行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

評估板藍根及 albendazole 混合治療廣東住血線蟲感染 BALB/c 小白鼠所引發腦膜炎之效果

計畫類別： 個別型計畫

計畫編號： NSC93-2314-B-040-030-

執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 中山醫學大學醫學系寄生蟲學科

計畫主持人： 李秀雄 共同主持人： 賴世展

報告類型： 精簡報告

處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 10 月 19 日

評估板藍根及 albendazole 混合治療廣東住血線蟲感染 BALB/c 小白鼠

所引發腦膜炎之效果

Efficacy of Banlangen–albendazole co-therapy against Angiostrongylus cantonensis induced parasitic meningitis in BALB/c mice

計劃編號：NSC 93-2314-B-040-030 執行期限：2004-01-01~2005-07-31 主持人：賴世展

執行機構及單位名稱：中山醫學大學寄生蟲學科

中文摘要

以albendazole 治療罹患廣東住血線蟲

症之小白鼠雖然可以殺死感染到腦部的廣

東住血線蟲幼蟲，但是死亡的幼蟲卻會造

成腦部的傷害並引起免疫反應。過去的研

究顯示使用非類固醇類的抗發炎藥物也可

能減輕腦膜炎的病徵。本研究以

albendazole 和板藍根混合治療罹患嗜伊紅

性腦膜炎的BLAB/c 小白鼠，並由下列的

治療指標中分析治療的成效: (1)蟲的回收

數。(2) eosinophil 的計數。(3)

pro-inflammatory cytokine 的 mRNA 表現

量，例如：TNF-α。本研究結果顯示

albendazole 和板藍根混合治療的組別明顯

地減少蟲回收數及eosinophil 數量，但是

TNF-α mRNA 表現量並無明顯影響。這

些結果顯示albendazole 和板藍根混合治療

可能提供治療寄生蟲性腦膜炎的方法。

英文摘要

Although the anthelmintic agent

albendazole can kill the Angiostrongylus

cantonensis larvae that infect the brain, their

dead larvae are capable of evoking a severe,

brain damaging immune response.

Administration of non-steroid

anti-inflammatory drugs have been reported

to possibly relieve the symptom of

meningitis. To observe the curative effects of

albendazole-banlangen co-therapy on

eosinophilic meningitis in BALB/c mice.

Assay indicators for the therapeutic effect

include 1) worm recovery; 2) eosinophil

counts; and 3) pro-inflammatory cytokine

mRNA expression, such as tumor necrosis

factor-α. The results showed that the

albendazole- banlangen co-therapy

significantly decreased (P<0.05) worm

recovery and eosinophil counts, whereas

TNF-α mRNA levels were not significantly

changes . This therapeutic approach of

albendazole-banlangen co-therapy may

provide for treating parasitic meningitis.

前言

廣東住血線蟲(Angiostrongylus

cantonensis)是一種寄生在大白鼠(Rat)肺動

脈的線蟲，屬於人畜共通的寄生蟲

(zoonotic parasites) ，人類是由於吃蝸牛肉

而意外感染(Alicata, 1965)。主要分佈於東

南亞和南太平洋一帶，台灣整個島嶼幾乎

都有此寄生蟲的存在，每年都有因飲食不

當而感染廣東住血線蟲病例報告出現，大

部分發生於台灣南部(Yii, 1976; Chen,

1979)。此寄生蟲發育中的幼蟲會侵入人類

中樞神經系統(CNS)，造成血腦障壁(BBB)

破壞，神經細胞脫髓鞘(demyelination)

(Hwang et al., 1993)及小腦(cerebellar)浦金

氏細胞(purkinje cells)喪失、損傷、有空泡

等(Perez et al., 1989; Yoshimura, 1993)，對

人類性命會造成嚴重威脅。臨床上重要的

特徵是引起嗜伊紅性腦膜炎(eosinophilic

meningitis)或嗜伊紅性腦膜腦炎

(eosinophilic meningoencephalitis)的主要原

因(Hsu et al., 1990; Ismail and Arsura, 1993;

