甘藷莖頂組織超低溫冷凍保存之研究
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(2) 210. Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 9, December 2012. immersion into liquid nitrogen, both Tainung No. 66 and No. 71 reached 3.3% regeneration rate. With aluminium cryo-plate technology for cryopreservation, the regeneration rate of Tainung No. 66 reached 3.3% when treated with both LS and PVS2 solutions for 30 min each. Tainung No. 71 had the same rate when treated with 30 min LS and 15 min PVS2. By comparing the results obtained from these two technologies, the cryopreservation using aluminum cryo-plate reduced 45% of processing time and 70% of chemical used. Accordingly, aluminum cryo-plate technology seems a better method for cryopreservation of shoot tips of sweet potato. Key words: Sweet potato, Cryopreservation, Encapsulation–vitrification, Aluminum cryo-plate. 縮寫表(Acronyms)： BA. 6-Benzyl aminopurine. DMSO. Dimethyl sulfoxide. EG. Ethylene glycol. GA3. Gibberellic acid 3. IAA. Indole-3-acetic acid. IBA. Indole-3-butyric acid. LN. Liquid nitrogen. LS. Loading solution. MS. Murashige-Skoog medium. NAA. α-Naphthaleneacetic acid. PVS2. Plant vitrification solution 2. PVS3. Plant vitrification solution 3. 前言 甘藷[Ipomoea batatas (L.) Lam.]為旋花 科 (Convoluvlaceae) 甘 藷 屬 (Impomoea) 的 植 物，營養成分豐富，富含維生素、蛋白質、 鈣、鐵及膳食纖維等，有助於維持身體健康 (Lai and Cheng 2006)。除了可作為輔助糧食 外，因富含澱粉可醱酵後製酒精，亦可加工 為罐頭、蜜餞及禽畜飼料，故為一利用性極 廣之優良作物。目前甘藷的種原保存方式以 現場保存(in situ conservation)及體外保存 (in vitro conservation )的方式為主，但前者 容易受外在環境的影響造成種原的流失，後 者則因繼代次數的增加而提升突變的機率，. 造成品種的變異，且此兩種種原保存方式皆 須耗費大量的人力、物力及空間維持與運作 (Hsu 1995)。然而超低溫冷凍保存技術改善上 述的缺點，此方法為將欲保存之植物組織， 先經一系列的處理後，再置入液態氮進行保 存。因植物組織保存於液態氮中，其生化代 謝停止，細胞維持於穩定的狀態而不至於死 亡，使植物可長期保存，達到種原長期保存 之目的(Yamamoto et al. 2012 )。至今已超過 160 個物種或栽培種成功地利用超低溫冷凍 保 存 方 法 保 存 重 要 的 種 原 (Yin and Hong 2009, 2010, Sisunandar et al. 2010, Hirai and Sakai 2003)； 所 保 存 的 植 物 材 料 相 當 多 樣 化，如體胚、不定芽及莖頂等(Popova et al. 2010, Burritt 2008, Tasi et al. 2009)，可依不 同條件需求選擇保存之部位。其中，莖頂組 織具非常穩定的基因遺傳特性，且需要保存 的空間小，因此為保存植物種原的良好材料。 凡有使用抗凍劑 PVS2 溶液處理之流程 者稱為玻璃質化法(vitrification)，其處理步 驟為植物組織的預培養(pre-cultured)、滲透 保護(osmoprotection)、PVS2 溶液處理、液 態 氮 保 存 、 回 溫 (rapid warming) 、 稀 釋 (dilution)及回復生長等，此處理流程具有操 作較簡單、所需工具少且處理時間短，但操 作時須甚小心，以免傷害植物組織(Sakai et al. 2008, Reed 2008)。而藻膠包埋玻璃質化法由 Matsumoto et al. (1995)所發表，以玻璃質化 法為基礎配合藻膠包埋的處理技術，其處理 步驟為植物組織的預培養、藻膠包埋 (encapsulation)、 滲 透 保護 、 PVS2 溶 液處 理、液態氮保存、回溫、稀釋及回復生長等。 此法不需擔心植物組織於操作時的機械傷 害，並與玻璃質化法有相同之植物組織存活 率，故為另一種良好之處理方法( Sakai et al. 2008)。 冷凍鋁片超低溫冷凍保存技術乃由 Yamamoto et al. 於 2011 年所發表，利用 7 mm × 37 mm × 0.5 mm 的鋁片(Fig. 1)，將植 物莖頂組織放置於鋁片上的小孔，先以藻膠.
