利用單分子顯微術觀察大腸桿菌鞭毛蛋白的群聚現象

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(1)國立臺灣師範大學物理學系碩士論文 Department of Physics. National Taiwan Normal University Master’s Thesis. 利用單分子顯微術觀察大腸桿菌鞭毛蛋白的群聚現象 The Clustering Phenomenon of Flagella in E. coli revealed by Single-Molecule Microscopy. 宋運欣 Sung, Yun-Sing. 指導教授 Advisor：張宜仁博士 Ph.D.. 中華民國一百零九年七月.

(2) 摘要大腸桿菌的鞭毛在大腸桿菌中扮演相當重要的角色。在與趨向系統 (Chemotaxis system)協同作用下，鞭毛能有順時鐘與逆時鐘旋轉的方向。逆時鐘方向旋轉時，鞭毛能讓大腸桿菌朝單一方向游泳前進；順時鐘旋轉時，鞭毛會讓大腸桿菌原地翻滾(tumbling)以改變方向。儘管對於鞭毛旋轉機制有透徹的了解，對於鞭毛生長的位置的認知卻相較貧乏。然而鞭毛的生長位置會影響細胞游泳與使用能量的效率，當鞭毛分佈集中在一端時，細胞能以較有效率的方式進行移動。對於大部分原核生物而言，其體內存在調控鞭毛生長位置與數量的蛋白，但在大腸桿菌中卻沒有相對應的蛋白與序列。故此，普遍對於大腸桿菌的鞭毛生長位置的認知為隨機分佈。先前的研究中有發現大腸桿菌的鞭毛具有集中在舊端(old pole)所在的半側，然而此研究結果並沒有完全反駁鞭毛生長位置的隨機性。為了能驗證鞭毛生長位置是否屬於隨機，我們用螢光蛋白標定最先嵌入細胞膜的 FlhA 與 FliF 蛋白，在讓其基因過度表達後觀察其細胞分佈，得到非隨機的分佈。更進一步，我們利用光漂白後螢光恢復(Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) 發現在原先長有鞭毛結構的周圍會聚集 FliF 與 FlhA 的堆積。因此，我們猜測此群聚現象是一種細胞調控生長鞭毛結構位置的一種機制。利用單分子顯微術來定位 FlhA 與 FliF，並藉由 Ripley’s K 函數與基於密度的聚類演算法 (Density-Based Spatial Clustering of Applications with Noise, DBSCAN)得到 FlhA 與 FliF 的堆積半徑與分子參與堆積的比例。觀察在不同數量條件下的堆積半徑與分子參與堆積比例，我們發現當數量的增加，FlhA 反而會分離原本的堆積並與 FliF 嘗試組織成新的結構。此結果可視為鞭毛蛋白從堆積組成結構的一種調控方式。關鍵字：鞭毛、群聚現象、單分子顯微術、Ripley’s K 函數、基於密度的聚類演算法 I.

(3) Abstract Flagella play important roles in Escherichia coli. Cooperate with chemotaxis system, flagella can rotate in clockwise and counterclockwise. When the flagella rotate with counterclockwise, an E. coli cell can swim toward a direction smoothly. In contrast, if the flagella rotate with clockwise, the cell will be tumbling to change direction of movement. Despite of how a flagellum rotates had been fruitfully researched, the detail mechanism of where and how a flagellum locate is still unrevealed, though the locations of the flagella is the key factor of the efficiency of the cellular energy regulation. For instance, when the flagella locate at its one pole concentrated, a cell can move more fluently. Since most of the Prokaryote depends on specific proteins to regulate the number and location of flagella, the flagella was assumed to randomly assemble on the cell surface in E. coli cells, which lack any analogs of the regulation proteins in other species of bacteria. In previous study, although more flagella were observed at the half side of the cell by the old pole, it still does not rule out the random assembly model since the old pole was synthesized anciently. To verify the random assembly model, we tagged the first two types of proteins embedded on membrane, i.e., FlhA and FliF, with fluorescence proteins. According to the images of the cells over-expressed FlhA and FliF, the nonuniform distributions of the proteins reject the random assembly model. In addition, we found out that FlhA and FliF clustered around the basal body via fluorescence recovery after photobleaching. Therefore, it implies that the clustering might be a regulation of how cell determined the location of basal body. Based on single molecule microscopy, the position of FlhA and FliF on the cell surface were super-resolved, and the radii of the clusters and the ratios of molecule in the clusters were further analyzed by Ripley’s K function and DBSCAN. The results suggest that when the number of protein increased, FlhA would separate the clusters II.

(4) and tried to assemble new cluster with FliF. It may provide a pathway of the regulation of flagellar structure assembly. Keywords: Flagella, Single Molecule Microscopy, Ripley’s K function, DBSCAN. III.

(5) 致謝在生物物理實驗室待了四年，特別感謝指導教授張宜仁老師，當我還是懵懂的專題生時，願意耐心地教導並讓我有親手操作實驗的機會。在老師循循善誘下，我建立良好研究態度與能力，並學著努力克服在實驗中所遇到的難題。在研究中我大而化之的失誤，老師也總是不厭其煩地協助且誨人不倦。或許，若沒有老師的教導，我現在可能仍是不學無術的。在進行碩士研究中，非常感謝中央研究院物理研究所周家復老師所提供的實驗室與實驗器材，讓我們能無後顧之憂地進行實驗。也感謝周家復老師和邱顯智老師願意在百忙之中擔任我的口試委員，並從中給予建議，使我能補足論文中的缺陷與瑕疵。在實驗室的同儕中，感謝鄧安祐、葉懷澤與彭茜徽，在實驗中能給予我實驗操作的建議。感謝宋狄恩學弟在程式上給予的協助，讓我能使用更有效率的演算法進行分析。也感謝曾經大學同學，朱恩德、莫詒凱與曾元亨，當我對於學術研究迷惘的時候，願意為我點一盞明燈指引道路。在每天實驗結束的時候，感謝我的家人，願意分擔我在研究所期間的生活壓力，讓我能心無旁鶩的準備實驗與碩士論文。最後，要感謝的人太多了，那就謝天吧。. IV.

(6) 目錄摘要................................................................ I 致謝............................................................... IV 目錄................................................................ V 圖目錄............................................................ VII 表目錄............................................................. IX 第一章緒論......................................................... 1 1.1.. 鞭毛介紹.................................................. 2 鞭毛的結構.......................................... 2. 1.1.2. 鞭毛與趨向系統...................................... 3. 1.2.. 1.1.1. 鞭毛的生長位置............................................ 3 鞭毛生長位置的種類.................................. 4. 1.2.2. 鞭毛的非對稱分佈.................................... 5. 1.3.. 1.2.1. 第二章 2.1. 研究目標.................................................. 5 實驗設計與原理........................................... 13 利用顯微術觀察帶有螢光分子的目標蛋白..................... 13 2.1.1. 光漂白後螢光恢復(Fluorescence Recovery After. Photobleaching, FRAP)...................................... 13. 2.2. 2.1.2. 單分子顯微術(Single Molecule Microscopy)........... 14. 2.1.3. 單分子顯微術的三維修正............................. 15. 群聚效應分析方法......................................... 15 2.2.1. Ripley’s K 函數 ................................... 16. 2.2.2. 基於密度的聚類演算法(Density-based spatial clustering. of applications with noise )............................... 17 2.3. 實驗設計................................................. 17 2.3.1. 基因過度表現驗證................................... 18. 2.3.2. 光漂白後螢光恢復實驗驗證........................... 19 V.

(7) 2.3.3. 單分子顯微術定位螢光位點........................... 19. 第三章實驗材料與方法.............................................. 25 3.1. 3.2. 3.3. 實驗樣品製備............................................. 25 3.1.1. 菌株............................................... 25. 3.1.2. 質體............................................... 26. 實驗觀察流程............................................. 28 3.2.1. 光學儀器........................................... 28. 3.2.2. 實驗條件........................................... 28. 實驗數據分析............................................. 32 3.3.1. 單分子顯微術分析................................... 32. 第四章實驗結果與討論.............................................. 36 4.1. 4.2. 4.3. 鞭毛隨機分佈的驗證....................................... 36 4.1.1. 隨時間觀察 FlhA 與 FliF 的堆積變化................... 36. 4.1.2. 結果討論........................................... 37. 光漂白後螢光恢復實驗驗證 FlhA 與 FliF 的堆積現象........... 37 4.2.1. 針對 FlhA 與 FliF 堆積現象的光漂白後螢光恢復實驗..... 37. 4.2.2. 結果討論........................................... 38. 單分子顯微術觀測不同濃度下的 FlhA 與 FliF 群聚現象......... 38 4.3.1. 以 FliF 數量為變因得到 FlhA 不顯著變化與 FliF 分佈變廣 39. 4.3.2. 以 FlhA 數量為變因得到 FlhA 具有分離堆積的特性....... 40. 4.3.3. 以 FliF 與 FlhA 數量為變因得到新的堆積............... 41. 第五章結論........................................................ 52 參考資料........................................................... 54 附錄............................................................... 56. VI.

(8) 圖目錄圖 1. 1 格蘭氏陰性菌的鞭毛結構圖............................. 8 圖 1. 2 不同基因的大腸桿菌鞭毛位置對照圖..................... 9 圖 1. 3 鞭毛蛋白嵌膜順序.................................... 10 圖 1. 4 不同菌種的鞭毛位置分佈圖............................ 11 圖 1. 5 膜蛋白行為模型示意圖................................ 12. 圖 2. 1 光漂白後螢光恢復示意圖.............................. 21 圖 2. 2 單分子顯微術與其修正示意圖.......................... 22 圖 2. 3 Ripley’ K 函數與 DBSCAN 示意圖 ..................... 23 圖 2. 4 誘導系統示意圖...................................... 24. 圖 4. 1 基因過度表達的實驗結果 .......................................................... 43 圖 4. 2 光漂白後螢光恢復實驗結果....................................................... 44 圖 4. 3 以 FliF 數量為變因的 Ripley’s K 函數的 L 分佈與 K 函數統計結果 ..................................................................................................... 45 圖 4. 4 以 FliF 數量為變因的 DBSCAN 堆積數量、參與堆積比例、迴轉半徑統計 ..................................................................................... 46 圖 4. 5 以 FlhA 數量為變因的 Ripley’s K 函數的 L 分佈與 K 函數統計結果 ................................................................................................. 47 圖 4. 6 以 FlhA 數量為變因的 DBSCAN 堆積數量、參與堆積比例、迴轉半徑統計 ..................................................................................... 48 圖 4. 7 同時以 FliF 與 FlhA 數量為變因的 Ripley’s K 函數的 L 分佈與 K 函數統計結果 .............................................................................. 49 VII.

