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苯二取代基化合物與ABTS●+反應之途徑探討

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(1)

國立高雄大學應用化學系(碩士班)

碩士論文

苯二取代基化合物與 ABTS

●+

反應之途徑探討

Study of reaction pathways of disubstituted benzene

compounds with ABTS

●+

研究生:陳心瑀撰

指導教授:何永皓博士

(2)
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目錄

摘要 ... 1 ABSTRACT ... 2 第一章前言 ... 4 第二章文獻回顧 ... 7 2.1 ABTS+的反應機制 ... 7 2.1.1 氫原子轉移與電子轉移 ... 7 2.1.2 ABTS+偵測方式 ... 8 2.3 Hammett equation ... 11 2.4 苯的衍生物與 ABTS+反應的相關研究... 13 2.5 VESI-MS 之介紹 ... 20 第三章實驗方法 ... 21 3.1 藥品 ... 21 3.2 儀器 ... 22 3.3 ABTS.+合成方法 ... 23 3.4 樣品配製方法 ... 23 3.4.1 苯環取代基標準品配製 ... 23 3.5 自動進樣(self-pumping)裝置 ... 23 3.5.1 以 sVESI 進行線上即時偵測 ... 24

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3.6 以 HPLC 分離 ... 25 第四章結果與討論 ... 26 4.1 ABTS+與 benzenediol、benzenediamine、amionphenol 同分異構物 的反應 ... 26 4.1.1 Benzenediol 鄰、間、對位同分異構物與 ABTS+反應 ... 26 4.1.2 Aminophenol 鄰、間、對位同分異構物與 ABTS+反應 ... 36 4.1.2 Benzenediamine 鄰、間、對位同分異構物與 ABTS+反應 ... 42 4.2 Aniline 間位取代基效應 ... 49 4.2.1 Aniline 間位取代基推電子基效應 ... 53 4.2.2 Aniline 間位取代基拉電子基效應 ... 58 4.2.3 其他間位苯環二取代基效應 ... 64 4.3 以不同比例 ABTS+與苯環取代基反應之結果 ... 74 第五章結論 ... 82 第六章參考文獻 ... 85

(5)

圖目錄

圖 2-1 Koleva 等人研究抗氧化力所用的實驗設計圖 11 ... 10 圖 2-2 線上 HPLC-ECD 系統裝置是意圖12 ... 11 圖 2-3 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應 30 秒內之光譜圖變化1 ... 14 圖 2-4 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應 0-10 秒及 1-6 分鐘之光譜變化圖 18 ... 14 圖 2-5 1,2-benzenediol 與 ABTS●+反應之反應機制 19 ... 15 圖 2-6 ABTS●+與 phloroglucinol 反應之反應機制20 ... 17 圖 2-7 Flavonols 與 ABTS●+反應加合物的斷裂機制及其降解途 21 ... 19 圖 2-8 單管進樣(sVESI)及雙管進樣(dVESI)示意圖2 ... 20 圖 3-1sVESI 裝置示意圖 ... 24 圖 3-2 以磁力攪拌器協助 sVESI-MS 裝置進行線上即時偵測 ... 25 圖 4-1 2.5×10-4 M ABTS●+及 1.25×10-4 M benzenediol 三種異構物反應之 質譜圖:(A)反應前(ABTS●+ );(B) ABTS●+加入 1,2-benzenediol;(C) ABTS●+加入 1,3-benzenediol;(D) ABTS●+加 1,4-benzenediol ... 27

圖 4-2 ABTS●+與 1,2-benzenediol 反應途徑 ... 27

圖 4-3 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應途徑 ... 28

圖 4-4 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應加成物(m/z 623)解離途徑 ... 29

圖 4-5 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應之 TIC 圖 ... 30

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圖 4-7 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖:

RT= (A) 3.77、(B) 5.69、(C) 6.83、(D) 22.81 min。 ... 31

圖 4-8 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應加成物 m/z 380、623 趨勢圖 ... 32

圖 4-9 ABTS●+與 ABTS 之 UV 圖 ... 33

圖 4-10 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應隨時間之 UV 變化圖 ... 33

圖 4-11 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應混合液之 HPLC-DAD 圖 ... 34

圖 4-12 ABTS●+與 1,2-benzenediol 隨時間反應之層析圖 ... 34

圖 4-13 ABTS●+與 1,4-benzenediol 隨時間反應之層析圖 ... 35

圖 4-14 (A) 1,4-benzoquinone;(B) ABTS●+與 1,4-benzenediol 反應層析 圖 ... 35 圖 4-15 2.5×10-4 M ABTS●+及 1.25×10-4 M Aminophenol 三種異構物反應 之質譜圖:(A)反應前(ABTS●+ );(B) ABTS●+加入 1,2-aminophenol;(C) ... 37 圖 4-16 m/z 108 之 EIC 圖 ... 37 圖 4-17 ABTS●+與 1,3-aminophenol 隨時間反應之層析圖 ... 38 圖 4-18 ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 2.08、(B) 3.02、(C) 3.77、(D) 7.23、(E) 16.48 min。 ... 39

圖 4-19 ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應隨時間之 UV 變化圖 ... 39

圖 4-20 ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應混合液之 HPLC-DAD 圖 ... 40

圖 4-21 ABTS●+與 1,2-aminophenol 隨時間反應之層析圖 ... 40

圖 4-22 ABTS●+與 1,2-aminophenol 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 2.60、(B) 3.51、(C) 26.68 min。 ... 41

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圖 4-23 ABTS●+與 1,4-aminophenol 隨時間反應之層析圖 ... 42 圖 4-24 2.5×10-4

M ABTS●+及 1.25×10-4 M benzenediamine 三種異構物反 應之質譜圖:(A)反應前 ABTS●+;(B) ABTS●+加入 1,2-benzenediamine; (C) ABTS●+加入 1,3-benzenediamine;(D) ABTS●+加 1,4-benzenediamine ... 43 圖 4-25 m/z 108 之 EIC 圖 ... 43 圖 4-26 ABTS●+與 1,3-benzenediamine 隨時間反應之層析圖 ... 44 圖 4-27 ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 2.05、(B) 2.56、(C) 7.01、(D) 8.19、(E) 25.61 min。 .. 45 圖 4- 28 m/z 621、m/z 619 趨勢圖 ... 46 圖 4-29 ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應隨時間之 UV 變化圖 ... 46 圖 4-30 ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應混合液之 HPLC-DAD 圖 . 47 圖 4-31 ABTS●+與 1,2-benzenediamine 隨時間反應之層析圖 ... 47 圖 4-32 ABTS●+與 1,2-benzenediamine 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 4.03、(B) 8.71、(C) 11.16 min。 ... 48 圖 4-33 ABTS●+與 1,4-benzenediamine 隨時間反應之層析圖 ... 49 圖 4-34 2.5×10-4 M ABTS●+及 1.25×10-4 M aniline、phenol 反應之質譜圖: (A)反應前 ABTS●+;(B) ABTS●+加入 aniline;(C) ABTS●+加入 phenol ... 50 圖 4-35 (A) ABTS;(B) ABTS●+之層析圖 ... 50 圖 4-36 ABTS●+與 aniline 隨時間反應之層析圖 ... 52 圖 4-37 ABTS●+與 aniline 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A)

(8)

3.11、(B) 6.73 min。 ... 52

圖 4-38 ABTS●+與 aniline 反應液不同時間之 UV 圖 ... 53

圖 4-39 2.5×10-4 M ABTS●+及 1.25×10-4 M aniline 間位取代基推電子基 化合物反應之質譜圖:(A)反應前 ABTS●+;(B) ABTS●+加入 3-methoxyaniline;(C) ABTS●+加入 3-aminoacetanilide;(D) ABTS●+加 入 3-methylaniline ... 54

圖 4-40 ABTS●+與 3-methoxyaniline 隨時間反應之層析圖 ... 55

圖 4-41 ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A)3.08、(B) 4.50、(C) 6.66 min。 ... 55

圖 4-42 ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應隨時間之 UV 變化圖 ... 56

圖 4-43 ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應混合液之 HPLC-DAD 圖 ... 56

圖 4-44 ABTS●+與 3-methylaniline 隨時間反應之層析圖 ... 57 圖 4-45 ABTS●+與 3-methylaniline 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A)2.5、(B) 6.01、(C) 7.11 min。 ... 57 圖 4-46 ABTS●+與 3-methylaniline 反應隨時間之 UV 變化圖 ... 58 圖 4-47 2.5×10-4 M ABTS●+及 aniline 間位拉電子基化合物反應之質譜圖: (A)反應前 ABTS●+;(B) ABTS●+加入 3-nitroaniline;(C) ABTS●+加入 3-aminoacetophenone;(D) ABTS●+加入 3-bromoaniline;(E) ABTS●+加 入 3-chloroaniline;(F) ABTS●+加入 4-chloroaniline。 ... 59

圖 4- 48 ABTS●+與 3-nitroaniline 反應隨時間之 UV 變化圖 ... 59

圖 4-49 ABTS●+與 3-bromoaniline 隨時間反應之層析圖 ... 60 圖 4-50 ABTS●+與 3-bromoaniline 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖:

(9)

RT= (A)7.18、(B) 9.06、(C) 16.33 min。 ... 60 圖 4-51 ABTS●+與 3-bromoaniline 反應隨時間之 UV 變化圖 ... 61 圖 4-52 ABTS●+與 3-chloroaniline 隨時間反應之層析圖:LC 條件為 0.5% CH3COOH(pH 6.9):MeOH= 70:30 ... 62 圖 4-53 ABTS●+與 3-chloroaniline 隨時間反應之層析圖:LC 條件為 0.5% CH3COOH(pH 6.9):MeOH= 75:25 ... 63 圖 4-54 ABTS●+與 3-chloroaniline 隨時間反應之層析圖:LC 條件為 0.5% CH3COOH(pH 6.24):MeOH= 70:30 ... 63 圖 4-55 ABTS●+與 3-chloroaniline 反應隨時間之 UV 變化圖 ... 64 圖 4-56 ABTS●+與 4-chloroaniline 反應隨時間之 UV 變化圖 ... 64 圖 4-57 (A) 1,8-diaminonaphthalene;(B) 1,5-diaminonaphthalene 之結構

