硫磺菌（Laetiporus sulphureus）之液態培養及其生理活性研究
陳明陽
1鄭淑蓉
2陳啟楨
2陳健祺
2*
1麻豆新樓醫院泌尿科 2南台科技大學生物科技系 (收稿日期：2005.5.31，接受日期：2005.6.24) 摘 要 硫磺菌 (Laetiporus sulphureus) 在傳統的中醫治療中可作為乳腺癌、前列腺癌之輔助食物， 它可以幫助病患對抗癌症，但其作用機制尚未釐清？本實驗探討在不同培養條件下對硫磺菌生 長速率之影響，在實驗過程中利用固態培養基探討最適培養硫磺菌之 pH 值、溫度及培養基，再 以液態培養探討最適生長培養基之碳氮源組成及比例。結果顯示，在 24 ℃、pH 6.0 下以 0.5 % 蛋白腖 (peptone) 加 3 %麥牙糖抽出物 (malt extract) 為培養基，菌絲體生長狀況最好。利用液態培養所得之硫磺菌發酵液處理腫瘤細胞，結果顯示，隨著發酵天數遞增，對抑制 腫瘤細胞的增生能力有顯著遞增現象，第十二天硫磺菌發酵液抑制腫瘤細胞 (HeLa、Hep G2、 HT1080、DU-145、MCF-7 以及 MDA-MB-231) 的增生能力皆大於 75%。硫磺菌發酵液處理 HT1080 細胞後以 gelatin zymography analysis 分析，結果發現硫磺菌發酵液具有顯著地抑制 HT-1080 細胞分泌金屬蛋白酶-9 (metalloproteinase-9) 的能力。因此本實驗的結果顯示，硫磺菌 之液態發酵液不僅具有腫瘤細胞的增生，同時也具有抑制腫瘤細胞轉移的功能，由此可知，硫 磺菌是值得進一步探討的食用菇類。 關鍵詞：硫磺菌，菌絲體，液態培養，腫瘤細胞，抑癌試驗，金屬蛋白酶-2，金屬蛋白酶-9，轉 移
緒 言
過去研究顯示食用菇萃取物質具備許多生 物活性功能包括有：抗腫瘤、增加免疫能力、 抗病毒、抗高血壓、抑制血小板凝集、降血糖、 降 膽 固 醇 、 抗 細 菌 、 抗 寄 生 蟲 等 (Jong and Birmingham, 1993；Wasser and Weis, 1999； Wasser, 2002；Alquini et al., 2004)。因為具有上 述的生理活性功能，所以近十幾年食用菇生理 活性成份的萃取，以及生理功能的研究廣泛地 引起醫界與學界的注意，因此，食用菇之子實 體、菌絲體以及發酵液的應用逐漸的被世人重 視。 硫磺菌 (Laetiporus sulphureus) 為褐腐型 木材腐朽菌，屬擔子菌 (basidiomycete) 真菌， 它的分布為泛世界性，在台灣常於低海拔地區 之闊葉樹幹上被發現。過去的研究顯示，食用 菇的確具有生理活性功能之有效成分，如多醣 體、三萜類及固醇類等 (Mizuno et al., 1995； Leung et al., 1997；Lee et al., 2002；Talorete et al., 2002；Wasser, 2002；Zjawiony, 2004)。雖然相 較於其他食用菇的研究，硫磺菌的研究是相對 欠缺，但是 Leon 等人 (2004) 指出硫磺菌的子 實 體 中 也 可 萃 取 出 三 萜 類 物 質 (lanostanoid triterpene)，這種物質可導致人類骨髓瘤細胞 (myeloid leukemia cells) 凋亡 (apoptosis)。至於 在多醣體方面，有學者在硫磺菌的子實體分離 出兩種多醣體，一為與β-葡聚醣 (β-glucan) 相 似的 laminaran，以β-(1→3) 為主鏈；另一種多 醣 體 其 主 鍵 為 (1 → 6) 結 構 ， 支 鏈 則 帶 有 α-D-galactopyranosyl 的 fucomannogalactan (Alquini et al., 2004)。硫磺菌之相關文獻中除已證實其子實體對
Salmonella aureus 及 E. coli 具強抗菌活性外
(Suay et al., 2000；Staments, 2002)，其他與硫磺 菌有關的研究僅止於探討子實體中萃取物之其 成 分 分 析 以 及 測 試 其 相 關 的 生 理 功 能 (Yoshikawa et al., 2001；Alquini et al., 2004； Leon et al., 2004)，因此本研究針對硫磺固態與 液態發酵培養，以及發酵液抑制腫瘤細胞增生 之生物活性研究。
材料與方法
