關鍵字:超級細菌、抗藥性、抗藥蛋白

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中華民國第 51 屆中小學科學展覽會 作品說明

科別:生物科 組別:高中組

作品名稱:遠在天邊近在你我身邊的超級細菌-鮑氏不動桿菌之抗藥 性-

關鍵字:超級細菌、抗藥性、抗藥蛋白

編號:

(2)

遠在天邊近在你我身邊的超級細菌

-鮑氏不動桿菌之抗藥性-

研究摘要

選擇了鮑氏不動桿菌作為研究目標,因為它是最常在醫院被發現的細菌之一。(編號:「L」

表「林新醫院提供」,「R 菌」表示「具有抗藥性的 AB 菌」,「S 菌」表示「不具抗藥性的 AB 菌」數字表示每支菌的編號;故「LS1」就是「由林新醫院所提供不具抗藥性的 AB 菌第 1 隻。) 在一開始先進行有抗藥性但未加抗生素及無抗藥性細菌的 SDS-PAGE 一維蛋白質電泳 後,確認了不論是有無抗藥性的細菌,在未加入抗生素前,其蛋白質的表現上並無差異。

經過討論後決定加入抗生素以刺激其抗藥蛋白的表現。在這之前,須先找出適合的抗生 素濃度也就是「最低抑菌濃度」(MIC)。於是我們在菌液中分別加入不同濃度的抗生素隔夜培 養後測 OD 值,經過整理數據後,決定以濃度為 4μg/ml 的抗生素進行下一階段的實驗。

分別於 R、S 加入濃度為 4μg/ml 的抗生素隔夜培養後再次進行電泳實驗,觀察結果並找 到被抗生素刺激而增加表現量的特殊抗藥蛋白。

將此蛋白從膠片上取出,並送交儀器測定,利用 NCBI 搜尋其序列,得知該蛋白質即為 AdeK,而此蛋白質對抗抗生素的方法即是細菌利用細胞膜上的幫浦將抗生素排出,達到對抗 抗生素的效果。

壹、 研究動機

最近,電視上出現了一則引人注目的新聞-不怕抗生素的超級細菌 NDM1 席捲全球。根 據國外報導,超級細菌讓現代醫學對抗傳染病、微生物感染的最重要武器-抗生素一路挫敗,

但是否只要染上超級細菌就沒救了?

隨著醫學技術進步,對於各種疾病的防治方法都漸漸被掌握。其中的功臣之一即是抗生 素,然而在人們長期使用抗生素後,有個名詞在很多的文獻及報導中便可看到,那即是-「抗 藥性」這個字眼。但為什麼細菌會產生抗藥性呢?甚至產生了能同時對抗多種抗生素的全抗 藥性細菌,我們稱之為「超級細菌」。

各式各種的超級細菌,其中最令我們好奇的是鮑氏不動桿菌(AB 菌),在看過一些資料 後,我們發現其實鮑氏不動桿菌是一種廣泛地存在於大自然環境中的細菌,可在水、土壤及 食物(Ex:水果、蔬菜中)和下水道污物中,亦為革蘭氏陰性桿菌中能存在人體皮膚上的正 常菌叢之一,能和人體和平共存,存在於皮膚、腋下、結膜、會陰、口腔、上呼吸道及下腸 胃道,有時也存於咽喉和唾液、黏膜的細菌。基本上,鮑氏不動桿菌是共生性的,為伺機性

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強抗藥性。 1998 年,台大醫院首度分離出對所有目前上市的抗生素(包含泰寧一類在內)

均具抗藥性的鮑氏不動桿菌,即「全抗藥性鮑氏不動桿菌(PDRAB)」。PDRAB 可說是台灣 獨有的超強細菌,沒有任何藥物可以醫治,病患只能依靠自身的免疫力來殺死細菌。

因為鮑式不動桿菌是現今醫院內感染最盛的細菌之一,那麼它的抗藥性有無是與基因還 是蛋白質不同有關?若有不同,是平常時就已有差異還是需要經過特殊誘導?若有產生特殊 蛋白,它是什麼?功用為何?這都是令我們感到好奇想進一步了解的問題。在查詢了一些資 料後我們便決定以鮑氏不動桿菌作為實驗對象並研究它的蛋白質,加入抗生素,以了解其中 發生了什麼變化。