... 65 圖 4-58 2.5×10-4

M ABTS●+加入 1.25×10-4 M 不同化合物反應之

VESI-MS 質譜圖:(A) 添加前;(B) 添加 1,3-Bis(aminomethyl)benzene; (C) 添加 1,8-diaminonaphthalene;(D) 添加 1,5-diaminonaphthalene .. 65 圖 4-59 ABTS●+與 1,8-diaminonaphthalene 隨時間反應之層析圖 ... 66 圖 4-60 ABTS●+與 1,8-diaminonaphthalene 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 5.55、(B) 6.88、(C) 12.81、(D) 20.25min。 ... 67 圖 4-61 ABTS●+與 1,8-diaminonaphthalene 反應隨時間變化之 UV 圖 . 67 圖 4-62 ABTS●+與 1,3-Bis(aminomethyl)benzene 反應隨時間變化之 UV 圖 ... 68 圖 4-63 2.5×10-4 M ABTS●+及 1.25×10-4 M 不同苯環取代基化合物反應

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之質譜圖:(A)反應前(ABTS●+

);(B) ABTS●+加入 catechin hydrate;(C) ABTS●+加入 epicatechin;(D) ABTS●+加入 chrysin ... 69 圖 4-64 ABTS●+與 1,3-benzenediol 在不同比例下反應: (A) 1:5;(B) 1:2; (C) 1:1;(D) 1:0.5;(E) 1:0.2 ... 75 圖 4-65 ABTS●+與 1,3-benzenediol 在不同比例下反應加成物(m/z 623) 趨勢圖 ... 76 圖 4-66 ABTS●+與 1,3-benzenediol 在不同比例下反應加成物(m/z 380) 趨勢圖 ... 77 圖 4-67 ABTS●+與 1,3-benzenediol 在不同比例下反應加成物(m/z 380) 趨勢圖 ... 78 圖 4-68 ABTS●+與 1,3-benzenediamine 在不同比例下反應: (A) 1:0.2; (B) 1:0.;(C) 1:1:;(D) 1:2;(E) 1:5 ... 78 圖 4-69 ABTS●+與 1,3-benzenediamine 在不同比例下反應加成物(m/z 621)趨勢圖 ... 79 圖 4-70 ABTS●+與 1,3-benzenediamine 在不同比例下反應加成物(m/z 621)趨勢圖 ... 79 圖 4-71 ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應加成物(m/z 619)在不同比例 下反應生成物趨勢圖 ... 80

(11)

表目錄

表 4-1 苯二取代基化合物結構 ... 70 表 4-2 苯二酚取代基種類與位置對反應途徑的影響 ... 73

(12)

苯二取代基化合物與 ABTS

●+

反應之途徑探討

指導教授:何永皓博士 國立高雄大學應用化學系(碩士班) 學生:陳心瑀 國立高雄大學應用化學系(碩士班) 摘要

ABTS 自由基陽離子(ABTS●+)常用於檢測物質抗氧化力的強弱,已知 ABTS●+於反 應中會還原成 ABTS,但是是否還有其他反應途徑存在則較少有研究報導,本研究結合 文氏管電噴灑游離質譜法(VESI-MS)、HPLC、UV/Vis,探討一系列苯環二取代基化合 物與 ABTS●+的反應。這些化合物雖然不是有效的抗氧化物,但是結構相對簡單,研究 結果可以協助了解取代基的相對位置以及種類對反應途徑的影響。VESI-MS 是一種線 上即時偵測的質譜法,可以用來觀測反應進行中成分的變化,並同時加以鑑定。HPLC 則是用來彌補 VESI-MS 不具分離效果,導致無法辨別同分異構物,以及無法偵測到不 利進行電噴灑游離的化合物。 綜合分析 benzenediol、aminophenol、benzenediamine 的鄰位、間位、對位異構物與 ABTS●+的反應結果,可以發現雖然三種不同的位置異構物都會將 ABTS●+還原成 ABTS, 但是唯有間位異構物會另外與 ABTS●+反應,生成加成物[M+ABTS●+-H●]和其他化合物。 以 HPLC 進一步分析時,除了可以觀察到沒能在質譜圖中顯現的 1,2-benzoquinone 等化 合物,也發現 VESI-MS 質譜圖中某些離子訊號,其實是包含兩種同分異構物。VESI-MS 即時偵測的特性,則讓我們得以觀察到兩個生命期只有數分鐘的反應中間產物。這些結 果提供了我們對化合物與 ABTS●+反應時,取代基位置不同對反應途徑的影響有了更深 入的了解。

比較一系列 aniline 間位化合物與 ABTS●+的反應結果,可以發現當取代基為 methoxy

等強推電子基時,化合物可以還原 ABTS●+和生成加成物。但是當取代基的推電子能力

減弱成中推電子基以下,例如 3-aminoacetanilide、3-methylaniline、3-aminoacetophenone、 3-bromoaniline、3-chloroaniline 等化合物,則無法將 ABTS●+還原成 ABTS 而只會生成 加成物,3-nitroaniline 則連加成物也無法生成。另外 1,8-diminonaphthalene、 1,5-diaminonaphthalene、1,3-bis(aminomethyl)benzene 的反應結果,則說明了化合物必須 擁有間苯二胺的子結構,才能與 ABTS●+反應生成加成物,將此項結論實際檢視常見的 抗氧化劑 catechin、epicatechin、chyrsin 與 ABTS●+反應的結果而獲得證實。 關鍵字:抗氧化劑、VESI-MS、ABTS●+、苯環二取代基化合物、取代基效應、反應途 徑

(13)

Study of reaction pathways of disubstituted benzene

compound with ABTS

+

Advisor: Dr. Yeung-Haw Ho Department of AppliedChemistry National University of Kaohsiung

Student: Hsin-Yu Chen Department of AppliedChemistry National University of Kaohsiung

ABSTRACT

The ABTS free radicals cation(ABTS●+) is a typical reagent that has been used to examinethe potency ofantioxidant.It is well knownthat antioxidantwill reduced ABTS●+ to ABTS. There are not many studies on the reaction path and products other than ABTS. We combined venturi electrospray ionization mass spectrometry (VESI-MS) developed by our laboratory, HPLC, and UV/Vis to investigate the reaction between ABTS●+ and disubstituted benzenes.Although these compounds are notpotentantioxidants, molecular structure is

relatively simple.Interpretation of experimental results is easier than that of typical

antioxidant.The goal of this research is to investigate substituent effect on the reaction path of disubstituted benzene compounds. VESI-MS is an on-line mass spectrometry method. It can simultaneously monitor the progress of reaction and identified the compound interested. However, VESI-MS cannot distinguished isomers. HPLC methods were used to analyze isomers generated in reaction. Moreover, compound has poor electrospray ionization (ESI) efficiency can also be detected by HPLC.

Results obtained from reactions between benzenediol,aminophenol, and benzenediamine and ABTS●+ showed all ortho-, meta-, and para- compounds reduced ABTS●+ to ABTS. In addition, meta- compound formed a new condensation product [M+ABTS●+-H●] and other compounds. HPLC studies showed some compounds presented in reaction solution did not appear in VESI-MS spectrum, e.g., 1,2-benzoquinone. And, several signals showed in mass spectrum are isomers. The on-line capability of VESI-MS resulted in observations of two short-live intermediates during our studies. From the above results, we gained information of substituent position affectedthe reaction path of disubstituted benzenes.

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donating substituent,e.g., -OCH3, will formed ABTS and the condensation product

[M+ABTS●+-H●]. As the electron donating capability decrease to medium and below, e.g., -NHCOCH3,-CH3,-COCH3,-Br, and -Cl, the reaction generated the condensation product but

not ABTS. 3-Nitroaniline has a strong electron withdraw substituent and cannot react with ABTS●+. Results obtained from reactions of 1,8-diminonaphthalene,1,5-diaminonaphthalene, and 1,3-bis(aminomethyl)benzene suggested that compound with a meta-aniline sub-structure is necessary for formation of [M+ABTS●+-H●]. Catechin,epicatechin, and chyrsin, which are antioxidants contained meta-benzenediol sub-structure, reacted with ABTS●+ produced ABTS and condensation product as expected.

Keywords:antioxidants, VESI-MS, ABTS●+, disubstituted benzene, substituenteffect, reaction pathways

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第一章前言

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS)是一個 常用於檢測抗氧化能力的指示劑,使用時先以氧化劑,例如potassium persulfate(K2S2O8,PDS)、ammonium persulfate ((NH4)2S2O8,ADS)、

2,2'-Azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride (AAPH),將 ABTS 轉換成 ABTS●+,再加入抗氧化劑並量測 ABTS●+消失的速率或程度,來量化物 質相對的抗氧化能力。ABTS●+之所以被選做為檢測抗氧化能力的指示劑, 主要是因其還原前後具有極易分辨的吸收光譜,此外也是一個相對穩定 的自由基,可以在室溫下穩定存在數小時,而吸光強度不會有顯著的變 化。 有關 ABTS●+的研究非常眾多,但是大半數是著重在應用 ABTS●+做 為檢測工具,對於抗氧化劑與 ABTS●+之間如何作用則較少著墨,就算是 對反應機制或途徑進行探討,也往往受限於分析方法而無法獲得較完整 的資料。使用 UV/Vis 等光譜方式進行研究,雖然可以進行線上即時分析, 但是系統中若有新的生成物,卻無法對它進行鑑定1。若以傳統質譜法進 行分析,雖然可以鑑定未知物,但是因為是離線分析,若是過程中有生 命期較短的中間產物生成,很容易就會錯失而沒能偵測到。過去數年本 實驗室已經成功開發出一項快速簡易的線上即時分析質譜技術,並將其 命名為文氏管電噴灑游離質譜法(Venturi electrospray ionization mass spectrometry, VESI-MS)2,本研究利用此項技術同時具有線上即時分析以 及化合物鑑定的功能,克服傳統分析方法在 ABTS●+與化合物反應之途徑 研究上分析能力的不足3