(3) 211. 甘藷莖頂組織超低溫冷凍保存. 固定後，再經 LS 溶液及 PVS2 溶液處理 後，放入冷凍管中即可置入液態氮中保存。 此法改善玻璃質化法易傷害植物組織、藻膠 包埋玻璃質化法過於冗長的流程，並與玻璃 質化法有類似之植物組織存活率，故為一極 具潛力的超低溫冷凍保存技術。 進行超低溫冷凍保存技術中，如何有效 的降低植物組織的含水量，乃為成功與否的 關鍵。以玻璃質化法而言，植物組織經預培 養後，先使用 LS 溶液(標準配方為 2 M 甘油 + 0.4 M 蔗糖，pH 5.8)處理，再進行 PVS2 溶 液[標準配方為 30% w/v 甘油 + 15% w/v 乙 二醇(ethylene glycol)+15% w/v dimethyl sulfoxide (DMSO) + 0.4 M 蔗糖，pH 5.8)處 理，並配合適當的預培養及回復生長培養 基，可提升植物組織經液態氮保存後之存活 率(Pennycooke and Towill 2000, Sakai et al. 1990, Hsu 1995)。而過程中 PVS2 溶液的處 理時間極為重要，因 PVS2 溶液可使細胞脫 水，降低其細胞水分含量，促進植物組織玻 璃質化的形成並減少冰晶的生成，因此於液 態氮保存時，可降低細胞受傷的機會，以提 升細胞的存活率(Hsu 1995, Benson 2008)。除. PVS2 溶液外尚有 PVS3 溶液可供選用，此溶 液為 Nishizawa et al. (1993)所發表之抗凍 劑，其成分為 50% w/v 甘油及 50% w/v 蔗 糖，因不含乙二醇及 DMSO 溶液，故對植物 組 織 的 毒 性 比 PVS2 溶 液 低 (Volk et al. 2006)，但目前仍以 PVS2 溶液較為普遍。本 研究以甘藷莖頂組織進行超低溫冷凍保存技 術之研究，期能開發甘藷種原更長久且經濟 的保存方法。. 材料與方法 一、供試材料 供試材料為行政院農業委員會農業試驗 所嘉義分所提供之甘藷臺農 57 號(Tainung No.57) 、 66 號 (Tainung No. 66) 、 71 號 (Tainung No. 71)及 73 號(Tainung No. 73) 品種的組織培養苗，將培植體切成單節後， 置於 MS 基本鹽類培養基(Murashige and Skoog 1962)，添加 30 g L-1 蔗糖及 9.0 g L-1 Difco agar, pH5.7 ± 0.1，其培養環境為光 照 16 h，溫度 25℃，經 14 d 生長後，切取莖 頂進行下列試驗。. Fig. 1. Aluminum cryo-plates. Bar = 1 cm..
