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無機砷對乳腺腫瘤細胞增生及其動情素受體表現量的影響

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無機砷對乳腺腫瘤細胞增生及其動情素受體表現量的影響

許玉青 莊仁華 王昱捷 黃慧滇 童麗珠

* 國立台灣師範大學生命科學系 (收稿日期:2005.11.30,接受日期:2006.6.26) 摘 要 無機砷是一種環境中常見的污染物及人類的致癌物質。近年來,有報導認為無機砷是藉由動情素 的模式引起生理變化。本研究目的是在證明亞砷酸鈉(sodium arsenite, 三價砷,As(3))及砷酸鈉 (sodium arsenate, 五價砷,As(5))是否具有干擾動情素對 MCF-7 人類乳腺腺腫瘤細胞的作用。由細

胞增生實驗結果顯示:當藥物處理濃度小於1 µM As(3)或小於 10 µM As(5)時,可促進細胞增生;

高於此二濃度的處理則抑制細胞增生。低劑量的0.1~1 µ M As(3)或 1~10 µM As(5) /24 小時處理,

在6 天的觀察中,細胞有持續增生的趨勢。外加 500 nM 動情素拮抗劑(ICI182,780)協同處理時,可

將單獨處理 As(3)、As(5)及 17 β-estradiol (雌二醇,E2)所誘發的細胞增生抑制。以西方轉法漬法 (Western blotting)分析動情素受體 α (estrogen receptor α, ER α)蛋白質的表現量,發現低劑量的 0.1~1 µM As(3)及 1~40 µM As(5)處理均會使細胞的 ER α 蛋白質的表現量下降。細胞以 ER α 抗體免疫螢 光染色,可發現0.5 µM As(3)及 1nM E2 處理組的細胞整體 ER α 亮度較控制組弱;單一細胞的 ER α 螢光呈現擴散狀分布,E2 與控制組二者細胞核與細胞質都有 ER α 分布,然而在 As(3)處理組,ERα 主要分部於細胞質中,在細胞核則無。在進行As(3)與動情素競爭結合動情素受體之實驗,發現 0.1、 0.5、1 µ M As(3)與 ER α 的結合比為 28%、35%、48%,顯示 As(3)能與動情素受體結合,且呈劑 量效應。上述實驗結果得知低劑量的As(3)及 As(5)處理 MCF-7 細胞會造成細胞增生、降低 ER α 的表現及能與ER α 結合,顯示無機砷可能透過動情素的模式引起細胞生理作用。 關鍵詞:無機砷、乳腺腫瘤細胞、增生、動情素受體表現量

緒 言

砷 是 最 早 被 視 為 具 致 癌 性 的 金 屬 物 質 之 一,砷化物原本廣泛存在於地殼礦脈中,經地下 水滲出、工業廢水的排放、含砷農藥及殺蟲劑的 使 用 , 使 砷 化 物 成 為 環 境 中 常 見 的 污 染 物 (Ishinishi et al., 1983;Chen et al., 1985; 1992)。無 機砷化物不僅為人類的致癌物質,且可誘發許多 細胞毒性及遺傳毒性,包括:細胞週期延遲、細 胞骨架變形、抑制酵素活性、氧化性傷害、染色 體變異等等(Yamanaka et al., 1989;Lee et al., 1989;Ochi et al., 1998)。根據流行病學研究顯 示,慢性曝露砷化物,與許多疾病的發生有相當 密切的關聯性,特別是膀胱癌、腎臟腫瘤、肺癌、 肝臟腫瘤、皮膚癌等疾病的發生都有統計上的正 相關性(Chen et al., 1992;Guo et al., 1997;1998; Smith et al., 1998)。除了上述癌症以外,砷中毒 亦和許多疾病相關,例如烏腳病、皮膚色素改 變、手、腳掌過度角化、神經病變、肝硬化等(Chen et al., 1985)。然砷化物的毒性一直是備受爭議 的,主因是科學家目前仍沒有辦法在動物實驗 中,成功的證實長期砷暴露能夠誘導這些疾病的 發生(Goering et al., 1999)。 動 情 素(estrogen) 是 一 種 類 固 醇 荷 爾 蒙 , 17β-estradiol (雌二醇,E2)主要由卵巢製造,動情 素進入細胞後,會與專一的動情素受體結合。動 情素受體為一種轉錄因子(transcription factor),當 其與動情素結合而活化時,能影響多種有關調控 細胞週期與細胞分裂及分化的基因表現,如細胞 經E2 處理後,cyclin D1(細胞週期素 D1)的表現 顯著增加,而 cyclin D1 大量表現會促使細胞由 G0進入 G1期,進而完成細胞週期,引起細胞增