(9) 圖 4. 8 同時以 FliF 與 flhA 數量為變因的 DBSCAN 堆積數量、參與堆積比例、迴轉半徑統計 .................................................................. 50 圖 4. 9 FlhA 與 FliF 群聚效應模型示意圖 ............................................. 51. VIII.

(10) 表目錄表 3. 1 菌株表 ...................................................................................... 33 表 3. 2 質體表 ...................................................................................... 34 表 3. 3 質體轉形菌株表 ....................................................................... 35. IX.

(11) 第一章緒論鞭毛是細胞身上一種向外突出且複雜的構造，其在細胞身上扮演相當重要的角色：當細胞需要移動時，需要鞭毛進行轉動以產生動力前進。此機制會與趨向系統協(chemotaxis system)同運作，當趨向系統偵測到養分時，會傳遞訊息讓鞭毛逆時鐘旋轉；若否，則鞭毛會順時鐘旋轉。逆時鐘選轉的鞭毛能讓細胞筆直的朝前前進，順時鐘旋轉的鞭毛則只能讓菌翻滾並隨機移動。而能驅動整隻細胞的鞭毛，有著相當複雜的結構。在細胞膜內膜上有鞭毛的基底結構 MSring，其會穿過並固定在內膜上，並且鞭毛的生長的位置會由 MS-ring 最先附著的地方所決定。基底結構向外則有著鞭毛馬達結構，也是整個鞭毛旋轉的動力來源。穿過細胞膜，鞭毛在細胞外則有鞭毛細絲，在鞭毛旋轉時會產生螺旋型的擺動，以產生足夠的前進力推動整隻細胞移動。當我們知道細胞移動方式是藉由鞭毛的旋轉來達成，了解鞭毛的生長位置便會是一個重要的課題。當鞭毛生長在適合旋轉前進的位置，細胞便能較有效率地運用能量來移動。然而，目前我們所熟知鞭毛與其生長位置則隨著菌種的類型而有所差異。大部分的菌種都有特定蛋白質去決定或指引鞭毛的生長位置。然而，原核生物中的大腸桿菌卻不存在這樣的蛋白質，其鞭毛的生長位置是直接由鞭毛基座蛋白在細胞膜上面開始建構的位置所決定。而基座蛋白在細胞膜上的建構位置並無特定規則。換言之，目前對於大腸桿菌的鞭毛生長位置的認知是其隨機生長在細胞的表面上。本論文中，我們便針對鞭毛在細胞膜上隨機生長位置的假設進行實驗與驗證，並得到鞭毛的生長位置與其基座蛋白的數量有關。藉由超解析顯微術，我們得以觀測較微觀下的鞭毛基座蛋白在細胞膜上的位置與群聚現象。同時，也利用誘導系統來控制基座蛋白的數量，來得到大腸桿菌如何調控不同數量基座蛋白的機制。這個章節我們會介紹實驗背景與目的。於 1.1 節會介紹有關鞭毛的特性與 1.

(12) 組成；於 1.2 節會介紹現在對於鞭毛生長位置的了解；於 1.3 節會解釋我們針對目前鞭毛生長位置進行假設與驗證，並從驗證中得出我們的研究目標。鞭毛介紹. 1.1.. 鞭毛屬於第三型分泌系統，由一百多個不同的蛋白所組成，其組成可分為馬達、鉤狀結構、鞭毛細絲。我們會於 1.1.1 節介紹鞭毛的結構；1.1.2 節介紹鞭毛與趨向系統的運作原理。 1.1.1. 鞭毛的結構. 鞭毛的結構包含馬達、鉤狀結構、鞭毛細絲，其中馬達可再分為定子 (stator)與轉子(rotor)的結構，如圖 1.1。定子是一個離子通道的結構並固定在細胞壁上，並吸收氫離子作為鞭毛旋轉的動力來源，而轉子的部分則主要由環狀的基底結構(basal body)所構成。基底結構中的 MS-ring、P-ring、L-ring 會是最優先嵌入細胞膜與細胞壁中。基底結構的外圍是 C-ring，負責與趨向系統互動並調控鞭毛旋轉的開關。除此之外，其中央則還有鞭毛的外輸出結構(flagellar export apparatus)。此結構會從基底穿過細胞膜與細胞壁到細胞的外側。其主要功能為將鞭毛的鉤狀結構向外延展，並讓鞭毛細絲能從鉤狀結構中生長出來 [1]。而鞭毛的組成過程，在 2004 年 Suzuki 的實驗中發現，過度表達 MS-ring 其中的 FliF 蛋白，會觀察到 FliF 會自組成(self-assembly)MS-ring 並嵌入細胞膜之中，並從中認為 FliF 為優先嵌入細胞膜的 MS-ring 蛋白[2]。然而，Suzuki 或是更早期的實驗並沒有驗證在缺乏其他鞭毛蛋白的情況下，FliF 是否還是能正常的組成 MS-ring。2011 年 Sourjik 針對大腸桿菌的基因剔除不同蛋白的序列，並在細胞內轉形有不同鞭毛蛋白的質體並從中讓其表現，試圖觀察在缺乏其他鞭毛蛋白的環境下，質體產出的個別鞭毛蛋白是否能一樣擁有自組成的功能 [3]。不同鞭毛蛋白在缺乏其他蛋白的條件下，分別會有不同的組成能力，舉例來說：FliG 蛋白在缺乏 FliM 的條件下能組成結構，但在缺乏 FliF 的條件下卻 2.

(13) 無法。其中，Sourjik 剔除了 flhC 序列，此序列為所有鞭毛蛋白的轉錄開關，代表此大腸桿菌並不會產出任何跟鞭毛有關的蛋白。在剔除 flhC 的細胞中，MSring 中的 FliF 蛋白和外輸出結構的蛋白 FlhA，兩者在缺乏所有鞭毛蛋白的情況下皆有觀察到自組成的現象，如圖 1.2。更進一步，Sourjik 便提出如圖 1.3 的模型，其認為鞭毛蛋白在嵌膜後有著特定的順序來組成結構：FlhA 和 FliF 會是最優先嵌上細胞膜的蛋白，FliG 在有 FliF 的蛋白的情況下，也能順利嵌上膜並組成結構；而後，FliM、FliN 等其他鞭毛蛋白再接續組成。 1.1.2. 鞭毛與趨向系統. 組成完的鞭毛有順時鐘與逆時鐘的旋轉方式。當環境中的物質濃度呈現梯度分佈時，鞭毛會呈現逆時鐘的旋轉以利細胞進行筆直且長距離朝濃度高的方向游泳；當環境中的物質無濃度梯度或是具有對大腸桿菌的有毒物質，鞭毛會順時鐘的旋轉讓細胞在原地翻滾(tumbling)並轉換行動的方向，趨向系統便是判斷當前環境能否前進的偵測器[4]。趨向系統的機制在於，一般而言鞭毛會呈現逆時鐘旋轉，而接受甲基化的趨向受體蛋白(Methyl-accepting chemotaxis proteins)，簡稱 MCP，會位在細胞膜上接受環境中的化學物質。MCP 結構底下則有 CheA 蛋白負責將 ATP 水解成 ADP 與磷酸根。當 MCP 接受到有害物質時，細胞質中的 CheY 蛋白會將 CheA 蛋白去磷酸化，並移動至鞭毛。在鞭毛的轉子結構中有另一個部分稱為 Cring，其由 FliM 和 FliN 蛋白所組成。當 FliM 和 FliN 再與帶有磷酸根的 CheY 接觸時，會將 CheY 磷酸化，並改變鞭毛旋轉方向成順時鐘。. 1.2.. 鞭毛的生長位置在眾多單細胞與多細胞生物中都存在鞭毛的結構，但菌種與菌種間生長鞭. 毛的機制與位置卻不盡相同。1.2.1 節會針對目前所瞭解的鞭毛生長位置的機制進行介紹；1.2.2 節則會說明針對大腸桿菌中的鞭毛位置已有的實驗驗證得到非對稱的分佈結果。 3.

(14) 1.2.1. 鞭毛生長位置的種類. 儘管熟知鞭毛旋轉機制與其和趨向系統的互動，但對於鞭毛生長位置的了解卻相較貧乏。目前對於鞭毛在單細胞生物中的觀察，其位置分佈可分為四類：偏端單毛(monotrichous)、雙端鞭毛(amphitrichous)、偏端叢毛 (lophotrichous)、全表面(peritrichous)[1]，如圖 1.5。產生四種分佈不同的差別，在於不同細胞間有不同蛋白與機制去控制鞭毛的生長位置。在新月桿菌中，鞭毛生長位置屬偏端單毛類，鞭毛只會長在單一鞭的端點，而其細胞內存有 TipN 的蛋白。TipN 會以捲曲螺旋的方式組成蛋白，並有指引的功能讓鞭毛生長在細胞的舊端。當 TipN 被剔除，則鞭毛會隨機的生長在細胞表面。而在同為偏端單毛類的弧菌屬細菌，則靠著 FlhF 和 FlhG 的蛋白來找到端點生長鞭毛。剔除 FlhF 會得到細胞無法生長鞭毛的細胞或是隨機生長鞭毛的細胞，而剔除 FlhG 則會產生表面長滿鞭毛的細胞。無獨有偶， FlhF 和 FlhG 存在眾多菌種內。曲狀桿菌屬的細菌具有雙端鞭毛的特性，鞭毛長在細胞的兩端。當把 FlhF 和 FlhG 剔除，除了會得到無鞭毛和表面長滿鞭毛的細胞外，還會得到有分裂障礙的迷你菌(minicell)；對於偏端叢毛的幽門螺旋桿菌，也是靠著 FlhG 來達成指引多根鞭毛集中生長在其中一端。在缺乏 FlhG 蛋白也會產生無鞭毛的細胞。同樣擁有 FlhF 和 FlhG 的枯草桿菌，但卻有不一樣的結果。枯草桿菌的鞭毛生長屬於生長在全部表面的類別。但實際上，FlhF 蛋白的調控下，鞭毛並不會生長在細胞的兩端，而是生長在細胞柱狀體的表面 [1]。從上述的介紹分類中，即便機制不盡相同，但不管 TipN、FlhF 或是 FlhG 都扮演著控制細胞生長鞭毛的「位置」與「數量」的角色。然而，大腸桿菌雖然屬於全表面類，但其並沒有 TipN、FlhF、FlhG 的蛋白，也沒有找到任何有關調控鞭毛位置和數量的蛋白，而大腸桿菌的鞭毛數量也僅發現與環境營養程度有關，生長位置的機制在並缺乏充分研究下認為是隨機分佈。. 4.