貮、研究目的

一、對抗生素Meropenem Trihydrate 具抗藥性(R 菌)和不具抗藥性(S 菌)的 Acinetobacter baumannii 菌在蛋白質電泳實驗中,比較蛋白質表現的差異。(文中所用代號:「R 菌」表 示「具有抗藥性的 AB 菌」,「S 菌」表示「不具抗藥性的 AB 菌」。)

二、具抗藥性(R 菌)的 Acinetobacter baumannii 菌在加入抗生素前後的蛋白質表現量有何 差異。先找出適合的抗生素濃度,也就是「最低抑菌濃度」(MIC)。

三、確定「最低抑菌濃度」(MIC)後,依照「最低抑菌濃度」(MIC)加入菌液中,進行電泳實 驗,觀察其蛋白質表現是否因抗生素而有所改變。

四、找到因加入抗生素而表現量增加的蛋白質,從膠片上取出後,送交儀器測定,並利用 NCBI 搜尋蛋白質序列,確定其身分及功能。

參、研究設備及器材

一、實驗菌種、抗生素種類

(一)菌種:Acinetobacter baumannii(AB 菌):由林新醫院提供

(二)抗生素:Meropenem Trihydrate

二、實驗設備及器材

高壓滅菌釜 分光光度計

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離心機(冷凍離心機[左]、微量離心機[右])

無菌操作台 通風櫥

震盪培養箱、加熱攪拌器和磁石、迷你 Protein 電泳槽、電源供應器、搖盪器、冷凍櫃(-80

℃)、電子秤、電磁爐、Eppendorf、滅菌條、Pipetteman 和 Tip、各種容量的離心管、錐形瓶、

1L 量筒、5L 量筒、凍菌管、Gel 盛裝盒、塑膠染色盒、齒梳

三、實驗藥品和配方

(一)實驗用消毒酒精(75%)

(二)養菌用

1.LB Broth(25g Powder/1L ddH2O)

(1)Tryptore 胰蛋白 5g

(2)Yeast Extract 酵母菌萃取 2.5g (3)Nacl 5g

(4)ddH2O 加至 1L 2.Glycerol 60%

3.Acetone

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(1)DTT 1.5M 5mL (2)SDS 10% 20mL

(3)Bromphenol blue 溴酚藍染劑 約 0.1mg (4)Glycerol 100% 10mL

(5)Tris-HCl PH=6.8 0.5M 10mL 2.Electro buffer

(1)Tris-HCl 3g (2)Glycine 14.4g (3)SDS 1g

(4)ddH2O 加至 1L 3. 13.8% SDS-PAGE 下膠

(1)Acrylamide-bisacrylamide 30% 1.85mL (2)Tris-HCl 1.5M PH=8.8 1mL (3)SDS 10% 40μL

(4)APS(Ammonun Persulfate)200μL (5)ddH2O 900μL

(6)TEMED 酵素 3μL 4. 13.8% SDS-PAGE 上膠

(1)Acrylamide-bisacrylamide 30% 250μL (2)Tris-HCl 1.5M PH=6.8 500μL (3)SDS 10% 20μL

(4)APS(Ammonun Persulfate)30μL (5)ddH2O 1100μL

(6)TEMED 酵素 3μL 5.Coomassie Brillant Blue 染劑 (1)R250 0.625g (2)Aminablack 染劑 0.5g (3)Acetic acid 冰醋酸 46mL (4)Methanol 有機溶劑 227mL 6.Destain(脫色劑)

(1)冰醋酸 50 mL (2)甲醇 150mL (3)ddH2O 350mL

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肆、研究過程或方法

(實驗一:測試蛋白質)

依 MIC 加入抗生素

重複實驗一(電泳) (實驗三:誘導特殊蛋白)

(有、無抗藥性的)

AB 菌回養

〈LB Broth 配置)

AB 菌回養

膠體、Electro buffer 配置

電泳 Sample 準備

架設器材進行電泳實驗

將誘導出的蛋白質送交儀器測定 (實驗四:測定誘導出的特殊蛋白) SDS-PAGE 保存

(實驗二:找出 MIC)

取 S、R 菌液測 OD 值

利用 NCBI 搜索蛋白質序列

分別加入不同濃度抗生素

找到特殊蛋白質 Overnight 後測 OD 值

整理數據找出 MIC

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一、測試蛋白質 (一)、 AB 菌回養

1.配置養菌用的 LB Broth(25g Powder/1L ddH2O)