(Prall et al., 1997)。動情素受體 α (estrogen receptor, ER α) 在乳腺及女性生殖道的發育及分 化上是一種重要的調節因子,通常也牽涉到此處 惡性腫瘤的發展(Stoica et al., 1997;2000b)。所以 動情素受體能作為正常乳腺細胞和癌細胞的病

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制尚未研究清楚。 近年來,少數的報導認為無機砷具有類似環 境荷爾蒙的作用,根據報告指出,將雌/雄小鼠持 續 反 覆 暴 露 於 低 劑 量 的 無 機 砷 酸(arsenate, As(5),五價砷),僅在雌鼠體內發現皮膚、腎臟 及肝臟增生性傷害(proliferative lesions);同時, 雌鼠也明顯地子宮內膜較易產生囊狀增殖(cystic hyperplasia) , 且 在 增 生 上 皮 細 胞 (hyperplastic epithelium) 中 動 情 素 受 體 、 增 殖 細 胞 核 抗 原 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA)及 cyclin D1 的 表 現 都 有 增 強 的 現 象 (Waalkes et al., 2000);低劑量的亞砷酸(arsenite, As(3)三價砷)處 理可明顯誘發MCF-7 細胞增生,降低 ER α 的表 現量,以及干擾受體與動情素的結合(Stoica et al., 2000a);而低劑量的三氧化二砷(arsenic trioxide) 處理MCF-7 及 T47D 等人類乳腺腫瘤細胞證明會 顯著的、專一性的抑制ER α 的表現及其訊息傳 遞的路徑(Chen et al., 2002)。顯示砷化物能藉由 干擾動情素的模式引起生理作用。然而,亦有報 導指出,無機砷並不會直接干擾動情素與動情素 受體的結合(Lopez et al., 1990)。 本研究目的是以 As(3)、As(5)與 E2 處理 MCF-7 細胞,測量細胞存活率;利用西方免疫轉 漬法(Western immunoblot analysis)、免疫螢光染 色來偵測細胞的動情素受體的表現量;與動情素 受體之結合競爭測定,來了解此二種無機砷對人 類乳癌細胞所誘發的細胞反應與動情素受體之 相關性。

材料與方法

藥品 細 胞 培 養 的 藥 品 購 自 GIBCO ; E2 購 自

CALBIOCHEM Co.;亞砷酸鈉(sodium arsenite, As(3)) 、 砷 酸 鈉 (sodium arsenate, As(5)) 、 ﹝2,4-3H ﹞ 17β- 雌 二 醇 (17β-estradiol, E2) 購 自

Sigma Chemical Co.;動情素拮抗物 ICI 182,780 (7α,17β-[9 [(4,4,5,5,5-pentafluoropentyl) sulfinyl] nonyl] estra-1,3,5 (10))-triene-3,17-diol) 購 自 TOCRIS;一級抗體購自 ABR。

細胞培養

人類乳腺腺腫瘤細胞 MCF-7 細胞購自食品

工 業 發 展 研 究 所 菌 種 中 心 , 細 胞 株 來 源 是 American Type Culture Collection,其繼代數為 87 。 細 胞 培 養 於 DMEM 培 養 液 (Dulbecco’s

modified Eagle’s medium) 並添加 5% 胎牛血清 (fetal calf serum, FCS) 、 100 units/ml 青 黴 素 (penicillin)、100µg/ml 鏈黴素(streptomycin)、0.37% 碳酸氫鈉(sodium bicarbonate) 及 0.03% L-麩醯胺 酸 (L-glutamine),置於含 5% CO2之37℃飽和濕 度培養箱中培養。 藥物處理 MCF-7 細胞先繼代培養 24 小時,更換為不 含血清的培養液培養24 小時後,分別單獨處理 1 nM E2 及適當濃度的砷化物或協同處理 500nM ICI 182,780 /24 或 48 小時,以不含血清的培養液 浸潤兩次,去除殘留藥物後,再更換為含 5%木

炭 吸 附 的 胎 牛 血 清(charcoal-stripped fetal calf serum, CSFCS,除去固醇類激素的血清)之培養液 分別培養至指定時間偵測。 細胞存活率分析 主要是根據Gerlier 及 Thomasset (1986)之四 甲基偶氮唑藍(3- (4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide, MTT)方法測定,利 用 活 細 胞 粒 線 體 中 之 琥 珀 酸 去 氫 酶(succinic dehydrogenase)與 MTT 反應,形成 MTT- formazan 結 晶 , 再 用 二 甲 基 磺 酸 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO)將結晶溶解,測得 OD570 之吸光值會與細 胞數目及酵素活性呈正相關。實驗是先將 5x105 個細胞以0.5 ml 培養液,種植於 24 孔培養盤, 第 2 天換上不含血清的培養基培養 24 小時後, 分別處理各種濃度的砷化物及1nM E2/24 小時, 更換為含5% CSFCS 培養液分別培養數天後,加 入 20µl MTT 溶液(5mg/ml in phosphate buffer saline, PBS),培養 3 小時,移去溶液,以 PBS 溶 液清洗一次,加入0.5 ml DMSO 將結晶溶解,最 後將每個孔吸取100µl 到 96 孔盤中,利用 ELISA reader 測量 OD570 之吸光值。 ER α 蛋白質表現量之偵測 以西方免疫轉漬法分析。藥物處理的細胞經 清洗、刮下、離心、以溶解緩衝液 (lysis buffer) 溶 解得蛋白質萃取液,利用Bradford 方法,以 OD595 進行蛋白質定量。取含50µg 總蛋白質之萃取液, 以 8% SDS- 聚 丙 醯 胺 膠 電 泳 (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳。將膠體中的蛋白轉漬到聚偏二 氟乙烯 (Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜、以 3% BSA (bovine serum albumin) blocking 1 小時、

