國立宜蘭大學生物技術研究所 碩士論文 Institute of Biotechnology National Ilan University Master Thesis

全文

(1)

國立宜蘭大學生物技術研究所 碩士論文

Institute of Biotechnology National Ilan University

Master Thesis

以蛋白質體學探討石斑魚虹彩病毒誘發金目鱸肌肉細胞株之表現

Study On The Genes Expression of Barramundi (Lates calcarifer) Muscle Cell Line Induced By Grouper Iridovirus Infection

指導教授:賴裕順 博士

Yu-Shen Lai, Ph. D.

研究生:陳瑾玟

Chin-Wen Chen

中華民國九十七年七月

(2)
(3)
(4)
(5)

謝誌

兩年過去了,回想起這兩年以來過著每週自汐止往返宜蘭的日子,終於也要 告一個段落。這兩年來每周一的離開,是我最害怕也最緊張的時刻,而這樣的氛 圍終於要結束了,我不需要再忍受每週與愛犬分離的苦痛,也不需要讓老劉鎮日 與泡麵為伍。

關於同時兼任妻子與學生的雙重身分,我一直不十分適應,當然做學生我是 拿手的,但為人妻卻像個牙牙學語的孩童,進步的空間仍很大。

了解我的人知道,我一向是個十分感性的傢伙,但在科學的世界裡,理性是 永遠需要被排除的,與其感性思考那些受難鼠屍的靈魂去向,倒不如理性的將需 要的器官趁著新鮮摘除。

我經常陷入理性與感性矛盾的漩渦當中,這些感性的想法亦不只一次在我撰 寫論文上造成重重阻滯,以致我的指導教授看到一篇殘破不堪的論文初稿,幸而 我的指導教授 賴裕順老師指正,與不厭其煩的修改,這篇論文才稍具雛型,也 謝謝 賴老師給我這個就讀研究所的機會,讓我得以在這六年研究助理與研究生 的時光,擁有一份自己撰寫的文章,與一篇掛上姓名的期刊。無論將來我能否持 續研究的夢想,老師對我的好我一輩子都不會忘記的。

這兩年的實驗歲月裡,謝謝中研院植微所的 溫端南老師、 徐子富學長與 蕭 證元學長,雖然我離職已久,但你們仍願意做我強而有力的支柱,感謝 溫老師 時時提供我人生與科學研究上最佳的線索,感謝 徐子富學長三番兩次不辭勞苦 的開車到宜蘭來給我鼓勵,感謝 蕭證元學長不斷的與我分享實驗上的技巧與經 驗,無論成功與挫敗,我無法想像如果沒有你們的幫助,這兩年來我將如何走過 這滿是挑戰的研究生生涯。

(6)

與指正,甚至是口試上的經驗傳承,學生都點滴感激在心頭。

感謝 郭村勇老師這兩年以來,您經常在我人生失去方向的時刻,點醒我、

指引我,甚至鼓勵我,幸而有老師的提點,讓我在每次的心灰意冷後有重新站起 來的勇氣。

謝謝中研院細生所的林志鴻學長,不分日夜回答老學妹的蠢問題,也謝謝學 長一直以來的照顧,無論是實驗上或是生活上,感激萬分。

謝謝我敬愛的學長呂柏毅,感謝你在這兩年來同時扮演我的司機、益友與線 民,謝謝你在每個深夜時分,在實驗室陪伴我通宵達旦,也謝謝你無論刮風下雨 張羅午餐與晚餐。

這兩年望海的日子終於要畫上一個句點,在這兩年求學的日子當中,感謝同 學春榮、筱婷、漢婷、乙書、讌君的陪伴與砥礪,尤其是春榮,你是我最好的垃 圾桶;感謝學弟妹雁玲、建智,尤其是建智在我畢業前夕,瘋狂趕實驗時的鼎力 相助;感謝郁慧永遠不辭勞苦的到實驗室來清鼠籠,讓學姊不至於在老鼠尿液環 肆的情況下缺氧窒息,也謝謝你經常充當實驗室的開心果,讓實驗失敗的苦澀得 到紓解;謝謝麗安在畢業典禮時無聲的相挺,也謝謝你不嫌棄我直接的個性;謝 謝算命團大龍女-安騏與小楊過-國瑋的陪伴,雖然相處的時間不多,但你們率真 的個性亦令我十分喜歡;最後謝謝實驗室的生力軍,美鈴、秀蓮、子揚,實驗室 有你們的幫忙真好,漫漫歲月裡我都會是大家一輩子的朋友,永遠情義相挺。

在論文謝誌交稿的前夕,恰巧看了陳懷恩導演的『練習曲』,電影裡有段引

自小學六年級課本的文章,讀了使人感觸良多,截取如下:岳納珊是一隻海鷗的 名字。他遠遠離開那些同伴,獨自練習飛行。為了追求理想,他忍受孤獨,忍受 譏嘲,忍受痛苦,立志要飛得快,飛得高,飛得漂亮。

希望這個碩士學位,僅是我的一部練習曲,我期許自己更勇敢的朝向科學之

(7)

僅以這篇不成氣候的論文,獻給我最愛的父親陳英龍先生、母親廖明玲女 士、妹妹麗鈞、慧潔,與丈夫劉建宏,謝謝你們的支持,讓過而立之年的女兒、

姐姐及妻子勇敢築夢,願以此份榮耀與你們分享。

(8)

摘要

病毒感染細胞時會表現一些抗細胞凋亡或是誘發細胞內抗凋亡的病毒蛋白 質,藉此來延緩細胞的死亡並順利進行病毒自我複製。細胞被病毒感染後,為了 防止病毒在細胞內進行複製,會表現出一些引發細胞凋亡的蛋白質,讓細胞本身 進行凋亡,進而造成病毒無法在宿主內進行複製與增殖。在2008年研究石斑魚虹 彩病毒的文獻當中指出,當石斑魚虹彩病毒感染金目鱸肌肉細胞時,會讓細胞產 生細胞凋亡的現象,藉以令病毒無法在細胞內進行增殖與感染。

在本篇論文中利用二維電泳觀察石斑魚虹彩病毒感染的細胞蛋白表現,與正 常細胞蛋白質表現比較,發現有八個蛋白質表現有明顯的差異,且這八個蛋白都 只大量表現在受感染的細胞中,因此認為這八個蛋白的表現應該與細胞的凋亡有 關聯。八個表現差異的蛋白質經過液相層析串聯質譜儀(LC-MS/MS)的分析,並 進一步進行胺基酸序列分析來確認蛋白質身份,結果發現總共有七種不同蛋白質 身分,分別是Initiation factor 4A 1B(eIF4A1B)、Proteasome 20S、ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)、Ribose 5 phosphate isomerase(RPIA)、Tyrosine Hydroxylase

(TH)、RAN binding protein 1 和 Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1)。除了 Proteasome 20S 和 RAN binding protein 外,接下來其餘五個蛋白質進一步利用 Real-time PCR的方式檢測分析,結果顯示Initiation factor 4A 1B、ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)、Ribose 5 phosphate isomerase 和 Tyrosine Hydroxylase 等四個 蛋白基因表現有明顯的上升,而 Phosphoglycerate mutase 1 基因表現並無明顯的 差異。

由以上結果證實石斑魚虹彩病毒感染金目鱸肌肉細胞時,確實會誘導細胞內 部分基因的表現,這些基因的表現是否與細胞的凋亡有直接關聯,仍然需要未來 更多的研究證明。

(9)

Abstract

By definition, viruses are unable to replicate within a host cell. Virus infection can trigger events that lead to apoptosis, however some viruses are known to encode gene products or induce host gene products that block apoptosis and use the host-cell macro-molecular machinery and energy supplies to replicate. In previous studies, it was suggested that GIV could induced apoptosis in barramundi muscle cells via caspase-3, -8, -9 activation pathway.

In this study, a proteomic method was applied to identify alterations in protein expression profile in barramundi muscle cells and being an indicator of apoptosis after GIV infection. From this screening, 7 novel proteins were identfied, including Initiation factor 4A 1B (eIF4A1B), Proteasome 20S, ADP-ribosylation factor 1

(Arf-1), Ribose 5 phosphate isomerase(RPIA), Tyrosine Hydroxylase(TH), RAN binding protein 1, and Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1), were overexpressed in GIV-infected barramundi muscle cells. In addition, we also determined these genes expression levels by real-time PCR. The results showed that except Initiation factor 4A 1B (eIF4A1B)but, ADP-ribosylation factor 1(Arf-1), Ribose 5 phosphate isomerase (RPIA)and Tyrosine Hydroxylase (TH)were up regulated conpared to the mock-infected cells. However, the Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1 ) expression only rises slightly is heightened in comparison to the mock-infected cells.

Summarized our results indicated that GIV could induce host genes expression level, by GIV infection and supports viral, and replication virus-infected cells of premature death. Our results provide an information for understanding of GIV viral replcation in the host cells and possible mechenisms apoptosis regulatory systems.