(4) 212. Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 9, December 2012. 二、莖頂高濃度蔗糖之預培養 將臺農 57 號、66 號、71 號及 73 號品種 的莖頂組織切下後，直接移入 MS 基本鹽類 及 9.0 g L-1 Difco agar，配合 0.0、0.1、0.2、 0.3 或 0.4 M 高濃度蔗糖培養 3 d 後，再將 莖頂再次切成 2–3 mm 大小，並移入上述不 同濃度蔗糖的培養基培養 1 d。將上述預培養 的莖頂組織移至冷凍管中，加入 1 mL 的 LS 溶液處理 60 min，將 LS 溶液吸出後，再加入 1 mL 的 PVS2 溶液於冰浴下處理 75 min。將 冷凍管中的 PVS2 溶液吸出，並加入 1.2 M 蔗 糖 MS 基本培養液進行稀釋處理靜置 20 min， 最後將莖頂組織移至含 0.1 mg L-1 IAA 的 MS 基本鹽類培養基。於溫度 25℃條件下， 先暗培養 7 d 後，再移至每日光照 16 h 下培 養 23 d 後，調查其植物組織存活率(其公式＝ 植株存活數/總培植體數×100％)。. 三、藻膠包埋玻璃質化法 將 莖 頂 組 織 置 於 藻 膠 培 養 液 [ 含 2% (w/v) Na–alginate 及 30 g L-1 蔗糖，不含 Ca2+的 MS 基本培養液]，以滴管將莖頂與藻 膠培養液一同滴入包埋培養液，並於 25℃中 靜置 30 min。待其形成直徑約 0.5 cm 球形， 再將藻膠球培養於含 30 g L-1 蔗糖之 MS 基本 鹽類液體培養基，每錐形瓶含有 15 粒藻膠球 及 50 mL 培養液，在 90 rpm 震盪速率培養 1 d，再移至含 0.3 M 蔗糖之 MS 基本鹽類液體 培養基培養 16 h。將上述處理的藻膠球置於 改良 LS 溶液(2 M 甘油+1.6 M 蔗糖，pH 5.8； Hirai and Sakai 2003)，以震盪速率 60 rpm 分別培養 0、60、120、180、240、300 及 360 min，再移至含 PVS2 或 PVS3 溶液(50% w/v 甘油 + 50% w/v 蔗糖，pH 5.8; Nishizawa et al. 1993)的錐形瓶，以震盪速率 60 rpm 培養 60 min，每瓶含有 10 粒藻膠球及 20 mL 的 LS 溶液、PVS2 溶液或 PVS3 溶液。將處理 後的藻膠球移入含有 1 mL 的 PVS2 溶液或 PVS3 溶液的冷凍管中，並置於液態氮中保存 1 h 後，取出冷凍管直接置入 40℃溫水中回. 溫 2 min，將冷凍管中的 PVS2 溶液或 PVS3 溶液吸出，再加入含 1.2 M 蔗糖 MS 基本鹽 類培養液，靜置 15 min。最後將藻膠球移至 含 1 μM α-Naphthaleneacetic acid (NAA), 0.5 μM 6-Benzyl aminopurine (BA), 0.1 μM Kinetin, 30 g L-1 蔗糖及 9.0 g L-1 Difco agar 的 MS 基本鹽類培養基，於溫度 25℃條件 下，先暗培養 7 d 後，再移至每日光照 16 h 下培養 23 d 後調查其植株再生率(其公式＝ 植株再生數/總培植體數×100%)。各處理分 別以每 10 粒藻膠球為一重複，共重複三次。. 四、冷凍鋁片法(aluminum cryo-plate) 切取莖頂(約 1 mm)置於含 0.3 M 蔗糖的 MS 基本鹽類之固體培養基，培養 1 d 後，以 微量滴管將藻膠培養液滴至冷凍鋁片上的小 孔。再用鑷子將莖頂組織移置冷凍鋁片，每 片可放置 10 個莖頂組織，滴入包埋培養液至 冷凍鋁片上，於 25℃中靜置 15 min 待其凝 固。再置於 LS 溶液處理 30 min 後，移至含 PVS2 溶液分別處理 15、30、45、60、75 或 90 min。 將 處 理 後 的 冷 凍 鋁 片 移 入 冷 凍 管 中，每管 1 片置於液態氮保存 1 h 後，取出冷 凍鋁片直接置入含 1.2 M 蔗糖之 MS 基本鹽類 培養液，於 25℃中靜置 15 min。將冷凍鋁片 上的莖頂組織取下，移至含 1 μM NAA, 0.5 μM BA, 0.1 μM Kinetin, 30 g L-1 蔗糖及 9.0 g L-1 Difco agar 的 MS 基本鹽類培養基，於溫 度 25℃條件下，先暗培養 7 d 後，再移至每日 光照 16 h 下培養 23 d 後調查植株再生率。各 處理以每 1 片冷凍鋁片為一重複，共三重複。. 五、資料統計與分析 本 試 驗 採 完 全 逢 機 設 計 (complete randomized design; CRD)，處理因子為品 種、液態氮及 LS 或 PVS2 的處理時間作 CRD 設計，所獲得的結果資料以無母數分析法 (Factorial Experiment by Kruskal-Wallis Method; Shen 1999)分析，若處理間有達到顯 著差異，以 Dunn multiple comparison 檢定 法作兩兩比較。.