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PBST 漂洗後,加入一級抗體抗-ER α 及二級抗體 (alkaline phosphatases, 鹼性磷酸酶)反應;以呈色 劑(0.2 mg/ml bromochloroindolyl phosphate, 0.4 mg/ml nitro blue tetrazolium)於黑暗中呈色,呈色

結果以定量分析儀Alpha Imager TM 2000 進行定

量分析。

細胞免疫螢光染色

細胞經藥物處理、PBS 清洗、3%三聚甲醛 /PBS(paraformaldehyde/PBS)固定 30 min、0.1% Triton X-100/PBS 浸泡 3min 穿孔、脫脂奶粉(Skim milk) blocking 後,加入一級抗體 anti-estrogen receptor α antibody (rabbit IgG) 及 二 級 抗 體 (anti-rabbit IgG-FITC) 反 應 後 , 滴 加 包 埋 劑 (H-100 VECTOR),並以指甲油封片。以螢光顯微 鏡(Leitz LABOR LUX S)觀察並拍照。

細胞動情素受體結合競爭測定 沿用Arcaro (1999)等人之方法。將 5x105 個 MCF-7 細胞以 0.5 ml 培養於 24 孔培養盤。以 1nM﹝2,4-3H﹞E2 與各種濃度的砷化物,或與 10nM、200nM E2 共同處理細胞 3 小時後,以 PBS 清洗 3 次,去除未與雌激素受體結合之﹝3H﹞ E2。再以 0.3ml 之 100% 乙醇處理 20 分鐘,來 溶出結合於雌激素受體之﹝3H﹞E2,取 0.2ml 溶 解液加入2ml 液體閃爍計數液,以液體閃爍計數 器(Beckman, LS 1801)偵測。所有處理測得之 cpm 值稱為全部結合,須以處理200nM E2 測得之 cpm 值(為非專一性結合)進行校正。以﹝3H﹞E2 與 0.1 % DMSO 處理組當做對照組,其 cpm 值為 1 計 算。藉計數器偵測由細胞ER 置換出﹝3H﹞E2 的 比率,來計算與動情素受體結合的比率。 統計分析 細胞經不同藥物處理後,細胞的存活率、ER α 蛋白質的表現量及細胞動情素受體結合競爭的 影響以單因子變異數分析法 (one-way ANOVA) 評估差異之顯著性(Zar, 1999)。

結 果

亞砷酸鈉與砷酸鈉對 MCF-7 細胞毒性測定 因為高濃度砷化物具有細胞毒性,須篩檢出 不對細胞具有毒性的濃度,以便進行後續實驗。 MCF-7細胞經不同劑量的0~10 µM As(3)及0~100 µM As(5) /24小時處理,結果如表一顯示,0.1 µM 表一、亞砷酸鈉與砷酸鈉對MCF-7 細胞的細胞毒性。 以MTT 的方法檢測其細胞存活率。

Table 1. Cytotoxicity of arsenite and arsenate in MCF-

7cells. After treatment with various sodium arsenite and arsenate for 24h, cells were incubated in medium with 5% charcoal-stripped fetal calf serum and without drugs for 24h. The cell viability was detected with MTT test assay (means ± SD).

