行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
Rac1-依賴訊息傳遞路徑在 thrombin 誘導人類肺部上皮細胞 IL-8 表現所扮演的角色
計畫類別： 個別型計畫
計畫編號： NSC94-2320-B-038-047-
執行期間： 94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日 執行單位： 臺北醫學大學呼吸治療學系
計畫主持人： 陳炳常
計畫參與人員： 鄭惠文
報告類型： 精簡報告
處理方式： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 95 年 10 月 30 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 ■ 成 果 報 告 期中進度報告
（計畫名稱）
Rac1依賴訊息傳遞路徑在thrombin誘導人類肺部上皮細胞IL-8表 現所扮演的角色
計畫類別：■ 個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：NSC 94-2320-B-038-047
執行期間：94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日
計畫主持人：陳炳常 共同主持人：
計畫參與人員：鄭惠文
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：▓精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
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□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
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處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、
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□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查 詢
執行單位:臺北醫學大學呼吸治療學系
中 華 民 國 95 年 10 月 10 日
一、中文摘要
我們先前的研究發現 thrombin 可經由 活化 protease-activated receptor 1 (PAR1) 的訊息傳遞路徑來活化 protein kinase Cα (PKCα)、PI3K/Akt 使得 nuclear factor-κB (NF-κB) 的 活 化 ， 最 後 促 使 interleukin-8/CXCL8 (IL-8/CXCL8)的表現 及肺部的發炎反應。本計劃將探討在 A549 肺部上皮細胞中，Rac 在 thrombin 誘導 IL-8/CXCL8 的 表 現 中 所 扮 演 的 角 色 。 Thrombin 誘 導 IL-8/CXCL8 釋 放 及 IL-8/CXCL8-luciferase 的活性，可被轉染 dominant negative mutant of Rac (Rac N17) 和 PI3K 抑制劑(LY 294002)及 dominant negative mutant of Akt (Akt DN)所抑制。更 進一步證實，thrombin 誘導 Akt Ser473 的 磷酸化，可被 Rac N17 及 LY 294002 所抑 制；同時 thrombin 所誘導 Akt 的激酶活 性，也可被 Rac N17、LY 294002 及 Akt DN 所抑制。此外，thrombin 所誘導的 IKKα/β 的磷酸化可被 Rac N17、LY 294002 及 Akt 抑制劑所抑制；同時 Rac N17、LY 294002 及 Akt DN 可抑制 thrombin 誘導的 IKKα/β 的激酶活性。再者 Rac N17、Akt DN 及 LY 294002 皆 可 以 抑 制 thrombin 誘 導 κB-luciferase 的活性。綜合以上的實驗結 果，可以推測出在 A549 肺部上皮細胞 中，thrombin 可經由 Rac/PI3K/Akt 的路徑 活化 IKKα/β進一步再活化 NF-κB 來調控 IL-8/CXCL8 的表現及釋放。
關鍵詞：thrombin；Rac；PI3K/Akt﹔IκB kinase α/β (IKKα/β) ﹔ NF-κB ； IL-8/CXCL8；肺部上皮細胞；發炎；訊息 傳遞
二、英文摘要
Our previously study has been shown that thrombin activates the protease-activated receptor 1 (PAR1) signaling pathway to activates protein kinase Cα (PKCα) PI3K/Akt, which in turn
expression and lung inflammation. This study investigated the signaling pathway involved in Rac in IL-8/CXCL8 expression caused by thrombin in A549 lung epithelial cells. Thrombin caused increase in IL-8/CXCL8 release, which was attenuated by cell transfection with dominant negative mutant of Rac (Rac N17), LY 294002 (a PI3K inhibitor), and dominant negative mutant of Akt (Akt DN). Treatment of A549 cells with thrombin caused increase in Rac and Akt activities. Pretreatment of A549 cells with LY 294002 or transient transfection with Rac N17 inhibited thrombin-induced Akt activity. In addition, Rac N17 and Akt DN inhibited thrombin-induced IKKα/β kinase activity.