Gardiner et al., 1990)。引起的病理變化特徵

是，腦脊髓液(CSF)及末梢血液的嗜伊紅性

白血球(eosinophils)增加，腦部嗜伊紅性白

血球及淋巴球浸潤等發炎反應，常見症狀

有頭痛、噁心、嘔吐、嗜睡及發燒等，有

時會出現頸部強直、視覺障礙及昏迷等神

經症狀(Hwang and Chen, 1988)。

細胞激素(cytokines)為一群低分子量

的調節蛋白，大約只有6~60 kDa，其生理

功能包括參與自然的免疫反應；調節淋巴

球生長、分化和細胞活性；參與免疫發炎

反應；刺激未成熟白血球的生長和分化

(Lucey et al., 1996)。當人類對抗微生物感

染，啟動發炎反應以抵抗微生物入侵的過

程中，皆需有細胞激素的參與，而這些激

素包括第一型干擾素(type I interferon)、腫

瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α,

TNF-α)、interleukin-1(IL-1)及趨化激素

(chemokines)等(Lucey et al., 1996)。腫瘤壞

死因子群 (TNF superfamily) 是具有多方

面功能的細胞激素群，藉由和標的細胞

(target cell) 上的相對受體結合而傳遞訊

息，影響細胞的生物反應，其中主要的是

關於免疫系統及發炎反應的調節。腫瘤壞

死因子群成員中，除了TNF-β 以可溶性蛋

白的方式存在之外，其餘皆是屬於 N 端在

細胞內，C 端向細胞外之第二型穿膜蛋

白，它們在細胞外和受體結合的區域約有

150 個氨基酸，具 20-25% 的相似性，然而

在細胞內區域，不論是在長度或氨基酸序

列上則皆不相同(Beutler and van Huffel,

1994; Nagata, 1997)。TNF-α 為一個具多功

能的細胞激素，參與調控許多生理反應，

尤其在調節免疫細胞上扮演主要的角色。

具生物活性的TNF-α 為含有 157 個胺基

酸，分子量26 kDa 之可溶性蛋白質，以

trimeric 的方式表現於細胞膜上，含有 233

個胺基酸的pro-TNF-α，經由

TNF-α-converting enzyme (TACE)分解而

成。許多人類疾病的發生可歸因於一些基

因的異常表達，這些基因通過存在的基因

開關(gene switch)而過量表現，從而導致疾

病的發生，其中一部分基因開關是在核因

數-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)控制

下進行的，NF-κB 可促進前炎症因子

（TNF-α、IL-1、IL-6）基因的轉錄，而 IL-1，

TNF-α 作爲細胞外刺激信號又可啟動

NF-κB，進一步增強炎症反應。目前已知

多種因素，包括TNF-α、介白素-1β

（IL-1β），脂多糖（LPS）、蛋白激酶（PKC）

等因素皆可誘導NF-κB 的活化(Han et al.,

1999)。

板藍根中文名稱板蘭根，中文拼音

Banlangen，拉丁名稱 Isatidis Radix，英文

名稱Isatis Root，別名北板藍根、藍根、板

藍、大靛、山藍、大靛、山藍，土龍根，

大蘭根或蘭龍根。板藍根是爵床科植物馬

藍的根莖或十字花科(Cruciferae)植物菘藍

（Isatis indigotica Fort.）、歐菘藍（Isatis

tinctoria L.）的根。板藍根爲常用中藥，性

寒，味苦。板 藍 根 除 煎 劑 外 還 有 沖

劑 、 口 服 液 、 注 射 液 、 含 片 等 ， 其

中 口 服 液 和 沖 劑 最 爲 常 見 。 具清熱解

毒、涼血利咽之功能，用於溫毒發斑、舌