(10)

目錄

摘要... I Abstract... II 圖表目錄...V

第一章 文獻探討...1

第一節、虹彩病毒...1

第二節、細胞凋亡、壞死與病毒之間的關係...5

第三節、ADP-ribosylation factor 1...9

第二章 研究目的...12

第三章 實驗材料與儀器...13

一、 實驗材料...13

二、 實驗儀器...18

第四章 材料與方法...20

第一節 石斑魚虹彩病毒的純化...20

第二節 石斑魚虹彩病毒感染金目鱸肌肉細胞之二維電泳...21

第三節 石斑魚虹彩病毒誘發金目鱸肌肉細胞內蛋白質增減之分析...26

第四節 在金目鱸肌肉細胞中表現重組蛋白質ADP-ribosylation factor 1(Arf-1) ...28

第五節、即時定量PCR(realtime PCR) ...31

第五章、結果...33

第一節、鑑定石斑魚虹彩病毒感染金目鱸肌肉細胞,胞內表現量上升之蛋白 質...33

第二節、病毒感染引發胞內大量表現蛋白質的cDNA選殖 ...34

第三節、以realtime-PCR監控基因表現量變化...36

第四節、選殖ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)基因...37

(11)

第六章 討論...38

第一節、由病毒所引發的細胞凋亡...38

第二節、研究方法與問題...39

第三節、誘發蛋白質的文獻探討...40

第四節 未來展望...43

第七章 圖表...45

參考文獻...65

(12)

圖表目錄

圖一 二維電泳蛋白質之銀染色圖。...45

圖二 二維電泳蛋白質之CBR染色圖。...46

表一 利用mascot軟體進行蛋白質身分鑑定的結果。 ...47

圖三 (A)eIF4A1B PCR增幅結果;(B)eIF4A1B核苷酸序列的比對結果。..48

圖三 (C)eIF4A1B胺基酸序列比對結果。 ...49

圖四 (A)Arf-1 PCR增幅結果;(B)Arf-1 核苷酸定序的比對結果;(C)Arf-1 金目鱸胺基酸序列的比對結果。...50

圖五 (A)RPIA PCR增幅結果 ...51

圖五 (C)RPIA金目鱸胺基酸序列的比對結果。...52

圖六 (A)TH PCR增幅結果,(B)TH核苷酸定序的比對結果。...53

圖六 (C)TH金目鱸胺基酸序列與斑馬魚胺基酸序列的比對結果。...54

圖七 (A)PGAM1 PCR增幅結果;(B)PGAM1 核苷酸定序的比對結果; (C)PGAM1 胺基酸序列的比對結果。 ...55

圖八 使用realtime-PCR監控不同感染時間點eIF4A1B的基因表現量。...56

圖九 使用realtime-PCR監控不同感染時間點Arf-1 的基因表現量。...57

圖十 使用realtime-PCR監控不同感染時間點RPIA的基因表現量。 ...58

圖十一 使用realtime-PCR監控不同感染時間點TH的基因表現量。 ...59

圖十二 使用realtime-PCR監控不同感染時間點PGAM1 的表現量。...60

(13)

圖十三 Arf-1 PCR增幅的結果。 ...61

圖十四 pCMV-tag4 的載體...62

圖十五 Arf-1 的cDNA,序列分析結果。 ...63

圖十六 金目鱸ADP-ribosylation factor 1 like的種源分析。...64

(14)

第一章 文獻探討 第一節、虹彩病毒

一、虹彩病毒的簡介與分類

虹彩病毒(Iridovirus)的名稱是來自Tipula iridescent virus,字首(Iri)在希臘文字 中所代表的意義即為彩虹,該病毒生長在蚊姥(Tipula)的血囊腫,而使蚊子呈現彩虹 的顏色。此病毒最早是在1954年的Claude rivers附近被發現,蚊姥因被虹彩病毒所寄生,

導致身體某部位出現藍色補丁狀,造成當時整條河中皆可以見到蚊姥幼蟲的體表,所出 現鮮豔的藍色螢光(Bellett, 1967)。

依照國際病毒分類委員會(International committee on Taxonomy of Virus;ICTV)

2006年報告,虹彩病毒科屬於雙股的DNA病毒(Double-strand DNA virus)(Alves, 1993),病毒顆粒的封套是由兩層膜所組成的。從電子顯微鏡下觀察病毒型態,病毒直 徑約120 nm – 300 nm,病毒的外鞘蛋白質(Capsid protein)是由147個重複的病毒的MCP

(Major capsid protein)所組成。病毒的主要宿主包括無脊椎動物及非哺乳類的脊椎動 物(Castric, 1984),病毒複製的位置位於宿主的細胞質中,並且利用出芽(Budding)

的方式將裝配完成的病毒顆粒釋出。

從病毒分類學上而言,虹彩病毒科下共分虹彩病毒屬(Iridovirus)、綠虹彩病毒屬

(Chloriridovirus)、蛙虹彩病毒屬(Ranavirus)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)

及巨化細胞病毒屬(Megalocytivirus)等五屬。其中虹彩病毒屬及綠虹彩病毒屬主要是 感染昆蟲為主;而蛙虹彩病毒屬、淋巴囊腫病毒屬與巨化細胞病毒屬則感染冷血的脊椎 動物(Kelly, 1979;Webby, 1998;Williams, 1994),以下分別介紹虹彩病毒科中五個病 毒屬的特性以及其代表性的病毒:

(一)、虹彩病毒屬(Iridovirus-IV):

(15)

可感染多種無脊椎動物,大部分以昆蟲為主,病毒直徑約120 nm,代表性的 病毒為Chilo iridescent virus(IIV6,又稱CIV)(Delhon, 2006)。

(二)、綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus):

以感染昆蟲類的蚊子為主,病毒直徑約為180 nm(Chapman, 1966;Williams, 1996),代表性的病毒為Mosquito iridescent virus(IIV3)。

(三)、蛙虹彩病毒屬(Ranavirus):

主要宿主為兩棲動物(Daszak, 1999;Chinchar, 2002),其如感染蠑螈及青 蛙,將會造成高度的死亡率(Cunningham, 1996;Jancovich, 1997);病毒直徑約 160-200 nm,最初是由豹蛙的腎臟惡性腺瘤(Adenocarcinoma)分離,但Frog virus 3 (FV3)和腫瘤並無直接關係,其代表性的病毒為Frog virus 3 (FV3),最近 這屬的病毒也被報告可以感染魚類,例如:石斑魚虹彩病毒(Grouper iridovirus - GIV)(Murali , 2002)。

(四)、Lymphocystivirus:

可感染多種硬骨魚類,病毒大小約為200 ± 50 nm(Walker, 1962),代表 性的病毒為Lymphocystivirus type 1(LCDV-1),會感染34個不同的科,約96種 的海洋魚類(Wolf, 1988)。該病毒屬慢性疾病,會侵犯真皮層的纖維細胞

(Fibroblast),造成細胞腫大,形成肉眼可見的結節,而腫大的纖維細胞在組織 病理學下可見細胞質內有嗜鹼性包涵體,然此病死亡率低,大部分受感染魚類可 自行復原。

(五)、巨化細胞病毒屬(Megalocytivirus):

此為近幾年來新建立之虹彩病毒屬,會感染淡水及海水魚種,尤其是暖水 魚類,造成重大疫情,如ISKNV(Infectious spleen and kidney necrosis virus)

(16)

(He, 2000)、RBIV(Rockbream iridovirus)(Jung, 2000)、RSIV(Red sea bream iridovirus)(Inouye, 1992)和TGIV(Grouper iridovirus of taiwan)(Chou, 1994)

等。

二、石斑魚虹彩病毒發現歷史

1986年產於澳洲之紅鰭河鱸(Red fin perch Perca fluviatilis)出現大量死亡,罹病 魚會有體色變黑,缺乏食慾的情況。病理解剖發現有出血以及肝、脾、頭腎的水腫,伴 隨血管壁的損害壞死,同時有壞死性肝炎等病症(Ahne, 1990;Langdon , 1986)。由病 理解剖的結果,證實為虹彩樣病毒(Iridovirus-like)感染,故本病又稱之為流行性造血 組織壞死症(Epizootic haematopoietic necrosis;EHN) (Hyatt ,1986;Langdon, 1987;

Eaton, 1991)。1986年澳洲養殖的虹鱒(Salmogairdneri Richardson)亦發生類似的病原 感染(Langdon, 1986)。

1990年日本四國地區養殖的嘉鱲魚(Pagrus major),因感染虹彩病毒而引起20-60 % 之死亡率(Kiyoshi, 1992),罹病魚出現活力不佳的情況,腮部則有貧血或點狀出血的 現象產生。解剖罹病魚內部可以發現,其脾臟有明顯腫大情況,藉由電子顯微鏡觀察這 些細胞的細胞質,其中有許多直徑約200-240 nm的病毒顆粒(Inouye, 1992;Nakajima, 1994)。Inouye與Marsuika等人在1990-1995年的調查報告中指出,此種虹彩病毒可感染 高達31種魚種,包括了嘉臘、石斑魚、鱸魚、鸚哥魚類、虎河豚類和多種鯛科魚類。這 些結果顯示病毒會在魚種間交互傳播,對海水養殖業的威脅不容置疑(Inouye, 1992;

Matsuoka, 1996;Nakajima, 2002)。

1992年新加坡近海箱網養殖之鱸滑石斑魚(Epinephelus tauvina),爆發不明原因的 大量死亡,由於罹病石斑魚呈現活力不佳的昏睡狀態,故將此疾病稱為石斑魚睡眠病

(Sleepy grouper disease,SGD),魚群在發病後死亡率會逐漸增加,在數天內死亡率可 累積到50%以上,重創新加坡石斑魚養殖漁業(Chua, 1994),當時此病毒無法在任何

(17)

一個細胞株上增殖。

1998年新加坡養殖的馬拉巴石斑(Epinephelus malabaricus)與鱸滑石斑再度爆發了 SGD的感染,對石斑魚之仔魚造成90%的死亡率。藉由病理解剖可在罹病魚體的脾臟與 腎臟組織中,發現巨大的嗜鹼性細胞。1994年Chew-Lim等人建立了石斑魚胚胎細胞株

(GP cell)用以增殖此病毒(Chew-Lim, 1994)。經過電子顯微鏡的觀察以及生化分子 特性的分析,證實此為虹彩病毒的感染,並且將此病毒暫時命名為新加坡石斑魚虹彩病 毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)(Chang, 2002;Qin, 2002)。