生物材料 實驗中所使用的硫磺菌 (BCRC 37154) 以 及 腫 瘤 細 胞 ( 纖 維 囊 腫 細 胞 (HT1080, BCRC60037)、乳癌細胞 (MCF 7, BCRC60436 以及MDA MB 231, BRCR60425)、肝癌細胞 (Hep G2, BCRC60025)、子宮頸癌細胞 (HeLa, BCRC60005) 前 列 腺 癌 細 胞 (DU-145, BCRC60348)) 皆購自食品工業發展研究所。 硫磺菌最適碳氮源固態培養 (solid cultures) 測 試 定量之硫磺菌菌絲體 (mycelium) 接種於 各種不同碳氮源之培養基 (pH 6) ，於 24℃恆 溫培養箱下培養，每隔 24 小時測量其菌絲生長 直徑。碳源的種類有葡萄糖 (glucose)、蔗糖 (sucrose)、果糖 (fructose)、玉米粉 (corn flour)、 馬鈴薯粉 (potato flour)、可溶性澱粉 (soluble starch) 以及麥芽抽出物 (malt extract) 等；氮源 的種類有：玉米漿 (corn steep liquor)、黃豆粉 (soy beans flour)、酵母抽出物 (yeast extract) 以 及蛋白腖 (peptone)等。 硫 磺 菌 最 適 碳 氮 源 液 態 發 酵 培 養 (liquid-fermented cultures) 測試 將長滿繡球菌之固態培養皿 (90 mm) 放 入含有 100 ml 無菌水的均質機中，攪拌 30 秒 後將菌液接種於不同培養基的錐形瓶中進行液 態震盪培養 (培養條件：pH 值為 6、接菌量為 5%、振盪速度為 100 rpm/min 以及培養溫度為 18℃、24℃、30℃)。液態發酵所收集菌絲體與 發酵液則進行硫磺菌生長曲線變化分析以及各 種生理活性試驗。 腫瘤細胞細胞存活率測定 (MTT assay) 將HT1080、MCF-7、MDA-MB-231、Hep G2、HT1080 及DU-145 等細胞分別接種於 96 孔培養盤，於 37℃培養與 5% CO2下 24 小時， 第二天加入各種不同培養條件下所得之硫磺菌 發酵液樣品，每孔加入 20µL硫磺菌發酵液 (經 高溫滅菌)，最終處理腫瘤細胞之濃度為原來發 酵液十分之ㄧ的濃度，於 37℃與 5% CO2下培養 72 小 時 後 加 入 MTT (3-(4,5-dimethyl- thiazol-2-yl)2,5- diphenyltrazolium bromide)，在 37℃下作用 4 小時後，移除培養基並加入 100µl/ 孔DMSO (dimethyl sulfoxide)，於室溫下振盪 5 分鐘後以酵素免疫分析儀 (550 nm) 來測定腫 瘤細胞的存活率 (Mosmann, 1983)。 實驗組 O.D.值 細胞分泌蛋白質 (conditioned medium) 之收集 將HT1080 細胞培養在 6 孔盤中 (8×105 cells/孔) 培養隔夜，再以含 0.1% BSA的培養基 於 4 小時之內洗腫瘤細胞 3 次，清洗後加入各 種不同濃度硫磺菌發酵液，濃度分別為 25µL /mL、50µL /mL與 100µL /ml，同時在每個處理 組內加入 10µL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 100 ng/mL)，處理後的細胞於 37 oC與 5% CO2下培養 24 小時，細胞於培養 24 小時後收集 其 培 養 液 ， 最 後 每 個 樣 品 再 以 centricon (10000MW; MILLIPORE) 在 6000 rpm下離心 35 分鐘，收集之濃縮液進行蛋白質電泳分析或 保存於-80℃備用。 金屬蛋白酶-2 與金屬蛋白酶 -9 表現的分析 (Gelatin Zymography Analysis)細胞分泌蛋白質 (conditioned medium) 與 2X 樣 品 緩 衝 液 (Laemmli, 0.125 M Tris-HCl pH6、4% SDS、0.04% w/v Bromophenol blue、 20% Glycerol) 以 1 : 1 混合，於 55 oC下加熱 5 分鐘後蛋白質樣品進行蛋白質電泳分析 (7 % SDS-polyacrylamide + 0.1% gelatin (w/v))。電泳 膠以 2.5% Triton X-100 清洗兩次約 15 分鐘後， 細胞存活率（％）＝ ×100 % 對照組 O.D.值
表一、不同碳與氮源培養基對硫磺菌 (L. sulphureus) 成長之影響。
Table 1. Growth rate of L. sulphureus in different carbon and nitrogen sources at 24 oC, pH 6.0. Data were conducted in triplicate.
