香椿對老鼠精子功能之生理、生化與功能性基因探討(1/3)
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(2) 行政院國家科學委員會補助專題研究計畫. 期中進度報告. 香椿對老鼠精子功能之生理、生化與功能性基因探討(1/3) 計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫 計畫編號：NSC 94－2320－B－006－003－ 執行期間： 94 年 8 月 1 日至 95 年 計畫主持人：張素瓊 共同主持人：郭保麟、張承晉 計畫參與人員：. 7 月. 31 日. 成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告 本成果報告包括以下應繳交之附件： □赴國外出差或研習心得報告一份 □赴大陸地區出差或研習心得報告一份 □出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份 □國際合作研究計畫國外研究報告書一份. 處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管 計畫及下列情形者外，得立即公開查詢 □涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢 執行單位：國立成功大學生命科學系 中. 華. 民. 國. 95. 年. 5. 1. 月. 31. 日.
(3) 二年將利用Real-time PCR進行PDXK mRNA 表現量的試驗。利用二維電泳分析法探討香椿 萃取液TSL-2P(TSL-6之上游萃取液)對氧化壓 力之大鼠睪丸內蛋白質的表現。組別 (control、negative control、positive control、 TSL-6)再以ImageMaster 2D Platinum Software 分析結果發現，有三個表現量明顯差異的蛋白 質點，其pI/MW分別為5.2/105 kD、5.5/78 kD 及5.3/55 kD，進一步利用database搜尋比對的 結 果 ， 推 測 這 些 蛋 白 質 可 能 為 inositol polyphosphate-4-phosphatase、androgen receptor isoform 及 protein phosphatase 2A ， 其 中 androgen receptor isoform與男性荷爾蒙的調控 有關，其餘兩個蛋白質則與磷酸化相關。本實 驗推測，TSL-2P可能藉由影響荷爾蒙的調控 及蛋白質磷酸化來回復精子之氧化傷害，未 來，將進一步利用質譜儀分析，以確認這些蛋 白質點。. 一、摘要： 氧化壓力會降低精子活動力及精子對卵 的穿透能力而使受孕能力下降。本實驗室先前 研究顯示，不同成分及濃度的香椿萃取液對人 類精子有不同的生理功能。因此，本實驗進一 步利用動物模式(SD rat)來探討不同香椿萃取 液(TSL-2、TSL-2P、TSL-6)對精子功能與相關 功 能 性 基 因 之 影 響 。 注 射 H2O2(1 mmol / kgB.W)誘發氧化壓力二週後，持續注射H2O2(1 mmol / kgB.W)並同時餵食香椿八週，再進行 精子功 能 的檢測， 包括利 用 流式細 胞儀以 DCFH-DA測定精子胞內ROS含量、以JC-1偵 測粒線體膜電位、以Acridine orange分析染色 質結構完整性、光學顯微鏡分析精子活動力 等。結果顯示，在氧化壓力下，香椿萃取物 TSL-2P及TSL-6明顯具有保護精子染色質結 構完整性及維持精子活動力，TSL-2則較低； 但皆對胞內ROS含量及粒線體膜電位皆無顯 著影響。本部份結論，TSL-2P及TSL-6改善精 子活動力的原因可能是藉由保護染色質結構 完整，而不是降低胞內ROS含量及改變粒線體 膜電位所引起的。將睪丸組織以HPLC進行不 同型式維生素B6濃度分析，發現，TSL2P組的 老鼠睪丸PLP濃度顯著低於負控制組 (1 mmol H2O2/ kgB.W) ，TSL2組的PLP濃度顯著高於 負控制組。TSL2P組的PL濃度顯著低於負控制 組。TSL2P組的總醛類濃度顯著低於負控制 組，TSL2組則顯著高於負控制組。結果顯示 在氧化壓力下，TSL2P組具有較低維生素B6 的濃度及總醛類濃度，TSL2組的PLP濃度及總 醛類濃度則顯著高於負控制組。偵測肝臟組織 脂質過氧化物指標TBARS (thiobarbituric acid reactive substance)含量、肝臟過氧化氫酵素 (Catalase ， CAT) 與 超 氧 化 物 歧 化 酵 素 (Superoxide dismutase，SOD) 活性發現，氧化 壓力大白鼠餵食香椿萃取物TSL-2組與TSL-6 組、山藥TA03組顯著降低由H2O2所誘發的脂 質過氧化；山藥TA03組則可顯著增加抗氧化 酵素SOD活性；山藥TA01組與香椿TSL-2組、 TSL-2P組可顯著增加大鼠肝臟CAT活性。萃取 睪 丸 組 織 的 total RNA ， 利 用 Reverse-transcription PCR證實睪丸組織中有 PDXK(Pyridoxal Kinase, PLK)基因的表現。第. Abstract Oxidative stress resultes in the male infertility due to a loss of sperm motility and a decreased capacity for sperm to oocyte penetration. Previous study from our laboratory indicated that different components and concentrations of TS extracts caused different physiological functions in human sperm. Therefore, the main purpose of the 1st year of this three-year project was to further investigate the effects of H2O2-induced rats fed with different components (TSL-2, TSL-2P, TSL-6) of TS extracts on the sperm functions and related functional gene expression. Feeding rats under oxidative stress induced by H2O2(1m mole/kgBW) with TS for eight weeks, subsequently the sperm functions evaluated in this study included the intracellular ROS level detected with DCFH-DA, mitochondrial membrane potential (MMP) measured with JC-1, and sperm chromatin structure assay (SCSA) detected with acridine orange by using flow cytometry, sperm motility determined by light microscopy. Our data showed that TSL-2P and TSL-6 were beneficial to the sperm chromatin structure and sperm motility resulting from oxidative stress, TSL-2 was the lesser protection effect. No significant 2.