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先前本實驗室已成功展示利用 VESI-MS 觀察 benzenediol 同分異構物 與 ABTS●+的反應過程,本研究進一步結合 VESI-MS、HPLC、UV/Vis 等不同分析方法探討 ABTS●+與化合物反應的變化。研究中利用 VESI-MS 對反應液進行線上即時偵測,此方法可以記錄化合物添加至 ABTS●+生成 液中數十秒後任意時間的質譜圖,此項資料可以提供 ABTS●+還原成 ABTS 的程度,以及有何種新的化合物生成,利用它的萃取離子層析圖 (extracted ion chromatogram, EIC),可以追蹤特定離子的消長過程,更重 要的是,可以觀察到一些生命期只有數分鐘的中間產物。由於質譜法有 無法直接分辨同分異構物的缺失,因此本研究中也利用 HPLC 將不同反 應時間的反應液進行分離,並收集特定時間的析出液(eluate)以 VESI-MS 方式收集該析出液的質譜圖,並且發現在幾個探討的反應系統中存在著 同分異構物產物,而不同的同分異構物有不同的生成趨勢。 研究中 UV/Vis 的功用為線上即時分析,當以 HPLC/DAD 系統得到特 定滯留時間析出液的 UV/Vis 吸收光譜資訊,以及 VESI-MS 所提供的鑑 定資訊後,可以將反應系統改以 UV/Vis 進行線上即時分析,此時任何區 段吸收度的變化,都可以連接到代表那一個析出液的變化,以及它的質 譜圖為何。 本研究探討的內容有觀察 benzenediol、aminophenol、benzenediamine 的不同位置異構物與 ABTS●+反應,了解雙取代基分別位於鄰位、間位、 對位對反應途徑有何影響,或者是相同雙取代基位置的不同官能基有何 影響。實驗結果發現間位苯二取代基化合物與 ABTS●+反應時會生成加成 物,因此本研究也探討 3-methoxyaniline、3-aminoacetanilide、

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3-methylaniline、3-chloroaniline、3-bromoaniline、3-aminoacetophenone、 3-nitroaniline 等多種不同化合物的反應結果,了解間位官能基提供電子到 苯環上能力大小對反應途徑的影響。此外 1,3-bis(aminomethyl)benzene、 1,8-diaminonaphthalene、1,5-diaminonaphthalene 的實驗結果則說明化合物 必須擁有間苯二胺子結構,方能與 ABTS●+反應形成加成物。將此觀察實 際檢視常見的抗氧化劑 catechin、epicatechin、chyrsin 與 ABTS●+反應的 結果而獲得證實。 總括而言,本研究利用 VESI-MS、HPLC-UV、UV/Vis 觀察一系列苯 二取代基化合物與 ABTS●+反應結果,所使用的化合物並非是常見的抗氧 化劑,因此研究的目的必非是常見的利用 ABTS●+探討物質的抗氧化力強 弱,而是了解苯環上取代基位置與官能基種類對 ABTS●+反應途徑的影響。 探討化合物除了進行電子轉移將 ABTS●+還原成 ABTS 外,還有沒有其他 的反應途徑會造成 ABTS●+的衰弱,造成在傳統上以 ABTS●+衰弱程度和 快慢做為物質抗氧化力強弱判斷上的誤導。

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第二章文獻回顧

自由基在生物體中可以協助生物體的代謝機能,但如果濃度過高反 而會造成生物體的傷害,自然界裡存在一些物質具有消除自由基的能力, 而能使生物體中的自由基濃度不至於過高,維持生物體中生理機制的正 常。2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS)是常用於 檢測物質消除自由基能力的一種試劑,使用時先將 ABTS 氧化成 ABTS●+, 再檢視待測物使 ABTS●+消逝的速度或量有多少,做為該物質抗氧化能力 大小的指標。依據文獻報導,抗氧化物質與自由基的作用機制有兩種4-5

: (1)氫原子轉移(Hydrogen Atom Transfer; HAT)和(2)電子轉移(Electron Transfer, ET),而 ABTS●+與自由基的作用機制一般為 ET6。

2.1 ABTS

●+

的反應機制

2.1.1 氫原子轉移與電子轉移

Apak 等人以 AH/ Ar-OH 為例說明 HAT 機制,反應中抗氧化劑將氫 原子(H●)轉移到 ROO●,而得到更穩定的自由基(A●和 ArO●) (如式一-三)5

ROO● + AH → ROOH + A●(式一) ROO● + Ar-OH→ ROOH + ArO●(式二) 2ROO●→nonradical products (式三)

Aliaga 等人則觀察 tert-butyl hydroperoxide 與 ABTS●+的反應6,研究 這反應的速率以推導反應機制和速率定律,提出 ABTS●+以 ET 機制還原 成 ABTS (式四)。改用 H2O2時,結果 tert-butyl hydroperoxide 與相似,發

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現一莫耳 H2O2會和兩莫耳的 ABTS●+反應(式五、式六)。 ROOH + ABTS●+ ROO● +ABTS + H+(式四) H2O2 + ABTS●+ HO2● + ABTS (式五) HO2●+ ABTS●+→ O2 + ABTS + H+ (式六)

2005 年 Huang 等人認為 ABTS●+還原時的電子轉移機制如式七4, ABTS●+由抗氧化劑中提取電子還原成 ABTS 時會有不同的 UVVis 吸收, 引起溶液顏色的變化,因此反應時溶液顏色變化的程度與樣品的抗氧化 能力相關。

probe (oxidant) + e (antioxidant)→reduced probe + oxidized antioxidant (式七)

2.1.2ABTS

●+

偵測方式

偵測 ABTS●+的方法有許多種,早期最常見的為光譜法進行偵測,利 用自由基與抗氧化劑反應,使自由基可產生消除反應而使該光譜的吸收 度出現變化。 1997 年 Miller 等人挑選 ABTS●+為檢測的自由基7,以 PDS 來氧化 ABTS 形成 ABTS●+,已知其吸收波峰在 645 nm、734 nm 或 815 nm;另 外 2017 年本實驗室的研究中3,以 ADS 來氧化 ABTS 形成 ABTS●+,當 ABTS 的吸收峰(340 nm)下降,ABTS●+的吸收峰(415 nm 和 728 nm)會上 升,ABTS●+在波長 415 nm 吸收值達到約 0.8 時,可以得到最大的 ABTS●+, 再利用 ABTS●+與 benzendiol、benzenediamine 反應可再將 ABTS●+轉換成 ABTS 及生成其他加成物,藉由 UV-Vis 光譜觀察於 340 nm 及 415 nm 的 吸收度變化。

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另外 HPLC 也是常見的偵測方法,2007 年時Baltrušaitytė 等人以不 同的地區、季節的蜂蜜作為探討抗氧化能力的題材8,將 HPLC 結合 MS 做為偵測的工具,HPLC 流動相條件以 A 相(10 % methanol 和 1 % acetic acid 溶於 DI 水中)及 B 相(100 % methanol)在梯度沖提中分離,結果發現 花粉蜜的 kaempferol 含量較蜂蜜高;同年 Ahn 等人以類似的題材作為研 究9 ,取自中國各地所產的蜂膠為樣品,探討各地蜂膠中所含苯酚類、類 黃酮類物質與 ABTS●+反應,同樣以 HPLC-PDA 與 MS 連用,流動相由 A 相(0.1% formic acid 的水)和 B 相(0.1 % formic acid 的 ACN)在梯度沖提下 進行分析。

2015 年,Ayça AktasKaraçelik 等人10利用 HPLC-UV-ESI-MS 檢測果 汁中的酚類化合物組成,將 HPLC-UV 再結合 MS 一起測定,流動相也是 由 A 相(0.1 % formic acid 的水)和 B 相(0.1 % formic acid 的 ACN)在梯度 沖提下進行分析。

(21)

2001 年 Koleva 等人將 HPLC 作為進樣的方法將經前處理的樣品進入 管柱中進行分離11,再以 UV 或 PDA 為偵測器得到分離後訊號,接著溶

液不流至廢液,而是在另一端接上一個 pump 注入 ABTS●+,使分離後的 物質與其在 reaction coil 中進行反應後,在後端再使用另一台 UV/Vis 偵 測器偵測反應後的情形,最後即有兩張圖譜可以對照,藉此了解混合物 中具有抗氧化力的訊號分布(圖 2-1),以此種方式達到線上偵測的方法, 其中 HPLC 的流動相為有機溶劑(methanol)或弱酸水溶液或緩衝溶液(pH 3-7.4)以這些溶劑作為流動相來調整分離條件。 圖 2-1Koleva 等人研究抗氧化力所用的實驗設計圖11 HPLC 不只可以與 MS 串聯使用,也可以使用電化學方法進行偵測, 2011 年嘉義大學古國隆老師的實驗室開發了 HPLC-ECD(HPLC-electrochemical detector)的線上偵測法12,裝置示意圖 如圖 2-2,他們以網版印刷電極測抗氧化劑的氧化電位,再以氧化還原電 位去定義抗氧化指數,其中 HPLC 分析方法有分三階段,分別是

HPLC-ABTS 系統、HPLC-ECD 系統、修飾後之 HPLC-ECD 系統,流動 相分兩種,水相及有機相,其中水相有三種(超純水、0.1% formic acid 水 溶液、10 mM Ammonium acetate 水溶液(pH 6.86);有機相則有兩種

(22)

(methanol、acetonitrile),三種系統皆由這些不同流動相組成去分析。

圖 2-2 線上 HPLC-ECD 系統裝置是意圖12

探討物質的抗氧化力時,主要都是觀察 ABTS●+強度的變化,而較少 討論反應途徑和產物的鑑定,2017 年本實驗室利用自行研發的文氏管電 噴灑游離質譜法(venturi electrospray ionization, VESI)應用於檢測抗氧化 能力3,即時偵測 ABTS●+與不同抗氧化劑反應時的變化過程,且在偵測 到 ABTS●+與 benzendiol、benzenediamine 反應時,發現有生成物的生成, 藉由 MS 的資訊可以推測出生成物為何,進而推測 ABTS●+與 benzendiol、 benzenediamine 的反應途徑,因此本研究再將此應用擴展至 ABTS●+與苯 環二取代化合物的反應,探討取代基對反應途徑的影響。

