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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
影響白血球吸附能力之蛇毒蛋白研究 Snake venom - derived inhibitors of leukocyte adhesion
計畫編號：NSC 87-2314-B-041-012 執行期限：86 年 8 月 1 日至 87 年 7 月 31 日
主持人：劉朝榮 嘉南藥理學院藥學系
一、中文摘要
透過與膠原 ( collagen ) 的結合，存在 於 Crotalus viridis 蛇毒中的一個單鏈蛋白 ( crovidisin ) 能有效的干擾血小板吸附到 膠原纖維，並且防止血小板受到膠原的活 化。利用細胞靜態吸附的實驗方式，我們 發現，隨著 crovidisin 存在濃度的增加，多 型 核 白 血 球 ( Polymorphoneuclear cells, PMNs ) 吸附到膠原的能力會逐漸變差。在 相同的條件下，Bitis arietans 蛇毒中的αIIbβ3
拮抗成分 ( arietin ) 並不會影響多型核白 血球吸附到膠原。這樣的結果顯示蛇毒中 存在有干擾多型核白血球 ( PMNs ) 吸附 能力的成分。
關鍵詞：蛇毒、膠原、多型核白血球、
吸附 Abstr act
Crovidisin, a single-chain protein isolated from the venom of Crotalus viridis snake, has been proved to prevent platelet- collagen interaction through binding to collagen fibers. Using static cell adhesion assay, we also found that crovidisin diminished the adhesion of polymorphoneuclear cells to collagen fibers in a dose-dependent manner. Whereas arietin, a member of αIIbβ3 antagonists belonging to disintegrin family, had no significant effect.
Here, we first revealed a novel snake venom protein ( crovidisin ) with inhibitory activity on leukocyte adhesion.
Keywor ds: Snake venom, Collagen, Polymorphoneuclear cells, Adhesion 二、緣由與目的
PMNs 是血液中量最多的白血球，同 時也是消滅入侵微生物的第一道防線，能 保護人體免於受到微生物的傷害。在展現 保護功能時，PMNs 先吸附到微血管，然 後離開微血管並移行至微生物入侵的部 位 ， 在 辨 識 並 吞 噬 微 生 物 後 將 其 消 滅 (1,2)。當 PMNs 進行上述的過程時，其細 胞膜上的β2 integrin 扮演重要的角色。利用 β2 integrin，PMNs 可以與其他細胞接觸 (3)，或是吸附在組織蛋白(4,5)。 甚至藉著 β2 integrin 和補體 ( complemen ) 的結合，
PMNs 可以更有效的吞噬微生物 (6)。臨床 上白血球β2 integrin 有缺陷的患者抵抗微 生 物 侵 害 的 能 力 很 差 (7) 。 由 此 可 見β2
integrin 對於 PMNs 的重要。
除了扮演生理角色外，PMNs 在某些 特定的情況下卻會傷害人體的正常組織，
例如心肌梗塞血液再灌流後的傷害(8)。因 此，干擾 PMNs 的功能具有臨床上的意 義。Collagen 是細胞之間相當豐富的一種 組織蛋白。在前人的研究中發現，PMNs 利用β2 integrin 吸附在 collagen 後會引發 Respiratory burst (4)。而且干擾 PMNs 吸附 到 collagen 能夠抑制 Respiratory burst (4)。
另外，補體 C1q 利用 collagen-like 的結構 與 PMNs 接觸後亦會引發 Respiratory burst (9)。這些研究顯示，藉由探討 collagen 與 PMNs β2 integrin 在分子層次上接觸的機 轉 ， 我 們 可 以 發 展 組 礙 PMNs 吸 附 到
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collagen 或是 complement 的藥物，有效的 減輕 PMNs 的病理作用。
我們從 Crotalus viridis 蛇毒中找到一 個分子量大約是 53 kDa 的單鏈蛋白並命名 為 crovidisin 。 Crovidisin 對 於 collagen ( Type I ) 有很高的親和力，經由結合在 collagen 上，它能有效的阻礙 platelet 與 collagen 的接觸，防止 platelet 受到 collagen 的活化 (10)。 基於 crovidisin 這樣的特 性，我們想知道 crovidisin 是否也會干擾 PMNs 與 collagen 的接觸，以及 PMNs 受到 collagen 活化後 Respiratory burst 的產生是 否會受到 crovidisin 的影響？
三、結果與討論
