行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
瘦體素抗糖尿作用於胰島素依賴性及非胰島素依賴性機轉
之研究(1/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2313-B-002-387- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學獸醫學系暨研究所 計畫主持人： 郭應誠 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 92 年 11 月 25 日
瘦體素抗糖尿作用於胰島素依賴性及非胰島素依賴性機轉之研究(1/3)
瘦體素重組蛋白質與瘦體素單株抗體之製備
郭應誠 國立台灣大學獸醫學系 I n g - C h e r n g G u o D e p a r t m e n t o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e , N a t i o n a l T a i w a n U n i v e r s i t y , T a i p e i , T a i w a n P l e a s e a d d r e s s a l l c o r r e s p o n d e n c e t o : D r . I n g - C h e r n g G u o , D e p a r t m e n t o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e , N a t i o n a l T a i w a n U n i v e r s i t y , T a i p e i , 1 0 6 T a i w a n . T E L : 8 8 6 - 2 - 2 3 6 3 0 2 3 1 e x t 2 7 6 1 e x t 2 2 0 2 . F A X : 8 8 6 - 2 - 2 3 6 6 1 4 7 5 . E - m a i l : i g u o @ c c m s . n t u . e d u . t w. T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y A c a d e m i a S i n i c a a n d b y g r a n t s f r o m N a t i o n a l S c i e n c e C o u n c i l , R e p u b l i c o f C h i n a , N S C 9 1 - 2 3 1 3 - B - 0 0 2 - 3 8 7摘要 糖尿病在人類醫學上是世界性的內分泌障礙疾病，主要原因為胰島素分泌 或功能障礙所致。有報告認為瘦體素有似胰島素的功能，可以調控糖類代謝，促 使細胞對糖的利用，也有研究指出瘦體素會抑制胰島素的分泌，體內高瘦體素患 者會有胰島素抗性，因此瘦體素的抗糖尿作用仍有許多爭議。而本計畫欲探討瘦 體素的抗糖尿作用、與胰島素的交互作用、以及這些作用的機轉。我們期望在確 認瘦體素的效用後，能提供治療糖尿病症多一項有效的選擇；而瞭解其作用機轉 後，在未來治療使用時，能提供藥理基礎，確立使用原則，避免不良副作用。現 階段我們已製備出可專一辨識瘦體素單株抗體，將可利用於分析組織細胞分泌之 瘦體素之，並建立免疫分析套組分析體液內之瘦體素之含量，配合本實驗室以建 構完成之胰島素分析套組，可作為進一步研究瘦體素及胰島素之間相互關係之工 具。 前言 糖尿病在人類醫學上是世界性的內分泌障礙疾病，開發程度越高之國家， 發生率越高。1997 年的指出，全世界的糖尿病患超過兩億人口（McCarty et al., 1997）。在美國，糖尿病多年來高居十大死因，醫療費用高達每年 919 億美元（約 3 兆新台幣）平均每人每年約需支付 3300 美元的醫療費用。近年來，台灣已從 開發中國家進入已開發國家，因此，糖尿病發生率逐年升高，自 1983 年後，糖 尿病年醫療花費佔年總醫療費用 11.5%（約 300 億元），而 1999 年因糖尿病死亡 人數佔台灣總死亡人數之 7%以上。