2.3 Hammett equation

Hammett equation 是描述是以苯甲酸作為參考標準,探討苯的間位和 對位衍生物在反應速率及平衡常數與線性自由能關係之方程式(式 八)13 log 𝐾𝐾 = log 𝐾𝐾0 + 𝜎𝜎𝜎𝜎 (式八)

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K0為不含取代基反應物之反應速率常數,K 為含取代基反應物之反 應速率常數,σ 為取代基常數,與取代基類型有關;ρ 為反應常數,與介 質和溫度反應有關。Hammett 方程式已廣泛應用於間位和對位取代的苯 反應系列14,原本因為空間效應的關係,Hammett 方程式無法直接應用 於鄰位取代的苯衍生物,而是以取代基常數來消除空間效應,使反應位 點不與取代基相鄰,使 Hammett 方程式得以應用於鄰位取代的苯反應系 列。 在各種溶劑中,幾乎所有型態的有機反應 Hammett 常數(σ)都有關聯, 其中σ 預測許多類型的化學現象,包含 pKas、反應速率和 proton 的 NMR 位移,雖然成功應用於很多方面,但並非全部情況下都可以用,例如取 代基變化導致過渡態位置偏移的情況下,σ 將無法使反應速率產生關聯性, 2001 年 Kevin 等人比較量子化學參數和 Hammett 常數在取代苯胺 pKa值 關聯15,苯胺苯環上的取代基影響胺 pK

a,這取決於它們的位置和拉電子 或推電子的性質,測試每種取代苯胺的計算參數 Qn,ΔHprot,IS,min,Vmin 和 VS,min,以及 σ 和實驗 pKa值,結論是量子化學計算得到的參數已經達 到了它們可以為 pKa 和其他性質的分析做出有用貢獻的階段,在單取代 酚的研究中,證明了自然電荷、最高佔據分子軌道能量和質子轉移能量 優於σ 作為 pKa線性回歸。 1991 年 Jovanovic 等人利用 Hammett σ 計算多取代酚類抗氧化劑的 氧化還原電位16。利用 methoxyphenoxyl 自由基 E 7的還原電位,使用 Brown σ+取代基常數是符合 Hammett 相關性,因此探討其他取代基與 Hammett 的相關性,成功的簡單計算氧化還原電位且應用於材料,設備,食品和

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生物醫學系統上。

Hammett 方程式也應用在 Heck 反應,2004 年 Peter 等人利用 Hammett 方程式解決了 4-substituted styrenes 的陽離子 Heck 反應的區域選擇性17 原本因反應條件下取代的偏好不同,使得反應物的反應曲線數據無可變 性而產物的分布曲線是可變動的,因此 Hammett 方程式無法適用;利用 一系列 4-substituted aryl iodides 作為芳基化反應 but-3-en-2-ol 的基質,因 為各種 4-substituted aryl iodides 與 methyl acrylate 在 PCP-type Pd(II)催化 劑存在下 cross-coupling 的實驗,當 phosphapalladacycle 作催化劑時,Pd (IV)中間體扮演重要的角色,可使得在 Heck 與 n-butyl acrylate 反應中 4-substituted aryl bromides 的 Hammett 相關性是有關連的。

2.4 苯的衍生物與 ABTS

●+

反應的相關研究

由於 phenolic antioxidants 被廣泛應用在食品、製藥、化工產業上, 因此也發展出很多方式來分析對活性上的影響,藉由其化合物消除自由 基的能力來定義此化合物的活性。近年科學家以 ABTS●+與許多不同種酚 類化合物反應,探討抗氧化能力,2003 年 Arts 等人1以 ABTS●+分析 1,3-benzenediol、1,2-benzenediol 及 1,4-benzenediol 三種同分異構物的抗 氧化能力,結果發現 1,3-benzenediol 的抗氧化能力比 1,2-benzenediol 及 1,4-benzenediol 小,但是 trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC)卻是 最大的,後續發現光譜圖 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應 10 秒後在波長 550 nm 左右生成一個未知的 peak,然後隨反應時間消失後又在波長 470 nm 生成另一個未知 peak,如圖 2-3。

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圖 2-3ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應 30 秒內之光譜圖變化 1 2004 年 Nenadis 等人針對 benzenediol 之三種同分異構物探討消除自 由基能力的差異與結構的關係18,其中 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應的 結果與 Arts 的結果有些許不同,如圖 2-4,Nenadis 的結果是在 500 nm 左右有新 peak 的產生,且隨時間增加而增加,另外也沒有提到有產生第 二個新生成物。 圖 2-4ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應 0-10 秒及 1-6 分鐘之光譜變化圖18

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2013 年 Bendary 等人探討酚類與苯胺類化合物對消除自由基能力的 影響19,其中有探討 benzenediol、benzenediamine 及 aminophenol 消除 ABTS●+能力的比較,其中也推測鄰位及對位的 benzenediol、

benzenediamine 及 aminophenol 與 ABTS●+反應會產生的化合物,推測 1,2-benzenediol 與 ABTS●+反應會生成 1,2-benzoquinone(圖 2-5),但是並 未對間位的苯二取代基化合物多作探討。

圖 2-51,2-benzenediol 與 ABTS●+反應之反應機制 19

從上述的研究中,2017 年本實驗室探討了 benzenediol、

benzenediamine 兩者的同分異構物與 ABTS●+反應的反應機制3,藉由 VESI-MS 線上即時偵測可直接看反應變化,研究發現 ABTS●+與

1,3-benzenediol 反應後,除了 ABTS●+(m/z 514)轉換成 ABTS(m/z 515)的 訊號,另外也會新生成 m/z 380 及 623 的訊號;而 ABTS●+與 1,2-benzenediol 反應則會有 1,2-benzoquinone 質子化(m/z 109)的訊號;ABTS●+與

1,4-benzenediol 反應就沒有任何特別的訊號生成。

ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應後除了 ABTS●+(m/z 514)轉換成 ABTS(m/z 515)的訊號,還有 1,3-benzenediamine (m/z 109)的訊號,且也

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新生成 m/z 619、621 的訊號;ABTS●+與 1,2-benzenediamine 反應則是另 會生成 1,2-benzenediamine 的縮和聚合物(m/z 211);ABTS●+與

1,4-benzenediamine 則是會生成一個中間產物(m/z 108),這些都是先前用 光譜分析無法得到的結果。

2006 年 Osman 等人也探討了 ABTS●+與 polyphenols 反應產生共價加 成物的分離和結構解析20,以 1,3,5-trihydroxybenzene (phloroglucinol)與 ABTS●+反應,藉由 LC-MS 測定可以發現 ABTS●+與 phloroglucinol 反應, 除了本身 ABTS (m/z 515),還有 m/z 639、381、396、244 的訊號生成, Osman 推測出反應途徑有兩種(圖 2-6),一分子 ABTS●+會從多酚化合物 得到電子(或得到氫原子),使得多酚化合物形成 semiquinone radical,然 後 semiquinone radical 會再與另一分子 ABTS●+反應形成加成物,其加成 物因不穩定而降解成其他產物,且有兩種途徑,一種途徑是會降解成圖 2-6 中的加成物Ⅱp,並釋放出 benzothiazolium 離子(X),benzothiazolium 離子(X)已知是不穩定的,容易經歷水解和氧化以形成化合物(Y)。另一種 途徑則是降解成圖 2-6 中的加成物Ⅲp,並釋放出

3-ethyl-6-benzothiazolinone imine (ABTS●+的另一種降解產物),而 Osman 將 ABTS●+分別與 phloroglucinol 反應後,從 LC-MS 的結果顯示,反應途 徑皆傾向為途徑一。

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圖 2-6ABTS●+與 phloroglucinol 反應之反應機制 20

2014 年 Liu 等人利用 HPLC-ESI/MS QQQ 測定來自 Hypericum perforatum L 的 flavonols 清除能力21,並且觀察反應加成物的特徵,當 flavonols 與 ABTS●+反應後會生成加成物,且加成物也會有兩種降解途徑 (圖 2-7),其中途徑二的降解產物(A-4)會受到 retro-Diels–Alder (RDA)裂 解形成圖中的 A-6,又或者 ring B fragment 形成圖中的 A-9。VESI-MS

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技巧延伸至探討苯環取代對 ABTS●+反應之影響,過去研究利用 ABTS●+ 探討抗氧化能力,許多酚類化合物皆有良好的抗氧化能力,因此將酚類 化合物與 ABTS●+反應,在許多研究中發現反應後不只是 ABTS●+還原成 ABTS,在間位的苯環取代有可能會有新生成物的產生,例如 1,3-benzenediol、1,3-benzenediamine,因此可以進一步的探討苯環二取代 與 ABTS●+反應,透過 VESI-MS 線上即時偵測獲取資訊,探討反應機制, 並且可藉由 HPLC 分離,進一步確認生成物物質,可與先前文獻中對於 1,3-benzenediol、1,3-benzenediamine 與 ABTS●+反應的反應機制比較。

(30)
(31)

2.5VESI-MS 之介紹

文氏管電噴灑游離質譜法(venturi electrospray ionization, VESI)2,藉 由電噴灑游離源端所使用之 desolvation gas 在高速流動時,於 ESI tip 的 前端形成 venturieffect 造成一壓力差來推動樣品液以達到連續自動進樣 的效果,如圖 2-8 的裝置圖,可分完單管進樣(sVESI)及雙管進樣(dVESI) 的裝置,並且成功將其運用在偵測蛋白質水解反應、水楊酸水解反應過 程與 Backmann rearrangement 的動力學變化。 圖 2-8 單管進樣(sVESI)及雙管進樣(dVESI)示意圖2 2014 年更將 VESI 裝置廣泛地應用,在苯並咪唑的有機反應以 sVESI 的方式可即時偵測反應的變化過程22,再利用 dVESI 偵測反應中可偵測 到中間產物,另外也可應用在茶葉化學的分析實驗、果皮表面所附著農 藥之偵測以及藍瓶實驗的氧化還原之反應,2017 年更將 VESI 系統應用 在檢測抗氧化能力3,即時偵測 ABTS●+與不同抗氧化劑反應時的變化過 程,進而偵測到 ABTS●+與 benzendiol、benzenediamine 反應機制,因此 本研究再將此應用擴展至 ABTS●+與苯環二取代反應的應用上,探討反應 機制及反應後的變化。

