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大仁科技大學環境管理研究所

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Academic year: 2022

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(1)

大仁科技大學環境管理研究所 碩士學位論文

不同藻類釋出有機物及其萃取色素性質之差異

The released organic matter and the extracted pigments from different algal species

指 導 教 授 :邱 俊 彥 共同指導教授:賴 文 亮

研 究 生:陳 彥 宏

中 華 民 國 九十六 年 一 月

(2)

目 錄

圖目錄 ... IV 表目錄 ... VI 中文摘要 ... VII 英文摘要 ... IX 致謝 ... XII

壹、前言

... 1

一、研究緣起 ... 1

二、目的 ... 2

貳、文獻回顧

... 3

一、藻類之基本特性 ... 3

(一) 藻類的分類 ... 3

(二) 藻類的形態與特徵 ... 4

1. 小球藻 (Chlorella sp.) ... 4

2. 矽藻 (Navicula sp.) ... 5

3. 頂刺藻 (Chodatella sp.) ... 6

(三) 微藻成長與營養鹽的關係 ... 6

(四) 微藻成長與碳的關係 ... 6

(五) 微藻胞內葉綠素及色素關係 ... 6

二、藻類之觀察及監測 ... 9

(一) 顯微鏡技術 ... 9

(二) 光學分析技術 ... 14

(三) 高效液相層析 (high performance liquid chromatograph, HPLC) 層析技術 ... 20

三、藻體在環境監測之應用 ... 22

四、三鹵甲烷生成潛能 (trihalomethanes formation potential, THMFP) ... 22

參、研究架構、設備與分析方法 ... 24

一、研究流程之規劃 ... 24

二、藻類培養系統 ... 26

(3)

三、參數分析 ... 28

(一) 藻體之計數與觀察 ... 28

1. 螢光顯微鏡配合影像分析軟體計數法 ... 28

2. 光學顯微鏡配合鏡檢計數法 ... 29

3. 血球計數板計數法 ... 29

4. 電子顯微鏡 ... 30

(二) 色素之測定 ... 32

(三) 有機物參數 ... 35

(四) 螢光光譜圖 ... 38

肆、結果與討論 ... 40

一、以藻體自發性螢光特性進行藻類數目計算 ... 40

二、不同生長階段藻體與其釋出液之光譜圖 ... 46

(一)可見光光譜圖 ... 46

(二) 螢光光譜圖 ... 50

三、藻體釋出有機物性質對消毒副產物生成潛能之影響... 58

四、 不同藻類色素成分之差異 ... 69

伍、結論 ... 76

陸、建議 ... 78

參考文獻 ... 79

附錄一 ... 91

(4)

圖目錄

圖 2-1 色素化學結構式……...8

圖 2-2 螢光顯微鏡技術之原理………...10

圖 2-3 掃描式電子顯微鏡原理示意圖………...13

圖 3-1 研究架構流程圖………...25

圖 3-2 實驗藻類連續培養之反應器示意圖. ………...26

圖 3-3 血球計數板在 400 倍顯微鏡下之網格示意圖………..………....30

圖 3-4 電子顯微鏡樣本前處理示意圖..………...31

圖 3-5 色素混合標準品之液相層析圖………35

圖 4-1 藻體在顯微鏡之外觀觀測比較………...41

圖 4-2 不同藻類之 SEM 圖... ………...42

圖 4-3 藻體在培養期間之自發性螢光強度變化…...43

圖 4-4 藻體於實驗室批式培養之生長曲線圖………...……...46

圖 4-5 各藻類在不同生長階段在可見光波長 (600-760 nm) 之對應吸收 值…………...………...47

圖 4-6 三種藻類培養所需營養鹽之螢光光譜圖………...……….………50

圖 4-7 藻類適應期之螢光光譜圖………...……….………51

圖 4-8 藻類對數期之螢光光譜圖………...……….……52

圖 4-9 藻類穩定期之螢光光譜圖……...……….………53

(5)

圖 4-10 不同生長階段藻數變化與藻體之關係……….…56 圖 4-11 FI(480-530/670-680 nm) 與 FI(440/670-680 nm)之關係……….….…56 圖 4-12 不同藻類與 protein-like 物質螢光強度關係…….…………..…57 圖 4-13 不同藻類生長階段釋出 NPDOC 之增加率………..………60 圖 4-14 以 SFS 方式進行有機碳含量之推估,各項參數之圖示位置……62 圖 4-15 以 SFS 預測與實測有機碳含量之比較..……….……64 圖 4-16 不同藻種在各生長階段釋出有機物含碳量百分比………….…..65 圖 4-17 不同藻類溶液之過濾液 THMFP 值之比較………....…..68 圖 4-18 不同藻類在對數期階段萃出液之液相層析圖………....…..72 圖 4-19 不同藻類在穩定期階段萃出液之液相層析圖………....…..73 圖 4-20 不同藻類在對數期與穩定期相對於 Chl a 之色素濃度比…….75

(6)

表目錄

表 2-1 河水與海水中溶解性螢光物質之波峰位置...19

表 3-1 Chodatella sp. 營養鹽濃度...27

表 3-2 Chlorella sp. 營養鹽濃度...28

表 3-3 Navicula sp. 營養鹽濃度...28

表 3-4 掃瞄式電子顯微鏡之操作條件...32

表 3-5 不同色素標準品檢量線濃度與各色素成份對應之停留時間...34

表 3-6 Purge & Trap 的操作條件 (THM) ...37

表 3-7 以氣相層析儀 (GC) 分析三鹵甲烷 (THM) 之操作條件 ...37

表 3-8 螢光光譜儀 (F-4500, Hitachi, Japan) 之操作條件 ...39

表 4-1 不同觀測方式進行藻數計算平均值及相對差異係數之比較...44

表 4-2 不同藻類在生長階段釋出之 NPDOC 及對應之藻數量……..….59

表 4-3 六種性質不同有機物之螢光特徵激發及發射波峰位置……...….61

表 4-4 SFS 迴歸模式中各項對應常數值…...……….62

表 4-5 以 SFS 方式推估各有機物種之 DOC 量………..…….65

表 4-6 不同藻類溶液及其過濾液之 THMFP 值………..……….67

表 4-7 不同藻類在對數期與穩定期階段之藻體特徵色素含量………....74

(7)

摘要

優養化水體中含豐富之藻體,其可導致水體之日夜溶氧差值變化 大、藻毒釋出、提高水中三鹵甲烷生成前質、增加水之臭、味及色度,

進而導致給水廠操作困難等問題。故國內外許多研究者著重於淨水處理 單元對藻類去除控制,及利用光學顯微鏡配合人工鏡檢進行藻相分佈調 查、及吸收光譜儀進行藻類質量測定等研究,少見研究者進行優養化湖 水中藻體釋出有機物性質變動、藻相計數方式及監測工具,以作為水廠 快速有效之監測工具。非破壞性光譜分析,如螢光光譜儀具有三度位向 測 量 激發 及 發射螢 光 光譜 圖 (excitation emission fluorescence matrix, EEFM),可區別有機物之官能基,故廣泛被應用於各領域中之有機物特 性分析,而液相層析儀則可進行色素測定,作為海域藻類分類之工具,

但兩者監測技術在淡水藻釋出有機物與藻類之定性研究,仍有值得進一 步探討之必要。

本研究分四階段進行: (1) 利用螢光顯微鏡配合影像分析軟體、光 學顯微鏡配合鏡檢計數法與血球計數法,對 Chodatella sp. 、 Chlorella sp.

與 Navicula sp. 等三種藻體細胞進行計數方法比較,(2) 利用螢光激發及 發射光譜進行藻體光譜資料之建立,(3) 利用螢光激發及發射光譜圖之 SFS (spectral fluorescent signature),進行藻體釋出有機物性質之推估並比 較三鹵甲烷生成潛能 (trihalomethanes formation potential, THMFP) 差 異,(4) 利用 HPLC (high performance liquid chromatography) 進行不同藻 體色素含量 (pigments) 之比較。

研究結果顯示,三種藻體細胞計數方法對三種藻類進行計數結果,

在 95 % 信賴區間,經 ANOVA (

analysis of variance

) 分析, F 值為 0.083 ,且遠小於 F critical (3.049),代表三種藻體計數方式對藻體進行 計數,並無顯著差異。Chodatella sp.、Chlorella sp. 與 Navicula sp. 三藻 體或藻水之最佳可見光吸收波峰位置均不相同,其值分別為 684、683 與 680 nm。

Chodatella sp. 、Chlorella sp. 與 Navicula sp. 三藻體本身在其培養 過程,均於 280-290/330-360 nm 出現螢光激發與發射波峰,此類物質屬

(8)

protein-like 之有機物;同時,在 440/670 nm 與 480-530/670 nm 之色素 螢光激發與發射波峰,Chodatella sp. 與 Chlorella sp. 在對數期即已被偵 測到,兩波峰螢光強度值,Chodatella sp.均高於 Chlorella sp.,Navicula sp.