Growth rate (cm) / Mean ± S.E. Nutrient Sources
Incubation time (day)
2% Nitrogen 2% Carbon 2 3 4 5 6
Corn steep liquor Glucose 2.12 ± 0.28 3.32 ± 0.28 4.52 ± 0.23 5.85 ± 0.31 7.42 ± 0.13 Soy beans flour Glucose 1.72 ± 0.12 3.13 ± 0.03 4.48 ± 0.14 5.97 ± 0.06 7.52 ± 0.06 Peptone Glucose 2.03 ± 0.06 3.33 ± 0.14 4.72 ± 0.18 6.13 ± 0.36 7.78 ± 0.28 Yeast extract Glucose 2.05 ± 0.01 3.43 ± 0.03 4.77 ± 0.03 6.33 ± 0.08 7.85 ± 0.05 Corn steep liquor Fructose 2.02 ± 0.14 3.00 ± 0.05 4.23 ± 0.10 5.50 ± 0.01 7.00 ± 0.01 Soy beans flour Fructose 1.53 ± 0.03 2.55 ± 0.1 3.77 ± 0.08 5.07 ± 0.06 6.43 ± 0.06 Peptone Fructose 1.75 ± 0.05 3.17 ± 0.03 4.63 ± 0.03 6.45 ± 0.05 8.07 ± 0.08 Yeast extract Fructose 1.67 ± 0.03 2.98 ± 0.06 4.30 ± 0.05 5.93 ± 0.13 7.55 ± 0.17 Corn steep liquor Sucrose 1.55 ± 0.09 3.13 ± 0.13 4.78 ± 0.18 6.80 ± 0.18 8.37 ± 0.08 Soy beans flour Sucrose 1.15 ± 0.09 1.83 ± 0.19 3.35 ± 0.15 4.37 ± 0.28 5.78 ± 0.26 Peptone Sucrose 1.28 ± 0.08 2.77 ± 0.06 4.15 ± 0.18 5.78 ± 0.36 7.02 ± 0.58 Yeast extract Sucrose 1.65 ± 0.22 3.22 ± 0.26 4.85 ± 0.09 5.75 ± 0.05 6.20 ± 0.10 Corn steep liquor Malt extract 1.52 ± 0.03 3.02 ± 0.03 4.38 ± 0.03 6.00 ± 0.05 7.55 ± 0.09 Soy beans flour Malt extract 1.52 ± 0.03 2.90 ± 0.10 4.30 ± 0.17 5.68 ± 0.19 7.12 ± 0.16 Peptone Malt extract 1.48 ± 0.08 2.98 ± 0.06 4.33 ± 0.08 6.02 ± 0.03 7.48 ± 0.28 Yeast extract Malt extract 1.78 ± 0.12 3.13 ± 0.03 4.33 ± 0.08 5.73 ± 0.13 7.30 ± 0.20 Corn steep liquor Corn flour 2.03 ± 0.03 3.48 ± 0.03 5.02 ± 0.03 6.95 ± 0.05 8.45 ± 0.09 Soy beans flour Corn flour 1.47 ± 0.03 2.28 ± 0.08 3.30 ± 0.26 4.37 ± 0.24 5.47 ± 0.15 Peptone Corn flour 1.60 ± 0.05 2.87 ± 0.10 4.07 ± 0.12 5.38 ± 0.08 6.67 ± 0.06 Yeast extract Corn flour 1.43 ± 0.15 2.80 ± 0.22 3.90 ± 0.26 5.25 ± 0.39 6.33 ± 0.53 Corn steep liquor Potato flour 1.95 ± 0.05 3.48 ± 0.08 4.97 ± 0.06 6.80 ± 0.20 8.18 ± 0.16 Soy beans flour Potato flour 1.40 ± 0.05 2.30 ± 0.13 3.25 ± 0.31 4.38 ± 0.16 5.68 ± 0.28 Peptone Potato flour 1.73 ± 0.03 2.90 ± 0.13 3.95 ± 0.17 5.45 ± 0.35 6.47 ± 0.51 Yeast extract Potato flour 1.68 ± 0.03 3.05 ± 0.09 4.33 ± 0.15 5.77 ± 0.10 6.88 ± 0.25 Corn steep liquor Soluble starch 2.05 ± 0.05 3.53 ± 0.03 5.15 ± 0.05 6.97 ± 0.19 8.5 0± 0.01 Soy beans flour Soluble starch 1.48 ± 0.16 2.35 ± 0.17 3.58 ± 0.14 4.80 ± 0.19 6.02 ± 0.03 Peptone Soluble starch 1.77 ± 0.13 3.07 ± 0.12 4.37 ± 0.25 6.05 ± 0.35 6.97 ± 0.03 Yeast extract Soluble starch 1.68 ± 0.08 3.03 ± 0.12 4.57 ± 0.03 6.07 ± 0.12 7.53 ± 0.08
加入顯像緩衝溶液 (Development Buffer；1.5 M Tris-HCl, pH 8.8，0.05 mM CaCl2，0.02% NaN3)
於室溫下輕微搖晃 15 分鐘，再將電泳膠片移至 37 oC培養箱培養 16 至 20 小時，之後將顯像緩 衝溶液移除並加入固定溶液 (Fixing Solution； methanol : acetic acid : water = 4.5 : 1 : 4.5, v : v : v) 於室溫下輕微搖晃約 15 分鐘後，移除固定 溶 液並以 染色 溶液 (Staining Solution ； 0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v) in Destaining Solution) 進行染色，將電泳膠置於 去染色溶液 (Destaining Solution；methanol : acetic acid : water = 4.5 : 1 : 4.5, v : v : v) 中進行 退染，直到條紋清楚的呈現為止，再將電泳膠 片放入去離子水中停止退染 (Hawkes et al., 2001)。電泳膠片經過densitometer (Bio-Rad) 掃 描後再進行MMP-2 與MMP-9 表現的定量。 統計分析 本實驗數據結果利用 Sigma Stat 軟體進行 數 據 分 析 ， 以 Turkey test 進 行 統 計 分 析 ， p<0.05，則表示有顯著性的差異比較。三次重 覆數據之結果以平均值±SE (standard error) 表 示。
結 果
硫磺菌固態培養與液態發酵培養的探討 在初步硫磺菌培養條件的探討上，發現固 態培養基酸鹼值為 6.0 與培養溫度為 24℃下可 以得到最佳硫磺菌的培養條件，因此在這種條 件下進行不同碳氮源組合培養條件的篩選。當 碳氮源各固定為 2 %之條件下，以固態培養的 方式進行硫磺菌的固態培養基的篩選試驗，結 果如表一所示，四種較佳碳氮源組合為：(玉米 漿+玉米澱粉)、(玉米漿+可溶性澱粉)、(蛋白腖 +麥牙糖抽出物) 及 (酵母抽出物+麥牙糖抽出 物)。雖然 (玉米漿+玉米澱粉) 及 (玉米漿+可 溶性澱粉) 培養基組合生長速率最快，但菌絲表二、不同比例之蛋白 與麥牙糖抽出物培養基對硫磺菌 (L. sulphureus) 成長之影響。
Table 2. Growth rate of L. sulphureus in different ratio of peptone and malt extract at 24 oC, pH 6.0. Data were conducted in
triplicate. (N: Peptone; C: Malt Extract).