1995年台灣南部茄定地區養殖的石斑魚爆發魚苗不明原因的大量死亡,罹病魚無明 顯的外觀病徵,由光學顯微鏡的觀察結果發現,鰓部與脾臟有肥大的嗜鹼性細胞出現,

利用電子顯微鏡則可觀察到大約230 ± 10nm的病毒顆粒,依據病毒的基本型態與特性,

命名為台灣石斑魚虹彩病毒(Grouper iridovirus of taiwan,TGIV)(周, 2000)。2001 年台灣養殖的金目鱸出現食慾不振、運動失調,並逐漸有魚之死亡的現象,經由電子顯 微鏡進一歩檢查,發現有大小約160-200 nm的六角形類虹彩病毒顆粒存在(吳, 2004)。

三、石斑魚虹彩病毒基因組與病毒顆粒複製

石斑魚虹彩病毒為細胞質增殖的病毒,其基因體大小約140 kb,其DNA成分GC比 為54 %,基因體內包含了120個讀碼框(Open reading frame)(Delius, 1984;Darai, 1990;

Tidona, 1997;Mao, 1997),可製作出62-1268個胺基酸的蛋白質(Tsai, 2004)。病毒外 觀形態為二十面體、病毒顆粒直徑 200 - 300 nm,具有Nucleoprotein core。病毒具有數 層結構,由內而外分別為:核蛋白(Nucleoprotein)、脂質內膜(Lipid inner membrane)、

蛋白鞘(Capsid)以及外套膜(Envelope)。

病毒的複製分兩階段,分別在細胞核內及細胞質內進行(Levy, 1994)。病毒可經 由宿主細胞膜的芽出(Budding),並以內胞飲(Endocytosis)作用方式進入相鄰細胞

(18)

(Levy, 1994;Qin, 2001)。亦有研究指出,感染的細胞,電顯下可觀察到不同複製時 期的病毒顆粒,有時分散、有時呈類晶體狀整齊地排列在細胞質中,亦會在寄主細胞形 成包涵體(Inclusion body)(Kasornchandra, 1997;Tapiovaara, 1998)。

四、石斑魚虹彩病毒感染魚類的病理及外觀

被石斑魚虹彩病毒感染的魚類會出現以下的情況:

(一)、在外觀行為上有體色變黑、食慾下降、明顯的消瘦現象及運動失調的情況

發生。

(二)、在病理解剖上出現造血組織、肝臟、脾臟和胰臟中局部壞死的病灶,因此 稱為(Epizootic haematopoietic necrosis virus;EHNV)(Langdon, 1987)。

病魚的腎臟、脾臟有腫大突出的情況,脾臟的紅髓、白髓、肝臟以及腎臟 產生局部性壞死,並且在肝臟細胞當中發現有病毒包涵體存在(Langdon, 1988)。另外,石斑魚虹彩病毒感染的魚隻死亡率會高達100%。

第二節、細胞凋亡、壞死與病毒之間的關係 一、病毒感染與宿主細胞凋亡

當病毒感染脊椎動物的宿主時,會因病毒的複製與病毒顆粒的增殖,而引發宿主一 連串的免疫反應。在病毒引發的先天性免疫反應中,包括了許多的Cytokine,例如:TNF、

INF等等,這些蛋白質可以引發一連串的訊號,而引起細胞的死亡(Helena, 1999.)。

細胞的免疫反應,在病毒感染時扮演很重要的角色;研究指出,經由先天性免疫反 應所造成的細胞凋亡,可用來做為抵抗病毒感染的第一線防禦。其原因如下:

(19)

(一)、細胞凋亡在早期發生,可藉由活化內生性的Non-lysosomal endonuclease來 摧毀病毒。

(二)、當細胞凋亡發生後,被細胞膜包覆住的細胞碎片,會引發巨噬細胞的吞噬

(Cluston, 1985)。在某些病毒感染的細胞中,誘發細胞的死亡可以限制病 毒的生產,甚至是降低病毒在宿主中的感染能力,因此有許多的感染動物的 病毒,都會透過抵抗細胞凋亡讓本身的複製增加。

二、細胞壞死與細胞凋亡介紹

細胞死亡之方式大致可分為二大類,細胞壞死(Necrosis)及細胞凋亡(Apoptosis):

(一) 、細胞壞死(Necrosis):

常見於一些急性的物理性或化學性的傷害,進而造成細胞質與胞器之間的 滲透壓不平衡,並導致細胞膜脹裂、細胞核和胞器瓦解、染色質被隨機切成不 規則的碎片、細胞內容物釋出,會誘發血液內淋巴球清除此類細胞碎片,因而 引發一連串的細胞發炎反應,最後導致整個區域的細胞壞死(Kerr, 1995;Guido et, 1998)。

(二) 、細胞凋亡(Apoptosis):

又稱為程式性的細胞死亡(Program cell death),此作用在細胞的生長恆定 上,扮演相當重要的角色(Ellis, 1991),許多凋亡的細胞都有型態與生理上的共 同特徵(Wyllie, 1980),從基因體的角度上來觀察這些細胞型態獲生理上的特徵,

都源於自殺程式(Suicide program)的啟動,使得細胞內酵素被活化所呈現出來的 結果(Chinnayian, 1996)。

(20)

這些細胞凋亡的特徵包括了:細胞萎縮、染色質濃縮(Chromatin

condensation)、染色質在核中呈現邊緣化現象,細胞內的DNA被核酸內切酶以 180~200 bp為單位,切成小片段並可在DNA電泳膠上形成DNA規則片段化的階梯狀

(DNA ladder),以及凋亡小體(Apoptotic bodies)的產生(Brown, 1993; Samali, 1996)。

細胞凋亡的調控機制,主要是透過蛋白質降解來進行,因此對於細胞凋亡的進 行與否,細胞必須要有完善的機制來調控。細胞中有一群結構相近的蛋白質,稱為 Bcl-2 family,在細胞凋亡調控上扮演重要角色。這群蛋白質中,有些會抑制細胞凋 亡(Anti-apoptotic),如Bcl-2、Bcl-xl,有些則會促使細胞凋亡(Pro-apoptotic)的 發生,如Bax、Bak、Bid、Bim、Noxa、Puma 等。細胞在正常生長的情況下,抑 制細胞凋亡的蛋白質會發揮功能,而促進細胞凋亡的蛋白質則會受到抑制,當細胞 受到刺激而進行細胞凋亡時,抑制細胞凋亡的蛋白質會被抑制,而促進細胞凋亡的 蛋白質會開始活化而發揮功用,開啟一連串蛋白質的活化路徑,造成細胞凋亡。目 前已知的細胞凋亡路徑有:

1、 外在路徑 (Extrinsic pathway)

當細胞的死亡接受器(Death receptor)接受死亡訊號(Death signal)的刺激,

而活化Pro-caspases 3、Pro-caspases 8、Pro-caspases 9 酵素,使細胞發生細胞凋亡。

例如:Fas ligand 與 Fas receptor 結合並經由其 Death domain 使 Adaptor proteins

(FADD 和 TRADD)聚集,藉由 FADD 的 DED(Death effector domain)與 Caspase-8 結合形成DISC(Death inducing signaling complex)並促使 Caspase-8 活化(Boldin, 1996; Chinnaiyan, 1995;Hsu, 1995)。

2、 內在路徑(Intrinsic pathway)

此路徑也被稱為Caspase-dependent pathway,內在路徑是當細胞受到內生性因

(21)

子的刺激,例如:ROS(Reactive oxygen species)、鈣離子、以及 UV 光等,這些 內生性的因子會促使 Pro-apoptotic markers 的活化,此 Pro-apoptotic markers 包括 有:Cytochrome C、apoptosis inducing factor(AIF)以及 SMAC,這些 Pro-apoptotic markers 會自粒線體釋放到細胞質當中,其中 Cytochrome C 會與 Caspases 9 形成細 胞凋亡體(Apoptosome),而藉由 Caspase 9 與 Caspase 3 的活化可以促使下游的 Poly ADP-ribose polymerase(PARP)活化因而產生細胞凋亡現象(Liu, 2002)。

三、病毒感染引發宿主細胞凋亡及影響宿主細胞蛋白質表現

目前已有文獻指出,病毒僅利用本身的外鞘蛋白質(Capsid protein),即可令宿主 產生細胞凋亡,例如:登革熱病毒利用其外鞘蛋白質(Dengue virus capsid protein - DENVC)與人類的Death domin – Associated protein產生交互作用,並進一步的引發人類 細胞凋亡現象(Thawornchai, 2007)。另外,在西尼羅河病毒(West nile virus - WNV)

的研究中也發現,其病毒的外鞘蛋白質(WNV capsid - WNVCp)會引發藉由p53所調節 的細胞凋亡(Yang, 2008)。研究文獻中指出,感染魚類的神經壞死病毒(Nervous necrosis virus - NNV),該病毒所攜帶的α蛋白質會引發粒線體膜電位差(Mitochondrial membrane potential - MMP),進而誘發細胞凋亡(Chen, 2007;Wu, 2008)。

在病毒感染宿主因而引發宿主細胞凋亡的現象中,可以發現病毒往往藉由自身的蛋 白質,引發宿主細胞內某些目標蛋白質的過度表現或是抑制,最終達到令宿主細胞產生 細胞凋亡的目的。例如:2007年流感病毒(Influenza virus)的研究文獻中指出,當流感 病毒 CV-1 感染MDCK細胞株時,係藉由細胞內蛋白質Akt的訊號抑制,而引發細胞凋 亡現象(Oleg, 2007)。而病毒是否可以成功感染細胞,宿主細胞內的蛋白質亦扮演極 為重要之角色,例如:2002年SV40病毒的研究指出,Arf-1蛋白質是SV40是否能成功感 染宿主細胞的重要關鍵,當宿主細胞內的Arf-1蛋白質表現被抗體所抑制時,SV40病毒 便無法成功的感染宿主細胞(Richards, 2002)。

