5). 1.36 (0.94-1.97). 0.103. AA. 55. (16.5). 66. (23.5). 0.78 (0.49-1.24). 0.291. G. 372. (55.7). 302. (53.7). 1.00. A. 296. (44.3). 260. (46.3). 0.92 (0.74-1.16). GG+GA. 279. (83.5). 216. (76.5). 1.00. AA. 55. (16.5)*. 66. (23.5). 0.64 (0.43-0.96). Age at onset, y. 0.493. 0.030. 61~93 (69.8±5.9) 61~90 (70.1±6.5). 註：Odds ratio的計算是以最常見的基因型/等位基因做為比較的標準。Odds ratio > 1.00表示較高的疾病罹患風險，Odds ratio < 1.00表示較低的疾病罹患風險。對正常人而言，age at onset是指樣品蒐集時的年齡。 45.

(54)