則在穩定期才出現該色素波峰。在藻體釋出液(過濾液),Chodatella sp. 與 Navicula sp. 在 整 個 生 長 階 段 , 均 發 現 270-290/310-340 nm (protein-like)、340-360/420-450 (humic substanc) 與 250-260/430-460 nm (humic-like) 出現螢光激發與發射波峰,Chlorella sp. 在生長階段中僅於 340-360/420-450 nm (humic substanc) 出現波峰。

至於不同藻類釋出液之有機物性質,以 SFS 模式推估結果顯示在 三個生長階段均以 HPON (hydrophobic neutral) 之含碳量百分比最高,但 HPOB (hydrophobic base) 與 HPIN (hydrophilic neutral) 均未被發現;

HPOA (hydrophobic acid) 之 含 碳 量 百 分 比 , 以 Chodatella sp. 大 於 Chlorella sp.,且均高於 Navicula sp.。其次 Chlorella sp. 之過濾液有最大 之 THMFP (trihalomethane formation potential) 值,三藻類之過濾液是藻 水中主要之 THMFP 貢獻者。

在特徵色素 (pigments/Chl a) 部分,Chodatella sp 以 Chlorophyll c2 與 Lutein/Zeaxanthin 為 主 , Chlorella sp. 則 是 Chlorophyll b 與 Lutein/Zeaxanthin,而 Navicula sp. 對應 Chlorophyll c2 與 Fucoxanthin。

關鍵字:激發及發射螢光光譜圖;螢光顯微鏡;光學顯微鏡;血球計數 法;三鹵甲烷生成潛能;色素

(9)

Abstract

The plentiful proliferation of algae in eutrophic lake can result in some problems in the source water, including (1)the severe variation of dissolved oxygen between day and night;(2)the release of algal toxin;(3) the precursor increase of trihalomethane formation potential (THMFP);(4) the formation of flavor, odor, and color. All above problems lead to the operational difficulty in watertreatment plant. For past several decades, most of researches were focused in the algal removal by various operation units in watertreatment. The improvement for the instrument of monitoring algae, especially in fluorescent spectrometer, was increasingly discussed in foreign researchers. However, few papers were still seldom mentioned in domestic reports. Fluorescent spectrometer (FS) also can be used to characterize the organic properties in source water. It seems possible using fluorescent spectrometer to classify algae and its excrete owing to its superiorities with non-destructive and slight amount of water sample, and quick analysis. The differences of pigments were measured by the tool of high performance liquid chromatography (HPLC).

In this research, the differences of algal species in EEFM (excitation–emission fluorescent matrix) of FS and pigments measured by HPLC were compared for possibly providing more information to waterteatment for adequately operating processes. Three algal species, Chodatella sp., Chlorella sp. and Navicula sp. were selected to conduct all experiments. Four goals also were scheduled as the following statement:

1. To compare the differences of the algae number counted using fluorescence combined with image analysis software, optical microscope with membrane filter and optical microscope with hemocytometer.

2. To establish the EEFM for Chodatella sp., Chlorella sp. and Navicula sp.

3. To characterize the characteristics of organic matter, and to measure the trihalomethane formation potential (THMFP) released from three algal

(10)

species.

4. To distinguish the major pigments for Chodatella sp., Chlorella sp. and Navicula sp.

The data obtained from three methods for counting algal number have insignificant difference by one way analysis of variance with the 0.083 for F value and above 0.01 for P value. The wavelengths of maximum absorption peak for Chodatella sp., Chlorella sp. and Navicula sp. were respectively found at 684、683 and 680 nm.

During incubation, three algae themselves had same peak location at emission wave length of 280-290 nm and excitation wave length of 330-360 nm. This peak may be protein-like organic matter induced. Two peaks coincidentally appeared at 440/670 nm and 530/670 nm, which belonged to pigments, for both Chodatella sp. and Chlorella sp. in the log phase. The fluorescent intensities of two peaks location for Chodatella sp. were higher than those for Chlorella sp. However, the peak locations for Navicula sp. had not found until the steady state of incubation. The filtrates of three algal waters through 0.2

m membrane filter were analyzed by EEFM of FS. The

peaks at 270-290/310-340 nm (protein-like substance), 340-360/400-450 nm (humic-like) and 250-260/430-460 nm (humic-like) can be found for Chodatella sp. and Navicula sp. in whole incubation periods, but only one peak of 340-360/420-450 nm (humic-like) existed in Choralla sp..

Regarding to characteristic of organic matter of filtrates from three algal species, the percentage of carbon content of hydrophobic neutral (HPON) in whole incubation periods was the largest part compared with other organic properties using SFS (spectral fluorescent significature) model. Both hydrophobic base (HPOB) and hydrophilic neutral (HPIN) were not found for all filtrates from three algal species. The percentage of carbon content of hydrophobic acid (HPOA) for Chdatella sp. was superior to that for Chlorella sp, but that for the former both algal filtrate were larger than that for Navicula sp. The THMFP value for filtrate form Chlorella sp. water was the largest, and THMFP of algal water was mainly attributed from the filtrate.

(11)

Based the ratio of pigments to Chl a., Chlorophyll c2 and Lutein/Zeaxanthin was dominant pigments for Chodatella sp., Chlorophyll b and Lutein/Zeaxanthin for Chlorella sp., and Chlorophyll c2 and Fucoxanthin for Navicula sp.

Keyword: excitation emission fluorescence matrix; fluorescence optical

microscope; hemocytometer; THMFP; pigments

(12)

致謝

首先誠摯的感謝指導教授邱俊彥博士及賴文亮博士,兩位老師悉心 的教導使我得以瞭解藻類領域研究的深奧,不時的討論並指點我正確的 方向,使我在這些年中獲益匪淺。老師對學問的嚴謹更是我輩學習的典 範。

兩年裡的日子,實驗室裡共同的生活點滴,學術上的討論、言不及 義的閒扯、讓人又愛又怕的 meeting、趕論文的革命情感、因為睡太晚而 遮遮掩掩閃進實驗室....等等,感謝眾位學長、同學、學弟妹的共同砥 礪,你們的陪伴讓兩年的研究生活變得絢麗多彩。

感謝建宏、志文、鄭勝不厭其煩的指出我研究中的缺失,且總能在 我迷惘時為我解惑,也感謝博名、書豪同學的幫忙,恭喜我們順利走過 這兩年。實驗室的勇廷、正偉、宣樺、建斌、金賢、上權、育展學弟、

惠茹學妹們當然也不能忘記,你們的幫忙及搞笑我銘感在心。

每個成功的背後總是有個人一直在旁默默的支持你、鼓勵你,使自 己前進的動力不致失去,沒有妳的體諒、包容,亦無法點綴這酸甜苦澀 的研究生涯的生活。

口試期間承蒙蘇惠美老師、陳振正老師、蔡永祥老師大力協助,對 論文的悉心指導,謹致謝忱

最後,謹以此文獻給我摯愛的雙親,讓我從出生到現在,給我無虞 的生活環境,得以專心唸書完成學業。

(13)

壹、前言

一、研究緣起

國內水庫水源,目前大都作為自來水廠處理之原水,然而依國內 環保署監測資料顯示,大部份水庫皆呈現優養化之現象,此與國內水 源保護區之管理不佳及政府未貫徹政策相關,故自來水廠為提高淨水 廠處理水質,如何有效瞭解水庫進水水質變化,提供後續淨水廠處理 操作程序之應變,應是水廠當務之急。在水庫優養過程,水源中藻類 滋生是該水源眾多問題之一,其除會干擾水處理程序單元之負荷外,

降 低 處 理 水 品 質 , 提 高 淨 水 廠 處 理 成 本 外 , 當 然 二 次 污 染 物 (secondary pollutants) 之產生,如三鹵甲烷等,均是民眾所關切之問 題。綜觀國內外研究文獻,大部分之研究著重於藻類之去除,及釋出 毒性之控制;由不同研究得知,不同淨水程序對不同藻類之去除能力 均不同,故如何提昇藻體監測技術,提供淨水廠有充分時間進行最佳 處理程序調整,應是值得進行研究之課題。

研究指出表面水中自然有機物之性質可能隨優勢藻種而變,且國 外已有部分學者開始以螢光光譜儀進行水中不同藻類及釋出有機物 之特性分析,由於各區域優養化湖泊水所含之優勢藻種不相同,即使 相同之藻種,由於生長環境之差異,藻體及其釋出液之有機物性質也 可能會有所差異。非破壞性光譜分析,如螢光光譜儀具有三度位向測 量 EEFM (excitation emission fluorescence matrix) 已廣泛應用於各領 域中有機物之特性分析,而液相層析儀進行色素測定,並作為海域藻 類分類之,在國外研究均已進行多年,但以上述兩者監測技術同時作 為淡水藻釋出有機物與藻類之定性研究,則國內外少見相關研究者進 行探討,故本研究擬以螢光光譜儀進行藻類光譜資料建立,配合高效 率液相層析儀進行不同色素成份及含量測定,並提供水廠未來進行水 庫水源藻體監測所需技術及資料。

(14)

