行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
計畫編號：NSC 90-2320-B-041-017
執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日 主持人：劉怡文 嘉南藥理科技大學藥學系
一、中文摘要
間 質 素 十是一種抗發炎性的細胞激 素，可由特定血液性細胞分泌，如 T 細胞、
B 細胞、單核/巨噬細胞等。已知脂多糖可 以促進老鼠巨噬細胞 RAW264.7 的間質素 十基因之表現。此篇研究即是要找出參與 這個誘導工作之機轉。首先我們建構一系 列 含 間 質 素 十 promoter 的 luciferase reporter 質 體 DNA ， 再 將 DNA 送 入 RAW264.7 細胞做短暫表現。結果發現對 脂多糖有反應的兩片段 DNA 為：–95bp 到–66bp,以及–422bp 到–363bp。利用電泳 位移試驗分析這兩段 DNA 區域，發現 Sp1 可 以 結 合 在 –122bp 到 –49bp 片 段 ， 而 C/EBPâ 則可結合在–422bp 到–363bp 片 段。利用點突變技術， 我們建構帶 Sp1 點 突 變 之 質 體 IG553 △ Sp, 結 果 顯 示 其 luciferase activity 大約減少一半。而利用 3 種 藥 理 抑 制 劑 來 研 究 訊 息 傳 遞 路 徑 ， SB203580、Sp600125、U0126，它們分別 抑制 p38、JNK 與 ERK。結果它們都可以 dose-dependent 抑制 LPS-induced IL-10 蛋 白質產生。另外，我們也在細胞大量表現 p38、JNK、ERK2 dominant negative 蛋白 質，結果也都可抑制 LPS-induced IL-10 promoter activity。總括來說，在此我們指 出 MAPK signaling pathways，以及轉錄因 子 Sp1 與 C/EBPâ 都可能在 LPS-induced IL-10 上扮演極重要之角色。
關鍵詞：間質素十、啟動子之調節、轉錄 因子 Sp1、轉錄因子 C/EBPâ、轉錄因子 c-Jun
Abstract
Interleukin-10 (IL-10) is an anti-inflammatory cytokine secreted by a
variety of cell types including T cells, B cells and monocyte/macrophages. It is known that lipopolysaccharide (LPS) could activate transcription of IL-10 promoter in murine macrophage cell line RAW264.7. In this study, we want to identify the regulation mechanisms involved in LPS-induced expression of IL-10. We constructed a series of luciferase vectors bearing various lengths of IL-10 promoter. After transient transfection and analysis of these vectors, we found that there were two LPS-response elements in IL-10’s promoter: one was residing at –95bp to –66bp, and the other was –422bp to –363bp. Analysis of these two regions by gel shift assay, it suggested that Sp1 bound to promoter region of –122bp to –49bp, and C/EBPâ bound to –422bp to –363bp region. By site-directed mutagenesis, we constructed Sp1 site-eliminated reporter vector IG553△Sp, and it showed that LPS-induced luciferase activity was reduced about half. By using the pharmacological inhibitors, our data demonstrated that p38, JNK and ERK inhibitors, SB203580, Sp600125 and U0126, respectively, inhibited LPS-induced IL-10 protein expression in a dose-dependent manner. In the other way, overexpression of p38, JNK and ERK2 dominant negative plasmids also inhibited LPS-induced IL-10 promoter activity. Taken together, our results suggest that MAPK signaling pathways, and transcription factors Sp1 and C/EBPâ may play a functional role in the regulation of murine IL-10 gene expression.