Arsenite

(µM) Cell viability (%) Arsenate (µM) Cell viability (%)

0 100±0 0 100±0 0.1 98±8 1 108±9 1 103±15 10 92±17 5 60±7 50 78±11 10 20±4 100 65±12 及1 µM As(3)處理對細胞存活率並無影響,表示 對細胞沒有毒性,但處理5 µM時,存活率下降至 60±7%,10µM時,存活率只剩20±4%,細胞形態 也嚴重變形,顯示濃度大於5 µM As(3)的處理有 細胞毒性。而As(5)處理也有類似的結果,在1~10 µM的濃度範圍處理無明顯細胞毒性,處理濃度升 至50 µM,存活率降至78±11%;至100 µM存活率 只有65±12%。As(3)與As(5)對MCF-7細胞的細胞 毒性有相似的劑量反應,只是As(3)的毒性比As(5) 大約10~20倍。 亞砷酸鈉與砷酸鈉對 MCF-7 細胞增殖率的影響 根據表一結果,以對MCF-7 細胞較不具有 毒性的濃度0.1~5µM As(3)及 1~40µM As(5)進行 細胞增殖率實驗。MCF-7 細胞是以藥物處理 24 小時,去除藥物再培養 48 小時後,測量細胞增 殖率。 如圖一 a 所示,與控制組做比較,0.1~1µM As(3)處理,細胞增殖有增加的趨勢,0.1、0.2、 0.5µM 處 理 分 別 為 對 照 組 1.20±0.041 、 1.15±0.06、1.07±0.06 倍,且細胞增殖率的增加均 達顯著差異(p<0.05, t test);2、5µM As(3)處理則 會導致細胞增殖率減少,細胞數量分別對照為組 的 0.88±0.07、0.56±0.04 倍;1、2µM As(3)處理 細胞增殖並無顯著的差異,但5µM As(3)處理則 細胞增殖率降低達顯著的差異(p<0.05, t test),有 明顯的毒理效應。 砷酸鈉As(5)處理的 MCF-7 細胞也有類似的 劑量效益。如圖1b 所示,1、5、10 µM As(5)處 理的細胞有增殖率的增加趨勢,分別為對照組 1.25±0.07、1.10 ±0.1、1.06±0.05,1、5 µM As(5) 處理的細胞增殖增加達顯著的差異(p<0.05);

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圖一、亞砷酸鈉與砷酸鈉處理對 MCF-7 細胞增殖的影 響。細胞分別處理亞砷酸鈉 As(3) (a)與砷酸鈉 As(5) (b)24 小時,去除藥物再培養於含 5% CSFCS 培養液中 48 小時後,以 MTT 法測 OD570 值來計算細胞的增殖

率(平均± SD)(n = 10); * 表示處理組與控制組比較 的顯著性差異 p<0.05( t test)。As(3): 三價亞砷酸鈉; As(5): 五價砷酸鈉。

Figure 1. Effects of arsenite and arsenate on the growth

of MCF-7cells. After treatment with various sodium arsenite As(3) (a) and arsenate As(5) (b) for 24h, cells were incubated in DMEM medium with 5% charcoal-stripped fetal calf serum and without drugs for 48h. The cell viability detected with MTT test assay was described as a value of OD570 in observed samples

(means ± SD). (n = 10; *: p<0.05). As(3): sodium arsenite; As(5): sodium arsenate.

10 µM As(5)處理細胞增殖則無顯著的差異;20、 40 µM As(5)處理則導致細胞增殖率減少,分別為 對照為組的 0.96±0.08、0.82±0.6,細胞增殖率減 少無顯著的差異。 由上述結果可見在某較低濃度範圍的無機 砷處理,有促使細胞增生的趨勢,濃度增加反而 會抑制細胞增生。故後續實驗就採用對細胞增生 效果較明顯 0.1~1µM As(3)及 1~10 µM As(5)/24 小時來處理細胞,並以 1nM E2/24 小時處理當正 控制組。如圖二所示細胞藥物處理後,再持續培 養 6 天的細胞增殖情形,顯示培養在含 CSFCS 培養液(缺乏 steroid 荷爾蒙)的控制組中,細胞停 止生長,亦不會死亡;加入 1 nM E2 培養,則細 胞會持續生長,在第六天的生長率為控制組的 2.42±0.09 倍;可見只要微量的動情素(1nM),就 能讓 MCF-7 細胞分裂,0.1、0.5µM As(3)或 0.1、 圖二、亞砷酸鈉與砷酸鈉處理對 MCF-7 細胞長時間的 增殖影響。細胞處理 1nM E2、0.1~1 µM As(3)(a)及 1~10 µM As(5)(b)24 小時後,去除藥物並培養於 5% CSFCS 培養液中,以 MTT 法測 OD570 值來計算細胞 在持續六天的增殖率(平均± SD)(n=10)。As(3): 三價亞 砷酸鈉;As(5): 五價砷酸鈉。