二、目的

本研究利用實驗室內恆溫培養箱進行本省湖水中常見優勢藻類 之培養,例如, Chodatella sp.、Chlorolla sp. 及 Navicula sp.,初期 比較不同藻體計數方法之差異性,評估簡便計數之技術,中期則探討 不同藻體在生長過程中,藉由 EEFM 之特徵波峰進行不同藻類之判 讀,並與藻體定性及藻數定量,建立藻體本身及其釋出有機物之 EEFM 特徵圖譜,提供水廠快速判斷水源中可能存在之藻種之方 法,並了解不同生長階段其 DOC 與 THMFP 之貢獻為何,後期利 用萃取方式將藻體破碎後,提取胞內葉綠素與色素 (pigment) ,以高 效能液相層析儀 (HPLC),進行葉綠素及色素定性分析,期能與 EEFM 特徵圖譜作比較及成分判定之評估。

(15)

貳、文獻回顧

台灣因受限於地形,水庫興建甚多,而台灣水庫多半有優氧化現 象,「優養化」是指一片水域所涵容的養分,隨著時間逐漸增加的一 種現象和過程。換句話說,優養化原本是自然生態水域體系裡必然的 演化過程。當湖泊在剛形成的時候,水中溶解性礦物和鹽類都很少,

尤其是氮化物和磷酸鹽的濃度都很低,而氮化物和磷酸鹽成了藻類的 生長之限制因子。長年累月雨水沖刷上游集水區的山坡上沖蝕和溶解 各類鹽類,溪流至湖泊累積,湖水中的氮化物和磷酸鹽的濃度愈來愈 高,藻類因而得以大量的繁殖。

藻類生長之限制因子為水中氮及磷,其中尤以磷較為氮重要,故 水體受到化學肥料、清潔劑或人類行為的污染時,藻類便可能大量生 長,光合作用增加,使水體溶氧增加,因此一些浮游生物及高等水生 動物亦隨之增多。其伴隨著水體及水質可能造成之影響如下: (1) 藻 類大量繁殖後,因光合及呼吸作用易造成水體溶氧量晝夜變化大,於 夜間藻體行呼吸作用時,常致溶氧值太低,造成其他水生物無法生存。

(2) 由於藻類死亡腐敗,可產生臭味、影響水體景觀、水生生物適應 性及遊憩價值。 (3) 藻類族群發生腐敗後,部分會釋出藻毒降低水 體利用價值。 (4) 藻類在生長過程所代謝出之有機物增加水中溶解 性有機物濃度,提高三鹵甲烷形成潛能,且會增加水之臭、味及色度。

(5) 導致給水廠操作困難,增加處理成本。

一、藻類之基本特性 (一) 藻類的分類

藻類可分為大型藻與微細藻 (microalgae) ,微細藻又可分為底棲 附著性 (phytobenthos) 與浮游性 (phytoplankton) (康氏, 2001)。藻類 的生長、種類、群聚組成與分布情形可以顯示採集當時的環境狀態,

亦可以顯示水質潛在之所有影響因子 (包括無法以分析方法所偵測 到的因子) 之變動性,因此有許多的藻類族群可以當成清澈或污染的 水質生態指標,以評估長期低劑量之污染物質所累積之長期效應 (賴

(16)

氏, 1997) 水體中的溶氧的日夜變化也可以看出藻類的生物量多寡,

當日夜溶氧的變化不大時,代表藻類在此水體的生物量不多,若是日 夜溶氧的差異大,則代表藻類的生物量是比較大的 (Sabater et al, 2000) 。水中的好氧細菌,會降低溶氧量,減少某些藻類(如:柵藻 與小球藻)光合作用氧的張力 (photosynthetic oxygen tension) 間接使 得藻類生長的速度增加 (Mouget et al, 1995)。

(二) 藻類的形態與特徵 1. 小球藻 (Chlorella sp.)

小球藻 (Chlorella sp.) 對環境的適應性強,營養豐富,多用於培 養 輪 蟲 。 小 球 藻 在 分 類 上 屬 於 綠 藻 門 (Chlorophyta) , 綠 藻 綱 (Chlorophyceae) , 綠 球 藻 目 (Chlorococcales) , 卵 囊 藻 科 (Oocystaceae) ,綠藻類 (Chloreceae) 。其形態特徵多為球形或廣橢 圓形、無鞭毛或纖毛 (森若與齊, 1996) 。

細胞內具有杯狀 (蛋白核小球藻) 或呈邊緣生板狀 (卵形小球藻) 的色素體。蛋白核小球藻的杯狀色素體中含有一個球形的蛋白核。細 胞中央有一個細胞核。細胞的大小依種類而有所不同,蛋白核小球藻 直徑一般為 3-5 μm ,在人工培養的情況下,條件優良,小球藻會變 小一點。繁殖方式以似親孢子的方式行無性生殖,首先在細胞內部進 行原生質分裂,把原生質分裂為 2 、 4 、 8 …… 個孢子,然後這 些孢子破母細胞而出,每個孢子長成一個新個體。常單獨或集合成群 生活,但不能游動。採無性生殖,外被細胞壁,內含細胞質包藏一核 及杯狀的葉綠體,在葉綠體內有一個明顯的澱粉核 (黃氏, 1985) 。

小球藻分佈廣泛而在近海河口之海水中生活者,通常稱之為海洋 綠藻,但在海岸邊生存者,雖生活在有鹽分之水中,卻不能算是海洋 綠藻。另外有些單胞綠藻十分適應海水亦可適應淡水中,生長環境不 同而有型態上的差異,致使性質亦不相同,且各地之氣溫差異甚大,

因此一般依照對溫度的適應性來區分,大致可分為低溫種,即溫度在 10 ℃ 以下能行繁殖作用;中溫種,在 10-30 ℃間能生長良好;高溫種

(17)

則在 30-40 ℃ 間亦能充分生長與繁殖,概括而言,以中溫種的分佈 最為普遍 (Huang, 1974) 。

2. 矽藻 (Navicula sp.)

矽藻 (Navicula sp.) 舟形藻生態 細胞獨立,舟形,緊貼殼環帶 的色素體,各有1個長桿形的蛋白核 (pyronoid) 。矽藻在分類上屬於 綠 藻 門 (Chrysoplyta) , 矽 藻 綱 (Bacillariophyceae) , 羽 紋 目 (Pennales) ,舟形藻科 (Nitzschiaceae) ,舟形藻類 (Nitzchia Hassall) (森若和齊, 1996) 。矽藻的細胞壁稱為矽殼 (frustule) ,由矽質和有 機質外層形成,而矽藻的乾重,其中有 4 %-50 % 是矽質成分 (Raymont, 1980) 。

不同種的矽藻生長時,所需要的矽質量會有差異 (Graham and Wilcox, 2000) 。矽藻從淡水到海水皆有分布,非常常見。矽藻的外 殼有許多不同的形狀。矽殼有上殼 ( epitheca ) 和下殼 ( hypotheca ) 之分。而矽殼上的裝飾刻紋 (ornamentation mark) 是作為矽藻傳統分 類時的重要依據 (Patrick and Reimer, 1966; Round et al., 1990)。裝飾 紋可分為四種: 1. 點紋 (puncta) :矽殼上的小孔和小點稱之,常是 不規則的散佈在矽殼上,或是會規律地排列成殼紋 (striae) 。 2. 網 孔 (areolae or alveoli) :為殼面的小凹槽,會形成腔室般的構造。 3.

小管 (canaliculi) :為貫穿矽殼上的管狀通路。 4. 肋紋 (costae) : 為堅硬的肋狀構造,可用來支撐矽殼,是由矽質高度堆積所形成。

矽藻最常見的生殖方式,是無性的分裂生殖,矽藻會先複製細胞 核,然後上下殼分離。上下殼分離的地方,會有矽質沈澱細胞的形成,

會形成新細胞的下殼部分。圓心目矽藻的精子具有管狀鞭毛的構造,

可幫助游泳。當矽藻進行無性生殖時,由於不斷分裂並形成較小的下 殼,會使得細胞尺寸越來越縮小。當矽藻的細胞大小指剩原本尺寸的 二分之一或三分之一時,矽藻就會進行有性生殖。圓心目矽藻的有性 生殖方式:2N 藻體進行減數分裂(亦即所謂的gametic meiosis)來 產生雄性配子(精子),並釋放到水中,與已形成雌性配子(卵)的 矽藻細胞結合,形成結合子,或稱為增大孢子(auxospore)(楊氏, 2004)

(18)

3. 頂刺藻 (Chodatella sp.)