(15) 1.2.2. 鞭毛的非對稱分佈. 大腸桿菌的分裂過程，會逐漸增長並在中央的位置產生隔板分隔兩隻細胞，中間的細胞膜會再向內凹陷，最後兩隻細胞脫離。完成分裂的子細胞，有一端的端點，會是原先在母細胞時的隔板，此端點被稱作為新端(new pole)；反之，在母細胞時遺傳下來的端點則被稱為舊端(old pole)。而許多膜蛋白在細胞膜上的分佈與細胞的兩端點有關聯，包含趨向系統的受體蛋白和絲氨酸受體蛋白(serine receptor, Tsr)都傾向在舊端產生受器結構[5, 6]。2010 年 Ping 在此依據下猜測細胞的鞭毛的位置也會與端點有關[7]。藉由標定絲胺酸受體蛋白與綠色螢光蛋白來判斷舊端，並利用紅色染劑(Alex Fluor 594)對鞭毛的細絲來染色。由其實驗結果發現，在大部分的細胞在舊端的鞭毛會比新端平均多一根鞭毛， 75%的細胞的舊端鞭毛的數量也比新端來的多，而少部分在舊端並無鞭毛的細胞，其鞭毛在整隻菌上則呈現隨機分佈。更進一步，當大腸桿菌被困在毛細管中，鞭毛分佈較不均勻的細胞，比例上比較均勻的細胞能從中脫困，所花費時間也較短。此結果代表鞭毛位置在舊端上有較高的分佈機率。此舉也讓細胞能更有效的搭配使用趨向系統來進行游泳。然而，這樣的實驗結果卻無法完全反駁鞭毛位置是隨機分佈的。Ping 對於統計上出現舊端無鞭毛的細胞的解釋是其舊端在母細胞中便是新端，在還沒長出鞭毛的情況下便進行分裂，導致子細胞的新舊兩端的鞭毛數呈現並無特別集中的現象。換言之，原本舊端會產生鞭毛也存在一定機率是源自該細胞膜存在的時間夠久而產生鞭毛，而新端會有較少鞭毛也單純是因為其存在的時間沒有舊端來的久。更甚者，我們也能懷疑是否此少比例的菌才是在各個細胞膜機率相等下所得到最貼近細胞隨機生長鞭毛位置的結果。. 1.3.. 研究目標目前對於鞭毛生長位置的認知在細胞膜上有非對稱的分佈：鞭毛在舊端生 5.

(16) 長機率較高。然而在尚未排除因為舊端存在時間較長所以易得到較多鞭毛分佈的結果之前，我們很難下定論去描述鞭毛生長位置是否隨機。退一步來說，倘若鞭毛真的存在非對稱的分佈，在舊端那一側的鞭毛位置也並無像趨向受體蛋白都集中在端點，而是隨機分佈在整個細胞中的半側。換言之，鞭毛在細胞膜上的分佈仍有不明確的地方需要探討。故此，我們提出一個假設：倘若大腸桿菌的鞭毛是隨機分佈，則當提高鞭毛數量時，理應會得到細胞表面長滿鞭毛的現象，或是鞭毛會均勻分散在表面。然而，在我們的驗證實驗中，我們用螢光蛋白標定最先嵌入細胞膜的鞭毛蛋白：外輸出結構蛋白 FlhA 與基底結構 MS-ring 中的 FliF。藉由讓大腸桿菌過度表達(over express)來得到額外的鞭毛蛋白，預期得到 FlhA 和 FliF 會均勻分散在細胞表面。但隨著數量增加，卻沒有得到均勻分散的結果，反而觀察到在固有的 FlhA 和 FliF 結構旁，聚集了更多額外的 FlhA 和 FliF(詳細實驗結果於第四章)。此結果程度上反駁了大腸桿菌的鞭毛是隨機形成的假設。傳統上認為，當膜蛋白摺疊完畢後，會在細胞膜上以單體的形式行快速自由擴散運動。當單體膜蛋白組成有功能性的結構時，此結構往往會穿透且固定在細胞壁上，此時觀測到的膜蛋白會是靜止的。然而，在眾多膜蛋白的研究中，包含絲胺酸受體蛋白 Tsr、細胞骨架蛋白 MreB、趨向系統受體蛋白 CheW、銅銀離子外輸出幫浦蛋白 CusB，皆有發現膜蛋白有至少三至四種的運動狀態：靜止、次擴散或侷限擴散、較慢的自由擴散、較快的自由擴散[5, 6, 8, 9]，如圖 1.5。對於較慢的自由擴散運動，是當單體膜蛋白遇到其他單體膜蛋白時，會以組成低聚物的方式在細胞膜上持續擴散，而質量的增加則會讓低聚物的運動變慢；而對於次擴散與侷限擴散，則是單體膜蛋白或是低聚物組成較大的集團與聚集，卻沒有形成有功能性的結構，並且堆積在一處進行極緩慢的運動。因此，我們給出了猜測：對於具有聚集的現象的過量 FlhA 和 FliF，他們可 6.

(17) 能未必有組成外出輸結構與 MS-ring，而是單純以大量單體或是低聚物進行堆積的結果。然而，要組成結構，膜蛋白勢必要經過堆積的過程，但在觀察中，給予更多的蛋白，並不會促成膜蛋白組織成結構，反而會以堆積的形式存在在細胞內。因此，組成堆積或許是一種調控的機制，用來控制 FlhA 與 FliF 是否要組成基底結構還是以單體形式堆積。利用單分子顯微數來觀察不同數量下的 FlhA 與 FliF 蛋白的聚集可以提供一種方式來了解鞭毛蛋白組成結構的機制。. 7.

(18) 圖 1. 1 格蘭氏陰性菌的鞭毛結構圖. 圖 1.1. 格蘭氏陰性菌的鞭毛結構圖. 圖為格蘭氏陰性菌、又名大腸桿菌的鞭毛結構圖。圖中米色與淺綠色為鞭毛的基座結構，包含 MS-ring、P-ring、L-ring、紅色的部分則是鞭毛的馬達結構、綠色的部分為鞭毛的細絲螺旋結構。鞭毛旋轉方向由 C-ring 控制，而細絲會在馬達旋轉後呈現順時鐘旋轉或是逆時鐘旋轉。[1]. 8.

(19) 圖 1. 2 不同基因的大腸桿菌鞭毛位置對照圖. 圖 1.2. 不同基因的大腸桿菌鞭毛位置對照圖. 在 2011 年，Sourjik 的實驗將大腸桿菌的 flhC 序列剔除，藉此讓大腸桿菌無法轉錄任何鞭毛蛋白，再分別轉形含有不同鞭毛蛋白序列的質體，讓細胞只能轉錄出單一特定蛋白，藉此檢驗在缺乏其他蛋白的環境下，各個單一蛋白是否能組成結構。圖中的 AD 作為對照組的原生菌種；E-H 為剔除 flhC 的實驗組，A 與 E 是觀測 FliF；B 與 F 是觀測 FlhA；C 和 G 是觀測 FliM；D 和 H 是觀測 FliO。在觀測中發現只有 FlhA 與 FliF 在缺乏其他鞭毛蛋白的環境下仍能組成結構。[3]. 9.

(20) 圖 1. 3 鞭毛蛋白嵌膜順序. 圖 1.3. 鞭毛蛋白嵌膜順序. 在 2011 年，Sourjik 在測試不同的鞭毛蛋白在缺乏其他蛋白的環境下是否能組成鞭毛結構的實驗中發現，FliF 與 FlhA 能夠在毫無其他蛋白的幫助下組成結構；而 FliG 只能在環境中存有 FliF 的條件下也能組成蛋白。因此，Sourjik 提出此模型描述鞭毛蛋白嵌入細胞膜的順序過程：FliF 與 FlhA 會最優先嵌入細胞膜並形成結構。在 FliF 嵌入後， FliG 會跟著組成結構，如圖中紅箭頭所標示。在 FliG 組成結構後，FliM、FliN 便會依序進入鞭毛結構中。[3]. 10.

(21) 圖 1. 4 不同菌種的鞭毛位置分佈圖. 圖 1.4. 不同菌種的鞭毛位置分佈圖. 圖為目前歸類各種細胞生長鞭毛位置的分類圖。A 為偏端單毛，鞭毛只會長一根並長在單一端點上；B 為雙端單毛，鞭毛會在雙端點各長一根；C 為邊端叢毛，鞭毛會集中在單一端點長若干根；D 為全表面都富含鞭毛，鞭毛會隨機在細胞表面進行生長，其中大腸桿菌便屬於這一類。. 11.

(22) 圖 1. 5 膜蛋白行為模型示意圖. 圖 1.5. 膜蛋白行為模型示意圖. 膜蛋白在細胞膜上具有四種運動型態。A.剛摺疊嵌上細胞膜的蛋白，因為單體形式，在細胞膜上具有快速的自由擴散運動。B.當單體與單體接觸後，有機會形成低聚物，則膜蛋白在細胞膜上會進行較慢的自由擴散運動。C.當大量膜蛋白聚集後形成堆積，則會觀察到膜蛋白在細胞膜上進行次擴散運動(subdiffusion)或是侷限擴散運動(confined-diffusion)。D.若膜蛋白在細胞膜上組織成有功能性的結構(如：環狀結構)，則膜蛋白則會靜止在細胞膜上。. 12.