(22)

2008年的研究文獻中也指出,當Arf蛋白質的表現不受調節,則會引起細胞死亡的 情況(2008 ,Citterio)。

第三節、ADP-ribosylation factor 1

一、ADP-ribosylation factor 1 簡介與發現歷史

ADP-ribosylation factor 1 簡稱為 Arf-1,其分子量大約為 21kDa,屬於 Arf subfamily 的成員;Arf subfamily 包含了三種不同的蛋白質包括 Arf、arf like(Arls)、以及 Sars(Kahn, 2005)。Arf 是一個與 Ras 有關的 Small GTP binding protein super family。Small GTP binding protein 的 Super family 包括有 Ras、Rab、Rho、Ran、Arf 等等。這四大成員都會與 GTP 結合,且被GTP 所調控,又稱為 G 蛋白(G protein)。這類蛋白質的特性為,當蛋白質 與GTP 結合的時候會被活化(Activated),而相反地當結合的GTP 被水解為 GDP 時,

蛋白質將失去其生物活性。

Arf-1蛋白質的純化與功能,最早是在霍亂毒素的相關研究中被發現(Enomoto, 1980;Kahn, 1984),不久之後,Arf-1蛋白質亦被發現是一個GTP-binding protein(Kahn, 1986)。第一個定序Arf-1的研究指出,Arf-1的序列接近Ras蛋白質以及其他GTPases中 的G protein α subunit(Sewell, 1988)。在真核生物當中Arf-1蛋白質的序列,是有高度保 留性的(序列的保留性在人類與酵母菌當中大約是74%)。

二、ADP-ribosylation factor 1的功能與調控

Arf-1在生物體中的功能,主要是參與細胞內囊泡運送的過程(Vesicular trafficking pathway)。細胞內囊泡運送為真核細胞所特有表現的生物作用,當細胞要藉由內吞或是

(23)

分泌作用(Endocytic or secretory pathway),將蛋白質或脂質送入或送出細胞時,皆須藉 由囊泡運送的方式來進行。而ADP ribosylation factor 1(Arf-1)主要負責參與的運送路 徑是從高基氏體(Golgi complex)往內質網(Endoplasmic reticulum,ER),或是高基氏 體膜與膜之間的運送過程。

在細胞當中Arf-1的功能需要依賴許多的蛋白質,Arf-1-GTP之間的交互作用與 Guane nucleotide exchange factor ( GEFs ) 有 關 , GEFs 可 以 促 進 Arf-1-GTP 的 形 成

(Donaldson, 2000;Jackson, 2000)。GTPase activating protein(GAPs)是一個負向的調 節者,GAPs可以辨認Arf-1-GTP,並且引發GTP水解(Donaldson, 2000;Randazzo, 2000)。 另外Arf-1-GTP結合在Effecter protein上,可以調控許多Arf-1的相關生理功能,包括液泡 的外套蛋白質(Coat protein),以及脂質代謝的酵素。

當Arf-1 經由GTP Exchange Protein(GEP)的幫助,由GDP結合形式(GDP-bound form)轉變為GTP結形式(GTP-bound form)時,其蛋白質結構會發生改變,使其具有 附著在細胞膜上的能力。此時,細胞內待運送的蛋白質及細胞外,幫助形成囊泡的其他 蛋白質會逐漸聚集在細胞膜上,細胞膜型態會發生改變,形成與母體脫離的運送囊泡。

當囊泡運抵標的胞器以前,必須先將包裹在囊泡外的蛋白質除去,才能使囊泡順利地與 標的胞器的細胞膜進行融合作用,囊內的蛋白質也才能順利地進入標的胞器中。此時 Arf-1 的GTP 水解作用扮演著決定性的角色。當Arf-1藉由GTPase activating protein

(GAP)之幫助,使結合的GTP水解為GDP時,Arf-1蛋白質再次發生結構上的改變,使 其能夠脫離細胞膜,進而帶動其他囊泡上的蛋白質離開囊泡表面(Takai, 2001;

Kirchhausen, 1999)。

三、ADP-ribosylation factor 1與病毒之間的關係

2006年,在病毒與ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)的相關報告指出,腸病毒科中

(24)

的小核糖核酸病毒(Picornavirus),其病毒的3A蛋白質會藉由與Guanine nucleotide exchange factor(GEF)的結合,來抑制Arf-1的活性,進一步的抑制細胞中內質網到高 基氏體的運輸(Wessels, 2006)。另外,更有文獻顯示同為腸病毒科中的小兒麻痺病毒

(Poliovirus)、鼻病毒(Human rhinovirus- HRV)、腦心肌病毒(Encephalomyocarditis virus)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)與A型肝炎病毒(Hepatitis A virus),

病毒3A蛋白質透過同樣的機制,抑制自內質網到高基氏體的運輸(Wessels, 2006)。

惟,並非所有的病毒在感染宿主細胞後,都會進行宿主細胞中內質網到高基氏體的 運輸抑制。2005年在對猪瘟病毒(Swine fever virus)的研究當中指出,藉由持續性的表 現Arf-1蛋白質對於病毒的感染並無任何顯著的影響。這樣的結果顯示,猪瘟病毒在細胞 的運輸,並不需要Arf-1蛋白質的協助(Andreas, 2005)。

2002年,在SV40病毒的研究當中更發現,Arf-1蛋白質是SV40是否能成功感染宿主 細胞的重要關鍵,當宿主細胞內的Arf-1蛋白質表現被抗體所抑制時,SV40病毒便無法 成功的感染宿主細胞。

四、ADP-ribosylation factor 與細胞凋亡之間的關係

Arf蛋白質與TNFα家族中的TRAIL-R1/DR4具有相關性,但詳細的作用機制目前仍 不清楚。可以確定的是,Arf蛋白質可能透過與TRAIL-R1/DR4的蛋白質交互作用,進一 步的引發細胞凋亡(Simova, 2008)。

2007年,在菸草鑲嵌病毒研究發現,經由菸草鑲嵌病毒感染,會導致植物產生 Hypersensitive response(HR)作用;HR cell death屬於一種程式性的細胞死亡,類似於 動物細胞的細胞凋亡現象,而藉由抑制arf蛋白質,可以降低病毒感染植物時,植物所產 生的HR作用(Lee, 2007)。

(25)

第二章 研究目的

台灣首次的iridovirus 感染病症,是自在東南亞進口的金目鱸所發生的。石斑魚虹 彩病毒在2008 年的研究中證實病毒會在感染金目鱸細胞株後,短時間內(三小時)引 發金目鱸細胞株的細胞凋亡,但其引發細胞凋亡的機制仍不清楚(Lai, 2008)。

病毒在感染細胞時,為讓自我的複製可以順利進行,經常會分泌出一些抗細胞凋亡 (anti-apoptosis)的病毒蛋白,或是誘發細胞內抗凋亡的蛋白質的表現。當細胞延緩凋亡的 同時,病毒就可以爭取時間進行本身的複製,以加速感染更多的細胞。因此研究病毒與 感染細胞產生凋亡的關係,將有助於釐清更多病毒感染宿主所引發的胞內相關機制。

本篇論文中利用蛋白質體學的方式,以二維電泳與質譜儀分析石斑魚虹彩病毒感染 金目鱸細胞株後,宿主細胞內蛋白質的表現量與蛋白質身分鑑定。進一步利用real-time PCR 的方式監控宿主細胞被病毒感染後,胞內被誘發蛋白質的基因表現量。另外亦將全 長蛋白質Arf-1 送入質體當中,分析其全長序列及進行種源比對。

最後希望藉由上述細胞內差異蛋白質的實驗分析,確實找出被病毒誘發的細胞內蛋 白質,進一步進行宿主細胞內細胞凋亡機制之研究。

(26)

第三章 實驗材料與儀器 一、 實驗材料

1.原核表現載體

pET-23a(ampicillin - resistant)

2.真核表現載體

pEGFP-N1(kanamycin - resistant)

pSecTaq4A(kanamycin - resistant)

3.菌種

E. coli:XL-10 Gold(tetracycline - resistant)

4 細胞株

金目鱸肌肉細胞株 Muscle cell line

5 實驗耗材

1.5 ml 離心管 (Viogene)

15 ml 離心管(Falcon®

(27)

50 ml 離心管 (Falcon®) 75T 培養瓶(Falcon®)

6 孔細胞培養盤(Falcon®)

24孔細胞培養盤(Falcon®)

ELISA plate(Nunc)

6. 實驗藥品 Agar(Bitek®) Agarose(J.T.Baker)

Alexa Fluor® 488 conjugated annexin V(Inviotrogen)

Ammonium Persulfate(USB)

Ampicillin(Sigma)

Bio-lyte 3-10(Bio-Rad®)

Bromophenol blue(Merck)

BSA(Sigma)

Calcium Chloride(J.T.Baker)

CHAPS(Sigma)

Chloroform(Merck)

Coomassie brilliant blue R-250(Merck)

Dithiothreitol(Merck)

(28)

DNA Ladder 1kb(Geneaid)

dNTP(Yeastern Biotech)

EDTA(J.T.Baker)

Ethanol (Merck)

Ethidium bromide(Merck)

Fetal bonvium serum, FBS (GibcoTM) Gel-MTM Kit(Viogene)

Glacial acetic acid (Sigma)

Glucose(Sigma)

Glycine(J.T.Baker)

Goat anti-mouse IgG-HRP(Cell Signaling)

Goat anti-rabbit IgG-HRP(Cell Signaling)

HEPES(Serva)

High-Range Rainbow Molecular Weight Markers(GE®) Iodoaceyamide(Bio-Rad®)

IPTG(Calbiochem®) Isopropanol(Sigma)

Kanamycin(Sigma)

LipofectamineTM 2000 reagent(Invitrogene)

(29)

Methanol(Mallinckrode)

Mini-MTM Plasmid DNA Extraction Kit(Viogene)

NaCl(Merck)

NaOH(Sigma)

NEB buffer 2(New England BioLabs®inc.)