Growth Rate (cm) / Mean ± S.E. Nutrient Sources
Incubation Time (day)
N(%) C(%) 2 3 4 5 6 P2.0%M2% 1.53 ± 0.08 3.05 ± 0.05 4.32 ± 0.08 6.08 ± 0.08 7.50 ± 0.05 P0.5%M1% 1.05 ± 0.05 1.98 ± 0.10 3.22 ± 0.13 4.40 ± 0.28 6.37 ± 0.47 P0.5%M3% 2.22 ± 0.08 3.73 ± 0.03 5.22 ± 0.08 6.83 ± 0.10 8.47 ± 0.06 P0.5%M5% 2.28 ± 0.10 3.70 ± 0.18 5.20 ± 0.10 6.85 ± 0.09 8.40 ± 0.10 P1.5%M1% 1.18 ± 0.08 2.38 ± 0.08 3.95 ± 0.13 5.33 ± 0.15 7.17 ± 0.15 P1.5%M3% 1.07 ± 0.10 2.28 ± 0.13 5.05 ± 0.05 6.48 ± 0.10 7.90 ± 0.10 P1.5%M5% 1.03 ± 0.03 2.10 ± 0.05 3.40 ± 0.10 4.52 ± 0.18 6.17 ± 0.18 P2.5%M1% 1.65 ± 0.05 3.18 ± 0.14 4.50 ± 0.05 6.58 ± 0.14 8.08 ± 0.08 P2.5%M3% 1.67 ± 0.08 3.27 ± 0.15 4.52 ± 0.08 5.97 ± 0.14 7.80 ± 0.10 P2.5%M5% 1.00 ± 0.05 2.08 ± 0.08 3.10 ± 0.10 4.08 ± 0.16 5.40 ± 0.10 體生長的密度比較稀疏，相較之下 (蛋白腖+麥 牙糖抽出物，PM) 及 (酵母抽出物+麥牙糖抽出 物，YM) 培養基組合是比較有利於硫磺菌菌絲 體生長，其菌絲生長的密度較其他培養基組合 緻密，菌絲的厚度也較其他碳氮源組合厚，因 此比較適合硫磺菌生長的培養基組合為 PM 與 YM，此兩組培養基又以 PM 較佳 (數據未登 出)。 為了進一步確認最佳蛋白腖與麥牙糖抽出 物 (PM) 之培養比例，利用十種不同比例的蛋 白腖與麥牙糖抽出物組合培養基進行固態最佳 培養篩選，結果如表二，初步篩選出較佳蛋白 腖與麥牙糖抽出物之培養比例條件依序為： (0.5%蛋白腖+3%麥牙糖抽出物)、(0.5%蛋白腖 +5%麥牙糖抽出物)及 (2.5%蛋白腖+1%麥牙糖 抽出物)。 硫磺菌液態發酵培養的探討 由上述所得硫磺菌較佳之固態培養條件進 一步探討其液態發酵條件，在pH 6.0，24 o C條 件下利用不同培養基 (PM與YM) 進行硫磺菌 液態發酵培養，結果如圖一顯示，在 12 天液態 發酵培養過程中，以PM培養基培養之硫磺菌菌 絲體生長量於第八天隨即顯著的多於YM (p < 0.05)，由以上結果得知，在固定碳氮源比例各 為 2%之條件下，硫磺菌最適培養條件為蛋白腖 +麥牙糖抽出物 (PM)。 硫磺菌以不同培養基之發酵液對腫瘤細胞株存 活率的影響 在初步硫磺菌生理活性探討試驗中發現， 利用 (玉米漿+玉米澱粉)、(玉米漿+可溶性澱 粉)、(蛋白腖+麥牙糖抽出物) 及 (酵母抽出物+ 麥牙糖抽出物) 等培養基組合之發酵液皆能顯 著的抑制子宮頸腫瘤細胞 (HeLa) 的成長 (p < 0.05)，其中以 (蛋白腖+麥牙糖抽出物，PM) 與 (酵母抽出物+麥牙糖抽出物，YM) 培養所得發 酵液抑制腫瘤細胞成長的效果較佳，但是發酵 所得之菌絲體則無此生理活性功能 (數據未登 出)。 為了進一步探討硫磺菌發酵液對腫瘤細胞 的影響，收集硫磺菌以 YM 或 PM 為培養基培 養之發酵液進行腫瘤細胞成長抑制試驗，結果 如圖二顯示，隨著培養天數遞增，兩種培養基 5.6 3.5 5.4 4.3 2.1 7.5 2.4 6.9 6.3 3.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 4 6 8 10 12
Fermentation Time (Day)
Bi om as s ( g /L ) : YM : PM * * * 圖 一 、 以 YM 或 PM 為 培 養 基 組 合 進 行 硫 磺 菌 (L. sulphureus) 液態發酵培養之菌絲量。
Figure1. Biomass of L. sulphureus grown in different
nitrogen and carbon sources (YM and PM) at 24 oC, pH 6.0, and 100 rpm/min. YM: 2% yeast extract + 2% malt extract; PM: 2% peptone + 2% malt extract. Data are represented as the Mean ± S.E. in triplicate.*: Significantly different between PM and YM (p < 0.05).