在鋪有 collagen fibers ( Type I )的 96 孔 culture plate 的槽內加入人類的 PMNs。靜 置 30 分鐘後吸走未吸附在 collagen fibers 的細胞，用 PBS 洗兩次，使用 Liu stain 染 色後在顯微鏡下觀察。在放大 100 倍的視 野下計數吸附細胞的數目。
從 Table 1. 的結果顯示，PMNs 吸附 到 collagen fibers 需要二價陽離子存在，在 2 mM 的 EDTA 存在下 PMNs 不大會吸附 到 collagen fibers，只有二價陽離子存在時 吸附量的 8.6%。這結果與其他實驗室的觀 察是一致的。隨著 crovidisin 存在濃度的增 加 ( 從 75 nM 到 2.4 µM )，PMNs 吸附在 collagen fibers 的量逐漸的減少。Crovidisin 在 2.4 µM 時大約可減少 70%的 PMNs 吸 附 。 從 先 前 的 研 究 得 知 crovidisin 干 擾 collagen 與 platelet α2β1的接觸是經由結合 在 collagen 上。因此，我們相信 crovidisin 是透過相同的機轉來妨礙 PMNs 吸附到 collagen fibers。從結構上來看，platelet α2β1
和 PMNs β2 integrins 的結構很相像，在α subunit 上都有 I domain (11)。所以，這兩 種 分 別 存 在 於 不 同 細 胞 的 integrins 和 collagen 的接觸可能都是辨識 collagen 上相 同或是相似的氨基酸序列及立體結構。
Crovidisin 可 能 是 覆 蓋 在 collagen 要 和 integrins 結合的部位上，進而同時干擾不同 integrins 與 collagen 的接觸。至於 crovidisin
是否會影響 PMNs 吸附到 collagen 後的活 化過程，包括 Respiratory burst。由於我們 這方面的實驗工作正在進行中，目前尚無 確切的結果。然而從其他實驗室的研究報 告獲悉，妨礙 PMNs 吸附到 collagen 就能 減弱 Respiratory burst。因此，我們認為 crovidisin 可能會抑制 collagen 引發 PMNs 產生 Respiratory burst 的作用。
另外，我們也同時看拮抗血小板αIIbβ3
的蛇毒成分 arietin (12) 對於 PMNs 吸附到 collagen 能力的影響。在 18µM 的濃度下，
arietin 無法有意義的減少 PMNs 的吸附 ( Table 1 )。
四、計畫成果自評
截至目前，很少人研究影響 PMNs 吸 附能力的蛇毒成分。我們的研究首先發現 Crotalus viridis 蛇 毒 中 的 蛋 白 成 分 crovidisin 具有阻礙 PMNs 吸附到 collagen 的作用。Crovidisin 覆蓋在 collagen fibers 上就能夠同時阻礙不同細胞的 integrins 與 collagen 接觸 (10,13 和本計畫結果) 。這些 研究發現似乎顯示 collagen fibers ( Type I ) 可 能 使 用 某 一 特 定 部 位 與 不 同 細 胞 的 integrins 接觸。而且 crovidisin 對於 collagen 的這個部位有很高的親和力。如果從分子 層次上來探討並了解蛇毒蛋白 crovidisin 是 如何與 collagen 接觸以及 crovidisin 覆蓋在 collagen 的 那 個 部 位 。 將 有 助 於 解 開 collagen 與細胞 integrins 之間如何互相接觸 的奧秘。本研究同時也為干擾白血球功能 藥物的發展開闢了一條新路。
由於是第一次取得全年度的國科會研 究計畫，相關的研究設備比較缺乏。因此 借用其他單位的儀器進行實驗時較為不 便。加上本計畫唯一購置的儀器 ( 用來純 化蛇毒蛋白的低壓層析系統 ) 到達的時 間較之預期的晚，造成蛇毒成分的純化工 作有些延誤。這些因素導致研究進度有些 落後。如今與研究相關的設備: 冷凍離心 機、蛋白乾燥系統以及 EIA reader 本單位 均已購置完成且正常運作中。所以，關於 PMNs 吸附到 collagen 後的反應，包括
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Respiratory burst 及 granule release 是否會受 到 crovidisin 的影響的實驗正在進行中，很 快就會有結果。
五、參考文獻
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Table 1. Effects of crovidisin and arietin on the adhesion of PMNs to coated collagen fibers.
Treatment % Adhesion
Saline 100
EDTA ( 2 mM ) 8.6 Crovidisin ( nM )
75 68
150 48
300 36
600 38
1200 44
2400 32
Arietin ( µM )
18 86
Adhesion assays were performed in the presence of 1 mM Ca2+ and 0.5 mM Mg2+
except for EDTA treatment. After pretreatment with saline, EDTA, crovidisin or arietin at room temperature for 10 min PMNs ( 2.5×105/ 100ul ) were added to collagen coated wells. Data were expressed as mean of triplicate results.