NEB buffer 4(New England BioLabs®inc.)

NEB buffer 1(New England BioLabs®inc.)

Oligo dT(Invitrogen)

Penicillin(GibcoTM

PBS Dulbecc’s Phosphate-Buffered Saline(GibcoTM) PCR buffer(Bioman)

PCR-MTM Clean up Kit(Viogene)

Phenol(Amresco®

Potassium acetate(Merck)

Protein binding dye (Bio-Rad®)

PVDF membrane(BioTraceTM

Restric enzyme (Roche、New England BioLabs®inc.) RT buffer(Invitrogen)

RTase(Invitrogen)

(30)

RNase A(Sigma)

Sliver nitrate(Merck)

Sodium chloride(Merck)

Sodium dodecyl sulfate(Sigma)

Sodium hydroxide(Riedel-Dehaen)

Sodium phosphate(J.T.Baker)

Sodium pyruvate(Sigma)

Spermin(Sigma)

Stable Peroxide Substrate Buffer(Pierce)

Streptomycin(GibcoTM

T4 DNA ligase(Roche、. NEW ENGLAND BioLabs®inc) TAE buffer(UniRegion Bio-Tech)

Taq DNA polymerase(Bioman)

Tetracycline(Sigma)

Tetra-methy-lethytenediamine(Merck)

Thiourea(Sigma)

Tris-base(J.T.Baker)

Tris-HCl(J.T.Baker)

Tryptone(Bio Basic Inc.)

(31)

Tween-20(J.T.Baker)

Trypsin(GibcoTM) Urea(Bio-Rad®)

Yeast extract(BactoTM) β-mercaptoethanol(Merck)

脫脂牛奶(安佳)

二、 實驗儀器

高速冷凍離心機(KUBOTA 6500) 數位顯示乾浴器(Basic Life BL3001)

聚合酶鏈鎖反應器(Bio-Rad® MyCyclerTM Thermal Cycler)

水平電泳槽(Major Science Shorter Mini Gel System)

紫外線照射儀(BioDoc-ItTM System)

微量盤分析儀(Molecular Devices Corp.SpectraMax M2)

紫外光可見光分光光譜儀(Thermo HeλIOSβ)

低溫迴轉式震盪培養箱(裕德LM-575R)

高速微量離心機(Kuobota Corporatuon 3300)

電磁加熱攪拌器(Lab Tech Lotplate Stirrer LMS-1003)

蛋白質電泳槽(Bio-Rad®)

電源供應器(Major Science)

(32)

震盪器5100 Spire Mixer(Pantech)

震盪器Labnet VX-100 Vortex Mixer(GenePure)

電子天平(Mettler Toledo PB602-S)

鑄模槽Short Mini Horizontal Gel Electrophoresis System(Major Science)

全波段長紫外光可見光分光光譜儀(Thermo Genesys 10)

轉漬槽(Bio-Rad®)

數位迴轉式震盪器(Yih Der TS-500D)

倒立式顯微鏡(Olympus CKX41)

恆溫水浴槽(Firstek B206)

低速離心機(Tomy LC-220)

一維電泳protean IEF cell System (Bio-Rad®)

(33)

第四章 材料與方法 第一節 石斑魚虹彩病毒的純化

一、金目鱸肌肉細胞株繼代培養

將金目鱸肌肉細胞細胞株培養在75 T培養瓶(BD Falcon)當中,以含 10% FBS-L-15

(Fetal Bovine Serum)、penicillin-streptomycin(Penicillin G sodium, 100 units/ml;

Streptomycin sulfate, 100 μg/ml in 0.85% Saline)及 2 mM L-glutamine的 Leibovitzs L-15 medium(10%胎牛血清的L-15 培養液)培養於 28°C。

待細胞長滿吸除培養瓶中原有培養液,以滅菌過之PBS 清洗 1 次後,加入 1 ml 的 0.25 %胰蛋白酶溶液作用。至細胞完全懸浮後,加入適量含血清之培養液中止胰蛋白酶 活性,並將細胞打散。留下1/3 的細胞液於原培養瓶內並補足培養液。

二、金目鱸肌肉細胞株冷凍保存

當細胞長滿時,吸除培養瓶中原有之培養液,並以滅菌過之PBS 清洗 1 次後,以胰 蛋白酶作用使細胞懸浮,再加入含血清培養液,打散細胞並計數細胞,將細胞懸浮液收 至15 ml 離心管中,並以 180 x g 離心 5 分鐘。

抽吸上清液後,將含有10% DMSO(Dimethyl sulfoxide)之細胞冷凍培養液加入使 細胞再懸浮,其細胞液最終濃度為每ml含有 1 X 106個金目鱸肌肉細胞。將此細胞懸浮 液每1 ml加入 1 個冷凍小管(Freezing vial)當中,旋緊外蓋後,放置於 4℃冰箱 20 分 鐘、-20℃ 30 分鐘、-70℃靜置隔夜,最後再移入液態氮桶中長期保存。

三、石斑魚虹彩病毒(GIV)增殖

(34)

石斑魚腎臟細胞株培養於175 T培養瓶中,將細胞繼代並增殖至 9 盒 175 T 培養瓶,

待細胞長至八分滿以上,即可進行病毒接種。將病毒以MOI(Multiplicity of infection)=

1 X 10-2接種至金目鱸肌肉細胞細胞株,且將培養液換成2 % FBS-L-15 培養液,28°C培 養7 天,待CPE現象完全後即可收集。

四、石斑魚虹彩病毒(GIV)力價測定

石斑魚腎臟細胞細胞株培養於24 孔細胞培養盤(Nunc)中,每個孔中的細胞數為 1 X 105個,28°C培養隔夜,待細胞貼附於盤上,形成約 50%滿之單層細胞後,即可進行 病毒力價測定。

實驗室的石斑魚虹彩病毒(GIV)病毒株是在 2001 年自罹病石斑魚中分離而來(Lai et al., 2001),首先將待測病毒液以 2 % FBS-L-15 培養液製作 10 倍連續稀釋液使病毒稀 釋為1 X 10-1-1 X 10-10濃度,接著將24 孔細胞培養盤中的培養液吸除,以PBS 清洗並 依序加入不同稀釋倍數的病毒液各1 ml;另外對照組加入 1 ml不含病毒的 2 % FBS-L-15 培養液,培養於28°C。以倒立顯微鏡每日觀察其細胞病變效應(Cytopathic effect, CPE)

情況,連續7 天並紀錄。

第二節 石斑魚虹彩病毒感染金目鱸肌肉細胞之二維電泳 一、金目鱸肌肉細胞蛋白質萃取:

首先將培養在10 公分細胞培養盤的金目鱸肌肉細胞刮下,收集至 15ml 離心管當 中,細胞於室溫以180 x g 離心 5 分鐘,再以 PBS(Dulbecc’s Phosphate-Buffered Saline)

沖洗細胞一次,於室溫180 x g 離心 5 分鐘。去除上清液後加入 500 μl 的 lysis buffer (7 M

(35)

urea、2 M thiourea、4%CHAPS、1% DTT、0.2% Biolyte 3-10、10 mM Spermin),震盪 2 分鐘(震盪器 Pantech 5100 Spire Mixer)。於室溫下以18000 x g 高速微量離心機(Kubota corporatuon 3300)離心 10 分鐘,以除去核酸及細胞碎片,取上清液並且加入 1 ml 的 95

%酒精進行蛋白質沉澱12-16 個小時,再以 18000 x g 於 4℃離心去除上清液,再加入 100 μl 的 lysis buffer 進行樣品的回溶。

二、金目鱸肌肉細胞細胞的蛋白質定量

使用Bio-Rad Protein Assay(Bradford, M. 1976),將不同量 BSA(Sigma) 溶於 159μl 去離子水溶液中,配成已知濃度 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 μg / μl 之標準溶液。另取待測 萃取之細胞蛋白質溶液1 μl 溶於 159 μl 去離子水溶液當中,同時加入 40 μl 蛋白質染劑 (Protein binding dye)(Bio-Rad)混合均勻,室溫等待 2 分鐘後,以 OD595 nm 可見光波 長測其吸光值,再以內插法推算病毒蛋白質濃度。

三、一維蛋白質等電點聚焦 (Isoelectric focusing, IEF):

本實驗第一維的IEF 電泳系統採用 protean IEF cell System (Bio-Rad)。首先將所需蛋 白質溶入125 μl 的復水緩衝液中(Rhydration buffer, containing 7 M Urea, 2 M Thiourea, 4

% CHAPS, 1 % DTT, 0.2 % Biolyte 3-10, 0.005 %BPB),於室溫下放置一小時使蛋白 質全部溶解。一維IEF 電泳使用具 pH 梯度的 7 公分 IPG 電泳膠條(Immobilized pH gradient strip),本實驗以 pH 3-10 看總體蛋白質表現,再利用 pH 4-7 的 IPG strip 進一 步分離酸性區的蛋白質。

將樣品放入製載體(Holder)中,置入 IPG 電泳膠條,使原本乾燥的電泳膠條復水

(Rehydration)並將蛋白質吸入膠條的孔洞中,在 Holder 上加一層覆蓋油(Mineral oil)

