行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
子計畫二:ASK1 在氧化態低密度脂蛋白誘導腦內皮細胞功能 喪失及死亡所扮演的角色(2/3)
計畫類別： 整合型計畫
計畫編號： NSC94-2745-B-038-002-URD
執行期間： 94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日 執行單位： 臺北醫學大學呼吸治療學系
計畫主持人： 陳炳常
共同主持人： 許重義，林建煌 計畫參與人員： 廖翊婷
報告類型： 精簡報告
處理方式： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 95 年 5 月 29 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 ■ 期中進度報告
（計畫名稱）
提昇私校研發能量專案計畫-探討氧化態低密度脂蛋白在中風過程 所扮演的病理角色-子計畫二:ASK1在氧化態低密度脂蛋白誘導腦
內皮細胞功能喪失及死亡所扮演的角色(2/3)
計畫類別：□ 個別型計畫 ■ 整合型計畫 計畫編號：93-2745-B-038-002-URD
執行期間：94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日
計畫主持人：陳炳常
共同主持人：林建煌、許重義 計畫參與人員：廖翊婷
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：▓精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
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處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、
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□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查 詢
執行單位:臺北醫學大學呼吸治療學系
中 華 民 國 95 年 05 月 24 日
一、中文摘要
在許多的研究顯示，中風病人其血中的低 密度脂蛋白(LDL)含量過高的現象。腦部 血 管 內 皮 細 胞(cerebral endothelial cells, CECs)為構成血腦障蔽的主要組成，防止 一些傷害性物質進入腦部。一旦氧化態 LDL (ox-LDL)誘導腦部內皮細胞凋亡將 促使內皮細胞通透性增加及血腦障蔽破 壞，而造成腦部的傷害如中風。然而，
ox-LDL 誘導 CECs 的凋亡機制目前還不清 楚。於是在本計劃中，我們將探討apoptosis signaling-regulation kinase 1 (ASK1)及 JNK 在 ox-LDL 誘導腦部內皮細胞凋亡所扮演 的角色及詳細的作用機轉。CECs 細胞給 予 ox-LDL 可依濃度依賴誘導腦部內皮細 胞的凋亡。細胞給予κ-carrageenan (Lox-1 受體抑制劑)及 Lox-1 抗體二者皆可抑制 ox-LDL 誘導腦部內皮細胞的凋亡。細胞 短 暫 轉 染 dominant negative mutant of ASK1 (ASK1 DN)可抑制 ox-LDL 誘導腦 部內皮細胞的凋亡。我們也發現 CECs 細 胞給予 ox-LDL 可誘導 ASK1 蛋白激酶的 活性及ASK1 在 Ser967 去磷酸化的作用。
再者，CECs 細胞給予 ox-LDL 明顯刺激 14-3-3 與 ASK1 分離。SP 600125 (JNK 選 擇性抑制劑)、JNK1 DN 及 JNK2 DN 皆可 抑制 ox-LDL 誘導腦部內皮細胞的凋亡。
CECs 細胞給予 ox-LDL 可依時間依賴誘導 JNK 的活性及其磷酸化。細胞短暫轉染 ASK1 DN 可抑制 ox-LDL 誘導 JNK 的磷 酸化。細胞給予 curcumin (AP-1 抑制劑) 可抑制 ox-LDL 誘導腦部內皮細胞的凋 亡。CECs 細胞給予 ox-LDL 可誘導 AP-1 特異性蛋白-DNA 結合的作用。更進一步 研究Bim 在 ox-LDL 誘導腦部內皮細胞的 凋 亡 所 扮 演 的 角 色 。CECs 細 胞 給 予 ox-LDL 可依時間依賴誘導腦部內皮細胞 BimS 的表現及 Bim-luciferase 的活性。經 由以上的結果顯示，在 CECs 細胞中，
ox-LDL 可經由活化 ASK1/JNK/AP-1 的訊 息傳遞路徑來誘導Bim 表現及腦部內皮細 胞的凋亡。
關 鍵 詞 ： 中 風 ﹔ 氧 化 低 密 度 脂 蛋 白 ﹔ apoptosis signaling-regulation kinase 1 (ASK1)﹔JNK﹔AP-1﹔Bim﹔腦部內皮細 胞﹔細胞凋亡﹔訊息傳遞
二、英文摘要
Several clinical studies demonstrated that plasma level of low density lipoprotein (LDL) are significantly higher in patients with stoke. Dysfunction of the endothelium is a hallmark of the early atherosclerotic lesion and ox-LDL activates cerebral endothelial cells (CEC), leading to an alteration of the functional and structural integrity of the endothelial barrier. CECs have distinct morphological and functional properties that are essential for strict exchange of water and nutrients between blood and brain. Since oxidant LDL (ox-LDL) might play an important role in the pathology of stroke due to cerebral vasculature dysfunction. However, the mechanism of ox-LDL-induced CEC apoptosis is still unclear. In this project, we interested to explore the role of apoptosis signaling-regulation kinase 1 (ASK1) and JNK on ox-LDL-induced CEC apoptosis.