(4) differences to ROS and MMP using any TS extracts. In conclusion, the improvement of sperm motility by treating TSL-2P and TSL-6 may result from protecting sperm chromatin structure but not result from decreasing ROS or changing MMP. In this study, testicular oxidative stress was induced by i.p injection of H2O2 (1 mmol/ kgB.W) for 8 weeks and B6 vitamers status were analyzed by HPLC. Results showed that PLP and total aldehyde concentration of TSL2P group was significantly lower than negative control group, and that of TSL2 group was significantly higher than negative control group. PL concentration of TSL2P group was significantly lower than negative control group. In conclusion, treated with TSL2 had higher PLP concentration and treated with TSL2P had lower B6 vitamers status. The malondialdehyde(MDA) levels、superoxide dismutase (SOD) and catalase(CAT) activity of liver in rats were measured. TA03, TSL-2 and TSL-6 significantly decreased liver MDA levels. TA03 significantly increased liver SOD activity.TA01, TSL-2 and TSL-2P significantly increased liver catalase activity. Extracted total RNA of testes tissues, and then amplified the gene fragment of PDXK using Reverse -transcription PCR technique. In future we will use Real-time PCR to examine the mRNA expression of PDXK. In this study, we used 2D-gel electrophoresis to analyze the protein expression of testes in rats under oxidative stress. Results of the 2D-gel analysis by ImageMaster 2D Platinum Software indicated 3 spots with pI/MW being 5.2/105 KD, 5.5/78 KD and 5.3/55 KD were differentially expressed. Further searching from database of NCBI revealed that these proteins might be inositol polyphosphate-4-phosphatase、androgen receptor isoform and protein phosphatase 2A. In conclusion, TSL-6 may regulate the expression of protein spots involved in the protection of sperm functions during oxidative stress. Two-D gel electrophoresis will be coupled with MALDI-TOF to identify these protein spots.. 二、報告內容： (一)前言： 目前已婚夫妻中，每六對就有一對不孕 (Hull et al., 1995)，而其中男性因素佔了約 50 % (Collins, 1989)。世界衛生組織 ( World Health Organization; WHO) 在 1940 年頒佈正 常男性精液的濃度標準為 113 × 106/ml (WHO, 1940)，到 1990 年已降至 60 × 106/ml (WHO, 1990)，顯見男性精液品質逐漸惡化中。相關 文獻亦發現，健康男性的精液品質在過去的數 十年來有逐漸惡化的現象。精子品質的好壞會 直接影響到體外受精的成功率，因此，最根本 的方法即為提升男性精子的品質。近年來許多 相關文獻指出，天然中草藥可有效改善男性精 子功能 (Crimmel et al., 2001)，其機轉逐漸被 受重視。 香 椿 (Toona sinensis Roem) 為 楝 科 (Meliaceae)，多年生落葉性喬本植物。目前國 內之香椿研究團隊聚集各領域專家學者 (含 基礎與臨床)，共同研發香椿生理功能與有效 成分，生理功能包括：糖尿病、抗癌、生殖、 止痛、肝功能、腎功能、抗氧化、免疫調節、 血液、抗發炎等，有效成分包括成分分析與安 全評估。目前對於香椿的有效成分分析之前驅 試驗中已發現香椿含有大量酚類化合物，主要 之抗氧化物質為gallate 和quercetin，而抑制酵 素活性之物質為flavonoids 和rutin。目前文獻 上有關香椿有效成份的研究僅有韓國研究報 告，由Cedrelasinensis A. Juss.分離出methyl gallate、quercitrin、bis-(p-hydroxyphenyl)ether、 adenosine、isoquercitrin、rutin、(+)-catechin 及 (-)-epicatechin 等 多 酚 類 化 合 物 (Park et al., 1996)。由香椿研究群所提供。香椿的成分分 析可進一步了解其保健功效的科學依據，同時 有助於各項生理功能之評估。 (二)研究目的： 本研究室 93 年度的國科會計劃在 in vitro 發現，不同成分之香椿萃取液對人類精子有不 同功效，七種香椿萃取物在低濃度 (0.01 與 0.05 mg/ml) 下均可有效降低精子胞內 ROS 含 量，高濃度 (0.5 與 1 mg/ml) 時，除了 5-4R 外，其餘六種萃取物均顯著提升精子胞內 ROS. Keywords: oxidative stress, sperm, Toona sinensis Roem, testes 3.