90 33 24 29 30 44 27 23 26 29 21 25 22 25 26 18 24 21 23 24 16 87 95 94 80 0 20 40 60 80 100 120 HeLa HT-1080 MCF-7 Du 145 Hep G2 Ce ll v ia b ili ty (% o f C o n tr o l) : Day 4 : Day 6 : Day 8 : Day 10 : Day 12 * * * * * * * * * * * * * * * * * * ** (A) 84 88 69 94 65 80 33 38 38 54 31 54 24 31 32 34 27 51 25 34 31 49 27 23 27 33 21 26 50 24 0 20 40 60 80 100 120
HeLa HT-1080 MCF-7 MDA-MB-231 Du 145 Hep G2
Ce ll v ia b il ity (% o f co ntrol) : Day 4 : Day 6 : Day 8 : Day 10 : Day 12 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * (B) 圖二、硫磺菌 (L. sulphureus) 在不同培養基 (PM 與 YM) 與不同培養天數下所收集之發酵液對腫瘤細胞株存活的影響。
Figure 2. Growth inhibitory effect of different liquid cultures from L. sulphureus on tumor cells. A: 2% peptone + 2% malt extract
(PM); B 2% yeast extract + 2% malt extract (YM); Data are represented as the Mean ± S.E. in triplicate. *: Significantly different control (p < 0.05). 組 合 對 腫 瘤 細 胞 (HT-1080 、 MCF-7 、 MDA-MB-231、Hep G2、HT-1080 以及 DU-145) 的存活率皆有顯著遞減現象產生，亦即液態培 養天數越久，抑制腫瘤細胞增生能力也隨之增 加。由圖二可以得知，硫磺菌之第六天發酵液 即有非常顯著的抑制腫瘤細胞增生效果。硫磺 菌以 YM 或 PM 培養至第 12 天的發酵液，其抑 腫瘤細胞存活率皆大於 70%以上 (圖二)，由以 上實驗結果得知硫磺菌培養液對於此 6 種腫瘤 細胞之增生都有顯著的抑制效果。 金屬蛋白酶-2 與金屬蛋白酶-9 的表現 由於硫磺菌液態培養所得之發酵濾液對腫 瘤細胞 (HT1080、MCF-7、MDA-MB-231、Hep G2、HT1080 以及 DU-145) 之增生有顯著的抑 制效果，而 HT-1080 細胞又可分泌 MMP-2 及 MMP-9 以促進癌細胞的轉移，因此利用硫磺菌 液態培養所收集之 YM 與 PM 發酵液處理 HT-1080 細胞，以探討腫瘤細胞經硫磺菌發酵 液處理後，MMP-2 或 MMP-9 的分泌量是否會 被降低或阻斷；HT-1080 細胞處理發酵液的同 時加入 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 以刺激 HT-1080 細胞產生更多的 MMP-2 以及 MMP-9。結果如圖三與圖四顯示，硫磺菌以 YM 及 PM 培養 8 天後，發酵液即可顯著地抑制 HT-1080 分泌 MMP-9，相較於控制組 (YM 與 PM) 其抑制 MMP-9 分泌的能力分別為 26%與 72%，然對 MMP-2 的分泌則無明顯的影響；第 (A) (B) 100 95 102 90 74 64 58 0 20 40 60 80 100 120
PBS Con Day 4 Day 6 Day 8 Day 10 Day 12
Re la tiv e in te ns ity (% o f c on tro l) 圖 三 、 以 YM 培 養 基 進 行 硫 磺 菌 (L. sulphureus) 液 態 培 養 後 其 發 酵 濾 液 對 HT-1080 細 胞 分 泌 金 屬 蛋 白 酶 (metalloproteinase-2 與 metalloproteinase-9) 之影響。
Figure 3. The effect of liquid culture (YM) from L. sulphureus on of MMP-2 and MMP-9 enzymatic activity. HT-1080 cells were
treated with PBS (lane 2), non-fermented YM medium (lane 3), day 4 fermented YM medium (lane 4), day 6 fermented YM medium (lane 5), day 8 fermented YM medium (lane 6), day 10 fermented YM medium (lane 7), day 12 fermented YM medium (lane 8) in the presence of 100 ng/ml PMA for 24 h; M: marker (lane 1). Supernatants were harvested and subjected to gelatin zymography, as described in Materials and Methods. (A) Gelatin Zymographic analysis of MMP-9 and MMP-2 expression. (B) The gelatinolytic activities of MMP-9 measured by densitometry (Bio-Rad) and the expression levels of MMP-9 were normalized to actin (data not shown).