Treatment of CECs with Ox-LDL induced CEC apoptosis in a concentration-dependent manner. Treatment of CECs with κ-carrageenan (Lox-1 receptor inhibitor) and Lox-1 antibody both inhibited ox-LDL-induced CEC apoptosis. Cells transient transfection with dominant negative mutant of ASK1 (ASK1 DN) inhibited ox-LDL-induced CEC apoptosis.
We also found that ox-LDL induced ASK1 kinase activity and dephosphorylation of ASK at Ser967. Moreover, CECs treatment with ox-LDL induced 14-3-3 disassociation with ASK1. SP 600125 (a selective JNK inhibitor) and JNK1 DN and JNK2 DN all inhibited ox-LDL-induced CEC apoptosis.
Treatment of CEC with ox-LDL caused JNK kinase activity and phosphorylation in a time-dependent manner. Cells transient transfection with ASK1 DN inhibited ox-LDL-induced JNK phosphorylation.
Treatment of cells with curcumin (AP-1
inhibitor) inhibited ox-LDL-induced CEC apoptosis. Treatment of CECs with Ox-LDL induced AP-1 specific protein-DNA binding activity. To further investigate the role of Bim in ox-LDL-mediated CECs apoptosis.
Treatment of CECs with Ox-LDL induced BimS expression in a dose dependent manner. These results indicate that ox-LDL induced ASK1/JNK/AP-1 signal pathway to mediate Bim expression and finally induced CEC apoptosis.
Keywords: stroke, oxidized low density lipoprotein (ox-LDL), apoptosis signaling-regulation kinase 1 (ASK1), JNK, AP-1, Bim, cerebral endothelial cells (CECs), apoptosis, signal transduction
三、報告內容[前言及文獻探討、研究目 的、研究方法、結果與討論(含結論與建 議)]
前言、文獻探討及研究目的