(5) 含量，其中 5-3 最顯著具有促氧化作用。高濃 度的 5-4R 與 5-5R 可促進 ATP 形成而 5-2 與 5-3 抑制 ATP 生成，高濃度的 5-4R 可維持粒 腺體膜電位 (MMP) 而 5-2 與 5-3 則無法維持 MMP；高濃度 5-4R 亦可維持精子染色質結構 (SCSA) 而 5-3 則無法維持。此外，在 93 年度 之計劃中亦發現，以 H2O2 誘發精子氧化壓力 後，5-4R 使精子胞內 ROS 生成降低、精子活 動力回升、ATP 生成增加、維持 MMP、維持 正常胞內鈣離子濃度、降低細胞死亡與減少染 色質變性百分比。 本研究為三年期計畫之第一年，餵食經氧 化壓力誘發性老鼠不同成份之香椿萃取液，探 討 不 同 成 份 香 椿 萃 取 液 (TSL2 、 TSL2P 與 TSL6) 對H2O2-誘發性氧化壓力老鼠精子功能 之影響。分析之精子功能指標為：(一) 精子 活動力及其影響因子，包括精子活動能力、精 子ROS含量、精子核染色質結構分析、精子粒 線體膜電位，(二) 精子成熟影響因子，包括 睪丸維生素B6 濃度 (包括PLP、PL、PMP、 PM、PNP 與PN) 及與睪丸細胞PLK的酵素活 性與RNA表現量，(三) 測定氧化壓力下，香 椿萃取物對大鼠肝臟氧化傷害指標 (MDA) 與抗氧化酵素活性(Catalase, SOD) 的影響， (四) 利用二維電泳分析，比較不同處理組別 之大鼠睪丸內蛋白質表現量的差異。 本研究成果能深入了解香椿不同成分萃 取液對男性精子之作用機轉，確定可提升男性 精子功能、抑制精子氧化壓力情形與增加PLK. 活性之有效成分，可進一步研發成改善男性精 子受孕力與應用於人工授精。 (三)研究方法： 根據本 實 驗室先 前 研究， 選 擇最具 抗 氧化 (TSL-6/5-4R)及促氧化(TSL-2/5-2)之香椿萃取 液動物試驗，另外再選擇 TSL-6/5-4R 上游萃 取物 TSL-2P 同時進行。 香椿萃取液及山藥劑量 利用萃取流程比例來計算香椿萃取液之劑量： 1 g 香椿粗萃取粉(TSL-1)可萃取出 0.94 g TSL-2P 、 TSL-2/5-2 0.053 g 及 0.013g TSL-6/5-4R。山藥組以 TA01 及 TA03 做動物 試驗，其劑量參考行政院農委會建議生山藥粉 之參考用量為每人每日攝取 10g，換算成大鼠 劑量為 5 g/Kg BW/day。 1. 不同椿葉萃取液及山藥對老鼠精子生理功 能之測定 出生九週雄性大白鼠(Sprague-Dawley rats)(購 自成功大學醫學院動物中心)，隨機分成八組： a.控制組(施打 0.9 % saline/兩天一次 ) b.負控制組(施打 H2O2 1 mmol/kg B.W./兩天一 次)(Zsolt et al., 2000)，以下各組皆施打 H2O2 1 mmol/kg B.W./兩天一次： c.正控制組(vitamin C 0.2 g /kg/day) d.香椿組 1 (TSL-2 0.053 g/kg/day) e.香椿組 2 (TSL-2P 0.94 g/kg/day) f.香椿組 3 (TSL-6 0.013 g/kg/day) g.山藥組 1 (TA01 5 g/kg/day) h.山藥組 2 (TA03 5 g/kg/day. (1)精子活動力(sperm motility)評估 取 10 µl 檢體於血球計數器上，隨機選擇 三區域計算區域中有活動力的精子數及總精 子數(有活動力+無活動力的精子) Motile sperms / total sperms × 100% = sperm motility (Atessahin A et al., 2006). (3)精子胞內 ROS(reactive oxygen species)含量 測定 取控制組及不同處理組之檢體 400 µl，避 光加入 DCFH2-DA(終濃度為 20µM)培養 15 分 鐘，以流式細胞儀偵測胞內 ROS 含量。(van Reyk et al.2001). (2)染色質結構分析(sperm chromatin structure assay; SCSA) 取控制組及不同處理組之檢體 300 µl，以 0.4 ml acid-detergent solution 混合均勻，30 秒 後，避光加入 1.2 ml AO stain solution 標定精 子染色質，3 分鐘後，以流式細胞儀分析。 (Evenson et al.1985). (4)精子粒線體膜電位(mitochondria membrane potential; MMP)測定 取控制組及不同處理組之檢體 400 µl 避 光加入 JC-1 (終濃度為 1 µM)標定精子粒線 體，置於 36 ℃培養 15 分鐘後，以流式細胞儀 分析(Carole et al., 2004)。 4.