絳紫暗、痄腮、喉痹、爛喉丹痧、大頭瘟

疫、丹毒、癰腫。在最近的研究報告中指

出，板藍根中的syringic acid 有抑制內毒素

(endotoxin)的作用，降低老鼠及兔子因注射

LPS 所導致的死亡率(Liu et al., 2001; Liu et

al., 2003)。在巨噬細胞(macrophage)，板藍

根抗內毒素的方式為與LPS 的接受器結

合，抑制LPS 所誘發的 TNF-α及 IL-6 (Lin

et al., 2002)。在人體試驗中板藍根對慢性

肝病也有相當的療效(Fu, 1991)。

板藍根能抑制TNF-α 的産生，增加 Th2

細胞激素IL-4 和 IL-5 的釋放，並伴隨抑制

Th1 細胞的活性，抑制白血球及單核球的

趨化現象(chemotaxis)，具有抗發炎的作

用。此外它可抑制多形核白血球的吞噬作

用而不會造成細胞毒性，因此如能減少

TNF-α 應可改善由細胞活素引起的發炎症

狀。本試驗將以RT-PCR 觀察 TNF-α 的表

現，評估albendazole 及板藍根混合治療廣

東住血線蟲感染小白鼠引起腦膜炎之效

果。因此惟有不斷的試驗以幫助於我們瞭

解此藥在各種疾病的作用機轉並做出正確

的使用抉擇。此外，建議劑量、將監測標

準化、劑量-期間的相關性都需進一步的試

驗分析確認。因此本研究期望藉由板藍根

抑制TNF-α 以減輕廣東住血線蟲所誘發之

嗜伊紅性腦膜炎及神經發炎反應。

材料與方法

一. 廣東住血線蟲第三期幼蟲(L3)之收集:

由田野撿拾非洲大蝸牛，將非洲大蝸

牛外殼碾碎，取其組織，剁碎。用組織均

質器絞碎，以1：30 (組織：消化液)比例加

入人工胃蛋白酵素消化液(pepsin, Sigma,

USA)，以磁性攪拌子於 37℃之恆溫箱中，

均勻攪拌消化2 小時。以雙層紗布濾去雜

質，加入生理食鹽水稀釋並靜置，每隔30

分鐘倒去約一半的上清液，再加入生理食

鹽水稀釋靜置，重複上述步驟至完全清澈

為止。以滴管吸取下層之沈澱物，置於玻

璃皿中，在解剖顯微鏡下，觀察並吸取L3幼

蟲。每50 隻L3幼蟲為一單位，置於玻璃培

養皿中。

二、實驗動物

BALB/c 品系小白鼠(mice)，購自國

科會動物中心，為五週齡雄性小白鼠。感

染前至少飼養於12 小時亮及 12 小時暗的

動物飼養中心一週。

三、動物感染

小白鼠在感染前12 小時均給予禁

水、禁食，每隻小白鼠以口胃管分別灌入

60 隻第三期幼蟲(L3)，於感染後 12 小時再

恢復其供水、供食。

四、藥物

板藍根 (Radix Isatidis)，板藍根商品

呈圓柱形，稍扭曲，長10~20 釐米。直徑

0.5~1 釐米。表面淺灰黃色或淡棕黃色，粗

糙，有縱皺紋及橫斑痕和支根，根頭部稍

膨大，有葉柄殘留。體實，質略軟，斷面

皮部黃白色至棕色，木質部黃色。質量以

平直、粗壯、堅實、粉性大者爲佳。規格

分兩個等級。本試驗將以口 服 液 經 口 餵

食 小 白 鼠 。

五、治療

將感染的動物隨機分五組，未治療之

對照組包括感染及未感染廣東住血線蟲兩

組，實驗組分為三組，分別在感染後第5

天，以口胃管投與albendazole、板藍根及

混合albendazole 與板藍根治療，

albendazole 劑量為每公斤體重 10 毫克，板

藍根劑量為每公斤體重50 毫克，連續投藥

7 天，在第 22 天將動物犧牲。而對照組則

灌食生理食鹽水，在犧牲實驗組動物時也

同時犧牲對照組動物做比較。

六、病理檢查

動物犧牲時將腦蓋剝開，評估其腦膜

出血情形，取出之腦置於培養皿中，將腦

膜剝離，以生理食鹽水沖洗，收集此液作

為腦脊髓液，分析其中嗜伊紅性白血球數

目，接著以解剖顯微鏡將蟲體挑出，計算

其數目。

七、RT-PCR (反轉錄聚合酶鏈反應)