Moreover, Rac N17, LY 294002, and Akt DN all inhibited thrombin-induced increase in κB-luciferase activity. These results indicate that thrombin activates the Rac/PI3K/Akt signaling pathway to activate IKKα/β, which in turn initiates NF-κB activation, and ultimately induces IL-8/CXCL8 expression and release in A549 cells.
Keywords: thrombin, Rac, PI3K/Akt, IκB kinase α/β (IKKα/β), NF-κB, IL-8/CXCL8, lung epithelial cell, inflammation, signal transduction
三、報告內容[前言及文獻探討、研究目 的、研究方法、結果與討論(含結論與建 議)]
前言、文獻探討及研究目的
肺部上皮細胞為一道生理的屏障，其 表面積約為 70 平方公分，保護著呼吸道 免於異物的侵害(Thurlbeck, 1967)。當有異 物吸入時，上皮細胞可經由黏液纖毛的作 用，分泌表面清潔劑(surfactant)，將異物 清除。當有細菌侵入時，上皮細胞也可泌 免疫球蛋白來促進細菌被清除的能力。一 旦此層上皮細胞受到破壞時，會使吸入性
(Gert and Frans, 1998)。但目前越來越多的 證據顯示，肺部上皮細胞除了是一道生理 屏障外，它在呼吸道發炎反應扮演著重要 調節的角色(Albert et al., 1998)。當致病原 活化肺部巨噬細胞時，巨噬細胞會釋放出 TNF-α及 IL-1β，會進一步作用至肺部上皮 細 胞 ， 使 得 上 皮 細 胞 釋 放 出 更 多 的 IL-8/CXCL8 發炎物質，讓更多的發炎細胞 進 入 氣 管 黏 膜 層 中 ， 而 放 大 發 炎 反 應 (Standiford et al., 1990)。
IL-8/CXCL8 為一種嗜中性白血球趨 化因子，最早被發現是在活化的單核球細 胞會被釋放出來，而刺激嗜中性白血球及 T 細胞的趨化作用(Kunkel et al., 1995)。當 嗜中性白血球進入呼吸道後，使嗜中性白 血球釋放出 elastase，會產生急性肺部受 損 、 肺 間 質 纖 維 化 及 急 性 呼 吸 道 受 損 (Piguet et al., 1990)。另外，氣喘病人的氣 管上皮細胞中，也有人發現 IL-8/CXCL8 的含量有上升的趨勢，認為可能在氣喘發 作時，IL-8/CXCL8 是促使發炎細胞趨化的 主要原因(Marini et al., 1992)。經由以上的 證據顯示，IL-8/CXCL8 在呼吸道發炎反應 扮演著重要的角色。
最近也有學者提出，thrombin 在呼吸 道 的 發 炎 反 應 扮 演 著 舉 足 輕 重 的 角 色 (Asokananthan et al., 2002)。在慢性肺部纖 維化疾病的初期，肺部微血管會有受到傷 害的現象(Malik and Horgan, 1987)。此時，
thrombin 會滲透至血管外面，作用至呼吸 系統的細胞，而使得呼吸道平滑肌及纖維 細胞快速的增生，而導致氣管有阻塞的現 象(Bar-Shavit et al., 1992)。此外，呼吸道 上皮細胞中，thrombin 也可以誘導前發炎 物質 IL-8/CXCL8 的產生，促使肺部組織 受到傷害(Asokanathan et al., 2002) ，顯示 thrombin 在呼吸道阻塞疾病扮演著重要的 角色。
Thrombin 的 作 用 皆 活 化 它 的 受 體 protease-activated receptors (PARs)而來。目 前已知的 PAR 有四種從 PAR1 至 PAR4，
PARs 為一種 G 蛋白偶合的受體，穿透細 胞膜七次的受體。PAR1 (Vu et al., 1991)，
PAR3 (Ishihara et al., 1997)和 PAR4 (Xu et al., 1998)可被 thrombin 活化。當 thrombin
與 PAR 結合的時候，thrombin 會將 PAR 的 N 端抑制性的 peptide 切除，使得 PAR 變成活化態，此時會活化 G 蛋白而產生一 連串的訊息傳遞，影響細胞的功能(Vu et al., 1991)。目前已經知道呼吸道上皮細胞 表現 PAR1、PAR2、PAR3 及 PAR4 四種受 體，thrombin 及 PAR 的 N 端合成的胜肽 (PAR1, PAR2 及 PAR4 作用劑)經由 PAR 受 體而誘導發炎物質 IL-8/CXCL8 的釋放 (Asokananthan et al., 2002)，但是 thrombin 經由何種作用機轉來誘導 IL-8/CXCL8 基 因表現及釋放目前還不清楚，是值得研究 的課題。