(6) Sprague-Dawley (SD rats). Control 0.9% NaCl. H2O2 1mmol/kg/2 days. H2O2 1mmol/kg/2 days 2 weeks. Vit.C 0.2g/kg/day. TA01 TA03 5g/kg/day. 10 weeks TSL-2 0.052g/kg/day. Sperm. TSL-2P TSL-6 0.94g/kg/day 0.013g/kg/day 8 weeks. Testis. Liver. Motility ROS MMP SCSA PL, PLP PDXK protein SOD MDA catalase mRNA 加入 0.1 ml BHT 和 1 ml TBA 於 95℃下加熱 2. 睪丸維生素B6含量測定： 60 min 後置於室溫冷卻，再加入 2 ml 15:1 的 睪丸處理： butanol : pyridine 並劇烈震盪均勻，於 1431 xg 將睪丸以液態氮結凍，用研缽將睪丸碎， 離心 10 min，使分層，取上層液以分光光度計 分裝置1.5 ml離心管中，每管睪丸重約1 g，之 (DU800, Beckman Coulter, California, USA)在 後進行以下分析。 532 nm 下測其吸光值。 HPLC分析條件： (2) 超 氧 化 物 歧 化 酵 素 (Superoxide 系統包含幫浦 (Jasco, PU-1580, UK)，螢 dismutase，SOD) 活性之測定 光檢測器 (Jasco, FP-1520, UK)，自動上管器 參考 Marklund 等人（1974）方法，取 300 (Jasco, AS-155, UK)。液態相由 0.06 M disodium hydrogen phosphate, 9.5% methanol µl 肝臟均質液，加入 2.4 ml 50 mM Tris-HCl 配製而成，pH 値調至 6.5。層析管柱使用 5-µm buffer，另取 300 µl 50 mM phosphate buffer 當 反相管柱 (Merck RP-C18 column, 4.6 x 250 作空白組，加入 2.4 ml pyrogallol 以 UV mm)。流速為 1 ml/min。 spectrophotometer(DU800, Beckman Coulter, California, USA) 於 420 nm (Vi)測一分鐘內 3. 組織抗氧化及氧化指標測定 10 秒吸光值變化。 (1)脂質過氧化指標測定 取 1 ml 組織均質液或去離子水，加入 1 ml (3)過氧化氫酵素 (Catalase) 活性測定 CAT 活性分析參考自 Aebi (1983) 之方 TCA 於 1431 xg 離心 10 min，取上清液 1 ml 5.
(7) Vhr (5)SDS-PAGE 凝膠電泳： Power supply setting(4 ℃)：100 V 15 分 鐘，300 V 3 小時。 (6)銀染： 首先以 95 % Ethanol 及 Acetic acid 固定 30 分鐘，接著以市售銀染試劑祖進行蛋 白質染色。染色完成後保存於 4 ℃冰箱。 (7)膠片掃描分析： 利用灰階掃瞄器將完成二維電泳之交片 進行掃描，再以軟體分析不同組別之間 蛋白質點的差異，針對有差異的蛋白質 點進行質譜分析、序列比對。. 法。組織樣品製備如上述，取適量以供測量。 取 100 µl 組織均質液，加入 2.8 ml 50 mM phosphate buffer，並取 100 µl 50 mM phosphate buffer 當作空白組，之後加入 100 µl 10 mM H2O2 以 UV spectrophotometer (DU800, Beckman Coulter, California, USA)於 240 nm (UV)測一分鐘內 10 秒吸光值變化。 4. 老鼠睪丸PDXK(pyridoxal kinase ) mRNA 之增幅 步 驟 ： Total RNA 的 萃 取 → Reverse Transcription→PDXK PCR增幅反應→PCR產 物回收→序列定序 5. 二維電泳分析： (1)蛋白質初萃取： 取出保存於-80 ℃冰箱之大鼠睪丸，秤重 後放於研缽中，加入液態氮研磨。並加 入等體積之 lysis buffer(8 M Urea, 4 % CHAPS, 40 mM Tris base, 1% DTT and 0.5% immobilized pH gradient buffer)，於 4 ℃冰箱 incubate 1 小時，離心 7500 x g 4 ℃ 30 min 後，上清液即為初萃取的蛋 白質。 (2)蛋白質定量： 蛋 白 質 測 定 使 用 市 售 之 組 合 試 劑 (2-D Quant Kit, Amersham, U.S.)，利用蛋白質 濃度與吸光值成反比的關係畫出標準曲 線，因此可利用內差法求出初萃取的蛋 白質濃度。 (3)clean-up kit 沉澱蛋白質： 為了使蛋白質純度更高，並且將蛋白質 濃度調至 1 µg/µl 以方便進行二維電泳分 析，因此利用 clean-up kit 沉澱法進行蛋 白質沉澱。 (4)蛋白質等電點聚焦： 取 150 µl 濃度為 1 µg/µl 的蛋白質，於 IPG strip 上進行等電點聚焦，IPGphor power supply setting (20 ℃)： Step1： 250 V 1 hr Step2： 500 V 2 hr Step3： 1000 V 1 hr Step4： 4000 V 2 hr Step4： 8000 V 10 hr 80000. 四、結果與討論： (一)、精子活動力評估: TSL-2、TSL-2P、TSL-6 及 TA01、TA03 皆可回復受到氧化壓力的精子活動力，由圖一 顯示，TSL-2、TSL-2P、TSL-6、TA01 及 TA03 各組的活動力分別為 63.68 %、62.01 %、63.9 %、60.87 %及 63.55 %，與控制組的 63.85 % 及正控制組 62.71 %無顯著差異，與負控制組 的 55.83 %活動力明顯提高了約 5-8 %，顯示 香椿及山藥各組皆可保護精子受到氧化傷害 而維持精子正常活動力。 (二)、染色質結構分析: TSL-2P、TSL-6、TA01 及 TA03 顯著降低 精子染色質變性程度 TSL-2P、TSL-6、TA01 及 TA03 各組的%COMPαT (染色質變性程度) 為 4.49 %、6.62 %、4.24 %及 4.97 %，與控制 組的 3.57 %及正控制組 5.4 %無顯著差異，與 負控制組的 52.41 %有顯著差異。(圖二)由結 果顯示 TSL-2P、TSL-6、TA01 及 TA03 可減 少精子受到氧化壓力所導致的染色質變性，且 變性程度與控制組接近。TSL-2 也可降低染色 質變性程度(18.73 %)，但保護效果較其他組 低。 (三)、精子胞內ROS含量測定及粒腺體膜電位: TSL-2、TSL-2P、TSL-6及TA01、TA03無 法影響老鼠精子ROS及MMP值圖三及圖四顯 示，給予香椿及山藥各組，其ROS及MMP值 6.
(8) (五)、脂質過氧化指標測定: 腹腔注射 H2O2 (負控制組)大白鼠肝臟 MDA 濃度顯著比控制組高(圖六)，腹腔注射 H2O2 並餵食 vitamin C(正控制組)及餵食香椿 萃 取 物 TSL-2( H2O2+TSL-2 組 ) 或 TSL-6( H2O2+TSL-6 組 ) 及 山 藥 TA03( H2O2+TA03 組)，肝臟 MDA 濃度顯著 比 H2O2 組來的低。餵食香椿萃取物 TSL-2P ( H2O2+TSL-2P 組) 及山藥 TA01( H2O2+TA01 組)則無法顯著降低肝臟 MDA 濃度(圖六)。以 上結果發現，氧化壓力大白鼠餵食香椿萃取物 TSL-2 組與 TSL-6 組、山藥 TA03 組顯著降低 由 H2O2 所誘發的脂質過氧化，其中以 TSL-2 組與 control 其 MDA 下降程度最高，表示在 氧化傷害下，TSL-2 組有較佳的抗脂質過氧化 能力。本實驗室先前研究結果發現，香椿萃取 物 TSL-2、TSL-2P 對精子有促氧化功效，TSL-6 具有抗氧化效果。圖五結果證實 TSL-6 的確可 以降低脂質過氧化具有抗氧化功效，並發現 TSL-2 對肝臟具有抗氧化的潛力。. 與正、負控制組皆無顯著差異(p＞0.05)。本研 究 結 果 顯 示 ， 三 種 香 椿 萃 取 液 (TSL-2 、 TSL-2P、TSL-6)及二種山藥(TA01、TA03)皆 可保護精子受到氧化傷害而維持精子正常活 動力(圖一)，而除TSL-2之外，其餘各組可使 精子染色質變性程度降低甚至回復至與未受 H2O2誘發之控制組無顯著差異(圖二)。前人研 究指出，不孕症患者精子DNA 斷裂的比例較 健康男性高（Sun et al., 1997; Lopes et al., 1998），而精子DNA 斷裂會影響男性受孕能 力（Shen & Ong, 2000）且精子DNA 斷裂與 精子活動力呈顯著負相關（Muratori et al., 2000），與我們的研究結果類似。但本研究結 果顯示，香椿及山藥各組對精子胞內ROS含量 (圖三)及MMP值(圖四)卻無明顯改變。由以上 結果推測，香椿(TSL-2、TSL-2P、TSL-6)及山 藥(TA01、TA03)可藉由降低精子細胞染色質 變性程度來維持精子活動力，而可能不是經由 降低胞內ROS量及維持粒線體膜電位來減少 精子活動力下降程度，其相關性仍需進一步探 討。. (六)、超氧化物歧化酵素測定: 腹腔 注射 H2O2(負控制 組 ) 大白鼠 肝 臟 SOD 活性與控制組並沒有顯著差異(圖七)，腹 腔注射 H2O2 並餵食山藥 TA03 組可以顯著增 加肝臟 SOD 活性，香椿三種萃取物均無法顯 著增加誘發氧化壓力大白鼠抗氧化酵素 SOD 活性。可見香椿三種萃取物及山藥 TA01 還無 法具有增加 SOD 活性的功效。. (四)、睪丸維生素B6含量測定: 各組老鼠睪丸維生素B6濃度(圖五)，TSL2 組的老鼠睪丸PLP濃度顯著高於負控制組 (1 mmol H2O2/ kgB.W) ，而TSL2P組顯著低於負 控制組。TSL2P組的PL濃度顯著低於負控制 組。TSL2P組的總醛類濃度顯著高於負控制 組，而TSL2P組顯著低於負控制組。結果顯示 在氧化壓力下，與負控制組比較， TSL2P組 具有較低的維生素B6及總醛類濃度；TSL2組 具有較高的PLP濃度及總醛類濃度，並達到統 計上顯著差異 (p< 0.05)。PLP為體內維生素B6 活化態，研究指出活化態維生素B6濃度多寡 與許多生理狀態有關，包含中樞神經失調、動 脈硬化。本實驗結果發現，TSL2組與負控制 組比較，可顯著增加PLP濃度，而PL濃度則無 顯著差異，推測TSL2組中的某種化合物可增 加PLP濃度；TSL2P組與負控制組比較，PLP 濃度、PL濃度及總醛類濃度均顯著低於負控 制組濃度，推測TSL2P組中的某種化合物可能 透過未知的機制降低維生素B6的濃度。. (七)、過氧化氫酵素測定: 腹腔 注射 H2O2(負控制 組 ) 大白鼠 肝 臟 CAT 活性顯著比控制組高，腹腔注射 H2O2 並 餵食維生素 C( H2O2+Vit C 組，正控制組)無法 顯著增加肝臟 CAT 活性(圖八)。腹腔注射 H2O2 並餵食香椿萃取物 TSL-2 組或 TSL-2 組，及 餵食山藥 TA01 組 CAT 活性顯著增高。腹腔注 射 H2O2 並餵食香椿萃取物 TSL-6 組及餵食山 藥 TA03 組無法顯著增加肝臟 CAT 活性。以上 結果發現，香椿萃取物 TSL-2 組、TSL-6 組與 山藥 TA01 組顯著增加抗氧化酵素 CAT 活性， 以 TA03 組具有較佳提昇 CAT 活性的能力。然 而負控制組也會顯著增加 CAT 活性，推測為 7.