(23) 第二章實驗設計與原理摺疊完的膜蛋白會在細胞膜上進行自由擴散運動與或組織結構與堆積。為了能準確的鎖定膜蛋白的位置，我們使用了螢光標定技術來標定螢光蛋白，並使用光漂白後恢復螢光(Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP)與單分子顯微術(Single Molecule Microscopy)來觀測膜蛋白在細胞膜上的運動與位置分佈。在 2.1 節中，會說明我們如何使用螢光顯微技術來定位帶有螢光分子的膜蛋白；在 2.2 節中，我們會解釋所使用的分析方法與針對分析上遇到的問題所進行的調整；在 2.3 節中，則會介紹我們實驗的設計。. 2.1 利用顯微術觀察帶有螢光分子的目標蛋白在螢光標定技術的幫助下，我們能在染色體上的目標蛋白後面連接螢光蛋白，藉此得到目標蛋白在顯微鏡底下的影像與位置。而藉由不同的螢光顯微術，我們能從螢光顯微鏡底下得到目標蛋白在細胞膜上的運動與位置分佈。在 2.1.1 節中，會介紹光漂白後螢光恢復實驗如何從螢光訊號得知分子的運動狀態；在 2.1.2 節中，因為繞射極限的關係，我們會利用單分子顯微術來看到更微觀的影像去還原目標蛋白的真實位置分佈；在 2.1.3 節中，我們會再針對單分子顯微術的背景去進行二維轉換三維的修正。 2.1.1. 光漂白後螢光恢復(Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP). 當細胞膜上具有螢光分子時，我們可以利用強激發光去照射細胞膜上的小區域，讓區域內的螢光分子光漂白。光漂白發生的螢光分子會因為光電子進入暗態(dark state)，而無法被之後的激發光所激發。當光漂白完成後，細胞膜上的螢光分子會有很顯明的亮暗分佈。此時，當細胞膜上的螢光分子具有自由隨機擴散的性質時，暗的螢光分子就會與亮的螢光分子彼此混合進行擴散運動。原先光漂白的區域也會由暗轉亮；相對的，原先不在光漂白範圍內的區域，也會 13.

(24) 觀察到由亮轉暗的過程，如圖 2.1。針對此亮暗變化的快慢，我們能推算目標分子的擴散速度[10]。 2.1.2. 單分子顯微術(Single Molecule Microscopy). 當一點光源經過透鏡發生繞射時，其照射在屏幕上的結果會是一系列光暈所組成的同心圓環，每個同心圓環的光強度會由中心向外遞減。而中心的光暈，稱為點擴散函數(Point Spread Function, PSF)，可以高斯函數近似如圖 2.2 和式 2.1： I(x, y) ≈ I0 exp(−. (𝑥 − 𝑥0 )2 (𝑦 − 𝑦0 )2 − ) 2𝑤𝑥2 2𝑤𝑦2. 式 2.1. 式 2.1 中的I0 為點擴散函數中心點的峰值；𝑤為光強度剖面圖的特徵分布寬度。由於此函數為高斯函數近似，我們也能求得其半高全寬(Full Width at Half Maximum, FWHM)可由式 2.2 表示： FWHM = 𝑤√8𝑙𝑜𝑔2. 式 2.2. 而此半高全寬也代表若有兩點光源，則其相距大於半高全寬的值，我們才能在顯微鏡底下分辨，也就是所謂的繞射極限，如式 2.3。 FWHM ≈. λ 2NA. 式 2.3. 式 2.3 中的λ為激發光波長；NA 為物鏡的數值孔徑。換言之，若我們今天用發射光為 594nm 的紅色螢光蛋白，在物鏡數值孔徑為 1.25 的條件下，兩螢光分子需間距約 237.6nm 我們才能分辨得出來，否則顯微鏡底下只會得到一大光斑的影像。然而，在我們的實驗中，細胞膜上的鞭毛蛋白的密度卻是相當高的，在 1.3 節中提到的堆積也往往發生在幾個像素內。若要區分出這些螢光分子，便需要借助單分子顯微術。當兩個螢光分子距離小於繞射極限而無法分辨時，我們可以在不同個時間激發兩個螢光分子，藉此在單一時間內能得到一螢光分子的點擴散分佈。再擬合其分佈的峰值位置，得到其分子所在位置的期望值，如圖 2.2。最後將一系列的只包含單一螢光分子位置的的影像進行疊合，便能得到所 14.

(25) 有螢光分子的座標。 2.1.3. 單分子顯微術的三維修正. 儘管靠著單分子顯微術能夠得到小於 237.6nm 的解析度，然而從螢光顯微鏡底下得到的二維影像仍不足以還原真實細胞的環境。故此，我們藉由演算法的修正來得到真實三維的座標。大腸桿菌在幾何上可以視為一圓柱體。若在影像上觀察到一亮點，我們無法分辨其在細胞上屬於上半圓球還是下半圓球。故此，需先將細胞的上半層與下半層進行區隔。根據高斯光束，當一點光源遠離焦點，其點擴散函數的光腰寬度會以式 2.4 形式增加： 𝑧 2 ( ) √1 𝑤 𝑧 = 𝑤0 +( ) 𝑧𝑅. 式 2.4. 其中𝑤0 為焦平面的高斯光腰寬度，也是即點擴散函數的分布寬度；𝑧𝑅 為瑞利距離，為當光束寬度變為束腰處的√2倍時所遠離焦點的距離。所以當螢光分子遠離焦點時，其擬合後的點擴散函數的分布寬度也會隨之增加。故此我們便能以對焦在細胞底部，然後以標準差做為域值進行篩選。過大的分布寬度便可視為此螢光分子來源為上半層，可進行排除，如圖 2.2。即便區分了上下層，對還原三維座標仍不夠。由於細胞屬於圓柱體，圓弧面的長度在投影過程中會被扭曲。故此，我們將螢光分子的座標隨著細胞的圓弧表面進行「攤平」的修正，如式 2.5 與圖 2.2。 𝑥3𝐷 = 𝑟 × arcsin(. 𝑥2𝐷 ) 𝑟. 式 2.5. 其中𝑟為細胞寬度的半徑，𝑥2𝐷 為螢光分子在顯微鏡底下的觀測到的座標。𝑥3𝐷 為螢光分子座標隨著細胞表面攤平後得到的座標。. 2.2 群聚效應分析方法在獲得座標後，其為一堆散佈點。我們雖然能用肉眼去判斷哪些點有聚. 15.

(26) 集，哪些點離散的，但終究過於主觀。藉有兩種演算法，便能較客觀的去分析分子間的間距與區域密度來判斷我們所得到的散佈點是否有堆積發生。在 2.2.1 節中，我們會介紹 Ripley’s K 函數是如何針對散佈點進行分析其堆積現象；在 2.2.2 節中，則會介紹第二種演算法，基於密度的聚類演算法 (Density-Based Spatial Clustering of Applications with Noise, DBSCAN)的精神。 2.2.1. Ripley’s K 函數. Ripley’s K 函數是藉由計算各個位點隨著距離變化，所接觸到的點數增加來進行統計[11]，如式 2.6 和圖 2.3。 𝑁. 𝑁. A K(r) = 2 ∑ ∑ 𝛿𝑖𝑗 N. 式 2.6. 𝑖=1 𝑗=1,𝑗≠𝑖. 其中r為以第 i 個位點為圓心畫圓的半徑；A為所有位點所散佈面積的大小；N為位點總數；δij 為以 r 為半徑畫圓時，第 j 個位點是否在圓內的結果。若在圓內則δij =1；圓外則δij = 0。換言之，此函數便是以各個點在不同半徑內周圍有多少其他位點在半徑所畫圓內的統計結果。而為了排除當系統太多點或太少點的變因，最後再除以點密度(N/A)與總點數(N)。因此，K 函數所描繪的曲線分佈可理解為一種累積分佈函數，用來代表有多少比例的位點在我所選定的半徑面積內。為了能凸顯散佈點的堆積性，L 函數會代替 K 函數，兩者關係如式 2.7： K(r) L( r ) = √ 𝜋. 式 2.7. 從式 2.7 可看出，L 函數的意義在於有多少比例的位點在我所選定半徑內，若位點屬於隨機分佈，則 L 函數的分佈則會呈現線性的斜直線。因此，為了能凸顯出分佈的堆積性，我們可以針對 L 函數與自身變數 r 相減，如式 2.8。 L′(r) = L(r) − r. 式 2.8. 此時的 L 函數則代表，當在對應 r 值內 L 函數為正，則代表散佈點具有堆積 16.

(27) 性；若 L 函數為負，則代表在 r 值內散佈點具離散性。其中，分佈的峰值所對應的 r 的意思為在此半徑內具有最顯著的堆積性。然而，在式 2.6 此函數並沒有考慮當以 r 為半徑畫圓時，圓會畫到散佈面積以外的機率存在，如圖 2.3。因為在邊界外產生位點的機率是零，所以會低估以此處進行畫圓統計的結果。1999 年的 Raphael 便有針對 Ripley’s K 函數所遇到的問題進行修正[12]，如式 2.9。 𝑘𝑖𝑗 =. 2𝜋𝑡 𝐶𝑖𝑛. 式 2.9. 其中𝑡為第𝑖個點與第𝑗個點的距離；𝐶𝑖𝑛 為以 t 為半徑畫圓時，超出在邊界外的圓弧長。在各個𝑖點進行不同半徑的統計時，乘上此修正因子𝑘𝑖𝑗 可還原在沒有邊界影響的結果。 2.2.2. 基於密度的聚類演算法(Density-based spatial clustering of applications. with noise ) 基於密度的聚類演算法是以當散佈點分散在空間中，以密度作為門檻來進行判別散佈點是否聚集的演算法[13]。其過程以各點為圓心，特定半徑進行畫圓，半徑的選擇會由密度所決定。若圓內的點數超過特定的門檻，包含圓心點與圓內點將會被分類成同一群集。若否，則會被標記為雜訊，或是離散點，如圖 2.3。將此兩分析方式比較，Ripley’s K 是以較巨觀的方式去測量整體系統中的離散點有沒有顯著的集中；而基於密度的聚類演算法則是用區域密度與半徑的方式去分類散佈點中有產生群集的組別。利用得到的組別中的分佈點，我們便能在統計一隻菌內產生多少聚集的組別，代表環境中的蛋白產生多少堆積數量；也能針對各個聚集的組別計算其迴轉半徑，得到空間上此組別所產生的堆積的大小。. 2.3 實驗設計 17.

