捌、附錄圖表 附表一、

捌、附錄圖表

附表一、SCA 基因

疾病 基因 蛋白質產物 重複單位：位置 擴增範圍 SCA1

SCA1

SCA2

SCA3

CACNAIA

SCA7

SCA8

SCA10

PPP2R2B

SCA17

附圖一、基因轉殖小鼠之建立：原胚核顯微注射法流程

表一、基因型分析PCR 放大引子及條件

基因 引子對 鍊合溫度

(℃)

MgCl2

(mM)

DMSO (%)

長度(bp) (重複次數) SCA17 F:

Hex-ATGCCTTATGGCACTGGACTG R:

CTGCTGGGACGTTGACTGCTG

58 1.0 0.2 186-237 (25-42)

Hex 表示引子所接的螢光種類

表二、基因轉殖小鼠基因型分析PCR 放大引子及條件

用途 引子對 鍊合溫度

(℃)

MgCl2

(mM)

長度(bp) (重複次數)

hTBP transgene

F: TATGGTGAGAGCAGAGATGG

R: AGGCAAGGGTACATGAGAGCCAT 54 1.0 1.2K-1.3K (36-109)

Transgene copy no.

F: TATGGTGAGAGCAGAGATGG

R: CTGCTGGGACGTTGACTGCTG 53 1.5 550-769

mβ-actin F: ATGGATGACGATATCGCT

R: ATGAGGTAGTCTGTCAGGT 53 1.5 550

表三、TBP 基因帶有三核苷酸序列異常擴增病患之定序結果

編號 年齡/性別 重複次數 (repeat no.)

重複序列 (Repeat sequence) Diagnosis

F67 59/F 45 (CAG)3(CAA)3(CAG)11CAACAGCAA(CAG)23CAACAG Dementia F91 76/F 46 (CAG)3(CAA)3(CAG)6CAACAGCAA(CAG)29CAACAG Dementia F281 52/M 46 (CAG)3(CAA)3(CAG)6CAACAGCAA(CAG)29CAACAG Dementia F297 50/F 46 (CAG)3(CAA)3(CAG)6CAACAGCAA(CAG)29CAACAG Dementia H889

H890 H1173

49/F 42/M 62/F

46 46 44

(CAG)3(CAA)3(CAG)6CAACAGCAA(CAG)29CAACAG (CAG)3(CAA)3(CAG)6CAACAGCAA(CAG)29CAACAG

PD PD PD

(PD，Parkinson’s disease)

表四、hTBP 各基因轉殖小鼠株所帶有之轉殖基因套數 hTBP36Q hTBP109Q Transgenic

line line-35 line-16 line-20 line-43 line-54 line-69 line-71 Copy

number 1 5 1 21 11 8 18

表五、hTBP 基因轉殖小鼠飼育數量統計表

Transgenic line F1 positive F1 negative Proportion (%) hTBP36Q

line-35 35 30 53.8

hTBP109Q

line-16 20 19 51.3

line-20 18 25 41.9

line-43 21 25 45.7

line-54 3 31 8.8

line-69 4 39 10.0

line-71 38 13 74.5

Transgenic line F2 positive F2 negative Proportion (%) hTBP109Q

line-54 19 20 48.7

line-69 12 11 52.2

圖一、hTBP 基因轉殖質體。轉殖基因包含 pcp2/L7 組織專一性啟動 子，人類 TBP 基因 cDNA 以及 SV40 poly-A 片段，並設計以 SphI 與 BamHI 限制酵素進行切割與純化。

圖二、hTBP 基因轉殖質體之 DNA 片段定序圖。構築完成之基因轉 殖質體經定序確認序列無誤，圖中僅表示進行接合反應之鄰近區域之 定序圖。hTBP cDNA 原構築於 pGEM-T 質體上，linker 部分表示原本 位於pGEM-T 質體上經限制酵素切割後殘留之片段。

圖三、顯微注射片段酵素切割示意圖與電泳圖。上圖為 hTBP36Q 基 因轉殖質體示意圖與限制酵素切割檢查電泳圖，下圖為hTBP109Q 基 因轉殖質體示意圖與限制酵素切割檢查電泳圖。＊表示進行原核胚顯 微注射所純化之片段。

圖四、南方墨漬法探針示意圖。所使用之探針為緊臨hTBP cDNA 上 CAG 重複序列 ( 部分) 之 3’端，共 619 bp 之片段。

圖五、FVB 小鼠之 rota-rod 行為常模 (norm)。實驗共使用 15 隻 FVB 小鼠，連續進行四天測試，可觀察到 FVB 小鼠具有良好學習成效，

以此作為FVB 小鼠 rota-rod 之分析標準。實驗數據以 Mean ± SEM 表 示。

0 50 100 150 200 250 300 350

1 2 3 4

Experiment day Latency to fall (sec) FVB (n=15)