Keywords: interleukin-10, promoter regulation , transcription factor Sp1 , transcription C/EBPâ, factor transcription factor c-Jun
二、緣由與目的
哺乳類動物因細菌感染而引發的敗血 症中，脂多糖扮演著一個重要的角色，它 可以活化宿主的先天免疫反應。在哺乳類 免疫細胞的先天性免疫反應中，脂多糖扮 演著可活化嗜中性血球與巨噬細胞的重要 角色，連帶的也促進許多發炎性的間質素 表現，因而導致感染所引發來的發炎反應 (1)。既然有發炎反應發生，邏輯推理上，
我們的生理反應接下來應該能啟動抗發炎 機制，以防止發炎反應之持續擴大。果真，
最近幾年來發現脂多糖也可以促進抗發炎 性的間質素表現(如間質素十) (2)。目前已 知間質素十在免疫作用的調控上扮演一個 很重要的角色，因為它可以抑制巨噬細胞 與 T 細胞的免疫反應，以阻止發炎性免疫 反應之再進行(3，4)。最近，在脂多糖促進 間質素十表現的研究上， Brightbill 等人利 用一系列的啟動子突變報告基因分析與電 泳位移試驗，發現脂多糖是透過啟動子上 的 Sp1 結合位置(位在-89 到-78bp 上)來使 間質素十基因表現，因此增加間質素十 mRNA 與蛋白質的量(2)。但是利用 EMSA 的實驗分析，卻觀察不到 Sp1 結合上間質 素十啟動子的能力有因脂多糖刺激而增 加。這些現象非常類似我以前研究上皮生 長因子對十二酯氧酵素基因誘導之機轉 (5)。後來發現，上皮生長因子誘導十二酯 氧酵素基因表現(6，7)，以及 TGF-â 誘導 p21 基因表現的原因是(8)：Sp1 必須與 c-Jun 結合才能活化基因表現，而 Sp1 很可能是 一個攜帶者的角色，再靠著 Sp1 與 c-Jun 的結合能力把 c-Jun 帶到 DNA 上而活化基 因表現。所以在 LPS-induced IL-10 的疑問 上，我們想問的是：在 LPS 促進 IL-10 表 現的作用上，除了 Sp1，是否有其他轉錄 因子也參與 IL-10 promoter 之活化？
而在訊息傳遞方面，脂多糖刺激免疫 細胞的方式，是透過細胞膜上的 TLR4 接受 體(9，10)。而當 TLR4 接受體被活化後便 藉由一些特定分子把訊息傳遞下去，這些 特定分子即所謂的訊息傳遞因子，目前已 知包括有 MAPKKK— MAPKK— MAPK 與 NF-êB 這兩大途徑(11，12)。其後者 NF-êB 被認為與脂多糖間誘導人類間質素十的表
現可能較無關(13)，因此我們便直接先觀察 MAPKKK— MAPKK— MAPK 路徑參與之 可能性。去年我們利用 3 種抑制劑 U0126、
PD098059、SB203580，初步確認 ERK 與 p38 應該參與在 LPS-induced IL-10 之訊息 傳遞路徑，本期研究將再深入找尋 LPS 活 化 IL-10 之相關訊息傳遞因子？
三、結果與討論
在我的初步實驗系統建立結果發現，
脂 多 糖 確 實 可 以 增 加 老 鼠 巨 噬 細 胞 株 RAW264.7 的間質素十 mRNA 與蛋白質的 表現：在間質素十 mRNA 的表現方面，在 脂多糖刺激細胞 1 小時後，即可以 RT-PCR 的偵測方法觀察到 mRNA 的增加，此現象 持續增加到 9 小時的時候；間質素十蛋白 質的分泌情形則是以 ELISA 方式定量，當 脂多糖刺激細胞 3 小時後，可見到間質素 十蛋白質開始增加，且一直增加持續到 9
小時
。
而利用藥理抑制劑的研究，得知這種由 LPS 誘導 IL-10 增加的訊息傳遞途徑 應該是經過 MAPK (至少包括 ERK、p38)。
接 下 來 要 問 的 是 ， 脂 多 糖 增 加 RAW264.7 的間質素十 mRNA 與蛋白質，
是否經由基因之轉錄活化？於是我們建立 帶有間質素十 promoter 與 luciferase gene 的建構質體 DNA (IG553)，結果發現脂多 糖 也 可 以 刺 激 luciferase gene 的 表 現 (Figur e 1) 。 於 是 我 們 肯 定 間 質 素 十 promoter 確實可被脂多糖活化。所以在細 胞訊息傳遞方面的研究，我們可以使用一 些 dominant positive 或 dominant negative plasmids 來更確認。結果告訴我們 dominant negative ERK (K52R ERK2) 、 dominant negative JNK (pcDNA3.1-JNK)與 dominant negative p38 (dn p38) (Figur e 2)皆可依劑量 來壓制脂多糖的作用，於是我們可以肯定 的說脂多糖活化間質素十 promoter 確實經 過了 ERK、JNK 與 p38 這三條路徑。
因為 Brightbill 等人曾經報告-86/-78 的 Sp1 binding site 是脂多糖活化間質素十的 重要部位(2)，於是我們也建構 Sp1 site mutant 之質體 DNA (IIG553△Sp、IG122△
Sp) (Figur e 3)。比較有加脂多糖與沒有加 的結果(LPS/control)發現，只有 IG122△Sp 喪失所有的活性，IG553△Sp 與 IG122 只
有喪失一半(Figur e 3)，所以初步判定除了 -86/-78 的 Sp1 binding site 外，-553/-122 間 應該還有其他 LPS-response element(s)。後 來針對-553/-122 做更細膩之 5’端邊段切，
可以把 LPS-response element(s)更縮小在 -422/-363 間。於是我們再利用 EMSA 分 析，結果顯示-422/-363 bp 的 DNA 片段上，
具有 C/EBPbeta protein 結合能力，而且 C/EBPbeta protein/DNA 結合能力可隨脂多 糖處理時間的增加而增加(Figur e 4)。