頂刺

藻 (Chodatella sp.) 屬於綠藻門 (Chlorophyta) ,綠藻綱 (Chlorophyceae) , 綠 球 藻 目 (Chlorococcales) , 卵 囊 藻 科 (Oocystaceae) ,頂刺藻類 (Chodatella Lemmermann) 以單細胞存 在,橢圓形,具 4 支長剌; 2 支生於細胞兩瑞,另二支生於細胞 腰部。剌排列在同一平面, 形狀與長度變化大;剌的基部具結節。

葉綠體一個,週生、片狀,具一個蛋白核。細胞直徑 5-10 μm 、長 8-14 μm ;剌長 10-27 μm 。因 Chodatella sp. 與 Chlorella sp. 兩種 藻種之類別相近,只有藻類類別差異,除外觀上之差異外,其生活 型態、分佈皆較相近。

(三) 微藻成長與營養鹽的關係

微藻生長除了需要有良好的生長環境外,充足營養鹽也是必要的 因子。微藻生長所必需的營養鹽,如氮、磷、鐵、矽、鎂、鈉等主要 元素和銅、錳、鋅、鉬、鈷等礦物離子和維生素等微量元素 (Eppley et al., 1973; Boney, 1989; Morel et al., 1991)。

(四) 微藻成長與碳的關係

構成微藻的主要元素以碳、氮、磷、矽 (矽藻) 為主。培養液的 添加可獲得氮、磷、矽,但多無碳源的考量。碳是構成生物體內化合 物的重要骨架,化學分析顯示微藻細胞的碳含量超過 50 % 乾燥體重 (Becker, 1994) ,碳對於微藻的重要性可見一斑。

(五) 微藻胞內葉綠素及色素關係

藻類的生長來自於胞內葉綠素行光合作用後,轉換碳源提供藻體 所 需 之 能 量 , 然 而 自 然 界 中 存 在 於 胞 內 之 色 素 體 除 了 葉 綠 素 (Chlorophylls) 外 , 尚 有 類 胡 蘿 蔔 素 (carotenoids) 、 藻 膽 蛋 白 (phycobiliproteins),這三種色素體皆構成藻體光合作用系統所需之要 素,葉綠素呈現之顏色以綠色為主,類胡蘿蔔素呈現之顏色為黃色、

橘色、紅色為主,另外藻膽蛋白分為藻紅蛋白 (phycoerythrin) 與藻

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藍蛋白 (phycocyanin) ,藉由色基團之差異,其吸收光譜亦不相同,

圖 2-1 為常見色素體之結構與分子量 (Wright et al., 1991;Jeffery et al., 1997)。

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圖 2-1 色素化學結構式 (Wright, 2005)

Alloxanthin C40H52O2

OH

HO

Lutein C40H56O2

Zeaxanthin C40H56O2

Perinidin C39H52O7

β-Carotene C40H56

Chlorophyll b C55H72MgN4O5

Chlorophyll C2 C35H28O5N4Mg Chlorophyll a C55H72MgN4O5

Fucoxanthin C40H60O6

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二、藻類之觀察及監測 (一) 顯微鏡技術

(1) 光學顯微鏡

光學顯微鏡的儀器裝置簡便,其成像原理是利用可見光照射在試 片表面造成局部散射或反射來形成不同的對比,然而因為可見光的波 長高達 4000-7000 Ǻ ,在解析度 (或謂鑑別率、解像能,係指兩點能 被分辨的最近距離) 的考量上自然是最差的。在一般的操作下,由於 肉眼的鑑別率僅有 0.2 mm,當光學顯微鏡的最佳解析度只有 0.2 μm 時,理論上的最高放大倍率只有 1000 X,放大倍率有限,但視野卻 反而是各種成像系統中最大的,這說明了光學顯微鏡的觀察事實上仍 能提供許多初步的結構資料。對於浮游植物種類之鑑別 (species identification) , 一般多使用顯微鏡 (microscopy) 來觀測,主要是依 照浮游植物特性的不同,分別使用特定的固定劑,經過濾或染色等前 處理步驟,再使用適當的顯微鏡進行鑑定和計數的工作。由於這種傳 統的鑑定方式較耗時,因此難以取得較高密度或是頻度的資料,且有 賴經驗豐富的專家方能完成。

(2) 螢光顯微鏡

螢光顯微技術則如圖 2-1 所示,首先由燈源 (汞燈) 發出激發光 源,再經由激發濾鏡 (excitation filter) 來篩選激發螢光染劑所須的光 譜範圍,再經由分光鏡 (dichromatic mirror) 將短波長激發光經由目 鏡反射至樣本,而樣本中之螢光物質 (螢光染劑) 受到較短波長的光 及足夠的能量所激發,當要回到穩態的能階時,會釋出較長波長的螢 光,而非螢光物質則成為黑色的背景;受檢樣品中的特定染劑及其它 物質被激發後,所有被激發的物質都釋放出來較長波長的螢光, 然而 螢光僅能在釋放光濾鏡 (suppression filter) 所選定的特定波長範圍內 通過,此通過的螢光再經由目鏡即可觀測出螢光影像。

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圖 2-1 螢光顯微鏡技術之原理 (http://www.mc.ntu.edu.tw/department /anatomy/chien/Confocal%20Homepage/MicroscopicT, 2005) Pernthaler et al. (2003) 指出眾多文獻及書籍顯示,微生物應用在 顯微鏡之觀測配合數位照相機所拍攝之影像,可取代傳統式顯微鏡所 拍攝之微生物影像,在水生微生物學中,影像分析應用於微生物的外 觀大小、總生物菌群落的生物量之定量、呼吸活動、運轉軌跡,透過 光學密度計或螢光強度測定分析細胞信號,來確定這些複雜細胞之群 落,學者也利用不同條件 (如不同培養時間、酸鹼值的變化) 下來進 行研究,也發現某種特殊優勢菌種,在優劣的環境下均可順利生長繁 殖。螢光顯微鏡不僅可以利用來計數菌類與藻類,也可用來作為外觀 觀測的工具。

Lichtenthaler et al. (2000) 以 flash-lamp chlorophyll fluorescence imaging system (FL-FIS) 對植物生長過程活性之監測,植物葉面經 FL-FIS 中 Xenon 燈源激發後,透過 UV-A 濾光片 (280-400 nm, λmax = 340 nm) ,擷取葉綠體所需光源波長後,葉綠體在 FL-FIS 呈

Excitation light Fluorescence

light

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現紅色點,再以 CCD-Digital camera 拍取所需之視野,研究者發現 葉綠體經由 Xenon 光源激發後,會有衰退現象之產生,其活性會隨 著燈源照射時間的增加降低活性,在 20 分鐘後其葉綠體的活性由激 發後的紅色亮點轉變為暗點,其也說明了在觀測標的物有此現象時,

須在短時間內完成,而此方法不僅可達到非破壞樣本之原則且可在短 時間內分析樣本。

由於葉綠素存在於藻體,在使用螢光顯微鏡觀測藻類之時,更增 添其便利性與非破壞性之優勢, Walker et al. (2002) 亦利用螢光顯微 鏡 並 選 用 適 合 葉 綠 素 波 長 之 濾 光 片 (exciter filter [band-pass]:

BP520–550, dichroic mirror: DM565, barrier filter [low-pass]:BA580IF) 以及配合 Digital colour CCD 系統與軟體,對湖水中之藻類進行分 類,對目標物以螢光激發後,測定出 120 種特徵,利用這些特徵經 過先前在電腦所建立之 microalgae database 去比對進行分類統計,其 亦提出若藻體無經過螢光激發,在拍攝過程中無法拍到所需之影像及 標的物,更遑論利用電腦分析及分類,這分析技術及方法亦可對藻類 及非藻類達到分類及鑑定的效能。

後期螢光顯微鏡除了對外觀之觀測外, Takahashi et al. (2003) 研究中發現若以較高階之螢光顯微鏡除了外觀之觀測亦能穿透細胞 外層觀察到細胞質裡的情況,如 Dictyocoryne truncatum (Ehrenberg) 與海藻共生是被寄主在細胞質裡,海藻共生體的葉綠體在紫外光會自 體發生螢光與反應,利用葉綠體自發性螢光來觀測藻類的外觀,此 外,以 4,6-diamido-2-phenylindle 來對共生細胞染色,此染色劑可使 可見光穿透到共生細胞中的細胞核,確認輻射藻類內含活的內共生性 海藻,所以利用光學顯微鏡和螢光顯微鏡觀察,其圖片顯示亦會有所 不同,且也會有其獨特之圖像。

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(3) 掃描式電子顯微鏡

德國 Knoll 於 1935 年提出掃描式電子顯微鏡之原理, 1938 年 Ardenne 開始實驗研究,到 1942 年第一台掃描式電子顯微鏡由 Zworykin.Hill 研發完成,高放大倍率式掃描式電子顯微鏡的特色,

可觀察高分子結構內之元素,如今的掃描式電子顯微鏡仍努力不斷追 求更佳的分辨率,圖 2-2 為掃描式電子顯微鏡原理示意圖,由最上 邊發射出之電子束,經柵極聚焦後,於電壓之加速作用下,經由二至 三個電磁透鏡所組成之電子光學系統,電子束即形成極細狀電子束照 射於試驗樣品上,於末級透鏡上邊裝有掃描線圈,此設備能使電子束 於試樣表面進行掃描,產生各種訊號使接收器接收,經放大後送至映 像管,轉變成一幅圖像。欲將試樣以掃描式電子顯微鏡觀測,試樣斷 面須乾燥新鮮,切忌以手觸碰,以避免觀測面玷污影響觀測品質,對 於非金屬材料試樣,須將試樣表面噴鍍一層薄薄的金屬膜,若要重複 長期觀測,最好再進行一次金屬膜噴鍍 (常氏, 1999) 。電子顯微鏡 對觀察對象的表面結構可提供非常好的解析及成像,陳氏 (2005) 以 前氧化劑作用對細胞表面結構之影響,經由電子顯微鏡加以觀察,