但即使在先進國家，糖尿病的診斷率仍然偏 低，不僅發現太晚，不利治療，而且隱性病患率在已開發國家達 50%，開發中國 家高達 75%，第三世界國家則更是無從評估。在動物醫學，美國賓州 1993 至 1998 年間統計犬隻糖尿病發生率約 0.5%（Rebecka et al., 2000）。而在 1980 至 1986 年間在美、加等地貓糖尿病發生率約 0.25%（Panciera et al., 1990）。不可諱言， 動物醫學對糖尿病之診斷與治療相較於人類醫學要更原始，據此推論，隱性動物 病患比率應該是相當高。顯然，不論在人類醫學或是在動物醫學，我們對糖尿病 的了解仍然不足。除了對致病機轉仍待更多研究探討外，早期診斷的系統也需儘 早建立，而糖尿病屬於慢性內分泌障礙疾病，尋求有效藥方，更是學者努力的地 方。 瘦體素與胰島素的關係十分密切，許多實驗指出兩者間可能有加乘或拮抗 的作用，如缺乏瘦體素基因小鼠，會有嚴重的高血糖、胰島素抗性。有報告認為 瘦體素有似胰島素的功能，可以調控糖類代謝，促使細胞對糖的利用，也有研究 指出瘦體素會抑制胰島素的分泌，體內高瘦體素患者會有胰島素抗性，因此瘦體 素的抗糖尿作用仍有許多爭議。本計畫即將以新的小鼠模式與研究方法，嘗試求 證瘦體素的抗糖尿效用及其機轉。若瘦體素可作為有效的糖尿病治療藥物，可以
提供糖尿病患者多一項選擇，尤其是當胰島素治療已無法發揮其效用，多一項有 效的藥物可以延長患者的生命，等待新藥的研發，不論在獸醫或人醫，都將具體 造福病患。
材料與方法
IPTG 誘導之時程效應與劑量反應 (Time-course and dose-response of IPTG induction ) 自選定的宿主菌株中挑單一菌落培養於 2ml 含 50µg/ml Kanamycin 的 LB 培 養液中，於 37℃培養箱中以每小時 200 轉的轉速過夜培養，第二天取適量菌液 添加在 100ml 含 50µg/ml 之 Kanamycin 的 LB 培養液，以每小時 200 轉的轉速在 37℃培養箱中繼續培養，至菌液的 O.D.590達 0.6-0.8 後再分別添加 0.1、1、10mM IPTG 繼續培養 6 小時，並在 0、1、2、3、4、5、6 小時等七個時間點收集菌液， 取 20µl 進行進行 12％SDS-PAGE 電泳分析，評估最適當之 IPTG 劑量及處理時 程。
包含體溶解試驗 (Solubility of inclusion body)
自選定的宿主菌株挑單一菌落培養於 1.5L 含有 50µg/ml 之 Kanamycin 的 LB 培養液培養，並以 0.1mM IPTG 誘導表現 6 小時後，將菌液以 1100xg 離心，去 除上清液，將菌體以 lysozyme 在 4℃作用 2 小時以上，再以超音波震碎菌體，經 離心分成上清液及沈澱物，上清液收取保存後，將沈澱物以含 6M 尿素而 pH7.0、 8.0、9.0，及 9M 尿素 pH9.0 的變性溶液進行清洗，然後將各個清洗後的上清液 及最後剩下的沈澱物進行 12％SDS-PAGE 電泳分析，來判斷包含體中重組蛋白 質的溶解情形。 重組蛋白之純化 將 His-bind resin 混合均勻，取 3 浬裝填於管柱，靜置使液體自然流出。以 6ml 之無菌水、10 ml NiSO4 及 6mlbinding buffer 依序清洗管柱，取韓重祖蛋白 之尿素溶解液通過管柱，使樹脂充分吸附重組蛋白，再以 binding buffer 及 washing buffer 將非專一性蛋白洗除，最後以 elution buffer 純化出重組蛋白。 單株抗體的製備：
取重組蛋白為免疫原免疫之小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞 NS-1 進行細 胞融合，經過二週 HAT 培養液的選拔(selection)後，再使用 ELISA 進行專一性 融合瘤的篩選(screening)，挑選正反應最強的融合瘤細胞，使用限數稀釋法 (limiting dilution)進行單株化，以獲得單株融合瘤細胞。以獲得分泌抗瘦體素抗 體。
酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)：