許多的研究顯示，中風病人其血中的膽固 醇、三酸甘油脂及低密度脂蛋白有含量過 高的現象。目前已知 ox-LDL 會沉積在血 管壁上造成動脈硬化斑塊(Kume et al., 2001)。此外，中樞神經系統也存在著大量 的膽固醇，且為神經髓鞘的組成之一。中 樞的膽固醇除了可以藉由中樞神經細胞的 合成之外，也會透過血腦障蔽自血漿中緩 慢 地 攝 取 至 腦 組 織 中(Sugawa et al., 1997)。直到目前為止，氧化態的低密度脂 蛋白被認為是造成膽固醇過度沈積於血管 壁的主因，也是導致動脈粥狀硬化的重要 過程(Kume et al., 2001)。此外，氧化態低 密度脂蛋白除了造成脂質堆積外，它也會 引起內皮細胞發炎或是凋亡。氧化態低密 度脂蛋白也會造成細胞外基質的斷裂降解 而使得動脈硬化斑塊不穩定及剥離，進一 步導致心肌梗塞或中風的產生(Kume et al., 1994)。由以上的結果顯示，氧化態低 密度脂蛋白作用至內皮細胞產生的反應如 活化、細胞凋亡及內皮細胞功能喪失在中 風的形成扮演著舉足輕重的角色。
氧化態低密度脂蛋白目前被認為是引起動 脈硬化的主因，但是氧化態低密度脂蛋白 造成動脈硬化的詳細機轉目前仍不十分清 楚。近來有報導指出，Lox-1 會媒介氧化
態低密度脂蛋白的作用而在內皮細胞增加 自由基的產生並活化NF-κB、增加細胞黏 附分子的表現及增加低密度脂蛋白受體 (LDL-R)的表現(Cominacini et al., 2000;
Hu et al., 2003; Sakurai et al., 2003; Kume et al., 2004)。此外也有報導指出，氧化態 低密度脂蛋白會透過 Lox-1 活化 caspase 而誘導細胞凋亡(Shin et al., 2004)。而內皮 細胞死亡特別是腦部血管內皮細胞死亡將 導致血腦障蔽破壞而誘發腦血管疾病如中 風的主因。因此，在本子計劃中，我們將 探討氧化態低密度脂蛋白誘導腦部血管內 皮細胞(cerebral endothelial cells, CECs)功 能喪失及死亡的分子機制。
氧化態低密度脂蛋白的組成包含了典型的 脂質過氧化產物如: LOOHs、4-HNE 或 oxysterols，並有報導指出氧化態低密度脂 蛋白具有神經細胞毒性(Keller et al., 1999 ; Sugawa et al., 1997)。除了在神經細胞外，
目前也有部分報告指出，氧化態低密度脂 蛋白在其它的細胞也會誘導細胞凋亡，例 如在小腸細胞引起粒腺體媒介的細胞凋亡 (Giovannini et al., 2002)。由此得知氧化態 低密度脂蛋白可經由不同的路徑誘導細胞 的死亡。然而，直到目前為止，氧化態低 密度脂蛋白對於腦內皮細胞死亡則尚未被 探討，也是本子計劃研究的重點。腦部血 管內皮細胞為構成血腦障蔽的主要組成，
可以調控血液與腦部間水份及其他營養物 質的交換，並防止一些傷害性物質進入腦 部且維持中樞神經系統的恆定(Rubin et al., 1999)。當大腦內皮細胞因缺血性損傷 而產生細胞凋亡後，會導致血腦障壁的崩 解，而加重大腦缺血性的損傷(Zhang et al., 2000)。一旦氧化態低密度脂蛋白誘導腦部 內皮細胞活化甚至細胞凋亡時，這將會促 使內皮細胞所組成的血腦障蔽通透性增加 及破壞，使得氧化態低密度脂蛋白及其他 毒性物質更容易通過血腦障蔽而沉積於腦 部血管形成斑塊，或是引發血栓而更進一 步導致血管失去功能造成中風。因此，氧 化態低密度脂蛋白在中風疾病中扮演著重 要的角色，但是氧化態低密度脂蛋白造成 大腦內皮細胞毒性詳細的分子作用機制到 目前還不清楚，值得做深入的探討。
細胞凋亡在多細胞有機體的發育過程及維
持組織恆定上是一個相當重要的調控機 制，當細胞凋亡機轉失去平衡則會導致許 多疾病的發生，其中包括神經退化性疾 病、癌症及中風等(Arends et al., 1991；
Thompson et al., 1995)。細胞凋亡又稱做程 序性的細胞死亡，其特徵有細胞質縮小且 有細胞小體的出現、細胞核濃染、DNA階 梯斷片的產生以及細胞膜上磷脂質的再分 佈即Phosphotidylserine外翻至細胞膜外等 現象(Fadok et al., 1992; Jacobson et al., 1997; Nagata et al., 1997)。這些型態的變化 主 要 是 進 行 細 胞 自 然 淍 亡 時 ， 因 活 化 caspase (cysteine aspartate-specific protease) 而進一步切割細胞內的受質所致。細胞凋 亡進行與否則取決於細胞所接受外來的訊 息 而 影 響 生 存 或 死 亡 間 的 平 衡 所 調 控 (Musci et al., 1997)。細胞凋亡的過程中，