2.將 AB 菌從-80℃的冰箱取出

3.將 AB 菌 40μ和 LB Broth 30ml 在無菌操作台混合 4.放入震盪培養箱震盪隔天取出

(二)、 電泳 Sample 準備

1.將 overnight 的菌液從震盪培養箱取出

2.取 100μl 菌液離心[13000r.p.m]後倒掉上清液 3.加入 100μl 二次水再次離心,倒掉上清液 4.加入 100μl[一倍稀釋] Sample Buffer 5.100℃煮 10 分鐘

(三)、 膠體配置 1.將制膠器架好

2.在離心管內依序加入

Acrylamide-bisacrylamide 30% 1.85mL Tris-HCl 1.5M PH=8.8 1mL ddH2O 900μL

APS(Ammonun Persulfate)200μL SDS 10% 40μL

TEMED 酵素 3μL[需最後,因未加入後即開始使混合液成固狀]

製成 13.8% SDS-PAGE 下膠 3.迅速注入制膠器

4.在離心管內依序加入 ddH2O 1100μL

Tris-HCl 1.5M PH=6.8 500μL Acrylamide-bisacrylamide 30% 250μL APS(Ammonun Persulfate)30μL SDS 10% 20μL

TEMED 酵素 3μL

製成 13.8% SDS-PAGE 上膠 5.迅速插入齒梳

(四)、 Electro buffer 配置 1. 將 Tris-HCl 3g

Glycine 14.4g SDS 1g

ddH2O 加至 1L,混合均勻 (五)、 架設器材進行電泳實驗

1.取 protein sample 及 Sample Buffer 各 20μL 於 eppendorf 混合均勻,100℃加熱 10 分鍾,放

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冷後備用,每次 load 10μL

2.取下膠片,勿與兩玻璃片分離,並架好膠片組合到電泳槽

3.電泳槽內側先加入新泡好的 Electro buffer,外側加入回收的 Electro buffer,並保持兩液面 等高

4.準備好一杯二次水&一張乾淨衛生紙,清洗 tip 用

5.從膠片之左至右依序加入 protein sample 3.5μL & Sample solution

6.迷你 Protein 電泳槽接上電源,調整為 120v 時間,安培數不調整,按下開始

7.電泳時 Electro buffer 會不斷冒泡,待 DYE 跑至離膠底 0.5~1 公分時取下膠片,進行呈 色步驟,用過的 buffer 回收

(六)、 SDS-PAGE 保存

1.小心於水龍頭下取下 gel 並將上層膠切除,洗去殘膠

2.將膠片放入 Coomassie Brillant Blue 染劑,染劑需蓋過膠片,放在 shaker 上搖盪 15-20 分鍾 3.將染劑回收,膠片用清水沖洗乾淨

4.倒入 Destain 需蓋過膠片,放在 shaker 上搖盪 15-20 分鍾,讓染劑溶入 Destain 後將 Destain 倒入回收瓶,重複 2-3 次

5.膠片放在自來水沖洗乾淨,用玻璃紙包起來晾乾 二、誘導特殊蛋白

(一)、 取 S、R 菌液測 OD 值 1.回養 3mlAB 菌液 overnight

2.次日,每 ml LB Broth 加入 10μl 的隔夜培養菌,共 3ml 以 600nm 測 OD 值 3.加入 1.2.4.8. μg/mlMeropenem Trihydrate

4.下午三點開始培養,次日九點半取菌液以 600nm 測 OD 值 5.比較不同濃度Meropenem Trihydrate 的 OD 值變化

6.以測出的最低抑菌濃度(MIC)開始重複電泳實驗,誘導出特殊蛋白 三、測定誘導出特殊蛋白

(一)、 將特殊的蛋白質由電泳膠上切割出來 (二)、 送至中興大學實驗室儀器測定

(三)、 利用 NCBI 做蛋白質定序(搜尋符合的特定蛋白質)

伍、研究結果

實驗一:在無抗生素狀況下測試蛋白質,觀察 R 菌是否具有異於 S 菌的特殊蛋白(數據圖表 中所用編號:「L」表「林新醫院提供」,「R 菌」表示「具有抗藥性的 AB 菌」,「S 菌」表示

「不具抗藥性的 AB 菌」數字表示每支菌的編號;故「LS1」就是「由林新醫院所提供不具 抗藥性的 AB 菌第 1 隻。)