一般要增加 IL-8/CXCL8 基因的表 現，主要是經由轉錄因子來調控。目前已 知在 IL-8/CXCL8 基因的核酸序列中具有 多種轉錄因子結合的位置，其中以 NF-κB 轉錄因子最為重要(Xie, 2001)。NF-κB 最 普遍的轉錄形態主要由 p50 與 p65 的次單 位組合而成(Ghosh et al., 1995)。在未受到 刺激的細胞中，NF-κB 與抑制性蛋白 IκBs 結合，遮蔽 NF-κB 移至細胞核所需的 nuclear localization signal 序 列 ， 所 以 NF-κB 一直存在細胞質，此時 NF-κB 是未 活化態。直到細胞受到刺激物作用時，會 將 IκBs 磷酸化，再接上 ubiquitin 後，
proteasome 會將 IκBs 分解，此時 NF-κB 為活化的狀態，便可以進入細胞核中，造 成標的基因的轉錄作用。一群蛋白酶複合 體被稱為 IκB kinases (IKKs)已被分離出 來，其中最主要包括 IKKα 及 IKKβ可將 IκBα在 Ser32 及 Ser36 的位置磷酸化；將 IκBβ在 Ser19 及 Ser23 的位置磷酸化，使 其接上 ubiquitin，接著 IκBs 則被分解，而 釋放出 NF-κB，此時 NF-κB 為活化態，則 進入細胞核中，與其標的基因結合，增加 其轉錄作用(Karin and Yinon, 2000)。
Rac1，為Rho蛋白家族的成員之一。
Rho蛋白亦為具有小GTPase (small GTPase) 活性之Ras家族成員的分支。直到目前為 止，至少有 11 種哺乳類之Rho蛋白被分離 出來，分別為Rac1、Rac2、RhoA、RhoB、
RhoC、RhoD、RhoE、RhoG、TC10、TTF 及CDC42Hs (Khosravi-Far et al., 1997)。
Rho蛋白可經由nucleotide exchange factors
活化而形成GTP-bound Rho，接著Rho蛋白 可經由GTPase-activating proteins的作用將 GTP 水 解 ， 使 得 Rho 形 成 不 活 化 的 狀 況 (Whitehead et al., 1997)。Rac1 可調節細胞 許 多 的 生 理 反 應 。 第 一 ， Rac1 可 誘 導 lamellipodium 的 形 成 及 細 胞 膜 的 皺 摺 (Nobes & Hall., 1995)。第二，Rac1 也可以 調控細胞的增生，可經由增加細胞循環之 regulator cyclin D1 的表現(Olson et al., 1995) 。 第 三 ， Rac1 可 以 導 致 rodent fibroblast 形 成 癌 化 的 細 胞 (Qiu et al., 1995)。此外，Rac1 也可以活化NF-κB轉錄 因子，可以增加基因的轉錄作用及表現 (Perona et al., 1997)。由以上的介紹得知，
Rac1 在細胞的生理反應扮演著重要的角 色 ， 但 是 在 thrombin 誘 導 肺 部 上 皮 細 胞 IL-8/CXCL8 的表現目前還不清楚，是否 thrombin可經由Rac/PI3K/Akt的路徑由媒 介IL-8/CXCL8 的表現是一個值得探討的 課題。
綜合以上的介紹，氣管的發炎反應在 呼吸阻塞性疾病中扮演著重要的角色，但 是 Rac/PI3K/Akt 是否會貢獻在 thrombin 誘 導 呼 吸 道 上 皮 細 胞 產 生 發 炎 物 質 IL-8/CXCL8 的釋放並還沒有被研究。這促 使 我 有 興 趣 研 究 thrombin 是 否 會 經 由 Rac1 活 化 PI3K 及 Akt ？ 所 活 化 的 Rac1/PI3K/Akt 經由何種作用機轉來增加 NF-κB 的活性、誘導 IL-8/CXCL8 表現及 釋放。希望能藉此計劃找出 thrombin 在呼 吸道疾病所扮演的角色及其作用機轉，進 而能够發展呼吸道阻塞性疾病治療的新方 向。
研究方法
1. 細胞培養:將人類肺部上皮細胞株 A549 培養在 DMEM 含有 10%胎牛血清及抗生 素 (100 units/ml penicillin 及 100 µg/ml streptomycin)中以進行下列的實驗。2. 轉 染及報告基因試驗:測定κB-luciferase 及 IL-8/CXCL8-luciferase 的 活 性 。 3.