(5) 213. 甘藷莖頂組織超低溫冷凍保存. 結果 臺農 57 號及 71 號莖頂組織於含 0.3 M 及 0.4 M 蔗糖之 MS 基本鹽類培養基預培 養，經 LS 溶液及 PVS2 溶液處理後，其植物 組織存活率皆 100%，其次為 0.1 M 蔗糖濃度 處理，使植物組織存活率達 90%。臺農 66 號 莖頂組織於含 0.2–0.4M 蔗糖之 MS 基本鹽類 培養基預培養，經 LS 溶液及 PVS2 溶液處理 後，其植物組織存活率皆 100 %，其次為 0.1 M 蔗糖濃度處理，使植物組織存活率達 90%。 臺農 73 號莖頂組織，於含 0.2 M 蔗糖的 MS 基本培養基預培養後，經 LS 溶液及 PVS2 溶 液處理後，其植物組織存活率達 90%，其次 為 0.1 M 及 0.3M 蔗糖濃度處理，使植物組織 存活率達 60% (Table 1 )。綜合以上結果得 知，MS 基本培養基中添加 0.3 M 蔗糖濃度作 為預培養，經 LS 溶液及 PVS2 溶液處理後， 可有效提升甘藷莖頂組織之存活率。 以藻膠包埋玻璃質化法及 PVS2 溶液保 存甘藷莖頂組織，臺農 57 號以 LS 溶液處理 300 min 及 PVS2 溶液處理 60 min，經液態 氮保存後，結果於回復培養基第 30 d 均無植 株再生，需經培養 75 d 後才有植株再生(Fig. 2A)，臺農 66 號、71 號及 73 號以 LS 溶液處 理 300 min 及 PVS2 溶液處理 60 min，於回 復 培 養 基 第 30 d 其 植 株 再 生 率 皆 為 3.3% (Table 2 )，再繼續培養至 45 天植株生長的情. 形(Figs. 2B、2C 及 2D)。未經液態氮保存處 理中，結果顯示 PVS2 溶液處理 60 min 配合 LS 溶液不同的處理時間，對於植株的再生效 果，品種之間有顯著的差異，以臺農 57 號及 臺農 66 號效果較佳，其次為臺農 71 號，而 臺農 73 號的植株再生的效果最差；另外 LS 溶液不同的處理時間對於植株的再生無顯著 的效果；並且品種與 LS 不同的處理時間並沒 有顯著的交感效應(Table 3 及 Table 4)。 以藻膠包埋玻璃質化法及 PVS3 溶液保 存甘藷莖頂組織，經液態氮保存處理中，結 果顯示臺農 66 號及 71 號分別以 LS 溶液處理 300 min 及 360 min 後，再以 PVS3 溶液處理 60 min，植株再生率皆為 3.3%。而臺農 57 號及 73 號以 LS 溶液處理 0–360 min 及 PVS3 溶液處理 60 min，均無任何再生植株產生 (Table 5)。未經液態氮保存處理中，品種之 間、LS 溶液不同處理時間對於植株的再生無 顯著的效果，而品種與 LS 不同的處理時間並 沒有顯著的交感效應(Table 6 )。 甘藷臺農 57 號、66 號、71 號及 73 號等 4 個不同品種的莖頂組織，於含有 0.3M 蔗糖 的 MS 基本鹽類培養基預培養 1d 後，再將莖 頂以藻膠包埋冷凍鋁片法處理，結果顯示臺 農 66 號以 LS 溶液處理 30 min 及 PVS2 溶液 處理 30 min，經液態氮處理後，回復培養之 植株再生率為 3.3%；而臺農 71 號以 LS 溶液. Table 1. Effect of different sucrose concentrations in pre-culture on the survival rates of Ipomoea batatas (L) Lam. cultivars Tainung Nos. 57, 66 and 71 without cryopreservationz. Sucrose concentration (M) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 z y. TNG 57 30 90 80 100 100. Survival rate (%)y TNG 66 TNG 71 50 40 90 90 100 80 100 100 100 100. TNG 73 0 60 90 60 20. Recovery medium: Full strength MS basal medium with 0.1 mg L-1 IAA, 30 g L-1 sucrose and 9.0 g L-1 Difco agar. Data were collected after 30 days of culture. Survival rate (%). Shoot tips pre-cultured on full strength MS basal medium with 0.3M sucrose and 9.0 g L-1 Difco agar, then loaded with LS for 60 min and dehydrated with PVS2 for 75 min at 0℃. Approximately 10 shoot tips were tested for each cultivar..