(36)

以減少反應過程中水的蒸發及尿素結晶。最後將Holder 放置在室溫下進行水合反應 12-16 小時。將復水完成後的 IPG strip 放入 Strip holder 上進行第一維 IEF 電泳。聚焦過 程以定溫(20℃)、低電流(50 μA)的狀態進行;所設定的系統步驟為: 300 Vhr(500 V × 2 hr),1000 Vhr(1000 V × 1 hr),4,000 Vhr(4000 V × 2 hr),500 Vhr(500 V × 2.5 hr)

四、二維膠體電泳 (2-dimentional gel electrophoresis)

(一)、蛋白質電泳製作

首先將玻璃片與間隔條組裝於鑄膠器上,置於水平台上。配製12% 的分離膠體

(Separating gel),注意避免產生氣泡,將膠體溶液緩緩注入玻璃片之間,並在玻璃片之 間插入齒模,同樣避免氣泡產生,待膠體凝固之後緩緩拔出齒模,並用去離子水將齒模 之間的殘膠沖淨。將完成的膠體裝置於電極板,並置於電泳槽中,加入1X SDS 電泳緩 衝液(25 mM Tris-HCl pH8.3, 250 mM Glycine, 0.1% SDS)。

(二)、IPG strip 平衡

將第一維的IPG 電泳膠條取出,以平衡緩衝液(Equilibration buffer, 1.5 M Tris-Cl/pH 8.8, 6 M Urea, 30% Glycerol, 2% SDS)調整膠條的環境至 SDS-PAGE 電泳可分析狀態。

過程如下:配製2 ml 平衡緩衝液,平衡緩衝液內含 0.02 g DTT 粉末,將配置好的 混和液加入玻璃管當中,再放入第一維的IPG 電泳膠條,橫放玻璃管,使電泳膠條可 以充分浸在平衡緩衝液中,利用數位迴轉式震盪器(Yih Der TS-500D)震盪 20 分鐘,

20 分鐘後移入另一個玻璃管,玻璃管內含 2 ml 平衡緩衝液以及 0.04 g 的 IAA,利用數 位迴轉式震盪器(Yih Der TS-500D)震盪 20 分鐘,取出 IPG 電泳膠條橫放入先前已鑄

(37)

好蛋白質電泳膠內,注意下緣的界面不可以有氣泡,最後以agarose 溶液(0.5%

agarose/SDS electrophoresis buffer)將 IPG 電泳膠條位置上方的空隙封住。第二維的蛋白 質電泳使用Bio-Rad 的電泳系統,電流值設定 50 mA,30 分鐘後調整為 135 mA,電泳 時間1.5 小時。電泳結束後小心將蛋白質電泳膠片取出,加入 Coomassie Brilliant Blue staining solution(0.025%(w/v)Coomassie brilliant blue R-250, 40%(v/v)Methanol, 7%

(v/v)glacial acetic acid)染劑搖晃染色 60 分鐘,接下來將染色劑倒出,加入退染液(50

%(v/v)Methanol, 10%(v/v)Glacial acetic acid)搖晃進行退染,直到各蛋白質帶均能 清楚顯示,即可倒去退染液並加入清水使其回復原本大小。

五、胰蛋白酵素降解反應(Trypsin digestion)

(一)、切取膠點

將欲分析的蛋白質點切成小片段,並且放入 1.5 ml微量離心管(Microcentrifuge tube)中。微量離心管須先用去離子水以及甲醇清洗。接下來加入含有 50% CAN(acetone nitritie)的 200 μl 25 mM NH4HCO3 並且震盪 10 分鐘,去除上清液。重複以上步驟一到 兩次。樣品放入Speed Vac當中抽氣 30 分鐘,即可將樣品風乾。

(二)、還原與鹼化

樣品加入40 μl的含有 10 mM DTT的 25 mM NH4HCO3中,放入56℃的培養箱中 1 小時,進行還原。接下來將上清液去除,在室溫下將樣品放冷。加入同樣體積含有55 mM Iodoacetamide的 25 mM NH4HCO3,同樣放入56℃的培養箱中 1 小時,進行鹼化,去除 上清液,並在室溫下將樣品放冷。接下來加入100 μl的 25 mM NH4HCO3 震盪10 分鐘,

移除上清液。最後加入100 μl的 25 mM 含 50% ACN的NH4HCO3,震盪5 分鐘,移除上

(38)

清液。完成後將樣品放入Speed Vac中抽氣乾燥。

(三)、胰蛋白酵素降解反應(trypsin digestion)

將25 μl的胰蛋白酵素,(酵素的濃度是 12.5 ng / μl溶在 25 mM NH4HCO3 當中)進 入乾燥的膠點中,等待15 分鐘,直到膠體完全吸入酵素溶夜,移除剩餘液體並將其丟 棄。加入少量體積的25 mM NH4HCO3令整個膠體浸入Trypsin當中,並且將樣品放入 37℃

培養箱中反應12 到 16 個小時。反應結束後,加入 30 ul的 5% Formic acid in 50 % ACN 在室溫下靜置60 分鐘。將上清液取出並且放入 1.5 ml乾淨的微量離心管當中。剩下的 膠體再加入15 μl 5% Formic acid靜置在室溫下 10 分鐘,隨後加入 15 μl的 100% ACN靜 置60 分鐘。將兩個上清液取出混合在一起,並且利用Speed Vac抽氣乾燥。最後將乾燥 的膠體加入10-20 μl 0.1% Formic acid。樣品即可以LC-MS/MS進行蛋白質身分鑑定。

六、液相層析串接式質譜儀鑑定蛋白質

使用質譜儀為液相層析串接式質譜儀(LC-MS/MS, Finnigan LTQ DUO,

ThermoQuest),軟體為Mascot。液相層析儀管柱尺寸為內部粒子 5 μm,孔洞大小 300 Å,

長度15 cm,流速設定為 0.1 ml / min,使用沖湜液 A 液為 0.1% Formic acid,B 液為 100

% Acetonitrile,梯度設定為 A 液先流洗 10 分鐘再由 99%到 20%,B 液由第 10 分鐘開 始,由1%到 80%,全程共 200 分鐘,Sample loop 設定為 20 μl。質譜儀參數設定掃描範 圍為200-2000 m/z,離子源 250℃,噴口電壓 4,500 伏特。進行比對的資料庫選用的是 Zebrafish 資料庫。

(39)

第三節 石斑魚虹彩病毒誘發金目鱸肌肉細胞內蛋白質增減之分析 一、金目鱸肌肉細胞蛋白質萃取:

首先將培養在 10 公分 Dish 的金目鱸肌肉細胞利用細胞刮棒刮下。收集至 15ml 離心管當中,細胞於室溫以180 x g 離心 5 分鐘,再以 PBS(Dulbecc’s Phosphate-Buffered Saline)沖洗細胞一次,於室溫 180 x g 離心 5 分鐘。除去上清液後加入 500 μl 的 Lysis buffer (7 M urea、2 M thiourea、4%CHAPS、1% DTT、0.2% biolyte 3-10、10 mM spermin),

震盪2 分鐘(震盪器 Pantech 5100 Spire Mixer)。於室溫下以 18000 x g 高速微量離心機 (Kubota corporatuon 3300)離心 10 分鐘,以除去核酸及細胞碎片,取上清液並且加入 1 ml 的95%酒精進行蛋白質沉澱 12-16 個小時。之後再以 18000 x g,於 4℃離心,去除上清 液,再加入100 μl 的 Lysis buffer 進行樣品的回溶。

二、金目鱸肌肉細胞細胞的蛋白質定量

使用 Bio-Rad Protein Assay(Bradford, M. 1976),將不同量 BSA(Sigma) 溶 於159μl 去離子水溶液中,配成已知濃度 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 μg / μl 之標準溶液。

另將待測純化之病毒液1 μl 溶於 159 μl 去離子水溶液中。同時加入 40 μl 蛋白質染劑 (protein binding dye)(Bio-Rad®)混合均勻,室溫等待 2 分鐘後,以 OD 595 nm 可見光 波長測其吸光值,再以內插法推算細胞蛋白質濃度。

三、SDS-PAGE 電泳

首先將玻璃片與間隔條組裝於鑄膠器上,置於水平台上。配製12% 的分離膠體

(Separating gel),注意避免產生氣泡,將膠體溶液緩緩注入玻璃片之間,注入高度至玻 璃片2/3 高度左右,再於膠體上層注入去離子水將氣泡趕出,待 30 分鐘膠體凝固之後配

(40)

製焦集膠體(Stacking gel),倒掉上層去離子水後將焦集膠體溶液注入分離膠體上,並 在玻璃片之間插入齒模,同樣避免氣泡產生,待膠體凝固之後緩緩拔出齒模,將完成的 膠體裝置於電極板並置於電泳槽中,加入1X SDS 電泳緩衝液(25 mM Tris-HCl pH 8.3,250 mM Glycine,0.1% SDS)。

將純化出的細胞樣品取10-20 μl 加入等體積的 2X SDS gel-loading buffer(100 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Dithiothreitol(DTT),4% SDS(electrophoresis grade), 0.2%

Bromophenol blue, 20%Glycerol 及 1/10 體積的 2-Mercaptoethanol 混合均勻,以 100℃沸 水煮5 分鐘,冷卻後以微量吸管小心注入於樣品槽,留一樣品槽注入 5 μl Prestained protein ladder(GE® High-Range Rainbow Molecular Weight Markers),接上電源供應器後 以50 V 進行電泳,待染料移動至分離膠體後,提高電壓至 125 V,待染料移動至玻璃片 底緣時,即可停止電泳並取下膠體裝置,小心撬開玻璃片後取下膠體置於容器中,加入 Coomassie Brilliant Blue staining solution(0.025%(w/v)Coomassie brilliant blue R-250, 40%(v/v)Methanol, 7%(v/v)Acetic acid)染劑搖晃染色 60 分鐘後,將染色劑倒出,