(9) 負回饋控制，過度施打 H2O2 會使得 CAT 活性 增加。. 六、計畫成果自評： 本研究結果已於第四屆第二次會員大會 暨調節免疫力研討會中發表「以體外及體內模 式探討香椿萃取液保謢受到氧化壓力的精子 功能之影響」 Abstract book: PA-104, P.93, 台 中,靜宜大學, 2006.2.27. (八)、老鼠睪丸PDXK(pyridoxal kinase ) mRNA 之增幅結果 從大鼠睪丸組織萃取出的 Total RNA，利 用 PCR 將 Pyridoxal kinase 和 GAPDH mRNA 片 段 增 幅 出 來 ， GAPDH 為 housekeeping gene，是細胞均會表現之基因，在每個細胞中 表現量是一定的，可做為實驗之對照組。圖九 為 PCR 增幅之電泳圖，可看出每個處理組均 有增幅出 Pyridoxal kinase 和 GAPDH 等 mRNA 片段。所增幅出的 Pyridoxal kinase 的序列為 238 bp，將其產物純化回收後送至成大定序中 心，定序結果經 NCBI Blast 比對結果顯示出 與 Rattus norvegicus similar to pyridoxal (pyridoxine, vitamin B6) kinase (LOC361819) 相 似 度 逹 98 ％ ， 確 定 所 增 幅 出 之 產 物 為 Pyridoxal kinase 片段。目前我們已經成功利用 PCR 的方式將 pyridoxal kinase 的基因增幅出 來，接下來則是要利用 Real time PCR 的方式 進一步了解，香椿萃取物是否會造成 pyridoxal kinase 基因表現量有所差異，進而影響下游蛋 白質的產生。. 七、參考文獻： Aebi Hugo. Catalase in vivo. Methods Enzymol. 1983; 105:121-126. Ahmet A, İzzet K, Gaffari T, Seyfettin G, Seval Y, Ali O. Protective role of lycopene on cisplatin-induced changes in sperm characteristics, testicular damage and oxidative stress in rats. Reprod Toxicol. 2006; Jan;21(1):42-7. Cao P, Gong Y, Tang L, Leung YC, Jiang T. Crystal structure of human pyridoxal kinase. Struct Biol. 2006; 154(3):327-32. Carole M, Nathalie J, Brigitte LM, Andre D, Pierre F, Philippe M. Comparison of four fluorochromes for the detection of the inner mitochondrial membrane potential in human spermatozoa and their correlation with sperm motility. Hum Reprod. 2004; 19:2267-76. Dugan JM, Allen CM. Changes in protein prenylation and prenyltransferase activity in the rat seminiferous epithelium during early stages of spermatogenesis. Biol Reprod. 1995; 53: 958-73. Essader AS, Cargile BJ, Bundy JL, Stephenson JL Jr. A comparison of immobilized pH gradient isoelectric focusing and strong-cation-exchange chromatography as a first dimension in shotgun proteomics. Proteomics. 2005; 5: 24-34. Evenson DP, Higgins PJ, Grueneberg D, Ballachey BE. Flow cytometric analysis of mouse spermatogenic function following exposure to ethylnitrosourea. Cytometry 1985; 6:238-523. Fang X, Zhou ZM, Lu L, Yin LL, Li JM, Zhen Y, Wang H, Sha JH. Expression of a novel pyridoxal kinase mRNA splice variant, PKH-T, in human testis. Asian J Androl. 2004; 6(2):83-91. Fijak M, Iosub R, Schneider E, Linder M,. (九)、二維電泳分析結果 利用 ImageMaster 2D Platinum Software 分析 control、negative control、positive control 及 TSL-2P 的大鼠睪丸蛋白質結果發現(圖 十)，有三個表現量明顯差異的蛋白質點，其 pI/MW 分別為 5.2/105 kD、5.5/78 kD 及 5.3/55 kD，利用 database 搜尋比對的結果，推測這 些 蛋 白 質 可 能 為 inositol polyphosphate-4phosphatase 、 androgen receptor isoform 及 protein phosphatase 2A。關研究發現，androgen receptor isoform 與男性荷爾蒙的調控有關， inositol polyphosphate -4-phosphatase、androgen receptor isoform 及 protein phosphatase 2A，則 與磷酸化相關。本研究結論，TSL-2P 可能藉 由影響荷爾蒙的調控及蛋白質磷酸化來回復 精子之氧化傷害，未來，將進一步利用質譜儀 分析，以確認這些蛋白質點。. 8.