(6) 214. Fig. 2.. Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 9, December 2012. Plant regeneration of sweet potato cultivars after cryopreservation by encapsulation– vitrification. A. Tainung No. 57 shoot tip after cryopreservation for 75 days; B. Tainung No. 66 shoot tip after cryopreservation for 45 days; C. Tainung No. 71 shoot tip after cryopreservation for 45 days; D. Tainung No. 73 shoot tip after cryopreservation for 45 days.. Table 2. Effect of different times for LS treatment with PVS2 on the plant regeneration rate of shoot tips of Ipomoea batatas (L) Lam. cultivars Tainung Nos. 57, 66, 71 and 73 with / without cryopreservation by encapsulation–vitrificationz. Plant regeneration rate (%) Cultivar LS treatment (min) TNG 57 TNG 66 TNG 71 TNG 73 -LNy +LN -LN +LN -LN +LN -LN +LN 0 23.3 0 6.7 0 20.0 0 0 0 60 26.7 0 3.3 0 3.3 0 0 0 120 13.3 0 0 0 0 0 0 0 180 3.3 0 6.7 0 0 0 0 0 240 6.7 0 13.3 0 0 0 0 0 300 0 0 6.7 3.3 0 3.3 0 3.3 360 0 0 13.3 0 0 3.3 0 0 z Recovery medium: Full strength MS basal medium with 1.0 μM NAA, 0.5 μM BA 0.1μM kinetin, 30 g L-1 sucrose and 9.0 g L-1 Difco agar. Data were collected after 30 days of culture. y Shoot tips pre-cultured on full strength MS basal medium with 0.3 M sucrose and 9.0 g L-1 Difco agar, then loaded with different times for LS and dehydrated with PVS2 for 60 min without (-LN) / with (+LN) immersion into liquid nitrogen. Approximately 10 shoot tips were tested for each of three replicates..
(7) 215. 甘藷莖頂組織超低溫冷凍保存. Table 3. The result table of Factorial Experiment by Kruskal-Wallis Method (Shen 1997) for effect of different times for LS treatment with PVS2 on the plant regeneration rate of shoot tips of Ipomoea batatas (L) Lam. cultivars Tainung Nos. 57, 66, 71 and 73 without cryopreservation. Source. DF 3 6 18. Variety Time Variety x Time. Sum of square 7892.81 2465.79 8609.57. Chi-square statistic 13.27 4.14 14.47. P-Value 0.004** 0.657 0.698. **Significant at 1% level. Table 4. Varietal comparisons among effects of LS treatment with PVS2 on the plant regeneration rate of shoot tips of Ipomoea batatas (L.) Lam without cryopreservation. Variety Regeneration Rate (%). TN57. TN66. TN71. TN73. 10.5 ± 3.3 a*. 7.1 ±2.0 ab. 3.3 ± 2.4 bc. 0±0c. * Mean ± standard error (n = 21). Means followed by the same letter(s) are not significantly different at 5% level by the Dunn multiple comparison test. Table 5. Effects of different times for LS treatment with PVS3 on the plant regeneration rates of shoot tips of Ipomoea batatas (L.) Lam. cultivars Tainung Nos. 57, 66, 71 and 73 with / without cryopreservation by encapsulation–vitrificationz. LS treatment (min) 0 60 120 180 240 300 360 z y. TNG 57 -LNy +LN 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. Plant regeneration rate (%) Cultivar TNG 66 TNG 71 -LN +LN -LN +LN 26.7 0 16.7 0 16.7 0 3.3 0 6.7 0 0 0 0 0 0 0 3.3 0 6.7 0 6.7 3.3 3.3 0 0 0 6.7 3.3. TNG 73 -LN +LN 0 0 0 0 0 0 3.3 0 0 0 0 0 0 0. Recovery medium: Full strength MS basal medium with 1.0 μM NAA, 0.5 μM BA 0.1 μM Kinetin, 30 g L-1 sucrose and 9.0 g L-1 Difco agar. Data were collected after 30days of culture. Shoot tips pre-cultured on full strength MS basal medium with 0.3 M sucrose and 9.4 g L-1 Difco agar, then loaded with different times for LS and dehydrated with PVS3 for 60 min without (-LN) / with (+LN) immersion into liquid nitrogen. Approximately 10 shoot tips were tested for each of three replicates.. Table 6. The result table of Factorial Experiment by Kruskal-Wallis Method (Shen 1997) for effects of different times for LS treatment with PVS3 on the plant regeneration rate of shoot tips of Ipomoea batatas (L) Lam. cultivars Tainung Nos. 57, 66, 71 and 73 without cryopreservation. Source. DF. Sum of square. Chi-square statistic. P-Value. Variety. 3. 4360.14. 7.33. 0.062. Time. 6. 1496.08. 2.51. 0.867. Variety x Time. 18. 4638.11. 7.80. 0.982.