發現綠藻 Chodatella. sp. 經氧化劑處理過程後之藻體外表明顯出 現變化,表面細胞壁網狀結構有破壞現象,藻體四周刺毛亦發現有 消失或斷裂情形,整體藻體細胞有皺縮現象,部分細胞甚至已有溶 出破損情形。顯示臭氧氧化藻體細胞,除了改變其外表結構,甚至 有使藻體細胞破壞之可能。

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圖 2-2 掃描式電子顯微鏡原理示意圖 (常氏, 1999)

顯微鏡筒

陰極

柵極

掃描發生器

前置放大器 二次電子

探測器

反背射 電子探測器

試樣電流 試樣

磁透鏡 磁透鏡

影相管 像

放大變化 掃描線圈

陽極

-6 V -100 V -5~50 kV

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(4) 其它

顯微鏡之用途乃為對標的物進行計數及標的物內、外部之構造觀 察,在計數方面,由於傳統光學顯微鏡觀測法 (light microscopy) 在 樣品的製備以及計數方面,需要花費較長的時間,對於一些體型較小 或是缺乏顯著之鑑別特徵的浮游植物而言,欲達成統計上有效的計數 資料較為困難,進而發展出流式細胞儀法 (flow cytometer) 是依據各 浮游植物族群細胞的體積大小以及細胞中特定的螢光質,作為該族群 的標記,從一個複雜的細胞混合體中,識別出特定的細胞亞群,據以 作為樣本中浮游植物族群的計數工作。在構造觀測方面,除了上述之 顯微鏡尚有穿透式電子顯微鏡,共焦點雷射掃描顯微鏡、顯微解剖操 作顯微鏡、顯微分光測光顯微鏡….等依不同實驗需求而選擇與操作 之顯微鏡,其目的皆是利於實驗數據之完整與準確。

(二) 光學分析技術 (1) 分光光度計法

紫外光及可見光吸收光譜法是依據物質分子或離子團對紫外光 及可見光的特性吸收光譜圖線來分析的定性定量的方法,紫外光可見 光 譜 法 又 稱 為 紫 外 光 可 見 光 分 光 光 度 法 (ultraviolet-visible spectrophotometry) ,它可分為可見光吸收光譜 (適用於可見光區:

400-700 nm) 及紫外光吸收光譜法 (適用於紫外線光區: 200-400 nm),兩種都可進行定性定量。Her et al. (2004) 研究中利用不同萃取 方式對河川水中葉綠素定性定量之研究中指出,葉綠素在可見光的最 佳吸收波長為 664 nm,其水樣中添加甲醇的萃取葉綠數量比未添加 甲醇之樣本效率要來的高,其意味著葉綠素較容易溶於甲醇或其他有 機溶劑。

Millie et al. (2002) 指出利用分光光度計之吸收光譜圖之特性波 峰加上 SI (similarity index) 演算公式所得值,可以提供區別微藻分類 上之依據, Erokhina et al. (2004) 從高海拔的南極洲區域裡與中歐氣 候中皆取得相同之藻種 Trebouxia (屬藍綠藻) ,其發現相同之藻類在

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不同之環境下,其藻體內所含葉綠素之成分與比例亦不相同。

(2)螢光光譜儀

螢光的發光過程原理可分成三個階段如,第一個階段是一個激發 光的光量子打到一個螢光分子上而被其吸收,激發光波長決定了光量 子的能量大小,激發光的波長越短,光子所具有的能量就越高;激發 光波長的選擇是由螢光分子的特性來決定,通常波長範圍必須涵蓋螢 光分子的最高吸收峰並且越長波長越佳,因為太高的能量容易使螢光 分子和其環境發生化學反應而消耗掉能量,而不發出螢光。

第二階段,螢光分子吸收一個光子而躍遷到一個較高能階狀態 S1' ,此時螢光分子發生結構上的變化,並且會有損耗部分能量 (stokes shift ) 而進入一個單重激發態 (singlet excited state) S1 ,這 是發出螢光過程的起點。但這時也有可能發生其他的狀況,例如螢光 分子將其吸收的能量傳遞給鄰近的分子用來驅動化學反應例如植物 的光合作用,此時能量便無法以發出螢光的形式表現出來。

第三階段,處在 S1 狀態下的螢光分子回到基態,放出螢光量子 將其僅剩的能量釋放掉;而因 Stokes shift 使得光量子的能量較激發 光量子為低,所以波長變得較長,也因此能夠將通常極微弱訊號螢光 與激發光分離。螢光分子的發光效率通常可以下列三個參數來決定 (Wang and Taylor, 1989):

Extinction coefficient:是指螢光分子吸收光子的機率或可能性,若螢 光分子吸收光子的機率越高,則分子放出螢光 相對的機率也越高,也因此將會使得螢光分子 的生命週期越短,時間上的解析度將更高。

Quantum yield (QY) :定義為螢光光子數量比上吸收光子數量;通常 用在觀測生物方面 (biomedical) 樣品的螢光 分子其 QY 是低於 1 的,不過一個螢光分子 的 QY 要大於 0.1 才算是實用的。

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Lifetime (生命週期) :指螢光分子停留在激發態的時間,如前所提 及,生命週期越短,時間解析度越高;一般實 用的螢光分子其生命週期約在 1-100×10-9 秒 的數量級。

以非破壞性分析方法,如螢光光譜儀除具有具傳統單一波長掃描 功能外,另三度位向測量 EEFM (excitation emission fluorescence matrix) 及同步 (synchronous) 掃描功能可區別有機物官能基 (Senesi, 1990; Pullin and Cabaniss, 1995) 之功能,故該方法目前己廣泛被應用 於水域中有機物 (Chen et al.,2003; Determann et al.,1998; Mopper and Schultz, 1993) 、在藥學及微生物領域之醱酵控制 (Li and Humphrey, 1990) 及不同細菌之光譜差異 (Angell et al., 1993; Daltiero et al., 1986) 之特性分析,目前研究者以螢光光譜儀對藻類之應用,主要以 葉綠素、胺基酸與有機物作為研究之標的物,並分述如下。

A. 葉綠素

不同藻種其生長時期、外在環境、與藻體生理狀態之不同,其代 謝或釋出有機物之種類亦不相同, Bruchet et al. (1990) 之研究指出 表面水之自然有機物之性質與所存在之優勢藻種相關, Her et al.

(2004) 之研究,藻體利用研磨、超音波震盪、浸泡甲醇等不同萃取 方式所萃出之藻體有機物與 SRHA (suwannee river humic acid) 比較 其間之差異性,發現藻體萃出物與 SHRA 之 EEFM 圖譜中有相似 之腐植質波峰位置 (EX:352-360 nm and EM:441 nm),如此,證明 了水體中有機物的來源乃為藻體所貢獻。其亦比較葉綠素萃取之差異 性,發現以物理方式萃取效率較差,而以甲醇萃取為佳,由此可見葉 綠素不溶於水,但可溶於甲醇之現象,研究者亦利用螢光光譜儀測 定,發現葉綠素屬長發射波長位置,而葉綠素 a 位置為長激發/發射 波長範圍在 278-593/673 nm ,皆有連續波峰,從螢光光譜儀之特 徵波峰技術來看,可提供藻類有機物及其萃取物定性及定量之依據。

光譜分析之特性乃當有機物性質及其官能基不相同,其所對應之 EEFM 圖譜則隨之變化, Henrion et al. (1997) 研究中提出 EEM

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(excitation-emission matrices) 之螢光特徵波峰可提供訊息可作為藻類 特徵區分來達到分類的目的, Determann et al. (1998) 等研究者則發 現海域浮游植物之 EEFM 圖譜在 305 nm 有發射光波峰,由於各區 域優養化湖泊水所含之優勢藻種均不相同,即使相同之藻種,由於生 長環境之差異,藻體及其釋出液之有機物性質也會有所差異,此意謂 以螢光光譜進行水中不同藻類及釋出有機物之特性分析,應是可行及 值得發展之方向。

Pinto et al. (2001) 以螢光光譜儀 (Turner 10-AU fluorometer) 配 合特定發射波長為 680 nm 之濾光鏡,其乃取表面水體之水樣以非破 壞藻體活性測定藻體中 Chlorophyll a 之含量,並可達到在現地連續 監測之效能,此方法之優勢的開發有助於往後自來水廠對於水體藻類 多寡有相當大之效益。Eullaffroy and Vernet (2003) 利用葉綠素為基 礎進行水生植物之研究,研究中添加抑制劑抑制水生植物的光合作 用,再以螢光光譜儀對葉綠素進行定性定量,數據結果顯示發射波長 在 684 與 735 nm 有葉綠素的波長存在,以葉綠素在螢光光譜儀所 對應的強度決定葉綠素在水體中的含量多寡,而葉綠素的含量作為藻 體生長狀態的依據,所以葉綠素含量越高,可能代表藻體越多以及生 理狀態越佳。