Figure 2. Time course effects of arsenite and arsenate on

the growth of MCF-7cells. After treatment with various sodium arsenite (a) and arsenate (b) for 24h, cells were incubated in medium with charcoal- stripped fetal calf serum and without drugs. The cell viability detected with MTT test assay was described as a value of OD570 in

observed samples during consecutive 6 days (means ± SD). (n = 10). As(3): sodium arsenite; As(5): sodium arsenate. 1、5、10µM As(5)處理的細胞在培養第二天至第 六天細胞總數均持續增加,但生長速度比不上 1 nM E2 處理組。此結果顯示在低劑量的 0.1~0.5 µM As(3)或 1~10 µM As(5)可刺激 MCF-7 細胞生 長達顯著差異(p<0.05);1 µM As(3)處理的細胞增 生就不明顯了。 E2 拮抗劑對 MCF-7 細胞生長的影響 ICI 182,780 是 E2 拮抗劑。0.5 µM As(3)及 1nM E2 /24 小時處理均能增生,分別為對照組 1.20±0.04、1.36±0.09 倍(圖三 a),與控制組比較 均有極顯著差異(p<0.001);10µMAs(5)及 1nM E2 處 理 , 細 胞 生 長 分 別 為 對 照 組 1.19±0.05 、 1.68±0.07 倍(圖三 b),與控制組比較均有極顯著 差異(p<0.001)。二者加入 500nM ICI 協同處理, 控制組的細胞量維持不變,顯示在正常狀況下

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圖三、亞砷酸和砷酸對MCF-7 細胞增殖的動情素性作 用。MCF-7 細胞單獨處理含 0.5 µM As(3)(a)、10 µM As(5)(b)或 1nM E2 及協同處理 500nM ICI 128,780/24 小時後,去除藥物,再培養於5% CSFCS 培養液 3 天, 以MTT 法測 OD570 值來計算細胞的增殖率(平均± SD) (n =5),c:控制組;As(3): 三價亞砷酸鈉;As(5): 五 價砷酸鈉。顯著性差異比較代號是:a: 控制組與處理 組比較 p<0.001;b: As 組與 As+ICI 組比較 p<0.001; c: E2 組與 E2+ICI 組比較 p<0.001。

Figure 3. Estrogenic effects of arsenite and arsenate on

the growth of MCF-7cells. After treatment with 0.5 µM sodium arsenite (a), 10 µM sodium arsenate (b) or 1nM E2 in the presence or absence of 500 nM of the antiestrogen ICI 128,780 for 24h, cells were incubated in DMEM medium with 5% charcoal-stripped fetal calf serum and without drugs for 3 day. The cell viability detected with MTT test assay was described as a value of OD570 in observed samples (means ± SD). (n = 5). As(3):

sodium arsenite; As(5): sodium arsenate. Significantly different test, a: Drug-treated groups are significantly different from the control (p<0.001); b: As-treated group is significantly different from As and ICI-cotreated group (p<0.001); c: E2-treated group is significantly different from E2 and ICI- cotreated group (p<0.001).

ICI 並不會對細胞生長造成影響,但在 ICI 與 As(3)、As(5)、E2 協同處理後,發現其單獨處理 所誘發的細胞增生都被抑制,細胞數均沒有比控 制組增加(p>0.05)。將 500nM ICI 協同處理組和 砷化物或 E2 單獨處理組比較,發現細胞增生均 有極顯著的被ICI 抑制(p<0.001) (圖三)。 砷化物對MCF-7 細胞 ER α 蛋白表現量的影響 將MCF-7 細胞分別處理不同濃度的 As(3)、 圖四、亞砷酸鈉(a)與砷酸鈉(b)對 MCF-7 細胞 ERα 蛋 白質表現量的影響。上圖為細胞經不同濃度 As(3)或

As(5)及 1nM E2/48 小時處理後,西方免疫轉漬出 ERα 及β-actin 顯影圖。ERα 分子量是 60,β-actin 分子量 是43。下圖為 ER α 蛋白質表現量變化圖。由 Imager 顯影定量(平均± SD; n = 4)。*表示處理組與控制組 比較的顯著性差異 p<0.05( t test)。c:控制組;As(3): 三價亞砷酸鈉;As(5): 五價砷酸鈉。

Figure 4. Effects of arsenite (a) and arsenate (b) on the

ER α expression of MCF-7 cells. After exposed to various concentration sodium arsenite, arsenate and 1nM E2 for 48 h, ER α protein was determined using Western blotting as described in Materials and Methods (mean ± SD; * :p < 0.05). c: control group ; As(3): sodium arsenite; As(5): sodium arsenate.

As(5)及 1 nM E2 /48 小時後,抽取細胞蛋白質, 進行西方免疫轉漬。由圖四發現,細胞在處理 E2、As(3)及 As(5)後,動情素受器 ER α 蛋白質 的表現量都被抑制。 處理0.1、0.5、1 µMAs(3)及 1nM E2 / 48 小 時,會使MCF-7 細胞 ER α 蛋白質的表現量依序 降為控制組的 0.85±0.3、0.4±0.2、0.33±0.25、 0.55±0.1。處理 0.5、1 µM 及 1 nM E2,ER α 蛋 白質表現量下降,其與控制組比較達顯著的差異 (p<0.05, t test);0.1 µM As(3)處理,ERα 蛋白質 的表現下降量則未達顯著的差異(圖四 a)。E2 處 理組和As(3)處理組二者之 ER α 蛋白質表現量則 無顯著性差異(p>0.05)。 處理1、5、10、20、40 µM As(5)及 1nM E2/48 小時,MCF-7 細胞 ER α 蛋白質的表現量依序降