於 96 孔免疫分析盤加入每孔 100μL 以吸附液稀釋之重組蛋白。將免疫分 析盤以膠膜密封，置於 4℃冰箱吸附抗體至少一天，同時可儲存於 4℃冰箱中。 分析樣品前 30 分鐘，先將吸附抗原的免疫分析盤取出回溫。以清洗液沖洗三次
後，每孔添加 200μL 填充液，於 37℃填塞一小時。沖洗三次，再每孔加入 100 μL 經適度稀釋過之的融合細胞培養液，此抗原抗體結合反應於 37℃下避光進 行反應 30 分鐘。之後沖洗三次，加入二次抗體作用 1 小時，之後沖洗三次，每 孔加入 200μL OPD 溶液（10 mg OPD 溶於 25 mL 之 PB6.0，於添加前加入 2.5 μL 之 33 % H2O2），於室溫下避光進行呈色反應 15 分鐘。再以 50μL 6N H2SO4 溶液終止反應，於 490 波長下測吸光值。
西方墨點法（Western Blotting Assay）：
將均質化組織或細胞懸浮液(cell lysate)加入等體積 2x sample buffer(4% SDS,125mM Tris-HCl pH6.8, 20% glycerol, 10% B-mercaptoethanol, 0.01% bromophenol blue)混合均勻，在 100OC 煮五分鐘後，注入 10% SDS-PAGE 明膠， 以 60 伏特解析。取下明膠，以電泳將膠上已解析的蛋白轉印至 NC 紙上。已染 印蛋白之 NC 紙浸於含有 5%脫脂奶粉的 PBST 溶液中填塞二小時，之後以 PBST 清洗三次，再與含專一性抗體之 PBST 液體中浸漬二小時，再用 PBST 清洗三次， 以含有35 S 標幟的蛋白質 A 的 PBST 浸漬一小時，最後用 PBST 清洗三次，烘乾 後再行自動放射顯像。 結果與討論 一. IPTG 誘導的時程效應 用 1mM 的 IPTG 誘導大腸桿菌過量表現瘦體素重組蛋白質，並在開始誘導 後從不同時間點收取菌液，經超音波震盪、離心及煮沸處理後，進行 12% SDS-PAGE 電泳分析，發現 IPTG 的誘導效果隨著時間點的增長而增加，其中以 五小時的誘導表現量最大（圖一）。 二. 瘦體素重組蛋白質的溶解試驗 由於瘦體素蛋白質以包含體的形態存在，並不溶於一般的水溶液，為了利 於進行蛋白質的純化工作，乃使用不同尿素濃度的變性溶液嘗試溶解包含體中的 重組蛋白質，結果發現這些變性溶液能溶出瘦體素重組蛋白質，經過這些變性溶 液的清洗，卻使得包含體中瘦體素重組蛋白質的純度越來越高（圖二）。 三、瘦體素重組蛋白之純化 將上述以 6M 及 9M 尿素溶解液溶出之重組蛋白，以 Ni-NTA 親和管柱進行 純化的工作，再以 SDS-PAGE 檢查純化之結果，其純化效果佳且可在第二個 fraction 獲得大量之純化蛋白（圖三）。 四、抗瘦體素單株抗體之生產 利用純化之瘦體素重組蛋白免疫小鼠生產可分泌抗瘦體素抗體之融合細 胞瘤，利用西方墨點法進行確認，所獲得 4H7 單株抗體可有效地辨認市售之人 類及小鼠之瘦體素蛋白，大小為 16KD（圖四）。
M
圖一:IPTG 誘導的時程效應。利用大腸桿菌俊株 JM109 表現的瘦體素重組蛋白質 (20kDa )在七個時間點(0、1、2、3、4、5、6 小時)的 IPTG 誘導後的表現情形。
pQE31: pQE31 載體； pQE31/leptin 瘦體素表現質體；M: 蛋白質標尺。
圖二：瘦體素重組蛋白質的溶解試驗。所使用的溶解液包括：分解液(lysis buffer) 及含 4.5 M、6M 及 9M 尿素 pH 7.0 的變性溶液。P: 沈澱物；M: 蛋白質標尺。 1 6 0 1 2 3 4 5 6 pQE31 pQE31/leptin kDa :Hour 30.0 42.7 17.2 66.2 Lysis buffer pellet 4.5M residual 6M 6M 9M 9M 9M M M
圖三：利用 Ni-NTA 親和力層析管柱純化重組蛋白。將 6M 及 9M Urea 溶解液進 行純化，可獲得一較純瘦體素重組蛋白。 圖四：以西方墨點法偵測以重組蛋白免疫小鼠生產出之單株抗體辨識瘦體素之能 力。4H7 單株抗體可專一辨識豬隻、人類及小鼠之瘦體素。 Elution fraction Crude pass bind wash
1 2 3 4 5 M
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