(28) 從第一章可以知道，目前對鞭毛的瞭解在於其生長位置在細胞舊端所在的半側有著較高的機率。然而這樣的不對稱分佈的結果並沒有完整的推翻原先所認知的生長點隨基分佈的假設。這一節會介紹我們如何設計實驗。2.3.1 節會介紹我們針對隨機分佈的假設，從鞭毛基因過度表現的角度來驗證；2.3.2 節會介紹從 2.3.1 節驗證結果，我們再進一步去分析鞭毛蛋白的聚集現象；2.3.3 節會介紹我們使用單分子顯微術來更微觀的去觀察鞭毛蛋白的堆積現象。 2.3.1. 基因過度表現驗證. 從 1.2.1 節可以知道，對大腸桿菌而言，並沒有任何如 FlhF 這類行指引位置的蛋白可以控制鞭毛生長位置。而從 1.1.2 節，Sourjik 的模型與實驗結果可以知道，最先嵌入細胞膜的是外輸出結構的蛋白 FlhA 與 MS-ring 的 FliF。故此，鞭毛生長位置有很大的變因是源自於 FlhA 與 FliF 兩種蛋白在細胞膜上所處的環境。因此，我們選擇利用螢光分子標記 FlhA 與 FliF，藉此觀察其在細胞膜上的狀態。倘若大腸桿菌的鞭毛生長位置是隨機分佈，則我們提出一個假設為當 FlhA 與 FliF 數量的增加，會得到它們分別組成更多的外輸出結構與 MS-ring 並均勻或隨機分佈在細胞膜表面的結果。我們將黃色螢光蛋白的序列接在染色體上 flhA 基因的後面，讓其在摺疊成蛋白後，FlhA 蛋白後會接著黃色螢光蛋白。為了給予更多數量的 FlhA，我們轉形帶有 flhA-yfp 基因的質體，代表細胞體內所有的 FlhA 蛋白我們都能利用透過黃色螢光蛋白的發射光來接收，並利用阿拉伯糖誘導機制當作控制，如圖 2.4。在經過培養後將菌滴在帶有阿拉伯糖的膠上後，認為細胞會在膠上面吸收，並開始轉錄出更多 FlhA-YFP 的蛋白，並觀察細胞體內的螢光堆積隨著時間的變化。相對的，我們也在 fliF 的序列後面接上藍色螢光蛋白 mtq，並轉形帶有 fliF-mturquoise 的乳糖誘導系統，並點在帶有人工乳糖操縱子的誘導物(IPTG)的膠上，一樣觀察細胞隨著時間體內的螢光變. 18.

(29) 化。倘若假設成立，則在螢光顯微鏡底下會看到原本只有區域有螢光分佈的細胞，隨著時間會逐漸佈滿整隻細胞；若否，則代表 FlhA 與 FliF 在決定鞭毛生長位置上並無隨機分佈。 2.3.2. 光漂白後螢光恢復實驗驗證. 過量的 FlhA 與 FliF 會組成更大的堆積，而為了驗證此堆積是否為有功能性的結構，或只是大量單體群聚的結果，我們使用光漂白後螢光恢復實驗來觀察 FlhA 和 FliF 的堆積現象。利用共軛焦顯微鏡(confocal microscopy)，將細胞部分堆積處螢光光漂白。由於膜蛋白在細胞膜上是自由擴散的，當光漂白發生後，已失去亮度的螢光蛋白與仍會發亮的螢光蛋白互相混合，原本漂白後的堆積會逐漸由暗轉亮；相對的，原本亮的堆積處也會由亮轉暗。從觀察亮暗轉化的速度，可以得到堆積區域內蛋白的緊密程度。倘若 FlhA 與 FliF 有組成更多結構，則會觀察到亮暗轉換較慢的結果；假如 FlhA 與 FliF 只是無功能性的組織或是大量單體堆積在一起，則會觀察到較快的亮暗轉換過程。 2.3.3. 單分子顯微術定位螢光位點. 礙於繞射極限的存在，只能看到最小兩百奈米解析度的群聚現象。為了能更微觀觀察細胞內 FlhA 與 FliF 蛋白群聚內的結構變化，我們使用了單分子顯微術來定位蛋白的位置。我們分別在染色體上 flhA 與 fliF 的序列後接上紅色螢光蛋白 mscarlet 的基因。mScarlet 紅色螢光蛋白在光學上具有易被光漂白與光閃爍(fluorescence intermittency)的特性。藉由光漂白，我們能將大量融合 mScarlet 的 FlhA 或 FliF 蛋白給剔除，讓空間上的 mScarlet 密度變低；餘下的 FlhA 與 FliF 也會因為 mScarlet 的光閃爍特性讓其能在不同時間點發亮，得到如 2.1.2 節中在單一時間的影像上只有單一螢光蛋白發亮的結果，並藉此定位螢光分子所在的位置。更進一步，我們猜測 FlhA 和 FliF 所形成的聚集與其數量有所關聯，我們 19.

(30) 分別在染色體上帶有 flhA-mscarlet 與 fliF-mscarlet 的序列的細胞，轉形帶有 flhA-mgeos、fliF-mgeos 和 fliF-mgeos::flhA 的質體，如圖 2.4。藉此我們能用三種不同的變因：只單方面增加 FlhA 或 FiF 的數量與同時增加 FlhA 和 FliF 的數量。最後再利用 Ripley’s K 函數和基於密度的聚類演算法來分析 FlhA-mScarlet 與 FliF-mScarlet 的位置，從兩種角度來討論其堆積現象。. 20.

(31) 圖 2. 1 光漂白後螢光恢復示意圖. 圖 2.1. 光漂白後螢光恢復示意圖. 我們能假定螢光分子所處的細胞膜是一個開放且分子能自由擴散運動的環境時，A.藉由光漂白讓特定區域的螢光分子進入暗態，進入暗態的螢光分子將無法被激發。B.經過一段時間，進入暗態的螢光分子會於外周圍的螢光分子擴散與混合。C.在顯微鏡底下的細菌若進行光漂白後螢光恢復實驗，會看到被光漂白的區域無法發亮。D.隨著時間經過，會看到原本無法發亮的區域，因為外圍的螢光分子混合近來，而亮度逐漸恢復。藉由觀察亮度由暗轉亮的過程，能得到螢光分子的擴散速度。. 21.

(32) 圖 2. 2 單分子顯微術與其修正示意圖. 圖 2.2. 單分子顯微術與其修正示意圖. A.為當一螢光分子在顯微鏡底下觀測時，其繞射圖形的中心光暈會是一點擴散函數的三維模擬圖。在單分子顯微術中，我們可以藉由擬合此分佈，找出峰值對應到座標，藉此得到螢光分子的位置(如黃色箭頭與紅色十字標誌)。B.圖為細菌的剖面圖，紅色圓形為螢光分子在細胞膜上的位置。圖中的兩個螢光分子位置位在細菌的上側最高點與下側最低點，其投影在顯微鏡上的影像距離接近，但其實際距離卻差了半隻菌的弧長。為了能區分上下側，我們若對焦在細菌的下側，則下側螢光分子的點擴散函數在擬合時會產生較小的標準差(如圖 A 中的紫色距離)，上側則會擬合出較長的標準差，藉由以標準差當域值，可以篩選出同側的螢光分子。C.當螢光分子在同一側，其投影下來的位置仍因為細菌的圓弧表面而產生扭曲(如圖中兩籃色箭頭的長度不一致)。此長度扭曲可藉由將圓弧表面「攤平」進行修正。. 22.

(33) 圖 2. 3 Ripley’ K 函數與 DBSCAN 示意圖. 圖 2.3. Ripley’ K 函數與 DBSCAN 示意圖. A.為 Ripley’s K 函數的示意圖，以特定點為圓心，隨著半徑的增加，統計涵蓋的點數，最後會得到一累積分佈函數。輪流計算每個點後，將每個點的累積分佈平均，便能得到此系統的 K 分佈函數。B.為當 Ripley’s K 函數遇到邊界時，由於邊界外存在位點的機率為零，此舉會低估此半徑所統計到的點數，故我們需要針對邊界進行修正。 C-E.為當空間有一散佈點的分佈，藉由 DBSCAN 的方式，以各點為圓心，特定長度為半徑畫圓。當圓內的位點數超過特定域值，則會判定這些點為同一堆積。. 23.

(34) 圖 2. 4 誘導系統示意圖. 圖 2.4. 誘導系統示意圖. 藉由誘導系統，我們能添加誘導劑來轉錄所需要的蛋白數量進入細胞體內。A.為基因過度表達的實驗中所設計的誘導系統。我們在乳糖操縱子上接上 fliF-mtq 的序列，便能利用給與 IPTG 來增加 FliF-mTurquoise 的數量；在阿拉伯糖操縱子上街上 flhA-yfp 的系列，便能利用給予阿拉伯糖來增加 FlhA-YFP 的數量。B.在單分子顯微術的實驗中，以數量為變因所設計的誘導系統。為了減少變因，我們使用同一種質體與誘導系統。在目標蛋白後面接上 mgeos 是為了確認誘導系統有轉錄出額外數量的蛋白。C.為同時增加 FliF 與 FlhA，我們將原有的 fliF-mgeos 序列後面接上 flhA-mtq 的序列。. 24.

(35) 第三章實驗材料與方法. 我們的實驗主要分成三個部分：基因過度表達、光漂白後螢光恢復、單分子顯微定位實驗。即便我們知道細胞在液態溶液裡面會生長鞭毛，選定特定的生長條件讓鞭毛與螢光蛋白能在最活躍的狀態下折疊完成仍是重要的。除此之外，由於我們使用螢光蛋白光漂白的特性來蒐集單分子的位置，此過程也會損失大量的螢光分子。因此，尋找一個穩定且能重複的實驗條件能幫助我們更有效率的蒐集數據。本章節會介紹我們為了達成 1.3 節與 2.3 節的目標，所進行實驗操作與流程。於 3.1 節會介紹我們所準備的實驗樣品的種類與過程；於 3.2 節會介紹我們在進行實驗的流程與如何尋找到合適的實驗條件；於 3.3 節會解釋在取完數據後，如何進行分析與設定參數。. 3.1 實驗樣品製備這個小節會介紹我們實驗中所使用的菌株與質體的製備過程，會在 3.1.1 節中介紹菌株；3.1.2 節中介紹質體。 3.1.1. 菌株. 為了能夠觀察到染色體所轉錄轉譯出來的 FlhA 與 FliF，我們皆在其後面接上不同螢光蛋白。我們事先利用聚合酶連鎖反應技術(Polymerase Chain Reaction, PCR)來製作所需要插入染色體的 DNA 片段，並利用勝任細胞 BW25141 與帶有 R6Kγ 複製起點的質體來大量生產。再使用 Red 同源基因重組 (The lambda red recombineering)的方式將 DNA 片段接入我們想要接上的位置，如表 3.1。 I.. USS3：為了觀察 FlhA 在基因過度表現與光漂白後螢光恢復的實驗，我們選擇將帶有 yfp 的序列：yecT::FRT::kanR::FRT::flhE::yfp::flhA，以同源重組技術與 25.