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第三章實驗方法

3.1 藥品

藥品名稱 廠牌 分子量 (g/mol) 純度 (%)

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) Sigma 514.62 98 Ammonium persulfate 日本製藥 228.18 96.5 1,2-benzenediol (catechol) Mallinckrodt 110.11 >90 1,4-benzenediol (hydroquinone) Riedel-de Haën 110.11 99.5 1,3-Benzenediol (resorcinol) Sigma 110.11 99

1,2-benzenediamine Alfa Aesar 108.14 98 1,3-benzenediamine Aldrich 108.14 99 1,4-benzenediamine Sigma 108.14 98 1,2-Aminophenol Alfa Aesar 109.13 99 1,3-Aminophenol Acros 109.13 99 1,4-Aminophenol Alfa Aesar 109.13 98 3-Nitroaniline Alfa Aesar 138.14 98 3-methoxyaniline Alfa Aesar 123.16 98 3-methylaniline Acros 107.15 99 1,8-diaminonaphthalene Acros 158.20 97 1,5-diaminonaphthalene Acros 158.20 97 Aniline Alfa Aesar 93.13 99+ 1,3-bis(aminomethyl)benzene Aldrich 136.20 99

3-bromoaniline Alfa Aesar 172.02 98 3-chloroaniline Acros 127.57 98 4-chloroaniline Acros 127.57 99 Phenol 日本製藥 94.11 98 3-aminoacetanilide Alfa Aesar 150.18 97 3-aminoacetophenone Alfa Aesar 135.17 97 Epicatechin Sigma 290.27 90 Catehin hydrate Sigma 290.27 96 Chrysin Acros 254.24 99+ 1,4-benzoquinone Alfa Aesar 108.10 98+

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使用的溶劑有 HPLC 級甲醇(購買於 Macron),以及去離子水(DI 水)。

3.2 儀器

液相層析儀為 HITACHI 所生產的 pump,型號為 L-7100,偵測器為 UV 偵測器型號為 L-7420。

質譜儀為 Micromass®UK 所生產的 Micromass Q-TOF,使用的游離 源為電噴灑游離。電噴撒游離裝置使用的霧化氣體(Nebuliser Gas)為氮氣 氣體,流速為 20 liters/hour,而去溶劑氣體(Desolvation Gas)的流速為 300 liters/hour。質量分析器為四極桿質譜分析器(quadrupole mass analyzer)與 時間飛行器(time of flight,TOF)的串聯使用。分析時的質譜最佳參數為 Source Block Temp: 100℃、Desolvation Temp: 180℃、TOF: 7200 V、MCP: 2700V、Capillary Voltage: 2600V、Cone: 25 V、Collision Energy: 3 V、Gas Cell: 5 psi。離子碰種誘導解離(Colleision Induced Dissociation,CID)的碰 撞氣體為氬氣(Ar)。進樣方式以本實驗室開發的自動進樣裝置

(self-pumping pump)或以注射針幫浦(KD Scientific, KDS101)直接注入進 樣(direct infusion)兩種方式,直接注入進樣的流速固定為 8 µL/min,而自 動進樣系統的流速則在 10.0-15.0 µL/min。

紫外線光譜儀為 HITACHI,U-3010,觀察 ABTS●+在不同苯環取代 基下反應後,ABTS.+轉換成 ABTS 以及是否有新產物的生成。

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3.3ABTS

●+

合成方法

合成法參照本實驗室研究出的最佳合成方法3,以過硫酸銨

((NH4)S2O8,或簡稱 ADS)作為氧化劑使 ABTS 氧化成自由基陽離子。 首先分別先配製 2.5×10-3 M 的 ABTS 儲存溶液(取 0.0343 g 的 ABTS 固體溶於 25 mL 的水中)及 5×10-3 M 的 ADS 儲存溶液(取 0.0285 g 的 ADS 固體溶於 25 mL 的水中),每次進行反應時先取 1 mL ABTS 溶液加入至 8 mL 的 DI 水中,在 50℃水浴鍋下預熱 3-5 分鐘後,再加入 1 mL ADS 溶 液加入其中反應 70 分鐘,使 ABTS 起始濃度為 2.5×10-4 M,ADS 則是 5 ×10-4 M。

3.4 樣品配製方法

3.4.1 苯環取代基標準品配製

將所有不同的苯環取代基標準品皆溶於 DI 水配成 6.25×10-3 M,其中 m-anisidine、3-bromoaniline、phenol 不溶於水,先將化合物溶於 100 μL 甲醇裡再加入 DI 水配製成 6.25×10-3 M;1,8-diaminonaphthalene 及 1,5-diaminonaphthalene 對水溶解度較低,此兩種化合物溶於 0.01 M 的 HCl; 另外 aniline 溶於水中訊號會較低,因此配製在醋酸裡提高訊號強度。另 外 chrysin 溶於 1 mL 的濃氨水中再加入 DI 水配製成 6.25×10-3 M。

3.5 自動進樣(self-pumping)裝置

利用本實驗室已開發設計的自動進樣裝置(self-pumping)-文氏管電 噴灑游離質譜法作為線上即時偵測之方法(Venturi electrospray ionization

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mass spectrometry, VESI-MS)。所使用的是單重進樣 VESI (sVESI)自動進 樣裝置的示意圖如圖 3-1,將口徑為 130 μm 的 PEEK 毛細管裁切成約 10 公分的長度,作為自動進樣裝置的連接管線,再將樣品瓶的瓶蓋打洞, 讓 PEEK 毛細管可穿入且末端可浸到待測溶液裡,另一端已轉接頭連接 到質譜儀的電噴灑游離源,使得自動進樣到質譜儀進行訊號偵測。 圖 3-1sVESI 裝置示意圖

3.5.1 以 sVESI 進行線上即時偵測

以質譜儀搭配 sVESI 的進樣方式進行線上即時偵測 ABTS●+與不同的 苯環取代基反應結果。首先取 2 mL 的 ABTS●+水溶液至棕色樣品瓶並加 入攪拌子攪拌,將其架設在磁力攪拌器上(如圖 3-2),先偵測 2 分鐘的 ABTS●+的訊號後,迅速加入 40µL 的苯環取代基溶液進行反應,線上偵 測 8 分鐘,觀察反應後之結果。

(36)

圖 3-2 以磁力攪拌器協助 sVESI-MS 裝置進行線上即時偵測 本研究中所使用的苯二取代基化合物標準品有 benzenediol、 benzenediamine、aminophenol 這三種的異構物(鄰、間、對位)、aniline、 phenol、3-methoxyaniline、3-aminoacetanilide、3-methylaniline、3-nitroaniline、 3-aminoacetophenone、3-bromoaniline、3-chloroaniline、4-chloroaniline 1,8-diaminonaphthalene、1,5-diaminonaphthalene、 1,3-bis(aminomethyl)benzene、epicatechin、catehin hydrate、chrysin。

3.6 以 HPLC 分離

使用的管柱是 Thermo 的 C18 管柱,型號是 Hypersil BDS C18,Dim. (mm):150×3,Particle Sz. (μ):5,流動相比例主要為 0.5% CH3COONH4 (pH 6.9):MeOH=70:30 為最佳條件,其中分離 ABTS.+與 1,3-benzendiol 反應生成物時,0.5% CH3COONH4的 pH 調整為 6.2;分離 ABTS●+與苯 benzenediol(ortho-、para-)、benzenediamine (ortho-、para-)、aminophenol(三 種異構物)反應生成物時,流動相比例為 0.5% CH3COONH4 (pH 6.9): MeOH=65:35。

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第四章結果與討論

已知 ABTS●+和 benzenediol 反應時,會因取代基位置的不同而生成 不同的產物,本研究利用實驗室已開發的 VESI-MS 質譜法2,觀察 ABTS●+ 和一系列苯二取代基同分異構物的反應,探討不同官能基和取代基位置 對反應途徑的影響,以及可能的反應機制。研究中利用 VESI-MS 線上即 時偵測反應過程,觀察較不穩定的反應中間產物和反應中各個化合物的 消長趨勢。另外利用 HPLC/UV 分離各個化合物,彌補 VESI-MS 無法直 接辨別同分異構物產物的限制,並且能較明確的觀察反應中特定化合物 的相對消長程度。

4.1 ABTS

●+

與 benzenediol、benzenediamine、amionphenol 同分

異構物的反應

首先探討一系列鄰、間、對位苯二取代基與 ABTS●+反應,了解不同 取代基相對位置對反應途徑的影響,其次以 aniline 為 model compound, 探討苯二取代基間位上不同取代基對反應的影響。

4.1.1 Benzenediol 鄰、間、對位同分異構物與 ABTS

●+

反應

首先以 VESI-MS 檢視 ABTS●+與 benzenediol 異構物的反應,結果與 過去本實驗室所觀察到的資料一致3。三種 benzenediol 異構物都可以提 供電子將 ABTS●+還原成 ABTS(圖 4-1)。除此之外,質譜圖中顯示

1,2-benzenediol 會進一步生成[M-H2]+ (m/z 109),顯示 1,2-benzenediol 與 兩當量的 ABTS●+形成 1,2-benzoquinone (MW 108) (圖 4-2)。

(38)

圖 4-1 2.5×10-4

M ABTS●+及 1.25×10-4

M benzenediol 三種異構物反應之質 譜圖:(A)反應前(ABTS●+);(B) ABTS●+加入 1,2-benzenediol;(C) ABTS●+ 加入 1,3-benzenediol;(D) ABTS●+加 1,4-benzenediol