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圖ㄧ、LS1~4 & LR1~8(未加抗生素)電泳結果

圖二、LS1~4 & LR9~16(未加抗生素)電泳結果

圖三、LS1~4 & LR17~23(未加抗生素)電泳結果

由圖一~圖三顯示,在未加入抗生素之前,比較 S、R 菌電泳圖之後並未發現某特殊蛋白質是

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普遍 R 菌所共同擁有而 S 菌不具有的,故我們決定進行下一階段的實驗,也就是加入抗生素 將抗藥蛋白刺激 R 菌中特殊蛋白表現出來。

實驗二、三:找出 MIC 及誘導特殊蛋白,由於未加入抗生素所跑的電泳結果(實驗一)中,未 發現特殊的抗藥蛋白,於是決定加入抗生素以刺激 R 菌表現出較大量的抗藥蛋白。

表一、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LS1,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素M eropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),表為 加入抗生素前後 OD 值。

LS1 濃度 0 濃度 1 濃度 2 濃度 4 濃度 8 加抗生素 0.245 0.245 0.245 0.245 0.245 未加抗生素 7.58 3.45 1.71 0.815 0.27

0 1 2 3 4 5 6 7 8

1900年1月1日1900年1月2日1900年1月3日1900年1月4日1900年1月5日

加抗生素 Origin

0 1 2 4 8 μg/ml OD 值 (菌數)

隔夜培養

(未加抗生素)

(抗生素濃度)

圖四、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LS1,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素M

圖顯示,編號 LS1 菌液隨抗生素濃度漸增而 OD 值(菌量)漸減,在濃度為 8μg/ml 時達抑菌 eropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),圖為 加入抗生素前後 OD 值。

效果,故 LS1 的 MIC(最低抑菌濃度)約略為 8μg/ml。

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表二、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LS2,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素M eropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),表為 加入抗生素前後 OD 值。

LS2 濃度 0 濃度 1 濃度 2 濃度 4 濃度 8 加抗生素 0.306 0.306 0.306 0.306 0.306 未加抗生素 4.33 1.065 0.962 0.154 0.141

0 1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5

加抗生素 Origin

0 1 2 4 8 μg/ml OD 值 (菌數)

隔夜培養

(未加抗生素)

(抗生素濃度)

圖五、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LS2,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素M eropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),圖為 加入抗生素前後 OD 值。

如圖顯示,編號 LS2 菌液隨抗生素濃度漸增而 OD 值(菌量)漸減,在濃度為 4μg/ml 時達抑 菌效果,故 LS2 的 MIC(最低抑菌濃度)約略為 4μg/ml。

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表三、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LS3,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素M eropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),表為 加入抗生素前後 OD 值。

LS3 濃度 0 濃度 1 濃度 2 濃度 4 濃度 8 加抗生素 0.243 0.243 0.243 0.243 0.243 未加抗生素 2.76 1.123 0.977 1.187 0.301

0 1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5

加抗生素 Origin

0 1 2 4 8 μg/ml OD 值 (菌數)

隔夜培養

(未加抗生素)

(抗生素濃度)

圖六、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LS3,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素M eropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),圖為 加入抗生素前後 OD 值。

如圖顯示,編號 LS3 菌液隨抗生素濃度漸增而 OD 值(菌量)漸減,在濃度為 8μg/ml 時達抑菌 效果,故 LS3 的 MIC(最低抑菌濃度)約略為 8μg/ml。

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表四、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LS4,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素M eropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),表為 加入抗生素前後 OD 值。

LS4 濃度 0 濃度 1 濃度 2 濃度 4 濃度 8 加抗生素 0.725 0.725 0.725 0.725 0.725 未加抗生素 7 3.64 4.16 0.398 0.309

0 1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5

加抗生素 Orign

0 1 2 4 8 μg/ml OD 值 (菌數)

隔夜培養

(未加抗生素)

(抗生素濃度)

圖七、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LS4,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素M

圖顯示,編號 LS4 菌液隨抗生素濃度漸增而 OD 值(菌量)漸減,在濃度為 4μg/ml 時達抑 eropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),圖為 加入抗生素前後 OD 值。

菌效果,故 LS4 的 MIC(最低抑菌濃度)約略為 4μg/ml。

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表五、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LR1,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素M eropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),表為 加入抗生素前後 OD 值。

LR1 濃度 0 濃度 1 濃度 2 濃度 4 濃度 8 加抗生素 0.545 0.545 0.545 0.545 0.545 未加抗生素 4.67 3.8 5.87 5.81 3.53

0 1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5

加抗生素 Origin

0 1 2 4 8 μg/ml OD 值

LR1 圖八、

Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LR1,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素Meropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),圖為加入抗生 素前後 OD 值。