但 Sp1 protein /DNA 結合能力並不隨 脂多糖處理時間而增加，所以我們懷疑可 能有其他轉錄因子與 Sp1 合作，一起參與 IL-10 的活化。由於我們之前已經證實脂多 糖處理 RAW264.7 細胞可以使 c-Jun protein 增加，而 Sp1 與 c-Jun 已被證實可以共同活 化 EGF-induced 12-lipoxygenase gene，所以 我們懷疑在 LPS-induced IL-10 gene 也可能 走 這 條 路 線 。 首 先 我 們 測 試 IG553 被 dominant positive c-Jun (pcDNA3.1-Jun)活 化 情 形 ， 結 果 顯 示 IG553 可 被 dose-dependent 活化(Figur e 5)，此現象極有 可 能 代 表 著 c-Jun protein 也 參 與 在 LPS-induced IL-10 gene 的事實。但如果把 所有的 5’端段切質體 DNA 都拿來測試，發 現 其 受 dominant positive c-Jun 活 化 的 pattern 與脂多糖有極大不同，利如 IG122 應為 IG553 的一半，但 dominant positive c-Jun 活化 IG122 卻與 IG553 相當(Figur e 6)，所以我們初步認為 c-Jun 雖然也可以活 化 IL-10 gene，但在脂多糖活化 IL-10 gene 的路徑中，其角色可能不重要。
四、計畫成果自評
由 於 RAW264.7 可 以 成 功 的 進 行 transfection assay，所以我們對於 IL-10 gene promoter 的分析腳步因此加速，藉此更可 以直接觀察基因的活化情形。
綜合我們所要研究的專題上，應該可 以提供以下幾個重要資訊，以供生物醫學 研究之進展與應用。
(一) 間質素十基因表現調節之重要性：
正因為間質素十扮演著減緩免疫反應 的角色，所以若將老鼠的間質素十基因剃 除，會因此加重老鼠的發炎性疾病進行(如
腸炎等)(14)。因此如果有病人的間質素十 基因表現低於正常人的話，可能就很容易 發炎過度。現在已知有許多疾病是和發炎 過度有關，包括我們台灣人也不少的肝硬 化也是其中之一。所以美國 DNAX 生技公 司已經研發生產間質素十蛋白質製劑，目 前正在進行一些人體臨床實驗(包括腸炎 之治療、C 型肝炎之治療等)。這些純化的 蛋白質製劑已經可以運用在疾病治療上 面，但間質素十基因本身的生理調節機轉 還不是非常清楚，因此我們的研究目的就 是想要更了解生物體內間質素十表現之架 構。目前從我們的數據已知，transcription factor Sp1 and C/EBPâ 是 LPS 誘導 IL-10 不 可或缺的因子。此外，LPS 雖不由 c-Jun 來 達成誘導 IL-10 之目的，但 c-Jun 也的確可 以活化 IL-10 promoter。
(二) 蛋白質與蛋白質交互作用在基因表現 調節之重要性：
現在蛋白質與蛋白質交互作用的研究 發展越來越快速，也越來越了解其重要 性，尤其在基因表現調節的影響程度更是 重要。在我們研究間質素十基因表現的故 事中，因為有單一蛋白質無法解釋的現象 存在，所以我們也積極的把蛋白質與蛋白 質交互作用的思考模式運用進來，希望能 挖掘更豐富的細胞生理知識。在 LPS 誘導 IL-10 的機轉中，已知 Sp1 and C/EBPâ 都很 重要，而這 2 種蛋白質之間有無交互作用，
目前尚不清處，但很值得研究。
五、參考文獻
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Figur e 1. Time-dependent effect of LPS on the activity of IL-10 pr omoter .
Figur e 2. Effect of dominant negative mutant of p38 on LPS-induced expr ession of lucifer ase vector IG553 bear ing IL-10 pr omoter .
6
Figur e 3. Effect of LPS on the pr omoter activity of IL-10 gene.
Figur e 4. Gel shift analysis of nuclear factor s inter acting with –422/-363 pr obe.
Figur e 5. Dose-dependent effect of pcDNA3.1-J un on the lucifer ase activity of vector IG553 bear ing IL-10 pr omoter .
Figur e 6. Effect of pcDNA3.1-J un on the expr ession of lucifer ase vector s bear ing var ious lengths of IL-10 pr omoter .
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行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
脂多糖對老鼠間質素十基因表現之調節
Regulation of Mouse Interleukin-10 Gene Expression by Lipopolysaccharide
計畫類別：R個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：NSC90－2320－B－041－017－
執行期間：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日 計畫主持人：劉怡文
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：嘉南藥理科技大學藥學系
中 華 民 國 91 年 9 月 23 日