圖 4-2ABTS●+與 1,2-benzenediol 反應途徑

在 VESI(+)的電噴灑游離過程下,1,2-benzoquinone 質子化生成 m/z 109 離子,這個離子因具有分子內氫鍵相對穩定而顯現在 VESI-MS 質譜

(39)

圖中。至於 1,4-benzoquinone 的生成,推測因為 1,4-benzoquinone 無法以 分子內氫鍵形式形成穩定的 m/z 109,而沒有在 VESI-MS 圖中顯現。有 別於 1,2-和 1,4-benzenediol,1,3-benzenediol 基本上是無法形成 1,3-benzoquinone,但是 VESI-MS 途中卻出現獨有的 m/z 623 與 m/z 380 離子,其中 m/z 623 為 ABTS●+與 1,3-benzenediol 的加成物 (圖 4-3),而 m/z 623 可以進一步解離成 m/z 380 (圖 4-4)。 圖 4-3ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應途徑

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圖 4-4ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應加成物(m/z 623)解離途徑

不同於傳統以光譜分析法探討 benzenediol 與 ABTS●+反應,只能以 UV/Vis 光譜圖的變化,說明除了 ABTS 外還有新產物的生成,VESI-MS 進一步提供了新產物的分子量,以及辨別加成物的可能結構。 由於 VESI-MS 是分析未經純化的反應液,溶液中含有合成 ABTS●+ 時所用的各種化合物和分析物,這些化合物在游離過程中可能有競爭壓 抑分析物的效應,或者是進行氣相離子-分子反應生成副產物,造成對實 驗結果的誤判,因此改用 LC-MS 來分離各個化合物進行探討。當觀察 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應時,發現現有 LC-MS 的系統狀況不佳,所 得的層析圖無法提供可以接受的解析度(圖 4-5),因此將分析方法改成 HPLC/UV,希望可以提供反應液中各個物質相對含量變化趨勢上,一個 較可靠的結果。

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圖 4-5 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應之 TIC 圖 以 HPLC 分析不同反應時間下 1,3-benzenediol 與 ABTS●+的反應液, 結果如圖 4-6,在滯留時間 3.77、5.69、6.83、22.81 分時有化合物流出。 圖 4-6ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應液之不同反應時間層析圖 為了確認特定滯留時間的化合物為何,乃將每個分離出來的化合物 收集起來以 VESI-MS 方式分析,確認每個化合物的分子量(如圖 4-7)。

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圖 4-7 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 3.77、(B) 5.69、(C) 6.83、(D) 22.81 min。 VESI-MS 分析結果顯示,滯留時間 3.77 分化合物為 m/z 623;滯留 時間 5.69 及 22.81 分的化合物質荷比皆為 m/z 380,比較不同反應時間採 樣分析的 HPLC 層析圖,可以觀察反應開始約 1 分鐘內,滯留時間 3.77 分的化合物(m/z 623)強度逐漸上升(圖 4-8),但隨著反應時間增長強度持 續減弱。滯留時間 5.69 及 22.81 分的化合物(m/z 380)其兩者的變化趨勢 不同,滯留時間 5.69 分的化合物反應一開始就存在,隨著反應的進行其 強度緩慢的增加,至於滯留時間 22.81 分的化合物在一開始是沒有訊號的, 但隨著反應的時間越久,強度越來越明顯。

(43)

圖 4-8ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應加成物 m/z 380、623 趨勢圖 為了確認 HPLC 層析圖中所顯現的兩種 m/z 380 化合物是來自反應 液本身,而不是 HPLC 分析管柱所造成的假象,我們另外以 UV-Vis 光譜 儀直接測定不同反應時間的反應液。已知 ABTS●+及 ABTS 的吸收波長分 別在 415 及 340 nm (圖 4-9),顯示當 1,3-benzenediol 一加入 ABTS●+生成 液後,ABTS●+很快轉換成 ABTS (圖 4-10),並且在波長約 340 及 520 nm 附近有新的波峰生成,初步結果顯示反應液中除了有 ABTS●+還原成 ABTS 以外,另外還有其他化合物生成。

(44)

圖 4-9ABTS●+與 ABTS 之 UV 圖 圖 4-10ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應隨時間之 UV 變化圖 確認的確有新產物生成後改用 HPLC-DAD 分析反應液,以便獲得特 定滯留時間化合物的 UV/Vis 光譜圖。結果顯示 m/z 623 的化合物最大吸 收波長約為 300 nm,與 ABTS 相較有藍位移現象,而兩種 m/z 380 的化 合物最大吸收波長皆是約 500 nm(圖 4-11),相較於 ABTS 有紅位移現象, 兩者在滯留時間上雖然有極大的差異,但是兩個化合物的 UV/Vis 光譜圖 並無顯著的不同。

(45)

圖 4-11 ABTS●+與 1,3-benzenediol 反應混合液之 HPLC-DAD 圖 以分析 1,3-benzenediol 與 ABTS●+反應液的相同方式探討 1,2-和 1,4-benzenediol,可以發現 HPLC 層析圖大不相同。1,2-benzenediol 反應 液層析圖中只有 ABTS 訊號(圖 4-12)。

(46)

1,4-benzenediol 反應液層析圖中,在滯留時間 2.41、3.92 分有波峰生 成(圖 4-13),其中滯留時間 3.92 分是 ABTS 的訊號,而滯留時間 2.41 分 在 MS 測定中無法判斷,推測是較難質子化的 1,4-benzoquinone,因此將 1,4-benzoquinone 用相同流動相進行 HPLC 分離,滯留時間是符合的(圖 4-14),而在 MS 中確實是沒有訊號,因此更加確定 ABTS●+與 1,4-benzenediol 反應在滯留時間 2.41 分是 1,4-benzoquinone。 圖 4-13ABTS●+與 1,4-benzenediol 隨時間反應之層析圖

(47)

4.1.2 Aminophenol 鄰、間、對位同分異構物與 ABTS

●+

反應

將 benzenediol 化合物中的一個-OH 官能基改成-NH2,觀察官能基對反應 途徑有何影響。相對於 1,2-benzenediol 與 ABTS●+反應形成

1,2-benzoquinone [M-H2],1,2-aminophenol 的 VESI-MS 質譜圖中除了 ABTS,另外有 m/z 110 [M+H]+、m/z 211、m/z 213 的訊號,但是並沒有 [M-H2+H]+離子(m/z 108),顯示 1,2-aminophenol 較無法進行第二個氫原子 轉移生成[M-H2],至於 m/z 211 和 m/z 213 化合物結構則尚待進一步分析。 不同於 1,2-aminophenol,1,4-aminophenol 反應液的 VESI-MS 質譜圖中可 以觀察到[M-H2+H+] (m/z 108)的訊號(圖 4-15),有趣的是這個化合物於數 分鐘後即消失(圖 4-16)。1,3-aminophenol 反應液的 VESI-MS 質譜圖中則 有 m/z 110、310、379 和微弱的 m/z 620、m/z 622 (圖 4-15),仔細觀察 圖 4-15 比較三種異構物的 VESI-MS 質譜圖,可以發現 1,3-aminophenol 具有最強的[M+H]+ (m/z 110)和最低的[ABTS+H]+ (m/z 515)訊號,顯示三 種異構物中,1,3-aminophenol 最不易還原 ABTS●+而有較多未反應物(M), 造成反應液氣化游離時有較強的[M+H]+訊號。

(48)

圖 4-152.5×10-4

M ABTS●+及 1.25×10-4

M Aminophenol 三種異構物反應之 質譜圖:(A)反應前(ABTS●+);(B) ABTS●+加入 1,2-aminophenol;(C) ABTS●+加入 1,3-aminophenol;(D) ABTS●+加 1,4-aminophenol

圖 4-16 m/z 108 之 EIC 圖

以 HPLC-UV 分析 ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應液,顯示在滯留時 間 2.08、3.02、3.77、7.23、16.48 分時分別有化合物流出(圖 4-17)。

(49)

圖 4-17ABTS●+與 1,3-aminophenol 隨時間反應之層析圖 收集各個析出液進行 VESI-MS 分析,顯示滯留時間 2.08 分的析出液 出現 m/z 110 和 m/z 622 訊號(圖 4-18 ),分別來自[M+H]+及反應加成物 [(M+ABTS-H2)+H]+的訊號。滯留時間 3.02 分生成 m/z 379,強度隨反應 時間增加而增加;滯留時間 3.77 分生成 m/z 515([ABTS+H]+ );滯留時間 7.23 分生成 m/z 351,此訊號反應一開始時還未生成,但隨反應時間增加, 波峰訊號也越來越明顯;滯留時間 16.48 分為 m/z 620 [(M+ABTS-2H2)+H]+。

(50)

圖 4-18 ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 2.08、(B) 3.02、(C) 3.77、(D) 7.23、(E) 16.48 min。

再利用 UV-Vis 測定 ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應液,顯示一加入 1,3-aminophenol 後 ABTS●+馬上轉換成 ABTS(圖 4-19),然後在 600 nm 附 近有新的波峰生成,隨著反應時間越長,這個波峰會藍位移到 500 nm 附 近。

(51)

以 HPLC-DAD 分析 1,3-aminophenol 反應液(圖 4-20),所得與 1,3-benzenediol 相似(圖 4-11)。

圖 4-20ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應混合液之 HPLC-DAD 圖

ABTS●+與 1,2-aminophenol 反應液的 HPLC 層析圖顯示,在滯留時間 3.51 及 26.68 分時有兩根較明顯的訊號產生,另外滯留時間 2.6 分時也有 一根較小的訊號產生(圖 4-21)。

(52)

由 VESI-MS 質譜圖得知滯留時間 3.51 分的化合物為 ABTS,滯留時 間 2.60 及 26.68 分皆為 m/z 213(圖 4-22),兩者的結構尚未探討。

圖 4-22ABTS●+與 1,2-aminophenol 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 2.60、(B) 3.51、(C) 26.68 min。

ABTS●+與 1,4-aminophenol 反應液的層析圖與 1,4-benzenediol 相似, 在滯留時間 2.48 及 3.85 分會有波峰生成(圖 4-23),其中滯留時間 3.85 分 的析出液為 ABTS;滯留時間 2.48 分的波峰強度隨反應時間增加而增加, 但是化合物於 VESI-MS 操作下並沒有訊號生成,依據 1,4-benzenediol 的 研究結果判斷,2.48 分析出液的化合物應該是[1,4-aminophenol-H2]。