如圖顯示,編號 LR1 菌液隨抗生素濃度漸增而 OD 值(菌量)卻沒有明顯大幅度的增減,可推 測此濃度範圍的抗生素並未對 LR1 造成太大的影響,亦即此範圍濃度之抗生素不足以致 R 菌 於死地。

(未加抗生素)

(菌數)

(抗生素濃度)

隔夜培養

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表六、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LR13,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素 Meropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),表 為加入抗生素前後 OD 值。

LR13 濃度 0 濃度 1 濃度 2 濃度 4 濃度 8 加抗生素 0.647 0.647 0.647 0.647 0.647 未加抗生素 4.03 3.69 4.46 4.78 3.72

0 1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5

加抗生素 Origin OD 值

0 1 2 4 8 μg/ml

LR13

(菌數)

隔夜培養

(抗生素濃度)

圖九、Acinetobacter baumannii(AB 菌),編號 LR13,分裝 5 管並分別加入不同濃度抗生素 Meropenem Trihydrate,於震盪培養箱培養 1 日後,以分光光度計測出個別吸光度(菌量),圖 為加入抗生素前後 OD 值。

如圖顯示,編號 LR13 菌液隨抗生素濃度漸增而 OD 值(菌量)卻沒有明顯的增減,可推測此濃 度範圍的抗生素並未對 LR13 造成太大的影響,亦即此範圍濃度之抗生素不足以致 R 菌於死 地。

測出 S 菌的 MIC 後,我們以此數據我們認為 4μg/ml 為效果最佳濃度,所以我們使用 4μg/ml 之抗生素加入各菌之中再跑一次電泳,觀察其有何改變

(16)

圖十、LR1-6 未加抗生素與加了濃度為 4μg/ml 抗生素的比較

如圖顯示,在 LR3 四倍抗生素位置紅色標記處有相較於未加抗生素之特殊蛋白質,推測是被 抗生素刺激而誘導出來的結果。

圖十一、LR7-12 未加抗生素與加了濃度為 4μg/ml 抗生素的比較

(17)

圖十二、LR13-18 未加抗生素與加了濃度為 4μg/ml 抗生素的比較

如圖顯示,圖十二中 LR13-18 並未因加入了抗生素而出現特殊蛋白質。

圖十三、LR19-23 未加抗生素與加了濃度為 4μg/ml 抗生素的比較,

白質。

與菌液內物質含量些許不同 如圖顯示,圖十三中 LR19-23 並未因加入了抗生素而出現特殊蛋 些許顏色深淺差異只是上清液電泳

(18)

,並使用 NCBI 資料庫搜尋進行比對,得到此蛋白質的

AAEQGLLLLQ =ANLNNQIEL YKTLGGGLKA NTSDTVVHQP 451 SSAELKKQ

陸、討論

入的

大腸菌素、制黴菌素)及細胞壁合成抑制劑(如:青黴素、頭芽菌素、萬古黴素)

四大

衍生出不受抗生素作用的下一代,久 而久

量的菌株,所以顏色較深的部份整體來看應該是 那隻

有相當程度的抑菌效果,為了上 實驗四:測定誘導出的特殊蛋白

經過儀器的檢驗得到此蛋白質的質量 序列,最後得知此蛋白為 AdeK。

1 MRGPEPVVKT DIPQSYAYNS ASGTSIAEQG =KQFFADPRL LEVIDLALAN 51 NRDLRTATLN IERAQQQYQI TQNNQLPTIG ASGSAIRQVS QSRDPNNPYS 101 TYQVGLGVTA YELDFWGRVR SLKDAALDSY =ATQSARDST QISLISQVAQ 151 AWLNYSFATA NLRLAEQTLK AQLDSYNLNK =RFDVGIDSE VPLRQAQISV 201 ETARNDVANY KTQIAQAQNL =NLLVGQPVP QNLLPTQPVK RIAQQNVFTA 251 GLPSDLLNNR PDVKAAEYNL SAAGANIGAA =ARLFPTISL TGSAGYASTD 301 LSDLFKSGGF VWSVGPSLDL PIFDWGTRRA NVKISETDQK IALSDYEKSV 351 QSAFREVNDA LATRANIGER LTAQQRLVEA TNRNYTLSNA RFRAGIDSYL 401 TVLDAQRSSY