(10) Respondek K, Klug J, Meinhardt A. Identification of immunodominant autoantigens in rat autoimmune orchitis. J Pathol. 2005; 207:127-38. Hanna MC, Turner AJ, Kirkness EF. Human pyridoxal kinase. cDNA cloning, expression, and modulation by ligands of the benzodiazepine receptor. J Biol Chem. 1997; 272(16):10756-60. Huang SY, Tam MF, Hsu YT, Lin JH, Chen HH, Chuang CK, Chen MY, King YT, Lee WC. Developmental changes of heat-shock proteins in porcine testis by a proteomic analysis. Theriogenology. 2005; 64:1940-55. Kang JH, Hong ML, Kim DW, Park J, Kang TC, Won MH, Baek NI, Moon BJ, Choi SY, Kwon OS. Genomic organization, tissue distribution and deletion mutation of human pyridoxine 5'-phosphate oxidase. Eur J Biochem. 2004; 271(12):2452-61. Marklund S, Marklund G., Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 1974; 47(3):469-474. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by t hiobarbituric acid reaction. Anal Biochem. 1979; 95(2):351-358. Sussmane S, and Koontz J. A fluorometric assay for pyridoxal kinaseapplicable to crude cell extract. Anal. Biochem. 1995;225:109–112. Talwar D, Quasimb T, McMillanb DC, Kinsella J, Williamson C, O’Reilly D.St.J. Optimisation and validation of a sensitive high-performance liquid chromatography assay for routine measurement of pyridoxal 5-phosphate in human plasma and red cells using pre-column semicarbazide derivatisation. J Chromato B. 2003; 792:333-343. Van Reyk DM, King NJC, Dinaure MC, Hunt NH. The intracellular oxidation of 2’7’-dichlorofluorescin in murine T lymphocytes. Free Radic Biol Med. 2001; 30:82-88. Yamamoto T, Fukushima T, Kikkawa R, Yamada H, Horii I. Protein expression analysis of. rat testes induced testicular toxicity with several reproductive toxicants. J Toxicol Sci. 2005; 30:111-26.. 9.
(11) 八、附圖： 80. 大鼠睪丸維生素B6濃度 ＊. ＊. ＊. ＊. ＊. ＊. ＊. 60. 700.00. 50. 600.00 vitamin B6 (nM). motility (%). 70. 40 30 20 10 0. 1. H2O2 (1 mmol/kg) Treatment n值. 2. 7. 3. + 8. 4. + Vit.C 6. 5. 6. + + TSL-2 TSL-2P 7 7. 7. + TSL-6 7. 8. + TA01 6. 500.00. control (n=7). 400.00. neagtive control (n=5). 300.00. positive control (n=5). 200.00. TSL2 (n=7). 100.00. TSL2P (n=4). 0.00. + TA03 7. TSL6 (n=6) PLP. 圖一、不同椿葉萃取液(TSL-2、TSL-2P、TSL-6)及山藥 (TA01、TA03)對施打 H2O2 的老鼠精子活動力之影響。 所有數據均以Mean ± SD 表示，並以Student’s t-test 統計分 析。*表示組間有顯著差異（p < 0.05）。. PL. total aldehyde. 圖五、餵食不同香椿萃取物後，各組老鼠睪丸維生素 B6 濃度。數據以 Mean ± SD 表示。以 Duncan＇s test 統計分析，*表示與負控制組比較有顯著差異 。. 70. 25. 50. 20. ＊. 30 20. 1-. 2+. 6. 5. 3+ Vit.C 5. 4 + TSL-2 7. +5 TSL-2P 5. 