圖一 乳房的結構。(摘自 American Cancer Society 網站)
小葉細胞 乳房小葉
乳管細胞
乳管 乳管
乳房小葉
乳暈 乳頭
脂肪結締組織 集合乳管
圖 二 核 受 體 功 能 區 域 結 構 。 A/B domain 上 具 備
ligand-independent activation function domain(AF-1),可藉 由被磷酸化的方式活化;C domain 為受體與 DNA 結合的 區 域 ( DNA binding domain, DBD), 該 區 域 具 有 兩 個 Zn-fingers 結構;D domain 允許受體在結構上可以進行彎 曲;E domain 為配體與受體結合的區域(Ligand binding domain ), 其 上 具 備 ligand-dependent activation function domain(AF-2),可藉由與配體結合的方式而活化;最後,F domain 位於核受體蛋白質之 C 端(C-terminal),目前功 能未明。
DBD Hinge LBD AF-2
A/B C D E F
AGGTCANAGGTCA Target Gene
PPAR RXR
Nucleus
圖三 PPARs 的調控機制。 活化的 PPARs 與活化的 retinoic
X receptors(RXR)形成 heterodimer 結構,結合上位於 target gene 的 promoter 區域上的 PPRE 序列,來調控基因的轉錄。Ligand
Ligand
S B S B S B S B
圖四 Western blot 分析 PPAR a 在乳房組織內的表現。 四位
乳癌患者以 western blot分析 PPAR a 在乳房癌化及周邊非癌化組 織的表現情形。S:Surrounding cancer free tissue。B:Breast cancer tissue。PPARα
Histone 1
1 2 3 4
A B
C D
圖五 PPAR a exon 1,2,4 及 8 的 DGGE 分 析 結 果 。 乳 癌 患 者
genomic DNA 使用 PCR 進行增幅,之後進行 DGGE 分析。 (A) Exon 1,
DGGE 條件為 12% polyacrylamide gel、10% ~ 80% denaturing solution 在 190V 及 55℃條件下進行電泳分析 3 小時。 (B) Exon 2,DGGE 條件為 8% polyacrylamide gel、10% ~ 60%
denaturing solution 在 190V 和 55℃條 件下進行電泳分析 4 小時。 (C) Exon 4,DGGE 條件為 12% polyacrylamide gel、30% ~ 70% denaturing solution 在 190V 及 55℃條件下進行電泳分析 4 小時 45 分鐘。 (D) Exon 8,DGGE 條件為 8% polyacrylamide gel、10% ~ 50% denaturing solution 在 55℃ 和 190V 條件下進行電泳分析 4 小時 30 分鐘。每個 well 分別代表一個乳癌 病患的 DNA 檢體。
A B C
圖六 PPAR a exon 3,5 及 7 的 DGGE 分析結果。 乳癌患者 genomic DNA 使用 PCR 進行增幅,之
後進行 DGGE 分析。 (A) Exon 3,DGGE 條件為 12% polyacrylamide gel、10% ~ 60% denaturing solution 在 55℃和 190V 條件下進行電泳分析 4 小時 45 分鐘。 (B) Exon 5,DGGE 條件為 8% polyacrylamide gel、20% ~ 60% denaturing solution 在 190V 和 55℃條件下進行電泳分析 3 小時 30 分鐘。 (C) Exon 7,DGGE 條件為 8% polyacrylamide gel、20% ~ 50% denaturing solution 在 55℃和 190V 條件環境下進行電泳分析 4 小時 45 分鐘。每個 well 分別代表一個乳癌病患的 DNA 檢體。
A B
圖七 PPAR a exon 6 的 DGGE 分析結果。 乳癌患者 genomic DNA 使用 PCR 進行增幅,之
後進行 DGGE 分析。DGGE條件為 8% polyacrylamide gel、20% ~ 50% denaturing solution在 190V 及 55℃環境下進行電泳分析 3 小時 30 分鐘。 (A) DNA 有兩種不同分佈情形,相異的 DNA 序 列如箭頭所指。 (B) DNA 有三種不同分佈情形,相異的 DNA 序列如箭頭所指。每個 well 分 別代表一個乳癌病患的 DNA 檢體。AGA→AAA
圖九 乳癌患者 PPARa exon 5 DNA定序
GTC→GNC
Ser(codon:TCT)
16 273 161
289
Phe(codon:TTT)
161
圖十一 PPARa exon 3 S24F RFLP 分析結果。 Genomic DNA 使
用 PCR 進行增幅,之後加入限制? DpnII 反應 3 小時,最後進行 Agarose 電泳分析。電泳反應條件:3.5% Agarose,100 V,40 min。(A)RFLP 分析設計圖。(B)Agarose 電泳結果圖,lane 1:表現型 S/S,lane 2:表現型 F/F,lane 3:表現型 S/F。
A B
289 273 161 1 2 3
單位:bp
圖十二 PPARa exon 5 L162V RFLP 分析結果。 Genomic
DNA 使用 PCR 進行增幅,之後加入限制? DdeI 反應 3 小時,最後進行 Agarose 電泳分析。電泳反應條件:3% Agarose,100 V,30 min。(A)RFLP 分析設計圖。(B)Agarose 電泳結果圖,
lane 1:表現型 L/L,lane 2:PCR 產物。
Leu(codon:CTT)
97 159 24
97
Val(codon:GTT)
183
A B
280 159 97 1 2
單位:bp
圖十三 PPARa exon 6 V227A RFLP 分析結果。 Genomic DNA
使用 PCR 進行增幅,之後加入限制? Sau96I 反應 3 小時,最後進 行 Agarose 電泳分析。電泳反應條件:3% Agarose,100 V,35 min。(A)RFLP 分析設計圖。(B)Agarose 電泳結果圖,lane 1:表現 型 V/V,lane 2:表現型 V/A,lane 3:表現型 A/A。
Val(codon:GTC)
479 17
325
Ala(codon:GCC)
17
A B
479 325 154 154
1 2 3
單位:bp
圖十四 ApoE 基因型分析結果。 Genomic DNA 使用 PCR 進行複製,之後
加入限制? HhaI 反應 6 小時,最後進行 Agarose 電泳分析。電泳反應條件:4.5 % Agarose,100 V,40 min。A. RFLP 分析設計圖。B. Agarose 電泳結果圖。
38
38
38 16
16
16 19 91
91
72
18
18
18 48
48 35
35 83
e2
e3
e4
A B
3/3 2/2 4/4 2/2 3/3 3/3 3/4 3/3 3/4 3/3 3/3
單位:bp