IL-8/CXCL8 ELISA 測定:測定培養液中 IL-8/CXCL8 的含量。4. 西方點墨法:測定
性測定:測定 Akt 及 IKKα/β的活性。6.統 計方法:所有實驗數據皆以平均值±標準差 (mean ± S.E.M)表示，並以 Analysis of Variance (ANOVA)配合 Dunnet’s test 分析 比較各組間是否有顯著差異。p < 0.05 視 為有統計上的意義。
研究目的
Thrombin 除了具有加強活化血小板，參與 血液的凝固外，它也是一種發炎的物質。
在慢性肺部纖維化疾病的初期，支氣管肺 部灌流液中 thrombin 的活性有增加的現 象。此時，thrombin 會誘導前發炎物質 IL-8/CXCL8 的產生。IL-8/CXCL8 會刺激 嗜中性白血球及 T 細胞的趨化作用，導致 呼吸道發炎的現象，與肺部慢性阻塞性的 疾 病 息 息 相 關 ， 顯 示 thrombin 及 IL-8/CXCL8 二者在呼吸道發炎反應中扮 演著重要的角色。本計劃主要的目的是探 討在肺部上皮細胞中，thrombin 是否會經 由 Rac 的作用機轉來活化 PI3K/Akt 最後增 加 NF-κB 的活性及誘導 IL-8/CXCL8 基因 表現。希望能夠藉此研究，找出 thrombin 在呼吸系統疾病所扮演的病理角色，進一 步提供臨床改善或治療呼吸系統疾病的參 考。
結果
Thrombin 經 由 活 化 Rac 誘 導 IL-8/CXCL8 的釋放
首 先 為 了 測 定 Rac 是 否 參 與 在 thrombin 誘導肺部上皮細胞 IL-8/CXCL8 的釋放中，將 A549 細胞分別轉染 0.5 µg 及 1 µg 的 dominant negative mutant of Rac (Rac N17) 24 小時後，以 thrombin (10 U/ml) 刺 激 24 小 時 ， 收 集 細 胞 培 養 液 觀 察 IL-8/CXCL8 的釋放。可見 Rac N17 0.5 µg 及 1 µg 皆可有效抑制由 thrombin 所誘發 IL-8/CXCL8 的釋放，分別抑制了 58 ± 16%，75 ± 16% (Figure 1A)。接著為了更 進一步證實 Rac 是否參與在 thrombin 誘導 IL-8/CXCL8 的表現中，將 A549 細胞分別 轉染 0.5 µg 或 1 µg 的 Rac N17 及 0.2 µg
現 thrombin 所誘導 IL-8/CXCL8-luciferase 的活性，可分別被 Rac N17 0.5 µg 及 1 µg 抑制了 62 ± 21%，92 ± 6% (Figure 1B)。接 下來為更進一步證明 thrombin 是否可直接 活化 Rac，將 A549 細胞給予 thrombin (10 U/ml)刺激 0-30 分鐘後，發現 thrombin 能 有效增加 GTP-Rac 的表現量即 Rac 被活 化，且在 3 分鐘活化量具有明顯的上升，
並持續至 20 分鐘(Figure 1C)。綜合以上結 果推論 Rac 確實參與在 thrombin 誘導肺部 上皮細胞 IL-8/CXCL8 的表現及釋放中。
Figure 1
Thrombin 經由 Rac 及 PI3K 路徑磷酸化 Akt
之前的研究發現 thrombin 能夠有效誘 導增加 Akt Ser473 磷酸化及活化之現象，
來媒介 IL-8/CXCL8 的表現及釋放。故將 更進一步探討 thrombin 磷酸化 Akt 的作用 是否可經由 Rac 及 PI3K 的路徑而來。
A549 細胞分別轉染 0.5 µg 及 1 µg 之 Rac N17 後 24 小時，再以 thrombin (10 U/ml) 刺激 20 分鐘後，發現 Rac N17 呈濃度相