會受到許多不同蛋白的調控，其中包括 Bcl-2 家族。當細胞受到死亡刺激時，Bcl-2 家族成員中拮抗和促進細胞凋亡兩類蛋白 間的平衡將調控粒腺體的反應(Martinou and Green, 2001)。拮抗細胞凋亡的成員如 Bcl-2, Bcl-xL和Mcl-1 會保護維持粒腺體的 完整性，然而促進細胞凋亡的家族成員則 會使得粒腺體釋放一些促進細胞凋亡的蛋 白 ， 其 中 包 括Bim 而 導 致 細 胞 的 死 亡 (Adams et al., 1998)。
ASK1 是 mitogen-activated protein (MAP) kinase kinase kinase 家族成員之一，它可活 化JNK 和 p38 MAPK 訊號傳遞路徑(Ichijo et al., 1997)。在許多不同細胞過度表現持 續活化的 ASK1，會引起粒腺體依賴性的 caspase 活化及細胞的凋亡(Kanamoto et al., 2000 ; Hatai et al., 2000)。ASK1 也被認為 參與在氧化態壓力或是內質網媒介所引起 的 細 胞 凋 亡 中 (Tobiume et al., 2001;
Nishitoh et al., 2002)。此外，許多報導也 指出，在發炎細胞激素及許多種壓力，例 如：死亡受體 Fas 的活化皆可造成 ASK1 的活化(Ichijo et al., 1997；Gotoh et al., 1998)。經由這些研究的結果顯示，ASK1 在細胞凋亡的過程中扮演著舉足輕重的角 色。因此，了解 ox-LDL 如何調控腦部血 管內皮細胞ASK1 及下游 JNK 的活化進而 誘導內皮細胞功能喪失及死亡，是一個值 得研究的課題。
Thioreducin (Trx)可以藉由結合至ASK1 的 氮端而抑制ASK1 的激酶活性(Liu and Min, 2002)。許多活性態氧化物質，例如H2O2， 它 可 以 導 致Trx 和 ASK1 的 分 離 ， 接 著 ASK1 本身會形成雙分子的複合體，而在 Thr845 或是Thr838 的位置進行自體磷酸 化的作用，而活化(Gotoh et al., 1998; Liu and Min, 2002; Tobiume et al., 2002)。另外 ASK1 的活性也會被負向調控蛋白磷酸分 解酶PP5 所抑制，PP5 會使得ASK1 去磷酸 化而失去活性(Morita et al., 2001)。目前也 有報導指出Akt也可以負向調控ASK1 的 活性，使得細胞得以存活下去(Zhang et al., 1999 ; Kim et al., 2001)。例如在L292 細胞 在去除血清的狀態下會使得內生性ASK1 的激酶活性增加，而同時給與IGF-1 使得 PI3K/Akt訊息路徑活化的情況下，則會在 ASK1 的Ser83 胺基酸殘基位置上進行磷 酸化，進而使得ASK1 和 14-3-3 蛋白結合 並抑制ASK1 的活性，而促使細胞得以存 活(Zhang et al., 1999 ; Kim et al., 2001)。因 此本實驗的主要假說為氧化態低密度脂蛋 白透過LOX-1 活化ASK1/JNK/AP-1，進而 引發促進細胞凋亡Bim蛋白的表現，最後 造成腦血管內皮細胞的凋亡進而使得血腦 障蔽破壞。希望藉此計劃的完成可進一步 瞭解氧化態低密度脂蛋白調控腦內皮細胞 凋亡的機轉，並發展出治療氧化態低密度 脂蛋白誘發腦血管疾病的治療方針。
3
研究方法
1. 細胞培養:將老鼠大腦內皮細胞培養在 DMEM含有 10%胎牛血清及抗生素(100 units/ml penicillin 及 100 µg/ml streptomycin)中以進行下列的實驗。2. 氧 化低密度脂蛋白的製備:以人類血液來製 備ox-LDL 。 3. MTT 分 析 : 可 用 來 評 估 ox-LDL對於腦內皮細胞存活率的影響。4.