(36) RP437 菌株染色體序列 yecT::flhE::flhA 進行交換，再轉形 pCP20A(以下雷同修改)的質體讓其將序列 FRT:: kanR::FRT 變成只有單一 FRT 序列，接著把 pcp20A 質體剔除，便可得到 USS3 的菌株。 USS6：. II.. 為了觀察 FliF，將帶有 mtq 序列： yedN::intG::FRT::kanR::FRT::fliF::mtq::fliG，以同源重組技術與 USS3 染色體序列 yedN::intG::fliF::fliG 進行交換，再轉形 pcp20A 的質體讓其將 FRT::kanR::FRT 變成 FRT，接著把 pcp20A 質體剔除，便可得到 USS6 的菌株。 USS13：. III.. 利用 mScarlet 的光漂白與光閃爍的特性，我們選擇將帶有 mScarlet 的序列：yecT::FRT::kanR::FRT::flhE::mScarlet::flhA，利用同源重組技術與 RP437 菌株染色體序列 yecT::flhE::flhA 進行交換，並利用 pcp20A 把 kanR 踢除後再把質體剔除，便可得到 USS13。 USS14. IV.. 為了觀察 FliF，將帶有 mscarlet 序列： yedN::intG::FRT::kanR::FRT::fliF::mscarlet::fliG，以同源重組技術與 RP347 染色體序列 yedN::intG::fliF::fliG 進行交換，再利用 pcp20A 把 kanR 踢除後再把質體剔除，便可得到 USS14。 3.1.2. 質體. 為了能夠在細胞內產生更多 FlhA 與 FliF 蛋白，我們使用具有誘導機制的質體，方便我們使用誘導劑來調控其數量。其中在 pBR322 上我們插入乳糖操縱子，藉此就能使用人工合成的乳糖操作子誘導物來控制其轉錄過程；在 p15A 上我們加入康黴素(Kanamycin, Kan)形成 p15AK，再接上阿拉伯糖操控子(Larabinose operon)，藉此能利用阿拉伯糖來控制轉錄。再利用聚合酶連鎖反應技 26.

(37) 術將我們不同的目標蛋白接上質體，如表 3.2。而不同質體轉形的菌株如表 3.3。 I.. pBR322-fliF-mtq 轉形進 USS6 中，用以觀測 FliF 的基因過度表達的實驗，在 pBR322 的質體上接上 fliF 與 mtq 的序列，由於 USS6 的染色體上也有 fliF-mtq 的序列，故利用 445 奈米波段的雷射便皆能接收到 FliF-mTq 的螢光。. II.. pBR322-fliF-yfp 轉形進 RP437 中，用以觀測 FliF 的光漂白後螢光恢復實驗，在 pBR322 的質體上接上 fliF 與 yfp 序列。. III.. p15AK-flhA-yfp 轉形進 USS3 中，用以觀測 FlhA 的基因過度表達與光漂白後螢光恢復的實驗，在 p15AK 的質體上接上 flhA 與 yfp 的序列，由於 USS3 的染色體上也有 flhA-yfp 的序列，故利用 488 奈米波段的雷射便皆能接收到 FlhA-YFP 的螢光。. IV.. pBR322-fliF-mGeos 轉形至 USS13 與 USS14 中，用以擔任單分子顯微術的實驗中增加 FliF 數量的變因，但為了控制接收螢光只有染色體上螢光蛋白，質體上的螢光蛋白選擇不同光譜的 mGeos，同時用以確認誘導後的數量。. V.. pBR322-flhA-mGeos 轉形至 USS13 與 USS14 中，用以擔任單分子顯微術的實驗中增加 FlhA 數量的變因，但為了控制接收螢光只有染色體上螢光蛋白，質體上的螢光蛋白選擇不同光譜的 mGeos，同時用以確認誘導後的數量。. VI.. pBR322-fliF-mGeos-flhA-mtq 轉形至 USS13 與 USS14 中，用以擔任單分子顯微術的實驗中同時增加 FliF 與 FlhA 數量的變因，但為了控制接收螢光只有染色體上螢光蛋白， 27.

(38) 質體上的螢光蛋白選擇不同光譜的 mGeos 與 mTq，同時用以確認誘導後的數量。. 3.2 實驗觀察流程這個章節會介紹我們在樣品製備完成後，如何在適當的養菌條件下觀察到 FlhA 與 FliF 的堆積現象。在 3.2.1 節中，會介紹我們所使用的光學設備；在 3.2.2 節中會介紹我們實驗操作的流程。 3.2.1. 光學儀器. 我們觀察樣品所使用的是倒立式螢光顯微鏡(OLYMPUS IX71)，其所使用的是放大倍率一百倍的物鏡(Olympus UPlanFL N 100X/1.30 Oil，JAPAN)。接受光子訊號端則使用電子倍增電荷耦合元件相機(EMCCD digital camera， HAMAMATSU ImageEM)。其中，在光漂白後螢光恢復的實驗中光漂白過程是使用雷射共軛焦掃描單元(OLYMPUS FLUOVIEW)。實驗中我們使用了三種螢光蛋白：mScarlet、YFP 與 mTurquoise，因此我們所使用的雷射為 561 nm(CLASS IIIb LASER PRODUCT MGL-N-561-30mW)、 488 nm(CLASS IIIb LASER PRODUCT MGL-N-488-30mW)、445 nm(UHGLGPS)，出光的功率分別為 561 nm 的雷射1.8 μW、488 nm 的雷射70 μW、 445 nm 的雷射300 nW。再共軛焦掃描單元中所使用在光漂白的雷射功率則為 300 nW。 3.2.2. 實驗條件. 由於細胞在不同的生理狀態與條件下，所生長的鞭毛數量，與鞭毛的基因表現量皆有影響，故在取得所需要的數據前，我們欲在細胞擁有最旺盛的鞭毛生長條件下進行觀測。以下會介紹我們實驗觀測前所進行的樣品準備。 ⚫. 基因過度表達 ◼. 養菌步驟： 1. 將目標菌株(USS3/p15AK-flhA-yfp、USS6/pBR322-fliF-mtq)稀釋 28.

(39) 1/1000 倍培養製 LB(Lysogeny broth)，並將此培養液放置 37 度培養箱中，以轉速 240 rpm 速度搖晃 18 小時。 2. 再將培養液中的菌株以 1/100 倍稀釋至 LB 培養液中，後將培養液放置 37 度培養箱中，以轉速 240 rpm 速度搖晃培養。此時用分光光度計(Termo scientific Multisskan go)測量此菌液對波長 600 奈米的光的西光度測得OD600 為 0.015 值。 3. 待培養約 4 個小時，OD600 測得約 0.05 值後，將培養液中的菌株放入離心機中，以 2000 rpm 離心三分鐘。倒去上清液後，用 M9 溶液進行稀釋後便能觀察，此步驟是為了能降地背景的雜訊。而我們所使用的 M9 溶液為 BD 公司 Difco™ M9 Minimal Salts，5×的粉末配製而成，裡面皆會添加濃度為 0.1%的酪蛋白胺基酸(casamino acids，BactoTM)、0.5 mg/ml 的焦磷酸硫胺素(thiamine hydrochloride，Sigma-Aldrich)、0.15 mg/ml 的生物素(biotin， Sigma-Aldrich)、0.4%的甘油(glycerol)、 0.002 M 的 MgSO4。 ◼. 觀察步驟： 1. 為了將菌株能固定在玻片上，我們觀測前一小時使用 M9 溶液與洋菜膠粉末(SeaPlaque○ Agarose low melting temperature agarose)來製 R. 作濃度為 2%的洋菜膠溶液，並在溶液中分別添加 100μM的 IPTG 與 0.2%的阿拉伯糖(β-L-Larabinose)。將配好的洋菜膠溶液中取 15μl出來，點在塗有真空油的25 × 75mm 的載玻片(VMR micro slides)上，並以18 × 18mm 的蓋玻片(Deckgläser cover glasses)覆蓋之，將其靜置於室溫中半小時，載玻片上的洋菜膠溶液即會凝固。 2. 將凝固而附著於18 × 18mm 蓋玻片上還有 IPTG 的洋菜膠從 25 × 75mm 的載玻片上取下，點0.3μl要 USS3/p15AK-flhA-yfp 的菌液於其上；同樣將含有阿拉伯糖的載波片取下，點同樣體積的. 29.

(40) USS6/pBR322-fliF-cfp 的菌液在其上，並分別將其覆蓋於 25 × 25mm 的載玻片(Deckgläser cover glasses)上。 3. 將玻片樣本放置於顯微鏡上，以曝光時間為 0.1 秒，曝光間格為 60 秒的方式 USS3/p15AK-flhA-yfp 以 488 奈米的雷射照射；對 USS6/pBR322-fliF-cfp 以 455 奈米的雷射照射，總計對菌株照射 90 分鐘。 ⚫. 光漂白後螢光恢復實驗 ◼. 養菌步驟： 1.. 將目標菌株(USS3/p15AK-flhA-yfp、RP437/pBR322-fliF-yfp)稀釋 1/1000 倍培養製 LB，並將此培養液放置 37 度培養箱中，以轉速 240rpm 速度搖晃 18 小時。. 2.. 再將培養液中的菌株以 1/100 倍稀釋至 LB 培養液中，並對含有 RP437/pBR322-fliF-yfp 的培養液添加 20μM的 IPTG 人工合成乳糖操縱子誘導物，並對含有 USS3/p15AK-flhA-yfp 的培養液添加 0.02%的阿拉伯糖(β-L-Larabinose)，後將培養液放置 37 度培養箱中，以轉速 240rpm 速度搖晃培養。此時用分光光度計(Termo scientific Multisskan go)測量此菌液對波長 600 奈米的光的吸光度測得OD600 為 0.015 值。. 3.. 待培養約 4 個小時，OD600 測得約 0.05 值後，將培養液中的菌株放入離心機中，以 2000rpm 離心三分鐘。倒去上清液後，用 M9 溶液進行稀釋後便能觀察。. ◼. 觀察步驟： 1.. 為了將菌株能固定在玻片上，我們觀測前一小時使用 M9 溶液與洋菜膠粉末來製作濃度為 2%的洋菜膠溶液，將配好的洋菜膠溶液中取 15μl出來，點在塗有真空油的25 × 75mm 的載玻片上，並以 30.