B. 蛋白質

研究顯示螢光光譜廣泛應用於水中有機物定性之研究,然其亦可 應 用 於 藥學 及微生 物 領 域蛋 白質及 核 酸 分析 ,包括 細 菌 細胞 中 tryptophan-like 之 螢 光 特 性 進 行 生 物 反 應 器 之 醱 酵 控 制 (Li and Humphrey, 1990) ,甚至測定生物上之細菌 (Angell et al., 1993) , Daltiero et al. (1986) 之研究證實實驗室培養之海生之細菌均可產生 類似 tryptophan-like 之圖譜。 Determann et al. (1998) 以 UV 激發 及對應之發射光譜進行海水細菌及浮游植物進行調查,並將發射波長 定為 340 nm (λex=230 nm) 之強度與細菌數、蛋白質含量呈現線性相 關,而此研究使用之十四種浮游植物,如 Ditylum brightwelli. 、 Nitzschia sp. 、 Skeletonema costatum. 、 Dunaliella tertiolecta. 、 D.

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tertiolecta. 、 Chrysochromulina sp. 、 Chrysochromulina sp. 、 Phaeocystis sp. 、 Phaeocystis globosa. 、 P. globosa. 、 Prymnesium 、 parvuum. 、 Isochrysis sp. 、 Rhodomonas sp.,大部 分 在 305 nm 有 微 弱 之 發 射 光 強 度 , 此 特 徵 圖 譜 亦 被 證 實 為 tryptophan 與 tyrosine 所致。

Mopper and Schultz (1993) 進行海水螢光光譜之特性分析,發現 波長 270-360 nm 有明顯之發射 (emission) 值,此訊號主要為蛋白 質、芳香族之胺基酸 (aromatic amino acid) 及相關代謝物產生,而 Determann et al. (1998) 之研究則指出 280-325 nm 有較高之發射 值,其可能為 tyrosine-like 及 tryptophan-like 物質所致。 De Souza Sierra et al. (1997) 調查世界海域有機物之螢光分析均發現有兩個 fluorophores ,且此雙 fluorophores 之強度隨有機物來源及性質會有 所改變,而 Matthews et al. (1996) 以激發/發射波長 (EX/EM) 為 310/430 nm 、 340/450 nm 、 390/490 nm 與 280/(320- 350) nm 進 行比較珊瑚礁、礁岩萃取液、海水、商業用之腐植酸螢光圖譜之差異 性,其中 280/(320-350) 代表蛋白質產生螢光之位置,結果顯示所有 研究對象在四種激發/發射波長均有波峰,但強度有明顯之差異,與 物種之濃度相關。

C. 有機物

Determann et al. (1996) 取東大西洋 (eastern Altantic ocean) 之水 樣 進 行 螢 光 分 析 , 發 現 在 海 水 表 面 存 在 之 tryptophan-like 與 tyrosine-like 較深海處多,其並認為粘狀之有機物 (particdate organic matter) 及衍生物之有機物 (derived dissolved organic molecule) 為可 能的來源。 Mcknight et al. (2001) 以螢光光譜儀進行河水及微生物產 生之黃酸有機物性質差異之比較,發現在激發波長為 370 nm ,放射 波長在 450 nm 與 500 nm 之螢光強度值可作此不同來源有機物性 質之判斷之指標,當比值為 1.9 時,水中黃酸之有機物可能來自微 生物,比值為 1.4 時,該物質可能來自陸域。Suzuki et al. (2001) 利 用同步 (synchronous) 及微分同步 (derivativ synchronous) 螢光光譜

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儀進行自然水體螢光物質特性分析,前者可約略瞭解螢光物質之特 性,而後者可明確判斷波峰位置,其在海水與河水中均可發現到似腐 植質 (如humic acid 與 Fulvic acid) 與似蛋白質 (如 tyrosine 與 tryptophan) 之螢光物質,其波峰位置整理如表 2-1 。

表 2-1 河水與海水中溶解性螢光物質之波峰位置

sample Region P Region A Region B

EX. EM. EX. EM. EX. EM.

Sea-1 225±5 305±5 240±10 405±45 320±20 425±35

Sea-2 240 445±5 335±5 445±5

River-1 230 305±5 245±5 430±20 325±15 435±5 River-2 220±5 315±25 225±15 415±20 325±30 425±15

EX: Excitation wavelength / nm EM: emission wavelength / nm

高解析度的螢光光譜儀可應用於河水、海岸與海水中溶解性有機 物 性 質 之 確 認 , 並 發 現 似 腐 植 質 (humic-like) 、 tyrosine-like 與 tryptophan-like 等三種性質之有機物。 Humic-like 之螢光物質包含 兩個波峰,一個屬 UV 之激發範圍之波峰 A ,另一則屬可見光範 圍 之 波 峰 C , 而 後 者 在 河 水 中 為 EX/EM 之 最 大 波 峰 位 置 為 340/448 nm ,海岸水樣則落在 342/442 nm ,海水淺處為 342/442 nm , 海 水 淺 處 之 變 化 之 變 化 端 (marine shallow transitional) 為 310/432nm ,優養化海水淺處 299/289 nm ,深海處 340/438 nm (Goble, 1996)。

Chen et al. (2003) 將水域中NOM 區分成 polyphenol-rich 及 carbohydrate-rich 兩部份,並利用螢光放射,三維螢光激發與發射光 譜與同步掃瞄激發光譜與 IHS (international humic substance) 腐植酸 與黃酸之標準品進行比較,結果顯示 NOM-PP 較 NOM-CH 在紅色 波長之螢光強度值為大,利用同步掃瞄功能,發現以 450-480 nm 可 以被用來區別定性定量與 polycondensed 腐植質。Wu et al. (2003) 利

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用切線流 (tangential flow) 之 UF 膜進行日本 Biwa 湖水中有機物 之分離,並利用螢光光譜儀進行有機物之定性與胺基酸測定,並發現 DOC 、 UV (Abs) 、 humic-like 、 fluorecence (Flu) 及總水解胺基 酸量 (THAA) 均以小於 5k Pa 之有機物為多,其並分等分布於不同 分子量,當分子量減少時, Flu/Abs 會隨之增加及 THAA/DOC 隨 之減少,且 humic-like fluorcence 所有分子量大小均可被發現,但 protein-like 之螢光僅被發現存在於 0.1 μm GF/F 。

(三) 高效液相層析 (high performance liquid chromatograph, HPLC) 層析技術

分離技術在植物色素體之應用,最早於高等植物色素體的分離上 之研究,近年來隨著分析方法的演進以及儀器的改良與發展,對於浮 游植物葉綠素與族群的資料已可透過 HPLC 的方法來進行分析、比 對 , 浮 游 植 物 通 常 含 有 本 身 特 有 的 色 素 體 , 稱 之 為 指 紋 色 素 (fingerprint pigment) , 如 矽 藻 (bacillariophyta) 具 有 藻 褐 素 (fucoxanthin) 、 綠 藻 (chlorophyta) 具 有 葉 綠 素 乙 、 原 核 綠 藻 (prochlorophyta) 具有雙乙烯葉綠素甲或乙 (divinyl chlorophyll a or b) 等,因此可以藉由 HPLC 色素分離的分析方法,偵測出樣本中所含 的色素體,再以不同浮游植物所含之指紋色素體作為族群判別的指標 (Millie et al., 1993; Jeffrey and Vesk, 1997) ,由於本島水庫優養化現象 乃由水中藻類大量生長所致,藉由 HPLC 分離色素體之技術進行中 藻體族群色素體之鑑定與族群分布皆有相當之前景,期能提供水廠快 速判斷水源中可能存在之藻種,讓水廠依不同藻種存在之水源,調整 適當之水處理程序,避免藻類在不當水處理程序可能衍生之相關問 題。

高效液相層析色素分析方法之應用,其色素體分離效能上以 Wright et al. (1991) 為最,其使用三種移動相可將 54 種色素體分 離,在此方法中大部分的指紋色素可以完全被分離開來, Obayashi et al. (2005) 與 Suzuki et al. (2005) 皆是沿用 Wright 方法來分離水體 中色素體,不同種類之浮游生物,經溶劑萃取後以 HPLC 分離浮游

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植物中之色素,發現特定浮游生物或藻體之細胞內所含有之色素組成 並不相同,利用這些特徵色素進行浮游生物之定性定量及群落分佈。

Stoń-Egiert and Kosakowska (2005) 對藻體色素進行研究,其以兩種液 相 層 析 管 柱 (LiChroCART Hypersil ODS and LiChroCART Li-Chrospher 100 RP18) 分析 23 種色素體,發現此兩種分析管柱層 析效率相似,且皆可應用自然水體中浮游生物色素體之測定。