(8) 216. Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 9, December 2012. 處理 30 min 及 PVS2 溶液處理 15 min，植株 再生率亦為 3.3%，而臺農 57 號及 73 號則無 任何植株再生(Table 7)。未經液態氮保存處 理中，品種之間、PVS2 溶液不同處理時間對 於植株的再生沒有顯著的差異，而品種與 PVS2 不同的處理時間並沒有顯著的交感效 應(Table 8)；Fig. 3 為臺農 66 號及 71 號利用 冷凍鋁片法經超低溫冷凍保存後於回復生長 培養基培養 45 天的植株生長情形。. 討論 目前已有許多物種可藉由高濃度蔗糖的 預培養提升植物組織的存活率，如山葵以 0.3 M 蔗糖培養基預培養 1 d，可有效提升莖頂 組 織 經 液 態 氮 保 存 後 之 存 活 率 (Matsumoto et al. 1995 )。Halmagyi and Deliu (2007)指 出康乃馨因不同品種需使用 0.5 M 或 0.75 M. 蔗糖培養基預培養 1 d；鐵皮石斛以 0.75 M 蔗 糖 培 養 基 預 培 養 5 d (Yin and Hong 2009)，其植物組織經液態氮保存後有最佳之 存活率，故最適當之預培養蔗糖濃度及培養 天數依不同植物物種調整。Hirai and Sakai (2003)及 Pennycooke and Towill (2000)指出 甘藷莖頂組織於含 0.3 M 蔗糖的 MS 基本鹽 類培養基進行預培養，可有效提升莖頂組織 經超低溫冷凍保存後之組織存活率。本研究 同樣地發現 0.3 M 蔗糖濃度為預培養的蔗糖 濃度，可提高植物組織的存活率。 Tsai (2004)及 Yang (2002)指出甘藷臺農 25 號及甘藷臺農 69 號以 LS 溶液及 PVS2 溶 液進行玻璃質化法經超低溫冷凍保存後，有 再生植株形成。Yin and Hong (2009)指出鐵 皮石斛亦可藉由 LS 溶液及 PVS2 溶液處理進 行超低溫冷凍保存。本研究同樣以藻膠包埋. Table 7. Effect of PVS2 with different times of LS treatment on the plant regeneration rates of shoot tips of Ipomoea batatas (L) Lam. cultivars Tainung Nos. 57, 66, 71 and 73 with / without cryopreservation by aluminum cryo-platesz. PVS2 treatment (min) 15 30 45 60 75 90 z y. TNG 57 -LNy +LN 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. Plant regeneration rate (%) Cultivar TNG 66 TNG 71 -LN +LN -LN +LN 10.0 0 13.3 3.3 6.7 3.3 3.3 0 3.3 0 6.7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. TNG 73 -LN +LN 3.3 0 0 0 0 0 6.7 0 0 0 0 0. Recovery medium: Full strength MS basal medium with 1.0 μM NAA, 0.5 μM BA 0.1 μM Kinetin, 30 g L-1 sucrose and 9.0 g L-1 Difco agar. Data was collected after 30days of culture. Shoot tips pre-cultured on full strength MS basal medium with 0.3 M sucrose and 9.0 g L-1 Difco agar, then loaded with different times of LS for 30 min without (-LN) / with (+LN) immersion into liquid nitrogen. Approximately 10 shoot tips were tested for each of three replicates.. Table 8. The result table of Factorial Experiment by Kruskal-Wallis Method (Shen 1997) for effects of PVS2 with different times of LS treatment on the plant regeneration rates of shoot tips of Ipomoea batatas (L.) Lam. cultivars Tainung Nos. 57, 66, 71 and 73 without cryopreservation. Source Variety Time Variety x Time. DF 3 6 18. Sum of square 1036.33 2020.17 2128.17. Chi-square statistic 2.37 4.61 4.86. P-Value 0.500 0.594 0.999.