(A) (B) 100 96 91 67 28 30 33 0 20 40 60 80 100 120
PBS Con Day 4 Day 6 Day 8 Day 10 Day 12
Relativ e in ten sity (% o f co nt ro l) 圖 四 、 以 PM 培 養 基 進 行 硫 磺 菌 (L. sulphureus) 液 態 培 養 後 其 發 酵 濾 液 對 HT-1080 細 胞 分 泌 金 屬 蛋 白 酶 (metalloproteinase-2 與 metalloproteinase-9) 之影響。
Figure 4. The effect of liquid culture (PM) from L. sulphureus on of MMP-2 and MMP-9 enzymatic activity. HT-1080 cells were
treated with PBS (lane 2), non-fermented PM medium (lane 3), day 4 fermented PM medium (lane 4), day 6 fermented PM medium (lane 5), day 8 fermented PM medium (lane 6), day 10 fermented PM medium (lane 7), day 12 fermented PM medium (lane 8) in the presence of 100 ng/ml PMA for 24 h; M: marker (lane 1). Supernatants were harvested and subjected to gelatin zymography, as described in Materials and Methods. (A)Gelatin Zymographic analysis of MMP-9 and MMP-2 expression. (B) The gelatinolytic activities of MMP-9 measured by densitometry (Bio-Rad) and the expression levels of MMP-9 were normalized to actin (data not shown).
12 天 YM 與 PM 發酵液對 MMP-9 分泌的抑制 力分別為 42%與 67%。相較於 YM，硫磺菌以 PM 培養所得的發酵液對 HT-1080 細胞分泌 MMP-9 的表現有較佳的抑制能力 (圖三與圖 四)。
討 論
利用固態培養探討最適 pH 值、溫度及培養 基組成條件時，我們不僅以生長直徑為判斷依 據，同時也以菌絲體生長之厚薄度、緊實度為 判斷依歸。雖然實驗數據顯示最佳的生長曲線 pH 值為 5 或 6，但硫磺菌在 pH 6.0 的條件下培 養所得之菌絲體厚度較 pH 5.0 下所得之菌絲體 厚，因此硫磺菌最佳生長速率應是在 pH 6.0。 碳氮營養組合篩選中，發現四種較佳碳氮源組 合：(玉米漿+玉米澱粉)、(玉米漿+可溶性澱 粉)、(蛋白腖+麥牙糖抽出物) 及 (酵母抽出物+ 麥牙糖抽出物)。其中 (玉米漿+玉米澱粉) 及 (玉米漿+可溶性澱粉) 培養基組合雖然生長速 率最快 (表一)，但菌絲體生長密度較為稀疏。 相對於 (蛋白腖+麥牙糖抽出物) 及 (酵母抽出 物+麥牙糖抽出物) 培養基組合培養之菌絲體 雖然其生長速率並非最快，但其菌絲體密度從 一開始就相當緻密，厚度也是所有碳氮源組合 中最厚。故選定 (蛋白腖+麥牙糖抽出物) 及 (酵母抽出物+麥牙糖抽出物) 培養基組合進行 液態培養，並測其搖瓶生長曲線變化，以進一 步確認最佳碳氮源組合。 過去許多的研究顯示食用菇類分離出之多 醣體與三萜類 (triterpenes) 具有抗腫瘤的生理 活 性 功 能 (Suzuki et al.. 1989 ； Jong and Birmingham, 1993 ； Wasser, 2002 ； Zjawiony, 2004)，Leon 等人 (2004) 也指出由硫磺菌之子 實體分離出的三萜類具有促進骨髓瘤細胞進行 細胞凋亡 (apoptosis) 的功能，然大部份的三萜 類都是由食用菇之子實體萃取而得 (Zjawiony, 2004)，一般的食用菇類是無法以液態發酵的技 術產生三萜類，因此本實驗抑制腫瘤細胞的生 物 活 性 物 質 應 不 屬 於 三 萜 類 。 Alquini 等 人 (2003) 的研究發現硫磺菌之子實體中可分離出 兩種多醣體 laminaran 與 fucomannogalactan，以 及過去的研究發現食用菇可以分離出多種的多 醣體 (例如β-glucan)，這些多醣體可以有效的抑 制腫瘤細胞的增生 (Dong et al., 1996；Wasser, 2002；Zjawiony, 2004)；雖然本實驗所得之硫磺 菌發酵液可以顯著地抑制腫瘤細胞的增生，並 且抑制能力隨著天數增加而增強 (圖二)，但是 液態培養硫磺菌所得多醣體的含量卻隨著培養 天數增加而遞減 (多醣數據未發表)，因此本研 究中培養之硫磺菌發酵液具有抑制腫瘤細胞增 生之生物活性物質可能不屬於多醣體，或是不 具有抑制腫瘤細胞增生的β-glucan，然本實驗發 酵條件下所得硫磺菌發酵產物與其他食用菇的 產物在抑制腫瘤細胞增生的作用機制上之差異 性是值得進一步的探討。