何謂超級細菌呢?所謂的超級細菌,是攜帶多種抗藥性基因的細菌,因此又可稱為多重 抗藥性細菌;細菌抗藥性機制約可分為四種:使抗菌藥物作用的靶點發生改變(改變受體結 構)、細胞膜特性的改變(膜蛋白構造改變)、產生破壞抗生素作用的酵素、使用主動運輸將侵

抗生素排出體外。而使細菌產生這麼多種抗藥機制與抗生素過度使用有很大的關係。

依據美國疾病管制局的檔案資料顯示,目前臨床使用的抗生素至少有一百五十多種。這 些抗生素主要是從微生物的培養液中純化,或者經合成或半合成的方法所製得,依其抑菌模 式可概分為核酸合成抑制劑、蛋白質合成抑制劑(如:四環黴素類、綠黴素)、細胞膜功能抑 制劑(如:

類。

在自然界中,生物有一種自然演變的特性即是生物體上控制生命現象的基因在複製時並 非完全不變的,在複製時有一極小比例的情形會發生突變,而細菌體是一單細胞生物,其分 裂繁殖非常快速因此有相當的機會可以因為基因突變而

之,活下來的細菌就幾乎具備了抗藥性的基因。

在實驗一中,有的 band 顏色較深,我們卻不認為此為 R 菌和 S 菌不同的特異蛋白,因 為在取菌的過程中不可能每管都取到同驗數

菌在一開始取到的量就較多的緣故。

實驗二的 MIC 部分,經過與教授及學長充分的討論後,我們決定在 S 及 R 菌加入抗生 素,目的就是希望在有抗生素刺激的環境下,R 菌會顯示出特殊的蛋白質,但由於抗生素M eropenem Trihydrate 的成本昂貴且為了節省實驗資源,所以我們決定先找出 AB 菌的 MIC,

也就是最低抑菌濃度。我們分別對 LS1~4 進行測試,得知了它們分別在 4 和 8μg/ml 時有抑 菌效果;雖然 LS1&3 的 MIC 為 8μg/ml,但在 4μg/ml 時也

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-Ala 結合,它便改變自己的細胞壁為 D-Ala-D-Lac,因此對萬古黴素產生了強 的抗藥性。

柒、結論

質電泳,確認了不

抗生素的方法即是可使細菌利用細胞膜上的 幫浦

,未來當然是希望能鎖定此特性,研發或是找到能夠對抗抗藥性細菌的抗生素 或是藥品。

捌、參考資料及其他

1. 蛋白Omp25與Imipenem 抗藥性

碩士論文。

2.

有表現,卻也顯示的非常些微,讓我們觀測不出來;又或許是我們當初取的抗生素濃度太低,

有抗藥性的 AB 菌身上的蛋白質可能要在更高濃度的狀況下才會被刺激表現出來;最後,或 者是其實每株菌對抗抗生素的機制是不同的,對於沒有被誘導出特殊蛋白的菌,他們可能不 是用此蛋白質進行抗藥的。就好比抗萬古黴素的腸球菌為了因應萬古黴素與自己細胞壁前質 末端的 D-Ala-D

在這次實驗中,我們選擇了鮑氏不動桿菌作為研究目標,因為它是最常在醫院被發現的 細菌之一。在一開始先進行有抗藥性但未加抗生素及無抗藥性細菌的蛋白

論是有無抗藥性的細菌,在未加入抗生素前基本上是沒有蛋白質變異。

在 4μg/ml 的抗生素下,有一隻細菌對抗Meropenem Trihydrate 的蛋白質被誘導出來,而

這個特殊蛋白經過儀器的檢驗得到此蛋白質的質量並使用 NCBI 進行比對,得到此蛋白質的 序列,最後得知此蛋白為 AdeK,此蛋白質對抗

將抗生素排出,達到對抗抗生素的效果。

未來展望:既然我們誘導出了那個特殊的蛋白質,明白了這個菌種的某一隻菌可以利用 這個蛋白質對抗抗生素,經過鑑定後,也明白了這個蛋白質對抗抗生素的機制,是主動將抗 生素排出體外。可以藉由生物基因轉植技術(PCR)將此段基因置入其他細菌中,觀察其表現 是否與鮑氏不動桿菌具有相同抗藥效果,若其結果相符,那麼,我們理解了抗藥性細菌是如 何對抗抗生素

謝一平(民95)。鮑氏不動桿菌乙內醯胺酶OXA-66 和外膜 之研究。國立陽明大學醫學生物技術研究所

施純如。蛋白質體學的研究方法。 取自:

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