(9) 甘藷莖頂組織超低溫冷凍保存. 217. Fig. 3. Plant regeneration of sweet potato cultivars after cryopreservation by aluminum cryo-plates. A. Tainung No. 66 shoot tip after cryopreservation for 45 days; B. Tainung No. 71 shoot tip after cryopreservation for 45 days.. 玻 璃 質 化 法 及 PVS2 溶 液 保 存 甘 藷 莖 頂 組 織，4 個不同品種皆有 3.3%之植株之再生。 由此可知，超低溫冷凍保存中，LS 溶液及 PVS2 溶液處理對於植株存活率的重要性。此 外，除以 PVS2 溶液進行植物組織超低溫冷 凍保存技術外，亦可使用 PVS3 溶液處理椰 子 及 芒 果 等 (Sajini et al. 2011, Wu et al. 2003)。本研究以 PVS3 溶液代替 PVS2 溶液， 可使臺農 66 號及臺農 71 號莖頂組織，經液 態氮保存後亦有 3.3%之植株再生，顯示 PVS3 溶液處理亦可使甘藷莖頂組織經液態氮保存 後不致死亡。綜合以上結果可知，4 個甘藷品 種 以 PVS2 溶 液 處 理 皆 有 植 株 再 生 ， 而 以 PVS3 溶液處理僅臺農 66 號及 71 號有植株再 生，因此 PVS2 溶液較 PVS3 溶液適合作為甘 藷超低溫冷凍保存技術的冷凍保護劑。類似 的結果如 Garcia et al. (2011)，其研究指出三 角葉西番蓮以 PVS2 溶液處理經液態氮保存 後之植株再生率高於 PVS3 溶液處理；而康 乃馨處理 PVS2 溶液或 PVS3 溶液且經液態氮 保存後，其植株再生率則無明顯的差異 (Sekizawa et al. 2011)，故不同物種對不同種 類之抗凍劑的適用性不同。本研究認為植株 再生率低的原因，可能為甘藷本身屬於熱帶 物種，較不耐低溫處理。此外，切取甘藷莖 頂組織進行超低溫冷凍處理過程中，莖頂組. 織嚴重受損，導致癒合組織形成及植株再生 率偏低，且未經 LS 溶液、PVS2 溶液或 PVS3 溶液處理及液態氮保存的莖頂組織仍有癒合 組織的形成，顯示回復生長培養基中植物生 長調節劑的種類及濃度，可能較不適合甘藷 臺農 57 號、66 號、71 號及 73 號莖頂組織的 再生。回復生長培養基成分的重要性，如康 乃馨於含 0.1 mg L-1 IAA 培養基，可有效促 進根系的分化，進而再形成完整植株 (Halmagyi and Deliu 2007)。甘藷於含 2.2 μM BA 及 0.49 μM Indole-3-butyric acid (IBA) 且不含 NH4NO3 的 MS 基本培養基，有最佳 之植株再生率(Pennycooke and Towill 2001)。 Hirai and Sakai (2003)指出含 0.5 mg L-1 BA 或 1.0 mg L-1 Gibberellin (GA)的 MS 基本鹽類 培養基，進行 2 階段式的回復生長培養，其 植株再生率可達 80%，但以臺農 66 號進行 相同處理流程，則無任何植株再生(data not shown)。由此可知，回復生長培養基成分不 僅須依不同物種進行調整，也必須依不同品 種加以改良。 選擇不同的超低溫冷凍保存處理流程， 使 LS 溶液及 PVS2 溶液最適當的處理時間亦 有差異，如臺農 66 號及臺農 71 號莖頂組織 以藻膠包埋玻璃質化法經液態氮保存後，最 適當處理時間為 LS 溶液處理 300 min 及.