膠體以清水略做清洗後,加入退染液(50%(v/v)Methanol, 10%(v/v)Acetic acid)搖 晃進行退染,直到各蛋白質均能清楚顯示,倒去退染液加入清水使膠體回復原來大小 後,使用玻璃紙固定在玻璃板上12-16 小時後,即可觀察電泳結果。

四、轉印(Electroblotting)

製作兩片12% SDS-PAGE 膠體,將重組蛋白與純化病毒進行蛋白質電泳,電泳完 畢後,將玻璃片撬開,一片膠體置入Coomassie Brilliant Blue staining

solution 染色,另一片進行西方墨點法,首先在解剖盤中注滿轉印緩衝液(25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 200 mM Glycine, 20% Methanol),將海棉置於卡夾上,浸入解剖盤,在 海綿上疊一張3 MM 濾紙,接著將膠體置於濾紙正中央,裁切一片略大於膠體的 PVDF

(41)

(Polyvinylidene fluoride)轉印膜(BioTrace TM),以甲醇(100% methanol)預先浸濕 後以轉印緩衝液平衡,再平鋪於膠體之上,接著在PVDF 膜上依序放置濾紙及海綿,

再合上卡夾固定後置入轉印槽(Bio-Rad),電場內填充轉印緩衝液後,開啟電源,以400 mA 轉印一小時。

五、西方墨點法(Western blot)

轉印完成後取出PVDF 膜以 5%脫脂奶粉的 PBST(Blocking solution)於 4℃進行填 塞12-16 小時。倒掉 Blocking solution,接著將抗人類的專一性第一抗體利用 0.1%PBST 以1,000 倍稀釋,於室溫振盪器 150 rpm 反應一小時。移除第一抗體後,以 0.1%PBST 進 行清洗三次,每次10 分鐘,接下來利用 0.1%PBST 做 2,000 倍稀釋之 Goat anti-mouse IgG-AP 作為第二抗體,於室溫震盪 150 rpm 反應一小時,以 0.1 % PBST 進行清洗三 次,每次10 分鐘,第二抗體連接 HRP 者加入以 DAB 呈色液(Pierce)呈色液浸潤轉 印膜,於室溫下避光反應至呈色(約1-20 分鐘以內),倒掉受質液後,將轉印膜以清水 清洗終止反應,晾乾後即可收藏保存。

第四節、在金目鱸肌肉細胞中表現重組蛋白質 ADP-ribosylation factor 1(Arf-1) 一、ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)基因選殖

(一)、聚合酵素連鎖反應(PCR)

聚合酵素連鎖反應(PCR),PCR反應液成分為:Template DNA 1 pg、Primers (10 μM each ) 1 μl、dNTP (10 mM ) 1 μl、10 x reaction buffer 5 μl、Taq polymerase (5 U/μl) 1 μl、

Deionized H2O;PCR 反應的溫度條件 Denature at 95℃ for 5 minutes、Denature at 95℃

for 45 seconds、Anneal at 55℃ for 45 seconds、Elongation at 72℃ for 45 seconds、Final

(42)

extension at 72℃for 5 minutes溫度梯度自Denature到Elongation,重複四十個週期。

(二)、純化PCR 產物

純化PCR產物,將PCR產物DNA以PCR-M Clean Up System kit (VIOGEN)純化:首 先加入500 μl PX Buffer,將溶液移置PCR-MTM管柱,以18000 g離心 1 分鐘,移棄流出 液,加入500 μl WF Buffer清洗PCR-MTM管柱,18000 g離心 1 分鐘,移棄流出液,加入 700 μl WS Buffer清洗PCR-MTM管柱,以18000 g離心 1 分鐘,移棄流出液,接著再離心 2 分鐘徹底除去殘留酒精。將PCR-MTM管柱置於新的微量離心管,加入30~50 μl 滅菌二 次水,靜置5 分鐘,以 18000 x g離心 2 分鐘,最後將含有質體溶液的微量離心管置於 -20℃冰箱保存。

二、質體剪切(Digestion)及接合(Ligation)反應

(一)、質體剪切(Digestion)反應

利用限制內切酶(Restriction enzyme)進行質體切割,參考使用手冊(New

England Biolabs Catalog),確認 10 x Buffer 的使用種類與適當切割作用溫度。Restriction enzyme digestion 反應液成分: Plasmid DNA 5μg、Restriction enzyme 0.3 μl、10x buffer 3 μl、Deionized H2O,37℃恆溫水浴槽約反應 8-10 小時。

(二)、質體接合反應

Ligation 反應液成分: Vector DNA(pSecTaq4A) 1 μg、Insert DNA 5 μg、10x ligation buffer 1 μl、Ligase 1 μl、Deionized H2O,4℃約反應 12-16 小時。

(43)

三、勝任細胞之製備

由固體培養基中挑取一個單一菌落的大腸桿菌BL21(DE3) pLysE,接種於 3 ml含 Tetracycline12.5 μg/ml 的LB 液體培養基,於 37℃,150 rpm 震盪培養 12-16 小時,將 1 ml的菌液加入滅過菌並含有 100 ml LB的錐型瓶內,繼續以 37℃,150 rpm旋轉培養,直 至OD 600 值介於 0.3-0.4 之間(約 3-4 小時),接著將菌液置於冰上,冰浴 10 分鐘,分 裝到新的50 ml 離心管,再以 4℃,300 x g 離心 10 分鐘後,去除上清液,將沉澱之菌 體懸浮於5 ml冰冷的 0.1 M CaCl2,然後靜置在冰上10 分鐘。

同樣用4℃,300 x g離心 10 分鐘,之後去除上清液,重複上述動作一次,最後將沉 澱之細菌懸浮於4 ml 含 15% Glycerol 冰冷的 0.1 M CaCl2,置於4℃冰上隔夜後,每 200 μl分裝於微量離心管中,保存在-80℃冰箱中,此即為勝任細胞,可供載體轉形作用。

四、轉形作用

將製備好的勝任細胞200 μl 取出置於冰上解凍,再與 3 μl Plasmid DNA 充分混合均 勻後,置於冰上45 分鐘,接著移至 42℃水浴作用 90 秒(Heat shock),再迅速移回冰 浴作用5 分鐘後,加入 1 ml 之 LB 培養液,於 37℃下培養 30 分鐘後,高速離心 30 秒,

然後倒掉上清液至菌液剩約200 μl。最後將菌液塗在含有 Kanamycine(100 μg/ml)和 Tetracycline 的 LB plate(40 μg/ml)的培養基上,隔夜培養,以進行重組蛋白之誘導表 現。

五、小量質體DNA 的抽取

取1ml 菌液至微量離心管中,2200 x g 離心 1 分鐘,倒掉上清液,加入 100 μl 冰的 SolutionⅠ,將菌震盪懸浮均勻,再加入 200 μl 的 SolutionⅡ,上下輕搖使其混合均勻,

(44)

加入150 μl 的 Solution Ⅲ,同樣地上下輕搖來回 6 次使其混合均勻,此時可看見白色物 質析出。

冰上靜置3 分鐘後以 18000 x g 離心 10 分鐘;將上清液吸出至另一個新的微量離心 管中,加入等體積的Phenol/chloroform 劇烈震盪,以 18000 x g 離心 10 分鐘再次沉澱蛋 白質;吸出上清液至另一個新的微量離心管中,加1ml 的酒精後劇烈震盪,以 18000 x g 離心10 分鐘;吸出上清廢液。

於室溫下風乾殘留的酒精,最後加入50 μl的ddH2O回溶質體DNA,保存於-20℃備 用。

第五節、即時定量 PCR(realtime PCR)

本試驗使用相對定量的方式來比較試驗組與對照組之間基因表現量的差別,使用的 引子分別從Initiation factor 4A 1B (eIF4A1B)、Proteasome 20S、ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)、Ribose 5 phosphate isomerase(RPIA)、Phosphoglycerate mutase 1、Tyrosine Hydroxylase(TH)、RAN binding protein 1、Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1)與 β-actin 的基因序列中選取,β-actin 基因乃是要當作基因表現量的基準值,可測得實驗組與對照 組之間基因表現量的差別。β-actin 的基因序列是從美國國家衛生研究院 NCBI 網站搜 尋而來。兩組引子取得後用滅菌水稀釋,將引子濃度調整成1 μM。 realtime PCR 反應 使用Applied Biosystems SYBR green PCR Master Mix,取 2.5 μl cDNA 加到 realtime PCR 反應管(Applied Biosystems Optical Tubes)內,並加入 19.5 μl SYBR green PCR Master Mix、reverse primer 與 forward primer 各 1.5 μl,之後蓋上反應蓋(Applied Biosystems Optical Caps),置於即時定量聚合酶連鎖反應器(7300 Real-Time PCR System, Applied Biosystems, U.S.A.),反應條件為 94℃ 10 分鐘,進入 40 次的循環(94℃ 30 秒→60℃

1 分鐘),之後進行 Melting Curve(Dissociation curve)分析,此分析系統可藉由溫度的 緩慢上升,產生雙股DNA 裂解與結合的反應,藉此得知產物的純淨度(Degree of

(45)

purity),分析反應產物是否為單一產物或有其他片段干擾。完成後便可取得反應管內的 螢光信號到達設定的閥值時所經歷的循環數- Ct(Threshold cycle)值,之後利用下列公 式計算試驗組與對照組的相對訂量比值。