Himelstein 等人 (1995) 指出金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs) 參與腫瘤轉 移過程中的數個步驟，包含有侵入、轉移及血 管新生作用，因此 MMPs 在癌細胞的轉移扮演 著相當重要的角色，此外許多學者也認為當腫 瘤細胞在轉移時會大量分泌 MMPs 以溶解胞外 基質 (extracellular matrix, ECM)，以便有利於腫 瘤細胞穿過基底膜 (basement membrane) 轉移 至生物體內其他的部位 (Nagase and Woessner, 1999；Westermarck and Kahari, 1999；Chang and Werb, 2001；Chakraborti et al., 2003)；此外有許 多的研究指出 MMP-2 及 MMP-9 與許多癌症腫 瘤細胞的轉移有極大的關連性，例如肝癌、乳 癌、前列腺癌、膀胱癌、膽管癌、大腸癌…等 (Jimenez et al., 2000；Sier et al., 2000；Chae et al., 2003；Ishida et al., 2003；Wass et al., 2003)，近 來的研究數據也指出阻斷腫瘤細胞分泌金屬蛋 白酶 (如 MMP-2 或 MMP-9)，可以降低腫瘤細 胞的轉移能力 (Ramos-DeSimone et al., 1999； Kim et al., 2000；Yoon et al., 2001；Dona et al., 2004)；再者 ， Zhang 等人 (2000) 指出雲 芝 (Coriolus versicolor) 萃取物 (PSK) 可以藉著 降 低 腫 瘤 細 胞 分 泌 金 屬 蛋 白 酶 (MMP-2 與 MMP-9) 而達到抑制腫瘤細胞的轉移，根據圖 三與圖四的數據顯示硫磺菌的液態發酵液可以 顯著的降低 HT-1080 細胞分泌金屬蛋白酶-9， 因此我們可以推斷硫磺菌的液態發酵產物具有 抑制腫瘤細胞轉移的生物活性物質，至於是那 一種生物活性物質可以降低腫瘤細胞分泌金屬 蛋白酶是值得進一步的探討。
誌 謝
本實驗之所以能夠順利完成要感謝新樓醫 院麻豆分院在研究人力與研究經費上的資助。參考文獻
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The Study of Liquid Culture and Bioactivity in Laetiporus
sulphureus
Ming-Yang Chen
1, Shu-Jung Cheng
2, Chee-Jen Chen
2, Jian-Chyi Chen
2*
1
Department of Urology, Sinlau Hospital,Matou Branch, Matou Town Tainan, Taiwan
2
Department of Biotechnology, Southern Taiwan University of Technology, Yung-Kang City Tainan Taiwan
(Received: 31 May 2005, accepted: 24 June 2005)
ABSTRACT
Laetiporus sulphureus has been used in Chinese traditional medicine for a long time. However, there are very few scientific evidence to support its biological functions. Therefore, the optimal culture conditions for L. sulphureus, such as pH or temperature, were investigated in this study. The biological activities of cultural broth and mycelium of L. sulphureus, including antitumor activity and antimetastasis, were evaluated. The growth inhibition in tumor cells was evaluated by MTT- microculture tetrazolium assay and the ability of anti-metastasis was investigated by Gelatin Zymography analysis.
The results showed that the optimal temperature was under 24 oC and optimal pH was around 6, and
the best nutrient composition was 0.5% peptone + 3 % malt extract. Moreover, the liquid culture of L. sulphureus at day 12 showed the best inhibitory effect on the growth of tumor cells, such as HeLa, Hep G2, HT1080, DU-145, MCF-7 and MDA-MB-231 cells, by almost more than 75%. Furthermore, Gelatin Zymography analysis revealed that the expression of metalloproteinase-9 (MMP-9) in HT1080 cells treated with day-12 cultured broth of L. sulphureus was significantly suppressed. This result reveals that it is worthy to do more studies to illustrate the bioactivities of L. sulphureus.
Key words: Laetiporus sulphureus, mycelium, liquid culture, solid culture, antitumor, MTT, gelatin