1. Total RNA 之抽取

小白鼠小腦total RNA之抽取，將小白

鼠小腦置入研磨器，加入TRIZOL reagent

(1 ml reagent / 50-100 mg tissue or 4 ml

reagent / 15 cm culture dish)研磨均勻。以

2.5 ml針筒/3 號針頭來回抽吸至液體之粘

度呈水狀，分裝 1 ml 至微量離心管，靜

置在室溫5 分鐘，每 1 ml TRIZOL reagent

加入 0.2 ml choloform，以手劇烈搖晃約 15

秒，靜置在室溫2-3 分鐘，在 4℃ 以 12,000

xg 離心 20 分鐘，transfer up-layer至新的

微量離心管，每1 ml TRIZOL reagent加

入 0.5 ml isopropanol (沉澱RNA)，靜置在

室溫10 分鐘，在 4℃ 以 12,000 xg 離心 10

分鐘，用 70%冰乙醇清洗沉澱物，在 4

℃ 以 7500 xg 離心 5 分鐘，風乾(air dry)，

加入50 μl DEPC-H2O溶解沉澱RNA，以光

譜分析儀(Spectrophotometer, Model

U-2000, Hitach, Japan)於D260/280測濃度，將

RNA儲存於-70℃備用。

2. First strand cDNA 合成

依序將1 μl oligo dT (500

ng/μl) 或 random primers (250~500 ng/μl) 1

ng ~ 5 ng total RNA、1 μl 10 mM dNTP

mix 加入微量離心管中，再加入二次離子

滅菌水至12 μl，加熱混合物至 65℃，時間

約5 分鐘，之後立刻置於冰上冷卻，簡短

離心後，依序將4 ul 5X first strand buffer

(主要提供 SuperScript Reverse

Transcriptase)、2 μl 0.1 M DTT、1

μl RNasin (40 U/μl)加入微量離心管中，溫

和的混合管內液體並在42 ℃下靜置約 2

分鐘，加入1 μl SuperScript II，利用微量

吸管上下抽吸數次，靜置在30℃ (for oligo

dT) 或 25℃ (for random primers) 約 10 分

鐘，靜置在42℃約 60 分鐘，加熱到 70℃ 約

15 分鐘以終止反應 (denaturation)，將得到

的cDNA 儲存在-20℃。

3. PCR 反應

依序將10 μl 10X PCR buffer (200 mM

Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl)、3 μl 50 mM

MgCl2、2 μl 10 mM dNTP mix、2 μl

amplification primer 1 (10 μM)、2 μl

amplification primer 2 (10 μM)、1 μl Taq

DNA polymerase (2-5 U/μl)、2 μl cDNA (從

first strand reaction中取得並經過RNase H

處理過)、80 μl滅菌的二次水加入PCR反應

微量離心管中，最終體積為100 μl。溫和

的混合管內液體並加入兩滴礦物油(約 100

μl)至微量離心管中，其策略是 94 ℃(1 分

40 秒)；94℃(40 秒)，50℃(1 分)，72℃(2

分)，30 cycles；72℃(10 分)。

結果

治療對於蟲回收數的影響

感染第5 天開始治療顯示 Albendazole

單獨治療和用Albendazole 與板藍根混合

治療的小白鼠腦組織明顯減少(P<0.05)蟲

回收數。而在沒有治療及用板藍根單獨治

療下所回收的蟲數則沒有明顯(P>0.05)的

差異 (Figure 1)。

治療對於 eosinophil 數量的影響

CSF 分析結果顯示廣東住血線蟲感染

的CSF 中之 eosinophil 明顯增加，經

albendazole、板藍根及 albendazole 與板藍

根混合治療後則明顯(P<0.05)減少(Figure

2)。

治療對於 TNF-α mRNA 表現量的影響

腦組織分析結果顯示廣東住血線蟲感

染的TNF-α mRNA 表現量明顯增加，經

albendazole、板藍根及 albendazole 與板藍

根混合治療後TNF-α mRNA 表現量並無

明顯(P>0.05)影響 (Figure 3)。

討論

腫瘤壞死因子群 (TNF superfamily)