(41) 18 × 18mm 的蓋玻片覆蓋之，將其靜置於室溫中半小時，載玻片上的洋菜膠溶液即會凝固。 2.. 將凝固而附著於18 × 18mm 蓋玻片上的洋菜膠從25 × 75mm 的載玻片上取下，點0.3μl要觀測的菌液於其上，將其覆蓋於 25 × 25mm 的載玻片上。. 3.. 將玻片樣本放置於顯微鏡上，並先以共軛焦顯微鏡以選定區域的大小用 488 奈米的雷射進行照射 20 秒。再以螢光顯微鏡以曝光時間為 0.05 秒，曝光間格為 1 秒的方式用 488 奈米的雷射照射，總計對菌株照射 10 分鐘。. ⚫. 單分子顯微術觀測 ◼. 養菌步驟： 1.. 將目標菌株稀釋 1/1000 倍培養製 M9，並將此培養液放置 37 度培養箱中，以轉速 240rpm 速度搖晃 18 小時。. 2.. 再將培養液中的菌株以 1/50 倍稀釋至 M9 培養液中，並分別添加加 20μM、80μM、320μM 的 IPTG 人工合成乳糖操縱子誘導物，並後將培養液放置 37 度培養箱中，以轉速 240rpm 速度搖晃培養。此時用分光光度計(Termo scientific Multisskan go)測量此菌液對波長 600 奈米的光的西光度測得OD600 為 0.04 值。. 3.. 待培養約 6 個小時，OD600 測得約 0.05 值後，將培養液中的菌株放入離心機中，以 2000rpm 離心三分鐘。倒去上清液後，用 M9 溶液進行稀釋後便能觀察。. ◼. 觀測步驟： 1.. 為了將菌株能固定在玻片上，我們觀測前一小時使用 M9 溶液與洋菜膠粉末來製作濃度為 2%的洋菜膠溶液，將配好的洋菜膠溶液中取 15μl出來，點在塗有真空油的25 × 75mm 的載玻片上，並以 31.

(42) 18 × 18mm 的蓋玻片覆蓋之，將其靜置於室溫中半小時，載玻片上的洋菜膠溶液即會凝固。 2.. 將凝固而附著於18 × 18mm 蓋玻片上的洋菜膠從25 × 75mm 的載玻片上取下，點0.3μl要觀測的菌液於其上，將其覆蓋於 25 × 25mm 的載玻片上。. 3.. 將玻片樣本放置於顯微鏡上，以曝光時間為 0.05 秒，連續照射下以 561 奈米的雷射照射，總計對菌株照射 1 分鐘；並再用白光以 0.5 秒曝光時間拍攝一張細菌輪廓。. 3.3 實驗數據分析在獲得拍攝的影像後，但從這些原始影像中要得到更詳細的數據需要借助軟體的幫忙。3.3.1 節會介紹關於單分子顯微術的分系過程。 3.3.1. 單分子顯微術分析. 如同 2.1.2 節中，我們利用 ImageJ 的插件軟體，ThunderSTORM 來取得 mScarlet 螢光蛋白在光閃爍之後的位置分佈座標[14]。再將其作標與拍攝到的白光拍攝到的細菌輪廓，利用 MATLAB 的軟體進行分析。利用 MATLAB 尋找出影像上的特定域值後，我們能皆細菌的輪廓分割出來，得到一張二元影像，並將得到的座標點標記在影像上。再利用 2.1.3 的方式，先對高斯擬合後標準差設定域值，藉此篩選掉位於另一側的細菌表面，再對細菌進行圓弧面的修正，最後便可得到攤平結果的座標。再利用 Ripley’s K 函數的公式與 MATLAB 內建的基於密度的聚類演算法的指令對分子座標進行分析。. 32.

(43) 表 3. 1 菌株表菌株. 說明. 抗藥基因. RP437. Wield type. None. USS3. yecT::FRT::kanR::FRT::flhE::yfp::flhA. None. USS6. yedN::intG::FRT::kanR::FRT::fliF::mtq::fliG. None. USS13. yecT::FRT::kanR::FRT::flhE::mscarlet::flhA. None. USS14. yedN::intG::FRT::kanR::FRT::fliF::mscarlet::fliG. None. 33.

(44) 表 3. 2 質體表質體. 說明. 抗藥基因. pBR322-fliF-mtq. pBR322, lacI::PlacI::Plac::fliF-mtq. bla. pBR322-fliF-yfp. pBR322, lacI::PlacI::Plac::fliF-yfp. bla. p15AK-flhA-yfp. p15A, araC::ParaC::PBAD::flhA::yfp. pBR322-fliF-mGeos. pBR322, lacI::PlacI::Plac::fliF-mgeos. bla. pBR322-flhA-mGeos. pBR322, lacI::PlacI::Plac::flhA-mgeos. bla. pBR322-fliF-mGeos-. pBR322, lacI::PlacI::Plac::fliF-mgeos-flhA-mtq. bla. flhA-mtq. 34. aphA.

(45) 表 3. 3 質體轉形菌株表菌株 USS3/p15AK-flhA-yfp. 所參與的實驗基因過度表達實驗、. 抗藥基因 aphA. 光漂白後螢光恢復實驗 USS6/pBR322-fliF-cfp. 基因過度表達實驗. bla. RP437/pBR322-fliF-yfp. 光漂白後螢光恢復實驗. bla. USS13/pBR322-flhA-mgeos. 單分子顯微術實驗. bla. USS14/pBR322-flhA-mgeos. 單分子顯微術實驗. bla. USS13/pBR322-fliF-mgeos. 單分子顯微術實驗. bla. USS14/pBR322-fliF-mgeos. 單分子顯微術實驗. bla. USS13/pBR322-fliF-mgeos-flhA-mtq. 單分子顯微術實驗. bla. USS14/pBR322-fliF-mgeos-flhA-mtq. 單分子顯微術實驗. bla. 35.

(46) 第四章實驗結果與討論藉由螢光標記技術，把螢光蛋白接在 FlhA 和 FliF 後面，我們能在顯微鏡底下得到 FlhA 和 FliF 聚集的影像。再藉由質體轉形技術和誘導系統，我們能夠控制 FlhA 和 FliF 的表現量當變因，並利用 Red 同源重組技術，把螢光蛋白的序列接在染色體上的 flhA 和 fliF 基因後面，以此得到原生細胞的 FlhA 和 FliF 的數量當對照。最後再觀察這些聚集的大小，來得到更微觀尺度下鞭毛結構的變化。在 4.1 節中，我們會展示反駁鞭毛隨機分佈的驗證實驗；4.2 節中會介紹我們利用光漂白後螢光恢復實驗，來確立 FlhA 與 FliF 也具有一般膜蛋白的聚集現象而非組成有功能性的結構；4.3 節中會介紹我們利用單分子顯微數來觀察此聚集現象，並在給予不同數量的 FlhA 和 FliF 當變因後得到大腸桿菌調控 FlhA 與 FliF 聚集現象的機制與模型。. 4.1 鞭毛隨機分佈的驗證為了驗證大腸桿菌的生長位置是否符合隨機分佈，我們利用轉形質體進入大腸桿菌體內，並利用誘導系統來產生額外的數量的 FlhA 與 FliF，觀察過程中大腸桿菌的螢光亮點分佈。我們假設若符合隨機組裝假說，則 FlhA 與 FliF 會隨濃度增加，於細胞表面隨機均勻組成諸多尺寸小於繞射極限的基座結構，而在傳統螢光成像下，得到在大腸桿菌表面均勻分散之螢光影像。在 4.1.1 節中，會介紹在我們的觀測中如何驗證這個假設，並在 4.1.2 節中會對 4.1.1 節的實驗結果進行討論。 4.1.1. 隨時間觀察 FlhA 與 FliF 的堆積變化. 我們將大腸桿菌點在帶有誘導劑的洋菜膠溶液上，並觀察其在吸收誘導劑後細胞內螢光堆積分佈隨時間的變化。如圖 4.1 所示，在細胞剛接觸膠的 30 分鐘內，可以看到細胞體內有零星的光點。這些光點可視為原本從染色體轉錄到. 36.

(47) 摺疊完畢的 FlhA 的堆積，且此堆積也可理解為 FlhA 所組織成鞭毛的外輸出結構。當隨著時間來到 70 分鐘後，原本 FlhA 的堆積點變的更亮，其堆積範圍也有變大的趨勢。同樣的實驗在 FliF 後面接藍色螢光蛋白也有一樣的結果。 4.1.2. 結果討論. 根據圖 4.1 中的趨勢，當顯微鏡底下看到的光點變亮，代表在光點的空間內存在更多接著螢光蛋白的 FlhA 和 FliF。因此，我們可以在定性上得到 FlhA 和 FliF 兩種蛋白在數量變多的條件下，會在固有鞭毛結構旁生長組織新的堆積。倘若鞭毛是隨機生長的機制，在數量變多下應會得到更多堆積，更甚者會佈滿整個細胞膜。然而，此假設與我們所觀察到的結果互相違背。在緒論 1.3 節中所提到：眾多膜蛋白皆具有組成無功能性的結構與堆積。故此也延伸出一個疑問：這些看似變大、數量變多的堆積，裡面除了原本存在的鞭毛結構外，是否有新的結構產生。. 4.2 光漂白後螢光恢復實驗驗證 FlhA 與 FliF 的堆積現象為了驗證猜測，我們使用光漂白後螢光恢復實驗來檢驗 FlhA 和 FliF 的堆積是否為有功能的結構，或只是大量單體群聚的結果。於 4.2.1 節會介紹我們如何用光漂白後螢光恢復實驗來驗證我們的猜測；於 4.2.2 節會說明驗證結果。 4.2.1. 針對 FlhA 與 FliF 堆積現象的光漂白後螢光恢復實驗. 假設 FlhA 與 FliF 與其他膜蛋白都擁有會在細胞膜上進行無功能性結構的堆積，且此堆積內的蛋白是能夠隨著布朗運動自由擴散的，則我們能利用光漂白後螢光恢復顯微術，將特定區域的堆積光漂白。光漂白區域內的螢光分子會因為光電子已進入暗態而無法發亮。而隨著細胞膜上分子進行著自由擴散，在光漂白區域外的分子會與區域內的分子進行混合，會觀察到原本光漂白區域逐漸變亮的過程。藉由觀察暗亮變化，我們能了解其在細胞膜上的運動狀態。從圖 4.2 中我們可以看到，經過激發光二十秒鐘的光漂白後，觀察整體細胞的變化五分鐘，得到原本被光漂白的區域逐漸復甦的現象。7 分鐘後，變可 37.

