F: ATAGTGTATATAGGGCTTGGTAC R: TTGCGCATGTCTATAATACCAGC

表一、PCR 放大 AGT、ACE 與 AT1R 基因 5'端上游區啟動子之引子對與反應條件

基因 放大區域† 引子對 煉合溫度

(℃)

MgCl₂ (mM) AGT -567 ~ +116

F: TTCCAGAAGGCACTTTTCAC

R: GGCCTTTTCCTCCTAGCC

56 1.0

ACE -5580 ~ -4815

F: TACAACCATCACTACTAATGTC R: AGAATAAGGCAAACATGGAACC

58 1.0

-4916 ~ -3847

F: TTTGTAGCTCAGGAGAGCAC R: AACCCATGGGATGAGAGAAG

60 1.5

-3975 ~ -3163

F: ATAGTGTATATAGGGCTTGGTAC R: TTGCGCATGTCTATAATACCAGC

58 1.0

-3184 ~ -2479

F: CTGGTATTATAGACATGCGCAAC R: GGGTCTTATTCATGAAGGAGAAG

60 1.0

-2626 ~ -1676

F: TGCCCAGACAGCCTTATCTC R: CTAACAGCTTGGCCTTCCAG

58 1.5

-1922 ~ -935

F: AGGAACTCTTTGGAGGCGAG R: GTCTTGTCCTATTGGCGCAC

58 1.5

-1207 ~ -637

F: CTCAGAGCCCCAGACACCAT R: CACAGAGCGCAGGAGCTT

60 1.5

-654 ~ +4

F: AAGCTCCTGCGCTCTGTG R: CGGCTCTGCCCCTTCTCCTGCGC

59 1.5

AT1R -1332 ~ -133

F: GACATAAAAACGTTGTCTTCCG R: ACCTCCTCCCTCTCGGGATA

58 1.5

-402 ~ +45

F: CCACAACTGTATTACCAAAG R: AGACGTCCTGTCACTCGCTG

58 1.5

† 放大區域之核苷酸序列 1 表示 mRNA 轉錄的起始點。

表二、AGT 基因多型性之 PCR 引子對、反應條件與檢測方法

多型性† 引子對 煉合溫度

MgCl2

放大片 段(bp)

限制酶(bp) / SSCP 檢測 C-532T

F:TTCCAGAAGGCACTTTTCAC

R:GGCCTTTTCCTCCTAGCC

56℃

1.0 mM

683 SSCP 檢測^★

G-217A

MspI: CCGG

335 / 207, 168

G-152A

NlaIII: CATG

490 / 264, 226 A-20C

F:TCACTAAGACTTCCTGGAAGA

R:GGCCTTTTCCTCCTAGCC

55℃

1.0 mM

298 HaeIII: GGCC 96 / 83, 13

G-6A

BstNI: CCAGG

176 / 121, 55 T174M

(C>T)

F:GATGCGCACAAGGTCCTGTC R:CAGGGTGCTGTCCACACTGGCTC

58℃

1.0 mM

303 NcoI: CCATGG 303 / 211, 92

M235T (T>C)

BstUI*: CGCG

† 核苷酸序列 1 表示 mRNA 轉錄的起始點。

* 利用誤配引子(底部畫橫線者為誤配序列) PCR 引入限制酶切點。

★ PCR 放大片段先以限制酶 NlaIII 切割後再進行 SSCP 檢測。

表三、ACE 基因多型性之 PCR 引子對、反應條件與檢測方法

多型性† 引子對

^煉合溫度

MgCl

放大片

段(bp) 限制酶檢測(bp) T-5491C F: TACAACCATCACTACTAATCTC

R: TATAATATATGTGACATGGCCTG

55℃

1.5 mM

110 BstNI*: CCWGG 110 / 88, 22 A-5466C F: GCCATGTCACATATATTATAGGA

R: CGTCTTTGGAAACTTGTCTGC

55℃

1.5 mM

133 EcoRV*: GATATC

133 / 109, 24 T-3892C F: ATAGTGTATATAGGGCTTGGTAC

R:

AGAAGATATTTGCAAAGTATGTACTG

55℃

1.5 mM

114 PstI*: CTGCAG 114 / 90, 24 A-3692C F: ATAGTGTATATAGGGCTTGGTAC

R: TTGCGCATGTCTATAATACCAGC

65, 58℃

1.0 mM

813

NlaIII: CATG

R: GAGAAAGGGCCTCCTCTCTCT

55℃

1.0 mM

137 XbaI*: TCTAGA 137 / 114, 24

Alu I/D F: CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT

R: GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT

58℃

3.0 mM

490 193 5% DMSO

† 核苷酸序列 1 表示 mRNA 轉錄的起始點。

* 利用誤配引子(底部畫橫線者為誤配序列) PCR 引入限制酶切點。

表四、AT1R 基因多型性之 PCR 引子對、反應條件與檢測方法

多型性† 引子對

^煉合溫度

MgCl

放大片

段(bp) 限制酶檢測 (bp) A-1138T F: CTAATCTGGATGCCATTCAT

R: TCCGAATTTATAGTGAGGGG

58℃

1.5 mM

393

DraI: TTTAAA

T-810A F: AGTCACCCTACTCACGGATC R: CTTTGGTAATACAGTTGTGG

52℃

1.0 mM

450 BstYI*: PuGATCPy 434, 16 / 450

T-713G

HinfI: GANTC

335, 115 / 450

C-521T

SspI: AATATT

283 / 142, 141 A-214C

G-213C

F: CCACAACTGTATTACCAAAG R: ACCTCCTCCCTCTCGGGTTA

58℃

1.5 mM

270

BstNI: CCAGG

A-153G MaeIII*: GTNAC

245 / 224, 21 A+1166C

F: AATGCTTGTAGCCAAAGTCACCT

R: GGCTTTGCTTTGTCTTGTTG

60℃

1.0 mM

856

DdeI: CTNAG

† 核苷酸序列 1 表示 mRNA 轉錄的起始點。

* 利用誤配引子(底部畫橫線者為誤配序列) PCR 引入限制酶切點。

表五、TGF-β1 基因多型性之 PCR 引子對、反應條件與檢測方法

多型性† 引子對

^煉合溫度

MgCl₂

放大片 段(bp)

限制酵素檢測 (bp) A-880G F: CCCGGCTCCATTTCCAGGTG

R: GGTCACCAGAGAAAGAGGAC

60℃

1.5 mM

808

HaeII: RGCGCY

G-800A

Tsp45I: GTSAC

325, 205 / 530

C-509T Bsu36I: CCTNAGG

617, 191 / 808 R25P

(G>C)

F: ACCACACCAGCCCTGTTCGC R: AGCTTGGACAGGATCTGGCC

61℃

1.0 mM

224

Sau96I: GGNCC

(C>T)

F: AAGCAGGGTTCACTACCGGC R: AGGCCTCCATCCAGGCTACA

58℃

1.0 mM

182

FokI: CATCC

† 核苷酸序列 1 表示 mRNA 轉錄的起始點。

表六、VUR 病患與正常人之 AGT 基因多型性分析 多型性

對偶基因 VUR 病患

染色體數(%)

正常人 染色體數(%)

哈溫平衡

對偶基因

基因座 總 P 值 C-532T C 123 (83.1) 200 (85.5) 0.69 0.76 0.41

T 25 (16.9) 34 (14.5) 0.45

G-217A G 123 (83.1) 200 (85.5) 0.69 0.76 0.41 A 25 (16.9) 34 (14.5) 0.45

G-152A G 145 (98.0) 223 (95.3) 0.13 0.74 0.12 A 3 (2.0) 11 (4.7) 0.13

A-20C A 132 (89.2) 198 (84.6) 0.11 0.55 0.12 C 16 (10.8) 36 (15.4) 0.16

G-6A A 117 (79.1) 192 (82.1) 0.27 0.69 0.34 G 31 (20.9) 42 (17.9) 0.39

T174M T 136 (91.9) 212 (90.6) 0.26 0.87 0.59 M 12 (8.1) 22 (9.4) 0.61

M235T T 117 (79.1) 192 (82.1) 0.27 0.69 0.34 M 31 (20.9) 42 (17.9) 0.39

表七、AGT 基因多型性的單套型分析

C-532T G-217A G-152A A-20C G-6A T174M M235T C-532T 179.76* 6.81 1.86 6.95 1.18 5.17 G-217A 7.03 1.66 7.50 2.36 5.66 G-152A 5.10 0.48 1.98 0.52