流式細胞儀測定以PI 染色的細胞來比較 細 胞 死 亡 的 程 度 。5: 西 方 點 墨 法 : 測 定 ASK1-p、ASK、JNK-p、JNK及 14-3-3 等 蛋白的變化。6:免疫沈澱法及蛋白激酶活 性測定:測定ASK1 及JNK的活性。7:統計 方法:所有實驗數據皆以平均值±標準差 (mean ± S.E.M) 表 示 ， 並 以 Analysis of
Variance (ANOVA)配合Dunnet’s test分析 比較各組間是否有顯著差異。p < 0.05 視 為有統計上的意義。
研究目的
台灣在出血性或缺血性中風的發生率上始 終高於西方國家，根據行政院衛生署統計 中風疾病久為國人十大死因的第二名，因 此中風疾病在台灣對於整個醫療體系，甚 至整個社會的影響實為沉重的負荷，中風 發生原因包括腦部組織因腦部內皮細胞喪 失功能引起血管栓塞失去血液循環造成缺 氧而引起組織壞死。腦部血管內皮細胞為 構成血腦障蔽的主要組成，一旦 ox-LDL 誘導腦部內皮細胞活化甚至細胞凋亡將促 使內皮細胞通透性增加及血腦障蔽破壞，
使得 ox-LDL 及其他毒性物質更容易通過 血腦障蔽而沉積於腦部血管形成斑塊，或 是引發血栓而更進一步導致血管失去功能 造成腦部的傷害如中風。因此，ox-LDL 在中風疾病中扮演著重要的角色，這促使 我們有興趣進一步探討 ox-LDL 對於構成 血腦障蔽的腦部血管內皮細胞的作用，特 別是細胞凋亡及其詳細的分子作用機轉。
因此本實驗主要探討 ox-LDL 經由何種訊 息傳遞路徑來增加 ASK1/JNK/AP-1 的活 性，進而引發腦內皮細胞凋亡的機制。希 望藉此計劃的完成可進一步瞭解 ox-LDL 調控腦內皮細胞凋亡的機轉，並且發展出 治療ox-LDL誘發腦血管疾病的治療方針。
結果
氧化態低密度脂蛋白經由濃度依賴性關 係降低腦部內皮細胞的存活率
為了了解氧化態低密度脂蛋白對腦內 皮細胞存活率的影響。我們利用 MTT 的 方式加以評估。圖一顯示，在腦內皮細胞 中，給予不同濃度的ox-LDL (3 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml, 24 h)，呈現濃度相關曲線降低腦內 皮細胞的存活率。在ox-LDL 50 µg/ml 及 100 µg/ml 處理下分別可降低腦內皮細胞 存活率約60%及 91% (圖一)。
(圖一)
氧化態低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導腦部 內皮細胞凋亡
利用流式細胞儀方法發現 ox-LDL (3 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml, 24 h)可以明顯增加腦部 內皮細胞位於sub G1 phase 的細胞數目亦 即細胞凋亡的細胞數量。於 ox-LDL 200 µg/ml 處理下，可誘導腦內皮細胞位於 sub G1 phase 的細胞數約 72% (圖二)。
(圖二)
氧化態低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導腦部 內皮細胞凋亡
利用 DNA 斷片的方法評估腦部內皮 細胞凋亡的程度。圖三顯示，在腦內皮細 胞中，給予不同濃度的ox-LDL (3 µg/ml,
10 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml, 24 h)，呈現濃度相關 DNA 斷片 產生的情況(圖三)。
(圖三)
κ-carrageenan 及 Lox-1 抗體抑制氧化態 低密度脂蛋白誘導腦部內皮細胞凋亡
接下來為了探討Lox-1 受是否參與在 ox-LDL 的過程中，老鼠腦內皮細胞先給 予κ-carrageenan (Lox-1 的拮抗劑) 24 小時 或 Lox-1 專一性抗體，隨後給予 ox-LDL (50 µg/ml) 刺激 24 小時，利用 MTT 分析 方法發現κ-carrageenan 及 Lox-1 抗體可以 明顯抑制 ox-LDL 降低腦內皮細胞存活率 的現象(圖四)。
(圖四)