對於藻體的葉綠素與色素體分析,大多使用溶劑配合萃取方式將 其萃出, Downes et al. (1993) 其利用 Aceton:Water (9:1)、 DMSO、

Ethanol:Water (9:1) 等三種溶劑對藻體進行萃取,藻體會因使用不同 溶劑與萃取時間過久,其發現使用沸騰之乙醇萃取五分鐘及使用 DMSO 萃 取 2 小 時 後 , 會 因 為 時 間 過 久 與 溫 度 過 高 導 致 Chlorephyll a 遭到破壞使其衰退現象產生, Mateos and García-Mesa (2006) 利用固相萃取與液相萃取方式進行橄欖油色素萃取,配合 HPLC 之定性定量特性分析,其發現利用固相萃取方式可達到 98.4

% (C.V < 4.5)以上,而利用液相萃取只達到 96.4 % ,其數據顯示固 相萃取方式較優於液相萃取。

藻類分類學上,早期因受限於設備以外觀之特徵作為藻類分類的 之依據,後期因科技發達,藻體的分類不在以傳統方式分類,改以 DNA 定序分類較為準確,然而此法固然優異,但其分析方法繁瑣耗 時且對於水體有較多藻種時鑑定較為不易,進而分析探討浮游植物或 藻類胞內的色素體, Quiblier et al. (1994) 在研究中培養三種純藻分 別為 (Chlorophyceae, Bacillariophyceae and Cyanobacteria) ,且個別單 一培養,利用 HPLC 對有機物種的分離特性,對三種藻種體內色素 進行分析,結果發現此三種藻種胞內含有不同色素體,且所含的量與 色素體會因為不同藻種而有所不同,其亦建議利用不同藻種中之色素 體之特徵可以用於自然水體中浮游植物或藻類的鑑定。Wong and Wong (2003) 研究中針對香港水體中矽藻的監測,其藻類因有季節性 之因素通常在三月、四月、九月有大量繁殖現象,加上矽藻中含有特 定色素體 fucoxanthin 與 peridinin ,利用 HPLC 分析後之數據對矽 藻進行定性定量分析。

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研究者為了分類上便捷與量化目的,通常會使用數學工具來整理 數據,因色素分析乃透過 HPLC 層析分離後,其層析波峰代表物種 裡含有特定色素,再依其特性定性定量,配合 CHEMTAX 軟體,對 經 HPLC 分析後之數據進行整理及特徵分析,利用藻體內含有特定 之色素體之特性,達到藻類分類的目的 (Marinho and Rodrigues, 2003;

Irigoien et al., 2004)。

三、藻體在環境監測之應用

早期對於藻類在監測的應用乃對於自然水體中藻類或浮游植物 對水體是否達到破壞水體生態平衡或優養化現象的探討,後期則對藻 體所釋出之有機物與存在於水體中之汙染物及藻類或浮游植物之研 究為最,而藻體胞內含有 Chlorophyll a 與色素,而當藻類接觸到汙 染物時,其光合作用的行為會被污染物所抑制, Werner Brack and Hartmut Frank 在 1998 年利用 Chlorophyll a 螢光特性,區別藻類在 水體中之毒性效應, 環境汙染效應如 triazines、 urea herbicides、

phenols、 nitro aromatic compounds、 aldehydes、 hydrogen sulfide、

volatile halogenated aliphatic、 aromatic compounds、 alkylbenzenes,

等 這 些 物 質 會 對 藻 類 的 光 合 作 用 機 制 產 生 抑 制 效 應 , 透 過 amplitude-modulated 螢光光譜儀分析其藻體內所含有之毒性物質,

Naessens et al. (2000) 與 Védrine et al. (2003) 透過光學生物感應器 (optical biosenor) 鑑別水體有毒污染物質之成份與含量,利用水體中 之藻類及浮游生物與汙染物的接觸與反應後,污染物質與藻類或浮游 植物之光合作用機制產生改變,而不同之污染物對其光合作用機制之 影響亦不相同的條件下,來判定水體中污染物的成分,生物感應器會 因為偵測器的偵測極限、水體溫度、 pH 、藻體密度等而有所改變,

其分析方法之優點為簡便且不破壞水樣下進行偵測之優勢。

四、 三鹵甲烷生成潛能 (trihalomethanes formation potential, THMFP) 三 鹵 甲 烷 (THMs) 分 為 : 氯 仿 (CHCl3) 、 一 氯 二 溴 甲 烷 (CHClBr2)、二氯一溴甲烷 (CHCl2Br)、溴仿 (CHBr3) 四種物質最常 出現。氯與水中有機物反應時會生成許多具有毒性的氯化有機物,

(35)

Rook (1974) 水中有機物質增加導致 THMs 產率增加,且提出有機 物與氯的反應可以簡化為兩大步驟加以敘述,即氯化反應階段與水解 反應階段,其反應型態可分為氧化反應、替代反應、不飽和烴類加成 反應、形成氨氮有機物反應等四種類型;水中 pH 值、加氯量會影 響氯與有機前質之反應型態,當加氯量高時主要進行氧化反應,加氯 量低時進行取代反應 (籃氏, 1997)。

影響消毒副產物生成的因子有加氯量、有機物濃度、溫度、pH 值、溴離子及反應時間。Shukairy et al. (1995)研究發現水中的Br-/DOC 值相當重要,當該值增加時,會形成更多之TTHM,而當該值減少時,

其形成之總三鹵甲烷則已含氯之THMs 為主。許多研究發現當反應時 間、pH 值及水溫升高時會影響TTHM 的產生;Batterman et al. (2000) 的研究顯示TTHM 除了隨反應時間、pH 值增加外,一旦當溫度升高 時TTHM 也隨之增加。

THMs 乃為加氯消毒後產生的消毒副產物,最早由美國國立癌症 研究機構 (NCI) 的動物實驗上發現,THMs 對人體的影響可能會造 成發生癌症之虞,及造成肝、腎及免疫系統的傷害;根據 Bull et al.

(1995) 對老鼠進行不同劑量之 THMs 物種 (包含TCM、BDCM、

DBCM、TBM) 臨床動物試驗,其發現皆會引起老鼠肝腫大或其他肝 方面疾病以及免疫系統方面的損傷。在流行病學研究亦顯示,飲用水 消毒副產物與膀胱癌、直腸癌之發生具有正相關,且在肝癌、結腸直 腸癌、膀胱癌死亡率以為高雄地區最高,甚至在民國 93 年癌症死亡 排名的第1、3 及第14 名,顯示水中消毒副產物對人體危害之嚴重性 (衛生署, 2006; Yang et al., 1998)。

(36)

參、研究架構、設備與分析方法

一、研究流程之規劃

國內水庫水源,目前大都作為自來水廠處理之原水,然而依國內 環保署監測資料顯示,大部份水庫皆呈現優養化之現象,此與國內水 源保護區之管理不佳及政府未貫徹政策相關,故自來水廠為提高淨水 廠處理水質,如何有效瞭解水庫進水水質變化,提供後續淨水廠處理 操作程序之應變,應是水廠當務之急。在水庫優養過程,水源中藻類 滋生是該水源眾多問題之一,其除會干擾水處理程序單元之負荷外,

降 低 處 理 水 品 質 , 提 高 淨 水 廠 處 理 成 本 外 , 當 然 二 次 污 染 物 (secondary pollutants)之產生,如三鹵甲烷等,均是民眾所關切之問 題。綜觀國內外研究文獻,大部分之研究著重於藻類之去除,及釋出 毒性之控制,由不同研究得知,不同淨水程序對不同藻類之去除能力 均不同,故如何提昇藻體監測技術,提供淨水廠有充分時間進行最佳 處理程序調整,應是值得進行研究之課題。

非破壞性光譜分析,如螢光光譜儀具有三度位向測量激發及發射 螢光光譜圖 (excitation emission fluorescence matrix, EEFM) 可作為 有機物性質之判讀工具,故廣泛被應用於各領域中有機物之特性分 析,而液相層析儀進行色素測定,作為海域藻類分類之工具,由於藻 體在生長過程除代謝有機物之問題外,另藻體本身亦水廠關心之問 題,故本研究針對兩種監測技術,進行在實驗室培養之淡水藻,進行 相關之研究議題,並詳細規劃相關之研究架構圖,如圖 3-1 所示,包 括:(1)利用螢光顯微鏡、光學顯微鏡與血球計,對 Chodatella sp. 、 Chlorella sp. 、 Navicula sp. 進行計數方法比較,(2) 利用螢光激發 及發射光譜進行藻體光譜資料建立,(3) 利用螢光激發及發射光譜圖 之 SFS (spectral fluorescent signature),進行藻體釋出有機物性質之推 估及比較三鹵甲烷生成潛能 (THMFP) 差異,(4) 利用 HPLC (high performance liquid chromatography) 進行藻體色素含量 (pigments) 之 比較。

(37)

圖 3-1 研究架構流程圖

1.以藻體自發性螢光特性進行藻數計算 2.不同生長階段藻體與其釋出液之光譜圖

3.藻體釋出有機物性質對消毒副產物生成潛能之影響 4.不同藻屬色素成份差異

HPLC

不 同 藻 屬 釋 出 之DOC

量 探討不同計數方法與藻

數間之差異性

文獻回顧

藻類培養

藻類計數方法

不 同 生 長 階 段 有

機物性質之比較

1.濾膜計數法+鏡檢 2.螢光計數配合 Image-Pro Plus 3.血球計數法+鏡檢 4.UV-vis

1.藻液 2.藻體 3.濾液

儀器分析

螢光光譜儀 總有機碳分析儀 GC

1. 分析不同生長階段 藻體及其釋出物之 EEFM圖譜變化 2. 利 用 SFS 進 行 有

機物性質分析 3.