(53)

圖 4-23ABTS●+與 1,4-aminophenol 隨時間反應之層析圖

4.1.3 Benzenediamine 鄰、間、對位同分異構物與 ABTS

●+

反應

若是將 benzenediol 上兩個-OH 都以-NH2取代,結果顯示

1,2-benzenediamine 和 1,3-benzenediamine 都有 ABTS 和[M+H]+ (m/z 109) 生成(圖 4-24),相反的,1,4-benzenediamine 則生成一個中間產物 m/z108 (M●+),這個自由基陽離子不穩定很快就消失(圖 4-25),因為有 VESI-MS 進行線上即時偵測,才得以觀察到這個離子的生成。1,2-benzenediamine 與 1,2-benzenediol 不同,並沒有生成[M-H2],而是生成 1,2-benzenediamine 的縮和聚合物[2M-2H2+H]+(m/z 213)和[2M-3H2+H]+ (m/z 211),推斷自由 基聚合反應抑制了 1,2-benzenediamine 生成[M-H2],也減少 ABTS 的生成。 文獻報導 1,2-benzenediamine 溶液在光照下會生成聚合物[2M-2H2]和 [2M-3H2],不過我們發現這種變化在反應液中加快許多,這與已知這個 反應是由光照引起的自由基聚合反應一致,也就是 ABTS●+加速了聚合反

(54)

應的進行。

1,3-benzenediamine 則與 1,3-benzenediol 一樣會有加成物 [M+ABTS-H2+H]+ (m/z 621)和[M+ABTS-2H2+H]+ (m/z 619)生成。

圖 4-242.5×10-4

M ABTS●+及 1.25×10-4 M benzenediamine 三種異構物反應 之質譜圖:(A)反應前 ABTS●+;(B) ABTS●+加入 1,2-benzenediamine;(C) ABTS●+加入 1,3-benzenediamine;(D) ABTS●+加 1,4-benzenediamine

圖 4-25 m/z 108 之 EIC 圖

ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應液的 HPLC 層析圖(圖 4-26)在滯留 時間 2.05、2.56、4.82、7.01、8.19、25.61 分有訊號產生,其中滯留時間 8.19 及 25.61 分訊號隨反應時間增加而增加,而滯留時間 2.56 分訊號是 隨反應時間增加而減少。

(55)

圖 4-26ABTS●+與 1,3-benzenediamine 隨時間反應之層析圖 滯留時間 2.05 分析出液的化合物為 1,3-benzenediamine,在滯留時間 2.56 和 8.19 分析出液的 VESI-MS 皆生成 m/z 621;滯留時間 7.01 分為 ABTS;在滯留時間 25.61 分為 m/z 619(圖 4-27)。為了能得到最佳的分離 效果,這個實驗所用的 HPLC 分析方法與分析 aminophenol 反應液並不相 同,因此 ABTS 的滯留時間與圖 4-17 所顯現的不同。

(56)

圖 4-27ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 2.05、(B) 2.56、(C) 7.01、(D) 8.19、(E) 25.61 min。

以 VESI-MS 分析 HPLC 層析圖中 25.61 分的析出液,所得為 [M+ABTS-2H2+H]+ (m/z 619),8.19 分的析出液為[M+ABTS-H2+H]+ (m/z 621),2.05 及 8.19 分析出液的波峰面積隨著時間增加而減少,相反的 25.61 分析出液的波鋒面積隨著反應時間增加而增加(圖 4- 28),顯示隨著反應 時間的增加,加成物會進行進一步脫氫反應,這現象並沒在 1,3-benzenediol 和 1,3-aminophenol 反應液中發生。

(57)

圖 4- 28m/z 621、m/z 619 趨勢圖

ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應液的 UV-Vis 圖則顯示,當

1,3-benzenediamine 加入後,ABTS●+會快速地轉換成 ABTS(圖 4-29),在 500 nm 附近產生新的吸收峰,而吸收度隨時間增加增強。

圖 4-29ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應隨時間之 UV 變化圖

進一步將反應液以 HPLC-DAD 分析,可以發現上述 500 nm 附近產 生的新吸收峰可能是[M+ABTS-2H2]或[M+ABTS-H2]化合物(圖 4-30),兩 者的 UV 圖沒有顯著差別,因此圖 4-29 中 550 nm 附近波峰的吸收值於

(58)

反應 120 分鐘較 90 分鐘弱,可能來自[M+ABTS-2H2]的莫爾吸收度較 [M+ABTS-H2]小所導致。

圖 4-30 ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應混合液之 HPLC-DAD 圖 ABTS●+與 1,2-benzenediamine 反應液的 HPLC 層析圖(圖 4-31)在滯留 時間 4.03、8.71、11.16 分有訊號產生。

圖 4-31ABTS●+與 1,2-benzenediamine 隨時間反應之層析圖

滯留時間 4.03 分的析出液為 ABTS,8.71 和 11.16 分析出液的

(59)

VESI-MS 直接分析反應液,而不是經由 HPLC 收集析出液再以 VESI-MS 分析,質譜圖中顯示的為縮和聚合物 m/z 211 ([2M-3H2+H]+)和 m/z 213 (2M-2H2+H)+),為何經由 HPLC 管柱分離後使得化合物失去一個 H 原因 不明,不過仔細觀察 HPLC 層析圖滯留時間 11.16 分的波型(圖 4-31),顯 示分析物與固定相間的作用力並不單純,我們後續研究 ABTS●+與 HPLC 管柱中自動轉換成 ABTS 時,也觀察到類似的波型變化現象。 圖 4-32ABTS●+與 1,2-benzenediamine 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 4.03、(B) 8.71、(C) 11.16 min。 1,4-benzenediamine 反應液 HPLC 層析圖與 1,4-benzenediol 及 1,4-aminophenol 所得相似,顯示兩根明顯的波峰,分別是滯留時間 2.64 及 6.97 分(圖 4-33),其中在滯留時間 2.64 分的訊號隨反應時間增加而增 加,以 VESI-MS 分析此析出液並無法獲得離子訊號,依據 1,4-benzenediol 實驗結果推斷這個化合物應該是[1,4-benzenediamine-H2],但以這個結構 來看於游離過程中要質子化形成[M-H2+H] +應是可行,為何無法在 VESI-MS 圖中顯現仍需進一步了解。

(60)

圖 4-33ABTS●+與 1,4-benzenediamine 隨時間反應之層析圖 綜合 benzenediol、aminophenol、benzenediamine 的實驗結果,可以 得知無論是哪種同分異構物都可以將 ABTS●+還原成 ABTS,此外對位和 鄰位異構物會伴隨脫氫反應生成[M-H2]化合物,甚至有聚合脫氫現象生 成[2M-2H2]。間位異構物則沒有反應物的脫氫現象,取而代之進行加成 反應生成[M+ABTS-H2],這個加成物隨時間增長而會解離更多的 H2。

4.2Aniline 間位取代基效應

根據 benzenediol、aminophenol、benzenediamine 三種苯環二取代同 分異構物與 ABTS●+反應的結果,發現三種位置易購物中,只有位於間位 的苯環二取代化合物會與 ABTS●+反應生成加成物,因此進一步探討間位 官能基對反應途徑的影響。

首先觀察在間位沒有取代基的 phenol 及 aniline 與 ABTS●+的反應結 果,以便隨後比較間位取代基的推拉電子對反應途徑的影響。VESI-MS 的結果顯示,phenol 及 aniline 與 ABTS●+反應時,都無發將 ABTS●+還原

(61)

成 ABTS (圖 4-34),ABTS●+與 aniline 反應時生成 m/z 350 及 m/z 606。改 用 HPLC 分析反應液時,無意間觀察到在尚未添加 aniline 前的反應液有 很不尋常的層析圖(圖 4-35),於滯留時間 4 到 6 分多鐘一直有物質持續流 出。 圖 4-34 2.5×10-4 M ABTS●+及 1.25×10-4 M aniline、phenol 反應之質譜圖: (A)反應前 ABTS●+;(B) ABTS●+加入 aniline;(C) ABTS●+加入 phenol

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進一步的探討發現此種現象,應該是來自 ABTS●+通過管柱時與固定 相作用,通行中沿途持續有 ABTS●+於管柱內轉換成 ABTS,才會形成這 種特殊的拖尾現象,後續的研究我們發現,只要 VESI-MS 的結果顯示反 應液中有 ABTS●+殘留,這瓶反應液的 HPLC 層析圖都將會有這種特殊的 外貌。 當添入 aniline 後,原有滯留時間 4 到 6 分多鐘的拖尾現象消失,形 成新的滯留鋒(圖 4-36)。滯留時間 3.11 分有一根新的波峰產生,此波峰 隨反應時間增加訊號越大,將析出液收集以 VESI-MS 分析,可以記錄到 m/z 259、350 及 606 三個訊號(圖 4-37),其中 m/z 259 是 ABTS 斷片訊號, m/z 350 及 606 是生成物的訊號,但是無法確認 m/z 350 是在反應液中已 經生成的,還是來自游離過程中人為的 m/z 606 斷片。滯留時間 6.73 分 的析出液以 VESI-MS 分析為 m/z 515,但是先前以 VESI-MS 線上分析反 應液的結果,顯示反應液中存在的是未反應的 m/z 514 (圖 4-34B),再次 證實了 ABTS●+於管柱中被轉換成 ABTS,也彰顯了以 VESI-MS 進行線 上即時分析的優點。

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圖 4-36ABTS●+與 aniline 隨時間反應之層析圖

圖 4-37 ABTS●+與 aniline 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A) 3.11、(B) 6.73 min。

ABTS●+與 aniline 反應液的 UV/Vis 圖可以更加確認,在我們 HPLC 實驗的採樣時間內 ABTS●+還原成 ABTS 的量應該很少,雖然反應液在 340 nm (ABTS)的吸收強度有隨時間增加而增加(圖 4-38),但與