(10) 218. Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 9, December 2012. PVS2 處理 60 min，有植株再生的情形。若 以冷凍鋁片法進行液態氮保存處理，以 LS 溶 液處理 30 min 及 PVS2 處理 15–30 min，亦 有植株再生，故最佳處理時間及最佳植物組 織存活率會因處理流程不同而有所影響。 Matsumoto et al. (1998)亦指出星辰花莖頂組 織以玻璃質化法進行超低溫冷凍保存，其最 適當之處理時間為 LS 溶液 30 min 及 PVS2 溶液 15 min 有最高之存活率，而以藻膠包埋 玻璃質化法進行超低溫冷凍保存，其最適當 之處理時間為 LS 溶液 30 min 及 PVS2 溶液 50 min 有最高之存活率，故 LS 溶液及 PVS2 溶液最佳處理時間需因不同超低溫冷凍保存 的方法而有所調整。因此，進一步探討液態 氮保存前之處理流程，以提升甘藷組織的抗 凍性，並於超低溫冷凍保存過程中盡可能降 低機械性傷害，以及調整回復生長培養基之 植物生長調節劑的種類及濃度，應可提升甘 藷莖頂組織之植株再生率。 藻膠包埋玻璃質化法及冷凍鋁片法操作 流程所需的時間、藥品量、植株再生率之比 較顯示，藻膠包玻璃質化法進行全部流程需 48 h，藥品量為 277 mL，而冷凍鋁片法僅需 26.5 h，藥品量為 83.5 mL。因此冷凍鋁片法 較藻膠包埋玻璃質化法節省 45%的時間及減 少 70%的藥品量；因冷凍鋁片法包埋於莖頂 組織外的藻膠量少於藻膠包埋玻璃質化法， 故 LS 溶液及 PVS2 溶液能更快速的產生作 用，因此可減少處理時間及藥品量。然而植 株再生率方面，藻膠包埋玻璃質化較法冷凍 鋁片法使較多的品種有再生植株的產生，但 冷凍鋁片法較藻膠包埋玻璃質操作上更簡 便、快速，並且可應用於多種物種之莖頂組 織(Sekizawa et al. 2011, Yamamoto et al. 2011)，故冷凍鋁片法具有發展潛力。 本研究結果顯示甘藷可藉由超低溫冷凍 保存技術保存種原，以藻膠包埋玻璃質化法 或冷凍鋁片法皆可獲得再生植株，其中以冷 凍鋁片法為最新的超低溫冷凍保存法，且操 作上更加簡單快速，故極具發展潛力。. 誌謝 本研究承行政院農業委員會科技計畫經 費支援(100 農科-8.1.1.1-農-C1)，並承農業試 驗所呂助理研究員椿棠、楊助理研究員滿霞 及農業試驗所嘉義分所廖助理研究員大經協 助資料分析，謹此一併誌謝。. 引用文獻 Benson EE (2008) Cryopreservation Theory. p.26-28. In: Plant Cryopreservation: A practical guide. BM Reed (ed.) Springer, New York. Burritt DJ (2008) Efficient cryopreservation of adventitious shoots of Begonia x erythrophylla using encapsulation–dehydration requires pretreatment with both ABA and proline. Plant Cell Tiss. Organ. Cult. 95:209–215. Garcia RO, G Pacheco, MG Vianna, E Mansur (2011) In vitro conservation of Passiflora suberosa L.: slow growth and cryopreservation. Cryoletters 32:377–388. Halmagyi A, C Deliu (2007) Cryopreservation of carnation (Dianthus caryophyllus L.) shoot tips by encapsulation–vitrification. Sci. Hort. 113: 300–306. Hirai D, A Sakai (2003) Simplified cryopreservation of sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.] by optimizing conditions for osmoprotection. Plant Cell Rep. 21:961–966. Lai YC, YX Cheng (2006) A variety of sweet potato varieties and processed products. (in Chinese) Agric. Exp. Tech. Serv. 68:35. Matsumoto T, C Takahashi, A Sakai, Y Nako (1998) Cryopreservation of in vitro-grown apical meristems of hybrid statice by three different procedures. Sci. Hort. 76:105–114. Matsumoto T, A Sakai, C Takahashi, K Yamada (1995) Cryopreservation of in vitro-grown apical meristems of wasabi (Wasabia japonica) by encapsulation–vitrification method. Cryoletters 16:189–196. Murashige T, F Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15:473–497. Nishizawa S, A Sakai, Y Amano, T Matsuzawa.
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