THMFP

與 藻 數 之 關 係

(38)

二、藻類培養系統

為要瞭解數種藻類及其代謝產物之螢光強度圖譜,提供實驗所需 穩定及充足之樣本來源,本研究藻類批式培養裝置架設修改 Widrig et al. (1996) 之方法,裝置如圖 3-2 所示,本研究初步選擇以澄清湖 常出現之優勢藻,本研究室培養之藻種包括 Chlorella sp. (綠藻類)、

Chodatella sp. (綠藻類) 、 Navicula sp. (矽藻類) 等三種,培養過程 所需營養鹽主要參考原藻種來源單位之建議為研究對象,Chodatella sp. 、 Navicula sp. 、 Chlorella sp. 前兩種取自於成大葉宣顯教授研 究室,第三種則取自東港水試所蘇惠美博士實驗室,由於實驗所需之 樣本量較大,故反應器之體積約 3 L ,並採用三槽式恆溫培養箱個 別培養,且可將溫度則維持一定,而在反應器週圍適當距離設置光 源,進行光照 (強度約 2000-2500 lux) ,每日照射 20 小時,再進行 暗室反應 4 小時。

圖3-2 藻類批式培養系統裝置圖

0.2μm filter air

pump

air-diffusing stone

air in 2525 TTEEMMPP

2525

(39)

培養過程中,利用抽氣幫浦 (AL40, ALITA, Taiwan) 將空氣導入 培養容器中,在空氣進入培養容器前連接 0.2 μm filter (Supor

®

Acrodisc ® 25, PALL, USA) 避免空氣中微小細菌及顆粒進入容器導 致藻體產生病變,且空氣易可提供碳源及維持水體均勻翻滾。另 Andersen et al. (2005) 文中亦有水域相關藻類之營養鹽配方,均可作 為藻類在照度強度及時間不同條件時,修正之參考。藻類培養之條 件,以 Chlorella sp. 與 Chodatella sp. 培養溫度控制在 25 ℃,

Navicula sp. 則控制在 20 ℃,三藻類照度約 2000-2500 lux,光照時 間為光反應 20 小時,暗反應 4 小時,各藻類營養鹽濃度如表 3-1、

3-2 與 3-3:

表 3-1 Chodatella sp. 營養鹽濃度

培養液 (Chodatella sp.)

Components 濃度 (M)

KNO3 4.99 × 10-3

K2HPO4 4.99×10-4

KH2PO4 5.00×10-4

MgSO4‧7H2O 2.00×10-3

Ca(NO3)2-4H2O 2.21×10-5

FeSO4-7H2O 1.08×10-5

Norris trace element solution 1 ml 溶於 1000 mL 之超純水中後滅菌

Norris trace element solution

Components 濃度 (M)

KNO3 4.99 × 10-3

H3BO3 0.023

MnSO4-H2O 6.21×10-3

ZnCl2 3.67×10-4

CuSO4-5H2O 5.77×10-5

MoO4-2H2O 4.13×10-5

溶於 1000 mL 之超純水中

表 3-2 Chlorella sp. 營養鹽濃度

(40)

營養鹽 (Chlorella sp.)

Components 濃度 (M) Components 濃度 (M) KNO3 0.012 ZnSO4-7H2O 3.07×10-4 KH2PO4 0.009 MnCl2-7H2O 5.71×10-5

CaCl2 0.001 MoO3 4.95×10-5

MgSO4‧7H2O 2.00×10-3 CuSO4-5H2O 5.77×10-5 H3BO3 0.002 M Co(NO3)2-6H2O 1.51×10-5 FeSO4-7H2O 1.79×10-4 EDTA-2Na 0.001

表 3-3 Navicula sp. 營養鹽濃度

培養液(Navicula sp.)

Components 濃度 (M) Components 濃度(M)

NaNO3 5.88×10-3 ferric ammonium citrate 2.45×10-5 K2HPO4 2.30×10-4 citric acid 3.12×10-5 MgSO4-7H2O 3.25×10-4 Na2CO3 1.89×10-4 CaCl2-2H2O 2.72×10-4 EDTA-2Na 2.69×10-6 Na2SiO3-9H2O 4.93×10-4

三、參數分析

(一) 藻體之計數與觀察

1. 螢光顯微鏡配合影像分析軟體計數法

一般藻體大小約在 2 μm 以上,所以利用螢光顯微鏡計數藻類之 前處理,以 0.45 μm 之硝酸纖維膜 (GN-6 Metrice® Grid 47mm, PALL, USA ) 進行過濾,過濾後之濾紙經適當剪裁後,置於螢光顯微 鏡之載玻片上,並以蓋玻片覆蓋於螢光光學顯微鏡 (Fluorescence Microscope) (E-400, Nikon, Japan) 下,以濾光片 (UV-2A, Nicon, Japan) 觀察螢光標記物,並以 CCD 影像擷取器 (Evolution VF colled color, MediaCybernetics, USA) 擷取影像,並配合影像處理軟體 (Image ProPlus 5.0, MediaCybernetics, USA) 來計算藻體數,於目鏡下選擇 20 個視野進行觀察,並計算其平均值,再乘以視野面積,即可得出

(41)

藻體數,最後再除以取樣體積即可求出水樣之總藻體數,單位為 cells/mL 。

螢光顯微鏡計數公式如下:

計數公式:

cells= CCD 擷取視野之總藻體數

162×121(μm)= CCD 擷取視野之面積 (μm2) 9.6×108= 樣本之過濾有效面積 (μm2)

X= 過濾樣本藻水之體積

cells/mL= 單位體積之總藻體數 2. 光學顯微鏡配合鏡檢計數法

此法與螢光顯微鏡計數法前處理相同,仍以 CCD 影像擷取器擷 取標的物影像,選擇 20 個視野進行觀察,但在計數過程中,以傳統 人工肉眼觀察之方式進行計數,再以螢光顯微鏡計數法中之公式換算 出實際藻數。

3. 血球計數板計數法

上述於實驗室培養之藻類,以微量吸管將藻水取出,並滴入以覆 蓋玻片之血球計數板之前後網格中,九小格組成一大格,其為邊長 3 mm 之正方形,搭配顯微鏡 (ECLIPSE E400, Nikon, Japan) 於 400 倍鏡頭下(圖 3-3 ) ,計算平板上前後網格中的小方格中之 16 小格平 均藻數,將平均藻數除以 0.0001 cm3 ,即為平均藻數,此值乘 104 , 即得每 1 mL 水樣體積的總藻數。

mL cells mL

X m m cells

/ 10

6 . ) 9 ( 121 162

8 2

2

 

 

  

 

(42)

血球計數公式如下:

計數表面: 5 個方格,面積為 0.2 mm2 計數表面水的高度: 0.1 mm

體積單位換算: 1000 μl = 1 mL 4. 電子顯微鏡

藻類於掃描式電子顯微鏡觀察之前處理及觀察方面,取適量含藻 類 之 樣 品 選 用 0.2 μm 之 Nylon 濾 紙 (Nylon membrane filters, whatman, England) 進行過濾,將濾紙分成四等份剪裁,將濾紙過濾 面朝內側,使用銅鐶以三明治的方式夾緊 (如圖 3-4 ) ,將夾緊後的 銅鐶放入磷酸緩衝溶液中 (pH=7.0) 浸泡 10-15 分鐘 (or 浸泡三 次 , 每 次 10 分 鐘 ) 進 行 表 面 清 洗 , 再 放 入 2.5 % 戊 二 醇 (Glutaldehyde Solution, Merck, Germany) 固定液中,置入 4 ℃ 冰箱 12-16 小時進行固定之動作,前述動作完畢後,再以磷酸緩衝溶液中 ( pH=7.0) 浸泡 10-15 分鐘 (or 浸泡三次,每次 10 分鐘) 進行清洗。

上述動作完成後,開始進行脫水之工作,首先使用絕對酒精 (Ethanol absolute, Ferak Berlin GmbH, Germany) 分段稀釋成 10 、 25 、 50 、 75 、 90 、 95 % 不同濃度之酒精;脫水分為兩階段,第一階段 將濾紙放入漸次遞增濃度 10 、 25 、 50 、 75 % 酒精各浸泡一

ml cells cells

1 / . 0 2 . 0

1000 

參考文獻

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