是具有多方面功能的細胞激素群，藉由和

標的細胞 (target cell) 上的相對受體結合

而傳遞訊息，影響細胞的生物反應，其中

主要的是關於免疫系統及發炎反應的調節

(Beutler and van Huffel, 1994; Nagata,

1997)。TNF-α 為一個具多功能的細胞激

素，參與調控許多生理反應，尤其在調節

免疫細胞上扮演主要的角色。然而，本研

究結果顯示albendazole 和板藍根混合治療

對TNF-α mRNA 表現量並無明顯影響，

此結果顯示albendazole 和板藍根混合治療

無法有效抑制此細胞激素的產生。

板藍根爲常用中藥，性寒，味苦。板

藍 根 除 煎 劑 外 還 有 沖 劑 、 口 服 液 、

注 射 液 、 含 片 等 ， 其 中 口 服 液 和 沖

劑 最 爲 常 見 。 具清熱解毒、涼血利咽之

功能，用於溫毒發斑、舌絳紫暗、痄腮、

喉痹、爛喉丹痧、大頭瘟疫、丹毒、癰腫。

在最近的研究報告中指出，板藍根中的

syringic acid 有抑制內毒素(endotoxin)的作

用，降低老鼠及兔子因注射LPS 所導致的

死亡率(Liu et al., 2001; Liu et al., 2003)。本

研究結果顯示albendazole 和板藍根混合治

療的組別明顯地減少eosinophil 數量，此結

果顯示板藍根治療可能具有抗發炎效果。

過去的研究顯示使用非類固醇類的抗

發炎藥物也可能減輕腦膜炎的病徵。本研

究使用albendazole 和板藍根混合治療罹患

嗜伊紅性腦膜炎的BLAB/c 小白鼠，結果

顯示albendazole 和板藍根混合治療的組別

明顯地減少蟲回收數及eosinophil 數量，但

是TNF-α mRNA 表現量並無明顯影響。

這些結果顯示albendazole 和板藍根混合治

療的新療法可能提供治療寄生蟲性腦膜炎

的新方法。

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C on trol

Inf ect ed

A BZ

BA N

ABZ +BA

N

Wo rm reco v ery

0 10 20 30 40

FIG. 1. Influence of treatment on larvae recovery. Following treatment on day 5 PI, the numbers of recovered larvae were significantly decreased (*P<0.05) by albendazole (ABZ) alone or by albendazole-banlangen (ABZ+BAN) co-therapy, compared with infected-untreated mice. No significant difference (P>0.05) in worm recovery was observed between

infected-untreated mice and banlangen (BAN) treated mice. Following treatment on day 15 PI, the numbers of recovered larvae were mildly decreased by albendazole alone or by

albendazole-banlangen co-therapy compared with infected-untreated mice. No significant difference (P>0.05) in worm recovery was observed between infected-untreated mice and banlangen treated mice.

Control In fe cted AB Z

B A N AB

Z +BAN Eosinophil counts ( x10

)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

FIG. 2. Influence of treatment on eosinophil counts. The CSF eosinophils were significantly increased in CSF of mice infected with Angiostrongylus cantonensis compared with uninfected control. Eosinophils were significantly reduced (*P<0.05) by albendazole alone or

albendazole-banlangen co-therapy, whereas mild reduction by banlangen alone.

Contr ol

Infe

cted AB

Z

B AN AB

Z+ B AN

Re lative inte nsity

0 20 40 60 80 100

FIG. 3. Influence of treatment on the mRNA levels of TNF-α. Angiostrongylus

cantonensis-infected mice leads to a significant increase in TNF-α compared with uninfected control. Treatment by albendazole-banlangen (ABZ-BAN) co-therapy was not significantly lowered (*P<0.05) mRNA levels compared with Angiostrongylus cantonensis-infected mice.

GAPDH was used as a loading control. Densitometric scanning quantification was expressed as the ratio of the signal intensity of TNF-α mRNA to that of GAPDH at each group.