A-20C 2.27 100.98* 2.42

G-6A 5.25 206.08*

T174M 5.57

M235T

*χ² > 18.47，P < 0.001，自由度= 4

表八、VUR 病患之

末期腎病

末期腎病

對偶基因 末期腎病患者

染色體數(%)

非末期腎病患者 染色體數(%)

對偶基因

基因座 總 P 值 C-532T C 27 (84.4) 96 (82.8) 0.92 0.81

T 5 (15.6) 20 (17.2) 0.83

G-217A G 27 (84.4) 96 (82.8) 0.92 0.81 A 5 (15.6) 20 (17.2) 0.83

G-152A G 32 (100.0) 113 (97.4) 0.88 0.36 A 0 (0.0) 3 (2.6) 0.36

A-20C A 30 (93.8) 102 (87.9) 0.73 0.31 C 2 (6.2) 14 (12.1) 0.34

G-6A A 23 (71.9) 94 (81.0) 0.56 0.19 G 9 (28.1) 22 (19.0) 0.23

T174M T 31 (96.9) 105 (90.5) 0.71 0.22 M 1 (3.1) 11 (9.5) 0.24

M235T T 23 (71.9) 94 (81.0) 0.56 0.19 M 9 (28.1) 22 (19.0) 0.23

表九、VUR 病患與正常人之 ACE 基因多型性分析 多型性 對偶基因

^{VUR 病患}

染色體數(%)

正常人 染色體數(%)

哈溫平衡

對偶基因

基因座 總 P 值 T-5491C T 87 (58.8) 148 (63.2) 0.63 0.49 0.26

C 61 (41.2) 86 (36.8) 0.37

A-5466C A 87 (58.8) 148 (63.2) 0.63 0.49 0.26 C 61 (41.2) 86 (36.8) 0.37

T-3892C T 87 (58.8) 148 (63.2) 0.63 0.49 0.26 C 61 (41.2) 86 (36.8) 0.37

A-3692C A 87 (58.8) 148 (63.2) 0.63 0.49 0.26 C 61 (41.2) 86 (36.8) 0.37

A-240T A 87 (58.8) 150 (64.1) 0.98 0.42 0.18 T 61 (41.2) 84 (35.9) 0.28

Alu I/D

表十、ACE 基因多型性的單套型分析

T-5419C A-5389C T-3815C A-3615C A-240T Alu I/D T-5419C 154.66* 154.66* 154.66* 149.82* 97.68*

A-5389C 154.66* 154.66* 149.82* 97.68*

T-3815C 154.66* 149.82* 97.68*

A-3615C 149.82* 97.68*

A-240T 105.17*

Alu I/D

*χ² > 18.47，P < 0.001，自由度= 4

表十一、VUR 病患之

末期腎病

末期腎病

對偶基因 末期腎病患者

染色體數(%)

非末期腎病患者 染色體數(%)

對偶基因

P 值

基因座 總 P 值 T-5491C T 27 (84.4) 60 (51.7) 0.01 ＜0.001

C 5 (15.6) 56 (48.3) 0.008

A-5466C A 27 (84.4) 60 (51.7) 0.01 ＜0.001 C 5 (15.6) 56 (48.3) 0.008

T-3892C T 27 (84.4) 60 (51.7) 0.01 ＜0.001 C 5 (15.6) 56 (48.3) 0.008

A-3692C A 27 (84.4) 60 (51.7) 0.01 ＜0.001 C 5 (15.6) 56 (48.3) 0.008

A-240T A 27 (84.4) 60 (51.7) 0.01 ＜0.001 T 5 (15.6) 56 (48.3) 0.008

Alu I/D

表十二、VUR 病患與正常人之 AT1R 基因多型性分析 多型性

對偶基因

染色體數(%)