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圖五、亞砷酸鈉處理MCF-7 細胞 ER α 蛋白質免疫螢 光染色圖。控制組(a 和 d)、1 nM E2(b 和 e)、0.5 µM As(3) (c 和 f)處理 48 小時,細胞經一級抗體抗 ER α 蛋白質及二級抗體(FITC-conjugated)的免疫螢光染色 圖。(a)、(b)和(c)為 100X;(d)、(e)和(f)為 400X。箭 所指為呈現ER α 螢光的單一 MCF-7 細胞。

Figure 5. Immunolocalization of ER α in MCF-7 cells.

Immunolocalization of ERα in control (a and d), 1 nM E2-treated (b and e) and 0.5µM sodium arsenite-treated MCF-7 cells (c and f). After drugs treated for 48h, cells were incubated with the anti-ER α primary antibody and labeled by second antibody-conjugated FITC. (a), (b) and (c) are 100X; (d), (e) and (f) are 400X。Arrow indicated the single MCF-7 cell with anti-ER α labeled.

為控制組的 0.50±0.25、0.40±0.18、0.55±0.13、 0.60±0.26、0.60±0.18 及 0.50±0.10。1、5、10µM As(5)及 1nM E2 處理,會使 ER α 蛋白質的表現 量 顯 著 下 降 , 其 與 控 制 組 比 較 達 顯 著 的 差 異 (p<0.05);20、40µMAs(5)處理 ERα 蛋白質的表 現下降量則無顯著差異(圖四 b)。相同的,E2 處 理組和As(5)處理組二者之 ER α 蛋白質表現量也 無顯著性差異(p>0.05)。 將處理1 µM As(3)、1 nM E2/48 小時之細胞 進行 ER α 免疫螢光染色。由 100 倍的圖五 a~c 可發現,控制組整體的ER α 螢光亮度呈現較處 理E2 及 As(3)組亮,也顯示 As(3)與 E2 處理可使 細胞ER α 表現量降低。觀察單一細胞,控制組 細胞除在細胞核周圍沒呈色外,ER α 的螢光呈 diffusion 狀分佈於細胞質與細胞核(圖五 d);E2 處理組細胞質與細胞核呈現 ER α 的螢光較少,

細胞核有ERα 螢光聚集的亮點(圖五 e);而 As(3)

處理組細胞質ER α 也呈現 diffusion 狀,螢光亮 度較少,值得注意的是,細胞核並無螢光 ER α 呈現(圖五 f) 。 亞砷酸鈉與動情素競爭結合動情素受體之作用 砷化物會影響 ER α 表現,是否會模擬動情 素,與動情素受體結合,進而影響後續的轉錄。 以MCF-7 細胞進行砷化物與 E2 競爭與動情素受 體結合能力之實驗。細胞經 3 小時的 1 nM ﹝3H﹞E2,與 200 nM E2 協同處理,有 0.06%的 ﹝3H﹞被置換,此數值認為是非專一性結合,當 做實驗的校正值。如與10 nM E2 協同處理,有 38%的﹝3H﹞被置換而測得,即 10 nM E2 與動情 素受體結合的比率為62%;與 0.1、0.5、1 µM As(3) 協同處理,分別有 72%、65%、52%的﹝3H﹞被 測得(圖六),即與動情素受體結合的比率分別為 28%、35%、48%。由此結果發現,As(3)處理與 E2 的競爭動情素受體結合比率具有劑量效應關 係,As(3)的濃度越高,與動情素受體結合之能力 越強。 圖六、亞砷酸鈉與動情素競爭結合動情素受體之作 用。細胞經1nM﹝3H﹞E2 與 0.1、0.5、1 µΜ As(3)共 同處理3 小時,清洗後,以乙醇溶出與雌激素受體結 合之﹝3H﹞E2,用液體閃爍計數器計數。以處理 0.1 % DMSO 當做對照組,來計算﹝3H﹞E2 由 ER 置換出來 的比率。As(3): 三價亞砷酸鈉。

Figure 6. Effect of arsenite concentration on estradiol

binding to ER α. Displacement of [H3]E2 by arsenite in

MCF-7 whole-cell estrogen receptor binding assay. MCF-7 cells were treated with 1nM [2,3-H3] E2 and

arsenite for 3h. Radioactivity of [H3] E2 in alcohol

soluble extract was determined. The amount of specific binding of [H3] E2 was determined as described in

(7)