1. △CtA=(對照組 c-mos 基因表現量 Ct 值)-(對照組 β-actin 基因表現量 Ct 值)

2. △CtB=(試驗組 c-mos 基因表現量 Ct 值)-(試驗組 β-actin 基因表現量 Ct 值)

3. △△Ct=△CtA-△CtB 4. ratio=2△△Ct

最後所得之2△△Ct 即是相對定量的比值。

(46)

第五章、結果

第一節、鑑定石斑魚虹彩病毒感染金目鱸肌肉細胞,胞內表現量上升之蛋白質

GIV 感染金目鱸肌肉細胞株約在 45 分鐘會開始出現細胞病理效應(CPE),在感染 後的2 小時後細胞開始自培養皿上脫落死亡,經由 Annexin Ⅴ、TUNEL、Hoechst 33258、

DNA ladder 的檢測,發現死亡的金目鱸肌肉細胞為細胞凋亡。為了解細胞被病毒感染後 短時間即產生細胞凋亡的原因,及其感染後胞內蛋白質與基因表現量改變情況,利用蛋 白質體學方式進行細胞內蛋白質分析,首先使用二維電泳觀察細胞感染前後的總蛋白質 表現量,接下來利用液相層析串聯質譜儀(Liquid chromatography/tandem mass

spectrometry - LC-MS/MS)鑑定出表現量有差異的蛋白質。

一、以二維電泳分析金目鱸肌肉細胞進行病毒感染時之蛋白質表現量差異

以pH 3-10 的 IPG strip 與 12%的 SDS PAGE 的二維電泳,以及銀染色(Silver stain)

的染色方式,觀察金目鱸肌肉細胞在有無病毒感染,與不同病毒感染後時間點時細胞內 總蛋白質表現量,結果發現金目鱸肌肉細胞蛋白質,大部分集中在pH 4-7 與高分子量 的位置(圖一)。接下來即利用pH 4-7 與 10%的 SDS 的二維電泳,以及藍染(Coomassie blue)的染色方式,觀察金目鱸肌肉細胞在有無病毒感染,與不同病毒感染後時間點,

細胞內大部分蛋白質表現量。觀察發現在病毒感染2.5 個小時後,有 8 個蛋白質點的表 現量有顯著上升的情況(圖二)。

二、利用液相層析串聯質譜儀(LC-MS/MS)鑑定蛋白質身份

將有顯著變化的8 個蛋白質點挖下,並且利用液相層析串聯質譜儀進行蛋白質身份 鑑定分析,接下來再利用MASCOT 軟體以及斑馬魚的蛋白質資料庫進行蛋白質身份的

(47)

比對,質譜數據顯示鑑定出的蛋白質身份如下(表一): 點1 :Initiation factor 4A 1B (eIF4A1B)

點2 : Proteasome 20S

點3 : ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)

點4 : Ribose 5 phosphate isomerase(RPIA)

點5 : Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1)

點6 : Tyrosine Hydroxylase(TH)

點7 : RAN binding protein 1

點8 : Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1)

第二節、病毒感染引發胞內大量表現蛋白質的 cDNA 選殖

引子的設計是利用人類與斑馬魚的序列做為模版,將較為保留的序列設計為引子,

進行PCR 的增幅,並將得到的部分序列進行序列分析(委託明欣生物科技公司進行),結 果如下:

點1: Initiation factor 4A 1B (eIF4A1B),以斑馬魚以及人類的 Initiation factor 4A 1B

(eIF4A1B)做為設計引子的參考,設計一段較具保留性的引子,並且利用金目 鱸肌肉細胞的cDNA 做為模板進行 PCR 增幅,由電泳圖的結果可以觀察到 PCR 增幅的結果,產物的大小為900 bp。將產物的核苷酸序列和胺基酸序列與斑馬 魚的核苷酸序列和胺基酸序列進行比對,核苷酸相似度有71.4%而胺基酸序列

(48)

的相似度為74.5%(圖三)。

點3: ADP-ribosylation factor 1(Arf-1),以斑馬魚以及人類的 ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)做為設計引子的參考,設計一段較具保留性的引子,並且利用金目鱸 肌肉細胞的cDNA 做為模板進行 PCR 增幅,由電泳圖的結果可以觀察到 PCR 增幅的結果,產物的大小為266 bp。將產物的核苷酸序列和胺基酸序列與斑馬 魚的核苷酸序列和胺基酸序列進行比對,核苷酸相似度有80.8%而胺基酸序列 的相似度為98.9%(圖四)。

點4: Ribose 5 phosphate isomerase(RPIA),以斑馬魚以及人類的 Ribose 5 phosphate isomerase(RPIA)做為設計引子的參考,設計一段較具保留性的引子,並且利 用金目鱸肌肉細胞的cDNA 做為模板進行 PCR 增幅,由電泳圖的結果可以觀 察到PCR 增幅的結果,產物的大小為 660 bp。將產物的核苷酸序列和胺基酸 序列與斑馬魚的核苷酸序列和胺基酸序列進行比對,核苷酸相似度有76%而胺 基酸序列的相似度為87.8%(圖五)。

點6: Tyrosine Hydroxylase(TH),以斑馬魚以及人類的 Tyrosine Hydroxylase(TH)

做為設計引子的參考,設計一段較具保留性的引子,並且利用金目鱸肌肉細胞 的cDNA 做為模板進行 PCR 增幅,由電泳圖的結果可以觀察到 PCR 增幅的結 果,產物的大小為579 bp。將產物的核苷酸序列和胺基酸序列與斑馬魚的核苷 酸序列和胺基酸序列進行比對,核苷酸相似度有76.3%而胺基酸序列的相似度 為83.4%(圖六)。

點8: Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1),以斑馬魚以及人類的 Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1)做為設計引子的參考,設計一段較具保留性的引子,並且 利用金目鱸肌肉細胞的cDNA 做為模板進行 PCR 增幅,由電泳圖的結果可以 觀察到PCR 增幅的結果,產物的大小為 254 bp。將產物的核苷酸序列和胺基

(49)

酸序列與斑馬魚的核苷酸序列和胺基酸序列進行比對,核苷酸相似度有69%而 胺基酸序列的相似度為62%(圖七)。

Proteasome 20S 與 RAN binding protein 1 兩個基因則因為序列較不具有保留性,因 此並未設計引子進行PCR 的增幅。

第三節、以 realtime-PCR 監控基因表現量變化

Realtime-PCR 的引子是利用 PCR 增幅並定序後結果重新設計,設計的產物約為 200bp,利用重新設計的引子進行 Realtime-PCR,由量化的結果可觀察得知各個感染時 間點的基因表現量,結果如下:

點 1: Initiation factor 4A 1B (eIF4A1B),使用 Realtime-PCR 監控不同感染後時 間點Initiation factor 4A 1B (eIF4A1B)的表現量,從量化圖(圖八)中可 清楚觀察到其表現量在感染病毒後有升高的情況,但並無隨著時間變化的情 況發生。

點 3: ADP-ribosylation factor 1(Arf-1),使用 Realtime-PCR 監控不同感染後時間 點ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)的表現量,從量化圖(圖九)中可清楚 觀察到其表現量在感染30 分鐘至 150 分鐘有逐漸升高的情況,感染 90 分鐘 基因的表現量相較於控制組相差3.4 倍,在感染 150 分鐘後基因表現量升高 至12 倍,最後在感染 180 分鐘基因表現量有下降趨勢,但其表現量仍較控 制組高約4.3 倍,顯示其基因表現量相較於控制組都有顯著的上升,並且有 隨時間點逐漸上升的情況。

點 4: Ribose 5 phosphate isomerase(RPIA),使用 Realtime-PCR 監控不同感染後

(50)

時間點Ribose 5 phosphate isomerase(RPIA)的表現量,從量化圖(圖十)

中可清楚觀察到其表現量在感染30-90 分鐘有升高的情況,90 分鐘的基因 表現量相較於控制組相差7 倍,在感染 150 分鐘後基因表現量則升至更高 的10 倍,最後在感染 180 分鐘基因表現量有下降趨勢,但其表現量仍較控 制組高約6 倍,顯示其基因表現量相較於控制組都有顯著的上升,並且有 隨時間點逐漸上升的情況。

點6: Tyrosine Hydroxylase(TH),使用 Realtime-PCR 監控不同感染後時間點 Tyrosine Hydroxylase(TH)的表現量,從量化圖(圖十一)中可清楚觀察到其表現量在 感染30 分鐘至 150 分鐘有逐漸升高的情況,在感染 60 分鐘基因的表現量相較 於控制組相差2.2 倍,在感染 150 分鐘後基因表現量升高至 4.3 倍,最後在感染 180 分鐘基因表現量有下降趨勢,但其表現量仍較控制組高約 3.4 倍,顯示其基 因表現量相較於控制組都有顯著的上升,並且有隨時間點逐漸上升的情況。

點8: Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1),使用 Realtime-PCR 監控不同感染後時間 點Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1)的表現量,從量化圖(圖十二)中可清 楚觀察到其表現量相較於控制組並未有很大的變化。

第四節、選殖 ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)基因

將上述部分定序的ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)序列為模板,再一次的設計含 有切位的引子,重新進行PCR 的增幅,結果如圖十三,可以得到一條 cDNA 約 710 個 的鹼基對的核苷酸。將這個全長並且只有一個讀碼框(ORF)的核苷酸序列選殖進入 pCMV-tag4 的載體(如圖十四)當中表現,利用抗生素進行篩選,並將成功表現 Arf-1 的 質體進行序列分析(委託明欣生物科技公司進行)結果如圖十五。

數據

Updating...

參考文獻

Updating...

相關主題 :