關性抑制 thrombin 誘導 Akt Ser473 磷酸化 之現象。0.5 µg 之 Rac N17 可抑制 thrombin 誘 導 增 加 Akt Ser473 磷 酸 化 約 58 ± 29%，而 1 µg 之 Rac N17 幾乎可完全抑制 thrombin 誘導 Akt Ser473 的磷酸化之現象 (Figure 2A)。相同地，用 PI3K 抑制劑 LY 294002 (10 µM)前處理 30 分鐘，再加入 thrombin (10 U/ml)刺激 20 分鐘後，發現 LY 294002 也可抑制由 thrombin 誘發 Akt Ser473 磷酸化的現象，約抑制 87 ± 15%
(Figore 2B)。經由以上的推論發現 thrombin 確實可經由 Rac 及 PI3K 的路徑來增加 Akt Ser473 之磷酸化。
Figure 2
Thrombin 經由 Rac 及 PI3K 路徑活化 Akt 激酶活性
進一步確定 thrombin 除了經由 Rac 及 PI3K 路徑增加 Akt 之 Ser473 磷酸化外，
是否也會增加 Akt 蛋白激酶的活性。A549 細胞分別轉染 1 µg 的 Rac N17 及 0.5 µg 的 Akt DN 後 24 小時，再以 thrombin (10 U/ml)刺激 20 分鐘後，利用蛋白激酶活性 方法測定，發現 Rac N17 及 Akt DN 皆有 效抑制 thrombin 誘導 Akt 蛋白激酶活性 (Figure 3A 及 3C)。同樣地，用 PI3K 抑制 劑 LY 294002 (10 µM)前處理 30 分鐘，再 加入 thrombin (10 U/ml)刺激 20 分鐘後，
也可見到 LY 294002 具有抑制 thrombin 所 誘 導 Akt 蛋 白 激 酶 活 性 的 現 象 (Figure 3B)，且與 Akt 被磷酸化的情形互相輔合。
經由以上推論得知 thrombin 確實可以經由 Rac 及 PI3K 的路徑來增加 Akt 的磷酸化及 蛋白激酶的活性。
Figure 3
Thrombin 經由 Rac 及 PI3K/Akt 增加 IKKα/β Ser180/Ser181 磷酸化的作用
依據以上結果得知 thrombin 可經由 Rac/PI3K/Akt 的路徑增加 A549 肺部上皮 細胞 IL-8 的釋放。而要增加 IL-8 基因的表 現，其中 NF-κB 為一個重要的轉錄因子。
在我們尚未發表的結果中，將 IL-8/CXCL8 promoter 之κB 剔除的載體中，發現可抑制 thrombin 所誘導之 IL-8/CXCL8 表現，顯
Akt 可徑由不同路徑來增加 NF-κB 的活 性，其中即包括將 NF-κB 上游之 IKKα/β 磷酸化。接下來我們將探討 Rac/PI3K/Akt 是否可經由誘導增加 IKKα/β活性的作用 來促使 NF-κB 的活化。將 A549 細胞分別 轉染 0.5 µg 及 1 µg 的 Rac N17 後 24 小時，
再以 thrombin (10 U/ml)刺激 30 分鐘後，
發現 Rac N17 呈濃度相關性抑制 thrombin 誘導 IKKα/β Ser180/Ser181 磷酸化之作 用，分別抑制了 68 ± 12% 及 95 ± 9%
(Figure 4A)。相同地，PI3K 抑制劑 LY 294002 (10 µM)及 Akt 抑制劑(10 µM)前處 理 30 分鐘，再加入 thrombin (10 U/ml)刺 激 30 分鐘後，同樣地 LY 294002 及 Akt 抑制劑皆可抑制由 thrombin 誘發 IKKα/β Ser180/Ser181 磷酸化的現象(Figure 4B)。