(64)

圖 4-38ABTS●+與 aniline 反應液不同時間之 UV 圖

4.2.1Aniline 間位取代基推電子基效應

1,3-benzenediol、1,3-aminophenol 及 1,3-benzenediamine 都具有將 ABTS●+還原成 ABTS,以及生成加成物的能力,這三種化合物的間位取 代基皆是屬於強推電子基的官能基,我們接下來削弱取代基的推電子能 力,研究強、中、弱推電子取代基對反應途徑的影響。 比較具有強推電子取代基的 3-methoxyaniline,中推電子取代基的 3-aminoacetanilide 以及弱推電子取代基的 3-methylaniline,發現只有 3-methoxyaniline 才能將 ABTS●+轉換成 ABTS,其餘兩者還原力不足,但 是三者都有加成物的產生(圖 4-39),從此項結果推測要將 ABTS●+數分鐘 內轉換成 ABTS 的話,取代基必須要是強推電子基才行。

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圖 4-39 2.5×10-4

M ABTS●+及 1.25×10-4 M aniline 間位取代基推電子基化 合物反應之質譜圖:(A)反應前 ABTS●+;(B) ABTS●+加入 3-methoxyaniline; (C) ABTS●+加入 3-aminoacetanilide;(D) ABTS●+加入 3-methylaniline

從 ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應發現有 m/z 380 生成,這與 ABTS●+ 與 1,3-benzenediol 反應結果相同,但是比較 HPLC 的滯留時間(圖 4-40), 可以發現兩者並不相同。收集 HPLC 析出液再以 VESI-MS 分析,其中滯 留時間 6.66 分析出液是 ABTS,滯留時間 3.08 分是 ABTS 斷裂訊號(m/z 259)及兩個生成物(m/z 380 和 m/z 636)的訊號(圖 4-41),而滯留時間 4.05 分是質子化的 3-methoxyaniline(m/z 124)。

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圖 4-40ABTS●+與 3-methoxyaniline 隨時間反應之層析圖

圖 4-41 ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A)3.08、(B) 4.50、(C) 6.66 min。

當以 UV-Vis 分析反應液時,一加入 3-methoxyaniline 後 ABTS●+立即 還原成 ABTS,並且在 305 nm 有吸收峰出現(圖 4-42),推測這是 m/z 380 的吸收波長,比對 HPLC-DAD 與 UV-Vis(圖 4-43),確認 305 nm 的吸收 峰為 m/z 380 及 636 的訊號,此外 ABTS●+與 3-methoxyaniline 生成的 m/z

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380 以及 ABTS●+與 1,3-benzenediol 生成的 m/z 380 吸收圖譜不相同,可 以更確定兩者是不同的化合物。

圖 4-42 ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應隨時間之 UV 變化圖

圖 4-43ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應混合液之 HPLC-DAD 圖

VESI-MS 實驗顯示具有弱推電子取代基的 3-methylaniline 無法還原 ABTS●+,反應液的 HPLC 層析圖顯示在滯留時間 2.5、6.01 和 7.11 分有 化合物析出(圖 4-44),其中滯留時間 6.01 分的訊號隨反應時間愈長而增 強。析出液的 VESI-MS 分析顯示,滯留時間 2.5 分為 m/z 563 (圖 4-45); 滯留時間 6.01 分為加成物 m/z 364 及 m/z 620,此訊號隨反應時間愈長而 增強,滯留時間 7.11 分則為 ABTS。

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圖 4-44ABTS●+與 3-methylaniline 隨時間反應之層析圖 圖 4-45 ABTS●+與 3-methylaniline 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A)2.5、(B) 6.01、(C) 7.11 min。 反應液的 UV-Vis 實驗則顯示,ABTS 的吸收強度隨著反應時間增長 而增加,但是 3-methylaniline 並無法將反應液中的 ABTS●+完全還原成 ABTS (圖 4-46);波長 305 nm 的吸收峰推測來自加成物 m/z 364 和 m/z 620。

(69)

圖 4-46ABTS●+與 3-methylaniline 反應隨時間之 UV 變化圖

4.2.2Aniline 間位取代基拉電子基效應

有關 aniline 間位取代基對反應途徑的影響,接著進一步研究拉電子 取代基的影響,所探討的化合物包含強拉電子基的 3-nitroaniline (-NO2)、 中拉電子基的 3-aminoacetophenone (-COCH3)以及弱拉電子基的 3-chloroaniline (-Cl)、3-bromoaniline (-Br),發現這些化合物皆不具有將 ABTS●+還原成 ABTS 的能力(圖 4-47)。具有中拉電子基的 3-aminoacetophenone 以及弱拉電子基的 3-chloroaniline、3-bromoaniline 皆會有加成物的產生,但是強拉電子基的 3-nitroaniline 則是完全沒反應 發生,進一步以 UV-Vis 分析,證實的確沒有反應發生(圖 4- 48)。此若以 4-chloroaniline 與 ABTS●+反應,則也是無反應。因此具有拉電子基的苯 環二取代化合物並不具有還原 ABTS●+的能力,而當拉電子基的強度夠強, 或是位置異構物不是間位,則連加成物也無法生成。

(70)

圖 4-47 2.5×10-4

M ABTS●+及 aniline 間位拉電子基化合物反應之質譜圖: (A)反應前 ABTS●+;(B) ABTS●+加入 3-nitroaniline;(C) ABTS●+加入 3-aminoacetophenone;(D) ABTS●+加入 3-bromoaniline;(E) ABTS●+加入 3-chloroaniline;(F) ABTS●+加入 4-chloroaniline。

圖 4- 48ABTS●+與 3-nitroaniline 反應隨時間之 UV 變化圖 3-bromoaniline 及 3-chloroaniline 反應液以 HPLC 分析時,

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隨反應時間增加而增加;而滯留時間 16.33 分產生的新波峰,訊號卻是隨 反應時間增加而減少。 圖 4-49 ABTS●+與 3-bromoaniline 隨時間反應之層析圖 將析出液經收集用 VESI-MS 測定 (圖 4-50),顯示滯留時間 7.18 分 是 ABTS、滯留時間 9.06 分是 m/z 428、686,滯留時間 16.33 分的析出 液在質譜圖中顯示大半為背景值,沒有顯著分析訊號可供參考,推斷這 化合物不容易游離,因此在 VESI-MS 圖中不易顯現。 圖 4-50ABTS●+與 3-bromoaniline 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖: RT= (A)7.18、(B) 9.06、(C) 16.33 min。

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UV-Vis 結果確認 3-bromoaniline 無法還原 ABTS●+ (圖 4-51),而波長 300 nm 的吸收峰推測來自加成物。 圖 4-51ABTS●+與 3-bromoaniline 反應隨時間之 UV 變化圖 以分析 3-bromoaniline 反應液相同的 HPLC 條件分析 3-chloroaniline 反應液發現有一根波峰會與 ABTS 重疊無法分離(圖 4-52),後續嘗試以 不同的流動相組成克服這個問題。以 0.5% CH3COOH (pH 6.9): MeOH= 70:30 為流動相組成,進行分離時,可以觀察到 ABTS 的訊號會隨反應時 間增加,並伴隨著一根與 ABTS 部分重疊的新波峰,這個新的波峰強度 隨著反應時間增加而增強。可以觀察到滯留時間 4 到 6 分多鐘有很奇怪 的拖尾現象,因此嘗試改流動相條件以便獲得可接受的分離效果。

(73)

圖 4-52ABTS●+與 3-chloroaniline 隨時間反應之層析圖:LC 條件為 0.5% CH3COOH(pH 6.9):MeOH= 70:30 以 0.5% CH3COOH (pH= 6.9) : MeOH=75:25 為流動相組成分析,重 疊現象有改善但無法完全克服(圖 4-53),進一步將 CH3COOH 的 pH 值調 整為 6.24,移動相比例為 0.5% CH3COOH(pH 6.24):MeOH= 70:30,波峰 較先前顯得更為狹窄,但是拖尾現象仍是仍無改善 (圖 4-54),比對先前 實驗結果,發現拖尾現象應該是來自反應液中有未反應 ABTS●+所引起(參 考圖 4-35)。最終選定以 0.5% CH3COOH (pH= 6.9) : MeOH=75:25 作為分 析 3-chloroaniline 反應液的最佳條件。

(74)

圖 4-53 ABTS●+與 3-chloroaniline 隨時間反應之層析圖:LC 條件為 0.5% CH3COOH(pH 6.9):MeOH= 75:25

圖 4-54 ABTS●+與 3-chloroaniline 隨時間反應之層析圖:LC 條件為 0.5% CH3COOH(pH 6.24):MeOH= 70:30

3-chloroaniline 與 4-chloroaniline 反應液的 UV-Vis 分析結果都確認, 並無 ABTS 的生成(圖 4-55)。圖 4-55 顯示 305 nm 波長處有新波峰生成, 並且強度隨反應時間增加而增強,推測是來自加成物。4-chloroaniline 反

(75)

應液則沒有顯示新的吸收峰(圖 4-56)。 圖 4-55ABTS●+與 3-chloroaniline 反應隨時間之 UV 變化圖 圖 4-56ABTS●+與 4-chloroaniline 反應隨時間之 UV 變化圖

4.2.3 其他間位苯環二取代基效應

前述實驗中發現 aniline 衍生物與 ABTS●+反應時,必須是間位化合物 才會有加成物的生成,接下來我們進一步探討稠環芳香族二取代基化合 物是否有這種效應,所研究比較的對象為 1,8-diaminonaphthalene 及 1,5-diaminonaphthalene (圖 4-57),前者的兩個-NH2官能基相對位置如同 1,3-benzenediamine,後者的兩個-NH2官能基則分隔較遠。

數據

圖 2-2 線上 HPLC-ECD 系統裝置是意圖 12
圖 2-51,2-benzenediol 與 ABTS ●+ 反應之反應機制 19
圖 2-6ABTS ●+ 與 phloroglucinol 反應之反應機制 20
圖 2-7Flavonols 與 ABTS ●+ 反應加合物的斷裂機制及其降解途 21
+7

參考文獻

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