圖六、台灣不同族群 SCA17 TBP 基因 CAG 重複序列基因型分析圖。

圖中顯示正常人族群與各種神經退化性疾病患者群間，TBP 基因 CAG 重複數目的分布情形類似，所分析之各族群中 TBP 基因 CAG 重複數 目皆以36 個重複序列所佔比例最高。另外發現四位失智症患者 (45、

46、46、46 個重複) 及二位 PD 患者 (46、46 個重複) 具不正常擴增 的等位基因。

A

B

圖七、hTBP 基因轉殖小鼠基因型分析與南方墨漬法分析結果。A. PCR 分析基因轉殖 founder 小鼠之基因型，以基因轉殖質體為正控制組 (P)，同時以 FVB 小鼠基因體 DNA (FVB) 與不加任何 DNA 之負控制 組 (N) 做對照，DNA 品質以 GAPDH 進行檢測。B. 以 619 bp 探針 進行Southern blot 分析，圖中箭頭所指位置顯示在七株基因轉殖小鼠 基因體DNA 中均可以偵測到有 hTBP 轉殖基因存在。

圖八、hTBP 基因轉殖小鼠轉殖基因拷貝數 (copy number) 定量之聚 合酵素鏈反應 (PCR) 電泳圖。經過計算後分別以基因轉殖質體稀釋 成1、10、50 個拷貝數之濃度 (1×，10×，50×) 進行 PCR，並將各株 基因轉殖小鼠之 PCR 產物比對標準曲線，換算各基因轉殖株所帶有 之拷貝數。

圖九、hTBP 基因轉殖小鼠 RT-PCR 實驗結果。hTBP 轉殖基因 RNA

在各基因轉殖小鼠株之小腦與大腦組織中均會表現，並同時以小鼠 β-actin 比較其表現量，發現 hTBP 轉殖基因 RNA 在小腦與大腦中表 現量並不相等 （C: cerebellum; B: brain tissue）。

圖十、基因轉殖小鼠西方墨漬法分析結果。在 hTBP109Q line-54 與 line-69 可明顯觀察到帶有 109Q TBP 之訊號。以 SK-N-SH cell lysate 做為正控制組 (＋)，其所表現之 TBP 上帶有 36Q。(C: cerebellum; B:

brain tissue，箭頭表示帶有 109Q 之 TBP 位置)

圖十一、hTBP 基因轉殖小鼠 clasping 行為照片。hTBP109Q line-16 基因轉殖小鼠症狀出現年齡約10 個月大，hTBP109Q line-54 基因轉 殖小鼠症狀出現年齡約6 個月大。

A.

B.

C.

圖十二、hTBP109Q line-69 行為分析結果。A. 由 rota-rod 分析發現 line-69 基因轉殖小鼠平衡感與運動協調功能嚴重受損，且隨年齡增加 （2 個月到 5 個月大） 其表現與非基因轉殖小鼠之差異越大 （＊p<0.05）。B. 由 locomotor 分析結果發現，line-69 基因轉殖小鼠與同一胎非基因轉殖小鼠之 水平移動距離與垂直運動頻率均無差異，顯示基本運動活性並未受損。C.

分析小鼠不同年齡之體重，line-69 基因轉殖小鼠與非基因轉殖小鼠之間亦 無差異。實驗數據以Mean ± SEM 表示。

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

2 3 4 5

Age (month)

Latency to fall (sec)

NT (n=12) Tg (n=11)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

NT T g

Distance moved (cm)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

NT T g

Rearing (frequency)

0 5 10 15 20 25 30 35 40

2 4 5

Age (month)

Body weight (g)

NT Tg

＊ ＊ ＊ ＊

A.

B.

C.

圖十三、hTBP36Q line-35 行為分析結果 (NT：n≧5，Tg：n≧9)。A. 由 rota-rod 分析結果發現，2 個月到 10 個月大之基因轉殖小鼠其表現與非基 因轉殖小鼠之間均未達顯著差異。B. 分析小鼠拉力強度，發現 4 個月與 6 個月大之基因轉殖小鼠與非基因轉殖小鼠拉力強度並無差異。C. 分析小鼠 不同年齡之體重，line-35 基因轉殖小鼠與非基因轉殖小鼠之間亦無差異。

實驗數據以Mean ± SEM 表示。

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

4 6

Age (month)

Grip strength (g)

NT Tg

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0 2 4 6 8 10 12

Age (month)

Body Weight (g)

NT Tg 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

2 9 10

Age (month)

Latency to fall (sec)

NT Tg

A.