(48) 觀察出光漂白區域的亮度與非光漂白區域的亮度已達平衡。 4.2.2. 結果討論. 根據 2011 年 Sourjik 針對 FliF 脫離 MS-ring 的現象進行光漂白後螢光恢復實驗發現 FliF 在十分鐘內是完全沒有恢復的跡象[3]；2010 年 Ishijima 的實驗，則是同樣運用光漂白後螢光恢復實驗觀察鞭毛馬達蛋白 FliM 脫離與嵌上馬達結構的現象，發現需要一百二十分鐘，光漂白區域與非光漂白區域的亮度才會達平衡[15]。由此可知，即便是位在鞭毛結構外圍的 FliM，膜蛋白要脫離或嵌上結構是耗時且不容易發生的，更遑論 FliF 與 FlhA 是在鞭毛結構中的深處。而在我們的觀察中卻得到短至七分鐘的復甦結果，則代表在 4.1 節中所看到的堆積，只是單體的蛋白群聚後所產生的，並非形成牢不可分的結構。. 4.3 單分子顯微術觀測不同濃度下的 FlhA 與 FliF 群聚現象然而礙於繞射極限的存在，只能看到最小兩百奈米解析度的群聚現象。為了能從群聚中得到更微觀資訊，我們使用單分子顯微術來觀察 FlhA 與 FliF 在細胞內的堆積。以下，我們會從群聚現象中的幾個面向進行討論：從 Ripley’s K 函數的統計結果，我們能得到堆積程度與距離有關的 L 曲線的分佈，並比較不同條件下分佈峰值所代表堆積半徑的期望值。從半徑的期望值，回推回 K 函數中，可以得到在此半徑中，多少比例的分子參與聚集；在 DBSCAN 中，我們能得到演算法所歸類的平均細胞堆積數量與參與各堆積的分子數，故我們也能同時比較 Ripley’s K 函數與 DBSCAN 兩種演算法所得到分子參與堆積的比例趨勢；而針對各堆積的分子分佈，我們能利用迴轉半徑去描述此堆積的體積大小。在後面的節數與圖表中，我們會陳列實驗分析的結果。其中，所有圖表皆會以藍色分佈統計代表觀測 FlhA；綠色代表觀測 FliF。在 4.3.1 節中，我們會先呈現只增加 FliF 數量當變因的分析結果；在 4.3.2 節中，會呈現只增加 FlhA 數量的結果；在 4.3.3 節中，會再呈現們同時增加 FliF 與 FlhA 數量的結果。 38.

(49) 4.3.1. 以 FliF 數量為變因得到 FlhA 不顯著變化與 FliF 分佈變廣. 從圖 4.3A-B 中，我們可以從 L 分佈中得知，FlhA 堆積的半徑因為 FliF 數量增加而產生變化並不顯著，只有從 300 奈米增長到 340 奈米。此長度的增加並不顯著的原因為我們單分子位點的解析度也只有 20 奈米到 40 奈米，故我們很難從增加的 40 奈米推估平均半徑的增加；而 FliF 堆積的半徑也是從 300 奈米增長到 340 奈米。同理，我們也很難從中給出半徑曾長的結論。在圖 4.3C-D 中，我們可以從參與堆積的比例中得出 FlhA 的比例從0.43 ± 0.02降低至0.40 ± 0.02。由於下降的幅度並不劇烈，代表 FliF 數量的增加對於 FlhA 參與堆積的比例並無顯著變化；而在參與堆積的 FliF 比例中，從最初始的原生狀態有0.40 ± 0.03的比例，到給予80μM的 IPTG 後，比例提高到0.42 ± 0.02，但在320μM的 IPTG 的環境中，比例又下降到0.37 ± 0.02。整體而言，雖然起初增加 IPTG 讓參與比例增加，但增加的幅度並不顯著，而在320μM的環境下參與比例下降至0.37 ± 0.02。此結果我們認為 FliF 參與堆積的比例是會隨著 FliF 數量的增加而略微減少，但此減少要在 FliF 數量大量增加的情況下才會有明顯變化，即便此變化仍就不顯著。在圖 4.4A-D 中，我們以 DBSCAN 來進行分析參與堆積的分子比例與產生的堆積數量。在圖 4.4A-B 中，FlhA 參與堆積的分子比例並不受 FliF 數量的增加，始終保持約0.88 ± 0.01的比例；在 FliF 參與堆積的分子比例也不受 FliF 數量的增加而影響，保持0.88 ± 0.01的比例。此結果與 Ripley’s K 函數的結果大致相同，皆代表著 FliF 數量的增加對於 FliF 參與比例上並沒有顯著的差別。在圖 4.4C-D 中，FlhA 所產生的堆積數量，隨著 FliF 數量增加，並沒有顯著變化，各個條件下平均產生約產生4.5 ± 0.3的堆積數量；而 FliF 所產生的堆積數量則從6.16 ± 0.43增加至7.92 ± 0.54，堆積數量有略微的增加的趨勢。在圖 4.4E-F 中，FlhA 各個堆積所產生的平均迴轉半徑，在 FliF 數量的增加下並無變化，皆保持平均422.38 ± 0.19奈米的大小；而 FliF 各個堆積所產生 39.

(50) 的平均迴轉半徑則從499.53 ± 1.01奈米增加到541.72 ± 0.55奈米，有較明顯的變大的趨勢。故此，我們發現增加 FliF 數量對於 FlhA 的結構幾乎完全沒有影響，FlhA 在不管多少數量的 FliF，皆能保持穩定的堆積；但對於 FliF 而言，雖然 L 函數的分佈並無顯著變化，但堆積的平均迴轉半徑卻有增加的趨勢，FliF 堆積的數量也有變多的現象發生，代表額外的 FliF 會向 FliF 的堆積聚集，並且同時會再產生新的堆積。這可理解為 FliF 的堆積或許有一定的作用區域，當區域內的蛋白達飽和，過多的 FliF 便只能在其他地方產生新的堆積，如圖 4.9。 4.3.2. 以 FlhA 數量為變因得到 FlhA 具有分離堆積的特性. 在圖 4.5A-B，從 L 分佈中我們可以看到 FlhA 隨著 FlhA 數量的增加，整體分佈有向右偏移的趨勢，堆積半徑也從 260 奈米增加到 380 奈米，有相當顯著變大的趨勢；在 FliF 的分佈中，半徑保持約 300 奈米並無明顯變化。在圖 4.5C-D，FlhA 的增加對於 FlhA 參與堆積的比例從0.45 ± 0.02下降到 0.39 ± 0.02，有明顯的下降的趨勢；而在 FliF 參與堆積的比例則是從0.53 ± 0.02下降到0.43 ± 0.02，有更明顯的下降趨勢，代表 FlhA 數量增加，會讓 FliF 參與堆積的比例下降。在圖 4.6A-B，我們再次對比 DBSCAN 對於分子參與堆積比例的結果，發現 FlhA 隨著 FlhA 數量增加，參與堆積比例從0.90 ± 0.01下降到0.80 ± 0.01，有大幅下降的趨勢；而 FliF 則隨著 FlhA 數量的增加，參與堆積的比例保持 0.90 ± 0.01不變，與 Ripley’s K 函數得到不一樣的結果。在圖 4.6C-D，FlhA 平均堆積數量則隨著 FlhA 的增加，從5.27 ± 0.24下降到3.85 ± 0.28，有略微下降但並不是非常的明顯；FliF 的平均堆積數量則不受 FlhA 的數量影響，保持約4.10 ± 0.24的堆積數量。在圖 4.6E-F，FlhA 數量的增加讓 FlhA 本身平均堆積的迴轉半徑縮小，從 479.39 ± 4.76奈米縮小至423.61 ± 0.84奈米，此結果與 L 分佈變大的趨勢互相 40.

(51) 衝突；在 FliF 平均堆積的迴轉半徑，則得到隨著 FlhA 數量增加而從437.39 ± 0.91奈米增加至486.04 ± 0.17奈米，也與 L 分佈的結果不同，有較顯著變大的趨勢。因此，對 FlhA 而言，從比例上的下降可以看出額外增加的 FlhA 並不會讓更多 FlhA 參與堆積，而在 L 函數中的半徑變大與迴轉半徑變小的衝突中，我們認為是額外的 FlhA 蛋白會散佈在原有的 FlhA 堆積旁，但卻無法藉由聚集讓彼此狀態穩定下來。迴轉半徑的下降也讓我們懷疑，給與環境更多的 FlhA 是否會讓部分 FlhA 從原有的堆積中分離出來；而對於 FliF 而言，K 函數中的參與比例下降，猜測 FlhA 的增加對 FliF 堆積而言會產生強烈的交換過程。若比照對於 FlhA 堆積的影響，我們會發現給予額外的 FlhA 不僅僅會分離堆積中的 FlhA 與 FliF，更甚者也會取代 FliF 在堆積中的位子。然而，DBSCAN 的參與比例與堆積數量持平，代表 K 函數的下降可能只是對於最顯著半徑的堆積而言是分離的結果，但被分離出來的 FliF 可能仍舊在堆積內。故我們進一步猜測被分離出來的 FliF 或許並沒有完全脫離原本的堆積，而是停在堆積處的外圍，以至於得到較大的迴轉半徑，如圖 4.9。 4.3.3. 以 FliF 與 FlhA 數量為變因得到新的堆積. 在圖 4.7A-B，我們同時增加 FliF 與 FlhA 的數量，並觀察 L 曲線的分佈。與其他條件的結果相反， FlhA 隨著兩種蛋白數量的增加，堆積半徑從 320 奈米縮小成 220 奈米；FliF 隨著兩種蛋白數量的增加，半徑則是從 280 奈米增加到 360 奈米，略微增加。在圖 4.7C-D，FlhA 參與堆積的比例，也隨著兩種蛋白數量的增加，顯著提高，從0.34 ± 0.02提升至0.55 ± 0.04，代表兩種蛋白數量的增加會讓 FlhA 正回饋的加強參與堆積的現象；FliF 參與堆積的比例則從0.44 ± 0.02下降至0.36 ± 0.01。在圖 4.8A-B，利用 DBSCAN，在參與堆積的比例上，FlhA 得到一樣的結 41.