經由以上推論得知 thrombin 確實可經由 Rac 及 PI3K/Akt 的路徑來增加 IKKα/β之 磷酸化。
Thrombin 經由 Rac 及 PI3K/Akt 路徑活化 IKKα/β激酶活性
接下來進一步證明 thrombin 除了經由 Rac 及 PI3K/Akt 路 徑 增 加 IKKα/β Ser180/Ser181 磷酸化外，是否也會增加 IKKα/β蛋白質激酶的活性。A549 細胞分 別轉染 1 µg 之 Rac N17 及 0.5 µg 之 Akt DN 後 24 小時，再以 thrombin (10 U/ml)刺激 30 分鐘後，發現 Rac N17 及 Akt DN 皆有 效抑制 thrombin 誘導 IKKα/β蛋白激酶活 性之表現(Figure 5A 及 5C)。相同地，利用 PI3K 抑制劑 LY 294002 (10 µM)前處理 30 分鐘，再加入 thrombin (10 U/ml)刺激 30 分 鐘 後 ， 發 現 LY 294002 也 可 抑 制 thrombin 誘 導 IKKα/β蛋白激酶的活性 (Figure 5B)，此現象與 IKKα/β被磷酸化的 情形互相輔合。經由以上推論 thrombin 確 實可經由 Rac 及 PI3K/Akt 的路徑來增加 IKKα/β的磷酸化及蛋白激酶的活性。
Figure 5
Thrombin 經由活化 Rac/PI3K/Akt 路徑誘 發 NF-κB 的活化和調控 IL-8/CXCL8 的表 現
綜合以上的結果已經證實 thrombin 誘導 IL-8/CXCL8 表現及釋放的路徑中，
Rac/PI3K/Akt 的確可經由活化 IKKα/β蛋
白激酶而來，因此接下來將利用轉染的方 法 ， 更 進 一 步 證 明 thrombin 可 經 由 Rac/PI3K/Akt 來增加 NF-κB 的活性。A549 細胞分別轉染 0.5 µg 及 1 µg 的 Rac N17 或 0.5 µg Akt DN 24 小時，或以 LY 294002 (10 µM)前處理 30 分鐘，再加入 thrombin (10 U/ml)刺激 24 小時之後，可發現 Rac N17、LY 294002 及 Akt DN 皆可抑制 thrombin 誘導κB-luciferase 的活性，其中 Rac N17 更呈現濃度相關性抑制作用。而 LY 294002 及 Akt DN 分別抑制 thrombin 誘導κB-luciferase 的活性為 67 ± 9%及 74 ± 12% (Figure 6) 。 經 由 以 上 結 果 得 知 Rac/PI3K/Akt 也可調控 NF-κB 轉錄因子的 活性來參與 thrombin 誘導 IL-8/CXCL8 的 表現。
Figure 6 討論(含結論與建議)
綜合先前的結果及以上的實驗證明顯 示，在 A549 肺部上皮細胞中，thrombin 除了經由活化 PKCα及 PI3K/Akt 的訊息傳 遞路徑，將 IκBα磷酸化及降解，促使 NF-κB 的活化，進一步誘導 IL-8/CXCL8 基因的表現，進而產生大量的 IL-8/CXCL8 的釋放。另外，thrombin 可能經由活化上 游之 Rac 再進一步透過 PI3K/Akt 的訊息傳 遞路徑，將 IKKα/β磷酸化來增加 NF-κB 的活化，而誘導 IL-8/CXCL8 的表現及釋 放。一旦 IL-8/CXCL8 釋放之後將會產生 更大的發炎反應。如此，希望能够透過本 計劃的研究，能够更清楚了解 thrombin 在 肺部濃度增加時所產生的發炎反應的作用 機轉，對往後發展治療肺部的疾病貢獻一 C
自之力。
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