正常人

染色體數(%)

哈溫平衡 P 值

對偶基因 P 值

基因座 總 P 值 A-1138T A 129 (87.2) 204 (87.2) 0.95 1.00 0.99

T 19 (12.8) 30 (12.8) 1.00

T-810A T 129 (87.2) 204 (87.2) 0.95 1.00 0.99 A 19 (12.8) 30 (12.8) 1.00

T-713G T 129 (87.2) 204 (87.2) 0.95 1.00 0.99 G 19 (12.8) 30 (12.8) 1.00

C-521T C 119 (80.4) 189 (80.8) 0.17 0.96 0.91 T 29 (19.6) 45 (19.2) 0.92

A-214C A 131 (88.5) 208 (88.9) 0.18 0.96 0.88 C 17 (11.5) 26 (11.1) 0.89

A-153G A 131 (88.5) 208 (88.9) 0.18 0.96 0.88 G 17 (11.5) 26 (11.1) 0.89

A1166C A 137 (92.6) 223 (95.3) 0.59 0.73 0.12 C 11 (7.4) 11 (4.7) 0.13

表十三、AT1R 基因多型性的單套型分析

A-1138T T-810A T-713G C-521T A-214C

G-213C A-153G A1166C A-1138T 195.74* 195.74* 111.25* 176.27* 176.27* 5.96

T-810A 195.74* 111.25* 176.27* 176.27* 5.96

T-713G 111.25* 176.27* 176.27* 5.96 C-521T 122.13* 122.13* 9.26 A-214C

G-213C 243.60* 5.13

A-153G 5.13

A1166C

*χ² > 18.47，P < 0.001，自由度= 4

表十四、VUR 病患之

末期腎病

末期腎病

多型性 對偶基因 末期腎病患者

染色體數(%)

非末期腎病患者 染色體數(%)

對偶基因

基因座 總 P 值

T 4 (12.5) 15 (12.9) 0.95

T-810A T 28 (87.5) 101 (87.1) 0.98 0.94 A 4 (12.5) 15 (12.9) 0.95

T-713G T 28 (87.5) 101 (87.1) 0.98 0.94 G 4 (12.5) 15 (12.9) 0.95

C-521T C 26 (81.3) 93 (80.2) 0.95 0.88 T 6 (18.7) 23 (19.8) 0.89

A-214C A 28 (87.5) 103 (88.8) 0.94 0.82 C 4 (12.5) 13 (11.2) 0.83

A-153G A 28 (87.5) 103 (88.8) 0.94 0.82 G 4 (12.5) 13 (11.2) 0.83

A1166C A 30 (93.8) 107 (92.2) 0.93 0.75 C 2 (6.2) 9 (7.8) 0.76

表十五、VUR 病患與正常人之 TGF-β1 基因多型性分析 多型性

對偶基因

染色體數(%)

正常人

染色體數(%)

哈溫平衡 P 值

對偶基因 P 值

基因座 總 P 值 C-509T T 102 (68.9) 132 (56.4) 0.22 0.04 0.002

C 46 (31.1) 102 (43.6) 0.02

表十六、VUR 病患之

末期腎病

末期腎病

對偶基因 末期腎病

染色體數(%)

非末期腎病患者 染色體數(%)

對偶基因 P 值

基因座 總 P 值 C-509T T 26 (81.3) 76 (65.5) 0.34 0.09

C 6 (18.7) 40 (34.5) 0.15

表十七、unpaired t test 檢驗 pGL3 重組質體間相對活性的差異及其顯著性 (數值表 t 值，*表顯著性差異)

編號 AGT-24 AGT-13 AGT-15 AGT-73 ACE-77 AT1R-24 AGT-2 5.573* 3.699* 2.291 2.362

ACE-1 0.251

AT1R-36 0.179

* t＞2.78，P＜0.05，自由度 = 4