討 論

三價的As(3)對 MCF-7 細胞生長的影響,有

兩種相反作用的報導,低劑量的處理會促使細胞 增生,其機制可能是能促進生長因子(如:EGF、 TGF-α)、熱休克蛋白(heat shock proteins)(如: Hsp90)、動情素受體(estrogen receptor)等的表現 量或活性(Lee et al., 1988; Trouba et al., 2000);反 之,高劑量處理則是抑制細胞生長,可能引起 DNA 的氧化性傷害、雙股斷裂(double strand break)、形成微核(micronuclei)與抑制 DNA 傷害 的修補、引起細胞凋亡(apoptosis)等(Yamanaka et al., 1989; Lynn et al., 1998; Liu et al., 2003)。

本研究以 As(3)及 As(5)處理 MCF-7 細胞也 有相同的反應,低劑量0.1~1µM As(3)/24 小時處 理 , 細 胞 的 增 殖 率 增 加 ; 而 高 劑 量 2~10µM As(3)/24 小時處理下則可有效的導致細胞死亡。 細胞增殖與抑制的轉折點是在1µM As(3)/24 小時 的處理,此結果與Chen 等(2002)以 1µM As2O3/24 小時處理 MCF-7 細胞沒有增加增殖率的現象是 一致的。但卻與 Stoica 等(2000a)的報導,相同 As(3)/24 小時處理 MCF-7 細胞有大量增生現象不 同,這可能是細胞培養的條件不同(胎牛血清及細 胞密度)所致。在本研究中,相同的現象也發生在 As(5)處理的細胞,0.5~1µM /24 小時處理對細胞 增生的效果最顯著,10~40µM /24 小時處理則沒 有顯著影響細胞增生。而 50µM /24 小時處理卻 有顯著抑制細胞增生。以本研究 MCF-7 細胞而 言,三價砷的毒性大約為五價砷的10~20 倍。 砷化物毒性由大至小依序為亞砷酸(arsenite, 正三價) > arsenic trioxide (正三價) > 砷酸鹽 (arsenate, 正五價) > 五價有機化合物 > 金屬 砷,無機砷較有機砷毒性大。在無機砷中,目前 知道五價砷含量最高,三價砷的毒性最大(Hughes, 2002),所以在毒物與生物學方面的研究都偏重在 三價無機砷相關機制的探討。由本實驗結果發 現,As(3)與As(5)對細胞的毒理有類似的效應, 高劑量的處理會造成細胞毒理性的傷害,導致細 胞死亡,毒性較強的三價砷,劑量較低就能造成 細胞死亡,五價砷需要高濃度處理才會達到與三 價砷一樣的效果。As(3)與As(5)的暴露都可以引 發 神 經 細 胞 的 促 進 細 胞 分 裂 的 蛋 白 激 酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) ( 如 JNK3 與 p38 蛋 白 質 ) 活 化 (Namgung and Xia, 2000;2001),只是三價無機砷JNK磷酸化現象會 較五價無機砷明顯,顯示五價或是三價無機砷作 用所引發的下游啟動機制是有重疊之處,但並非 完全相同(Porter et al., 1999)。 低劑量砷化物處理促進細胞的增殖機制,有 研究指出 As(3)是藉由改變許多細胞增生訊息的 基因與蛋白質的表現,導致細胞增生,可增加 c-myc 和 E2F-1 等正調控者的表現,減少負調控 者MAP kinase phosphatase-1 的表現(Trouba et al., 2000),顯示砷可能破壞細胞增生正負調控的平衡 來誘引細胞增生;低劑量0.1 µM As(3)處理增加 人類纖維母細胞內cyclin D 蛋白質的表現量,進 而 影 響 細 胞 週 期 造 成 細 胞 增 生(Vogt and Rossman, 2001);低劑量的砷處理在一些具有動 情素受體的細胞內,如乳腺細胞、子宮頸細胞, 可能會經由動情素作用路徑造成細胞增生(Stoica et al., 2000a, Waalkes et al., 2000),就是與動情素 受器結合,促使細胞增生的基因轉錄轉譯,導致 細胞增生。 通常,控制人類乳腺癌細胞分化和增生的激 素包括類固醇荷爾蒙、生長因子、有絲分裂原、 訊息傳遞的活化子等,而動情素屬於其中一種。 動情素能透過與其受體結合,造成細胞週期調控 蛋白cyclin 與 cdk 的調控異常,在乳癌細胞中, 表現不正常的 cyclin D1,會磷酸化動情素受體 ER α,使之與 SRC-1 鍵結,而 cyclin 蛋白的分泌 量則是受動情素的刺激而分泌,是間接地藉由受 體作用的(Zwijsen et al., 1998)。如以 E2 處理 MCF-7 細胞,cyclin A、B1、D1、D3、E 的分泌 量均會上升(Saceda et al., 1988; Buckley et al., 1993);cyclinA-cdk2 複合體則會磷酸化 ER α 的 Ser106 與 Ser104,所以,乳癌細胞在沒有接合 ligand 也會持續進行轉錄,導致受體在癌細胞中 表現量會比一般正常時為高。而且,生長因子的 增加以及cyclin 蛋白的高度不正常作用,促使癌 化細胞增生速率加快。因此,乳癌細胞增生和動 情素很有關係(Sommer and Fuqua, 2001)。