6+ TSL-6 6. 7+ TA01 5. 8 + TA03 4. 5 0. 圖二、不同椿葉萃取液(TSL-2、TSL-2P、TSL-6)及山藥(TA01 、TA03)對施打 H2O2 的老鼠精子染色質變性程度 (denatured cells %)之影響。所有數據均以 Mean ± SD 表示，並 以 Student’s t-test 統計分析。*表示組間有顯著差異（p < 0.05）。. n=7. n=7. n=7. TA03+H2O2. H2O2 (1 mmol/kg) Treatment n值. 10. TA01+H2O2. ＊. TSL-6+H2O2. ＊. TSL-2+H2O2. ＊. TSL-2P+H2O2. ＊. H2O2. ＊. ＊. 0. ＊. Vit C +H2O2. 10. ＊ ＊. 15. control. 40. MDA 濃度 (uM). denatured cells (%). 60. n=7. n=7. n=7. n=9. n=7. 圖六、餵食不同香椿萃取物後，各組老鼠肝臟 MDA濃度，數據以Mean ± SD表示。以t-test統 計分析，*表示有顯著差異 (p<0.05)。 70. 1.60. ＊. 60 SOD 比活性 (U/mg). 1.40 1.20 1.00 +8 TA03 7. 0. 0.9 0.8. n=7. n=6. n=7. n=7. n=6. n=7. n=5. 圖七、餵食不同香椿萃取物後，各組老鼠肝臟 抗氧化酵素SOD活性，數據以Mean ± SD表示。 以t-test統計分析，*表示有顯著差異 (p<0.05)。. ＊. 0.6 0.5. 60. 6 + TSL-6 7. 7 + TA01 6. +8 TA03 7. 圖四、不同椿葉萃取液(TSL-2、TSL-2P、TSL-6)及山藥(TA01、 TA03)對施打 H2O2 的老鼠精子 MMP(mitochondria membrane potential)之影響。所有數據均以 Mean ± SD 表示，並以 Student’s t-test 統計分析。*表示組間有顯著差異（p < 0.05）。. 10. 30 20 10 0. n=8. n=7. n=6. n=7. n=7. n=6. T A03+H2O2. 5+ TSL-2P 7. T A01+H2O2. 4+ TSL-2 7. T SL -. +3 Vit.C 6. 6+H2O2. +2 6. 2P+H2O2. -1 7. 40. T SL -. H2O2 (1 mmol/kg) Treatment n值. ＊. T SL -. 0. ＊. 2+H2O2. 0.1. ＊. 50. c+H2O2. 0.2. vitamin. 0.3. H2O2. 0.4. c a ta la se 比活性 (U/mg). MMP (FL-2/FL-1). n=8. TA03+H2O2. 10. 圖三、不同椿葉萃取液(TSL-2、TSL-2P、TSL-6)及山藥(TA01、 TA03)對施打 H2O2 的老鼠精子染 ROS 之影響。所有數據均以 Mean ± SD 表示，並以 Student’s t-test 統計分析。 0.7. 20. TA01+H2O2. +7 TA01 6. TSL-6+H2O2. TSL-2P 7. + 6 TSL-6 7. TSL-. TSL-2 7. 5+. 2P+H2O2. 7. 4+. TSL-2+H2O2. 7. + 3 Vit.C 6. Vit C +H2O2. 2+. 30. H2O2. 1-. 40. control. H2O2 (1 mmol/kg) Treatment n值. 50. control. ROS level (DCF MFI). 1.80. n=7. n=5. 圖八、餵食不同香椿萃取物後，各組老鼠 肝臟CAT活性，數據以Mean ± SD表示。以 t-test統計分析，*表示有顯著差異 (p<0.05).
(12) 1. 2 3. 4. 5. 6 7. 8 （A）. （B） 圖九、 （A） （B）Pyridoxal kinase 及 GAPDH 的 PCR 電泳圖 圖（A）為 Pyridoxal kinase PCR 電泳圖，編號 1~8 分別是 control、Negative control、Vitamin C、TSL-2、TSL-2P、TSL-6、 TA01 及 TA03 。圖（B）則是 GAPDH 當做對照。. A.. B. 1 2 3. C.. D.. 圖十、A~D 分別為 control、negative control、positive control 及 TSL-2P 大鼠睪丸蛋白質之二維電泳圖，1~3 點之 pI/MW 分別為 5.2/105 kD、5.5/78 kD 及 5.3/55 kD，利用 database 搜尋比對的結果，推測這些蛋白質可能為 inositol polyphosphate-4-phosphatase、androgen receptor isoform 及 protein phosphatase 2A。. 表一、進行聚合酶連鎖反應所用到的 DNA 引子。 複製區域 引子名稱 序列 Pyridoxal kinase (forward) PDXK-F 5 ’－tggtcatcaccagctctgac － 3’ Pyridoxal kinase (reverse) PDXK-R 5’－gcagacaccgttttctcaca － 3’ GAPDH (forward) GAPDH-F 5’－gccaaaagggtcatcatctccg － 3’ GAPDH (reverse) GAPDH-R 5’－acattgggggtaggaacacgga － 3’. 11.
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