B.

C.

圖十四、hTBP109Q line-16 行為分析結果 (NT：n≧10，Tg：n≧10)。A. 由 rota-rod 分析圖可知，2 個月到 18 個月大之基因轉殖小鼠其表現與非基因 轉殖小鼠之間均未達顯著差異。B. 分析小鼠拉力強度，發現 2 個月到 11 個月大之基因轉殖小鼠與非基因轉殖小鼠其拉力強度之間均未出現差 異。C. 分析小鼠不同年齡之體重，line-16 基因轉殖小鼠與非基因轉殖小 鼠之間亦無差異。實驗數據以Mean ± SEM 表示。

0 50 100 150 200 250

2 9 11

Age (month)

Grip Strength (g)

NT Tg

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Age (month)

Body Weight (g)

NT Tg 0

100 200 300 400 500

5 6 7 14 15 17 18

Age (month)

Latency to fall (sec)

NT Tg

A.

B.

圖十五、hTBP109Q line-54 行為分析結果。A. 由 rota-rod 分析發現基 因轉殖小鼠之表現較差，第3 天和第 4 天之測試結果基因轉殖小鼠與 非基因轉殖小鼠之表現呈顯著差異，＊p<0.05。B. 分析小鼠體重，

line-54 基因轉殖小鼠與非基因轉殖小鼠在 6 個月大之體重之間並無 顯著差異。實驗數據以Mean ± SEM 表示。

0 50 100 150 200 250 300 350 400

1 2 3 4

Experiment day

Latency to fall (sec)

NT (n=9) Tg (n=10)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

M ale Female

Gender

Body weight (g)

NT Tg

＊ ＊

圖十六、hTBP 基因轉殖小鼠小腦組織切片 Nissl stain 結果，箭頭表

示 Purkinje cell 位置，在 FVB 與 hTBP36Q line-35 小鼠小腦中之 Purkinje cell 數量與形態均正常，hTBP109Q line-69 與 line-54 基因轉 殖小鼠之小腦中則幾乎找不到 Purkinje cell。（NT：non-transgenic mice。放大倍率：400×）

圖十七、15 個月大之 hTBP 基因轉殖小鼠小腦免疫組織染色 (IHC) 結 果，橫排由上而下分別為FVB (a，d，g)，hTBP36Q line-35 (b，e，

h)，hTBP109Q line-69 (c，f，i)。抗體由左至右分別為 calbindin，TBP (N-12)，1C2。由 calbindin 染色發現 hTBP109Q line-69 基因轉殖小鼠

小腦中Purkinje cell 數量明顯減少 (C)。TBP (N-12)與 1C2 單株抗體 染色結果中，FVB、hTBP36Q line-35 與 hTBP109Q line-69 小腦呈現 之訊號未出現明顯差異。（放大倍率：400×）

圖十八、hTBP 基因轉殖小鼠小腦免疫組織染色 (IHC) 圖。縱排由左 至右分別為 FVB (a，d)，hTBP109Q line-69 基因轉殖小鼠 (b，e)，

hTBP109Q line-54 基因轉殖小鼠 (c，f)，小鼠年紀為 6 個月大。上排

為 calbindin 抗體染色結果，下排為 TBP (N-12) 抗體染色結果。由 calbindin 染色結果可發現在 FVB 小鼠腦中 Purkinje cell 分布與型態非 常完整，然而 line-69 與 line-54 基因轉殖小鼠小腦中 Purkinje cell 型 態與數量均呈現受損情況。由TBP (N-12) 抗體染色結果可觀察到有 體積較大且染色較深的細胞，顯示基因轉殖 hTBP 的確可在 Purkinje cell 中表現。（放大倍率：400×）

圖十九、三個月大之 hTBP 基因轉殖小鼠小腦免疫組織染色 (IHC) 圖。上排為 FVB 小鼠之小腦切片 (a，b，c)，下排為 line-69 基因轉 殖小鼠之小腦切片 (d，e，f)，縱排由左至右分別為 calbindin，TBP (N-12)，1C2 抗體染色結果。由 calbindin 染色結果顯示 line-69 基因 轉殖小鼠小腦之Purkinje cell 已出現受損情況，同時由 TBP (N-12) 染 色結果可觀察到在Purkinje cell 中有大量 TBP 之訊號，在 1C2 抗體染 色部分則未觀察到有蛋白質不正常聚積之情況。（放大倍率：400×）