動情素拮抗劑 ICI 182,780 是一種治療乳癌 的藥物,當它與動情素受體結合,能抑制動情素 與其受體結合,所以當ICI 存在時,動情素無法 與其受體結合、無法進入細胞核中傳遞轉錄的訊 息,故能有效的抑制癌細胞的增生。本研究也證 實 MCF-7 細胞處理 E2,會造成細胞有顯著性的 增生;E2 及 ICI 同時處理時,則 E2 所以引發的 細胞增生效應被抑制。砷化物處理的細胞也有類 似的結果,低劑量的砷化物所造成的細胞增生, 在加入ICI 後就不會增生。ICI 會抑制砷所誘發的 增生功效,且 As(3)能劑量相關與動情素競爭結

(8)

合動情素受體。這顯示砷造成 MCF-7 細胞增生 的路徑之一可能是透過動情素受體所誘發的。 在本研究中,低劑量砷化物、E2 處理 MCF-7 細胞的影響,可增加細胞的增生、細胞的增生現 象能被ICI 所抑制、減少 ER α 的表現量、As(3) 能與動情素競爭結合動情素受體等相同之處。但 卻有 As(3)處理細胞之動情素受體,並不會進入 細胞核的差異。綜合上述的結果,可推測無機砷 誘發細胞增生的機制可能是透過與動情素受體 結合、影響動情素受體本身的生合成來誘發細胞 的增生,但並不是透過動情素與動情素受體的複 合物的轉錄因子作用。有關無機砷與動情素受體 結合所引發的細胞增生的進一步路徑仍有待證 實。

誌 謝

本 研 究 承 國 科 會 研 究 計 畫( 編 號 NSC 92-2511-S-003-056) 和 農 委 會 研 究 計 畫 ( 編 號 92AS-1.2.1-FD-Z1(3))補助經費,謹此致謝。

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Effects of Arsenics on Cell Growth and Estrogen Receptor-α

Expression in MCF-7 Breast Cancer Cells

Yu-Ching Hsu, Ren-Haw Chaung, Yu-Chieh Wang, Hwei-Tein Hwang, Li-Chu Tung*

Department of Life Science, National Taiwan Normal University, Taipei, Taiwan

(Received: 30 November 2005, accepted: 26 June 2006)

ABSTRACT

Inorganic arsenics, are one of widely dispersed environmental pollutants and well-documented human carcinogens. Previous reports indicated that inorganic arsenic might somehow act through an estrogenic mode of action. In this study, effects of sodium arsenite (trivalent) and sodium arsenate (pentavalent) on cytotoxicity, cell proliferation and the expression of estrogen receptor α (ER α) in breast adenocarcinoma MCF-7 cells were examined. The preliminary results showed that the inhibiting threshold concentrations of sodium arsenite and sodium arsenate on cell growth were at 1µM and 10µM, respectively, whereas their concentrations lower than inhibiting threshold concentrations promoted cell growth instead of cell toxicity. Time course studies on cells treated with 0.1~1µM sodium arsenite and 1~10µM sodium arsenate for 24 h, and observed consecutive six days without drugs, MCF-7 cells proliferation exhibited continuous increase. Cotreated with drugs and estrogen antagonist (ICI 182,780), MCF-7 cell proliferations were completely inhibited. Data of Western blotting showed that the expression of ER α were decreased in cells treated with low dose of sodium arsenite and sodium arsenate. Immunocytochemical studies with fluorescent microscopy illustrated that ERα displayed a diffusion distribution in cytoplasm and were more concentrated within nucleus of control cell and E2-treated cells. In arsenic-treated cells, the ER α only displayed in cytoplasm. Whole-cell competitive estrogen-receptor binding assay demonstrated that 0.1, 0.5 and 1µM sodium arsenite could bind with 28%, 35% and 48% in ER respectively. Based on the results, MCF-7 cells treated with a low dose sodium arsenite and sodium arsenate increased cell proliferation, lowered the ability of ER α expression and binding to estrogen receptor that strongly suggested inorganic arsenics induce physiological effects through a estrogen model.

數據

Table 1. Cytotoxicity of arsenite and arsenate in MCF-
Figure 1. Effects of arsenite and arsenate on the growth
Figure 4. Effects of arsenite (a) and arsenate (b) on the
Figure 5. Immunolocalization of ER α in MCF-7 cells.

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