ASK1 dominant negative plasmid (ASK1 DN) 抑制氧化態低密度脂蛋白誘導腦部 內皮細胞凋亡
接下來為了探討 ASK 的確參與在
ox-LDL 的 過 程 中 ， ASK1 dominant negative plasmid (ASK1 DN) 是否可以抑 制 ox-LDL 誘導腦內皮細胞的死亡。我們 利用轉染ASK1 DN (0.5 µg) 以及 pcDNA (0.5 µg, 作為控制組) 24 小時, 隨後給予 ox-LDL (50 µg/ml)刺激 24 小時，利用 MTT 分析方法發現 ASK1 DN 可以明顯抑制 ox-LDL 降低腦內皮細胞存活率的現象(圖 五)。
(圖五)
氧化態低密度脂蛋白誘導 ASK1 蛋白激酶 活性的增加
為了解ASK1 蛋白激酶在氧化態低密 度脂蛋白誘導腦內皮細胞死亡所扮演的角 色。接著我們將直接測定氧化態低密度脂 蛋白在腦內皮細胞所誘導的ASK1 蛋白激 酶 活 性 增 加 的 現 象 。 利 用 專 一 性 的 anti-ASK1 抗體做免疫沉澱及使用 MBP 當 作受質來測定其激酶活性。圖六顯示，在 腦內皮細胞中，給予氧化態低密度脂蛋白 (ox-LDL, 50 µg/ml)不同時間呈現時間相 關曲線增加ASK1 蛋白激酶的活性，且氧 化態低密度脂蛋白可在短時間內即迅速誘 導的ASK1 活化(圖六)。
(圖六)
氧化態低密度脂蛋白誘導 ASK1 蛋白之 Ser 967 的去磷酸化
接下來我們想探討ASK1 蛋白激酶活 性的增加是否經由 Ser967 的位置去磷酸 化而來。我們將老鼠腦部內皮細胞加入 ox-LDL (50 µg/ml) 刺激，發現在 1 分鐘 ASK1 有明顯的去磷酸化現象，且在 2 分 鐘的時候達到最大(圖七)。
(圖七)
氧化態低密度脂蛋白誘導 14-3-3 與 ASK1 分離
當ASK1 與 14-3-3 結合的時候，ASK1 呈現不活化的現象。接下來我們想要測試 ox-LDL 是否會誘導 14-3-3 與 ASK1 分 離 。 老 鼠 腦 內 皮 細 胞 加 入 ox-LDL (50 µg/ml)刺激，發現在 1 分鐘的時候 14-3-3 即有明顯與ASK1 分離，且此現象持續至 30 分鐘之久(圖八)。
(圖八)
SP600125 抑制氧化態低密度脂蛋白誘導 腦部內皮細胞凋亡
接 下 來為了 探 討 JNK 的確參與在 ox-LDL 的過程中，給予 JNK 特異性的抑 制劑SP600125 是否可以抑制 ox-LDL 誘導 腦內皮細胞的死亡。老鼠腦內皮細胞先給 予SP600125 (1 µM) 後再加入 ox-LDL (50
µg/ml) 刺激 24 小時後，利用流式細胞儀 方法發現 SP 600125 明顯抑制 ox-LDL 增 加腦部內皮細胞位於sub G1 phase 的細胞 數目亦即細胞凋亡的細胞數量(圖九)。
(圖九)
JNK1 DN 及 JNK2 DN 抑制氧化態低密度 脂蛋白誘導腦部內皮細胞凋亡
確定JNK 的確參與在 ox-LDL 的過程 中之後，我們進一步偵測JNK1DN 及 JNK2 DN 是否可以抑制 ox-LDL 誘導腦內皮細 胞的死亡。我們利用轉染JNK1DN 及 JNK2 DN (0.5 µg) 以及 pcDNA (0.5 µg, 作為控 制組)24 小時，隨後給予 ox-LDL (50 µg/ml) 刺激 24 小時，利用 MTT 分析方法發現 JNK1/2 DN 可以明顯抑制 ox-LDL 降低腦 內皮細胞存活率的現象(圖十)。
(圖十)
氧化態低密度脂蛋白誘導 JNK 蛋白激酶 活性的增加
為進一步了解 JNK 蛋白激酶在氧化 態低密度脂蛋白誘導腦內皮細胞死亡所扮 演的角色。我們直接測定氧化態低密度脂 蛋白在腦內皮細胞所誘導的 JNK 蛋白激 酶 活 性 增 加 的 現 象 。 利 用 專 一 性 的 anti-JNK 抗體做免疫沉澱及使用 c-jun 當 作受質來測定其激酶活性。圖十一顯示，
在腦內皮細胞中，給予氧化態低密度脂蛋 白(ox-LDL, 50 µg/ml)不同時間呈現時間 相關曲線增加JNK 蛋白激酶的活性，且在 30 分鐘時達到最大(圖十一)。
(圖十一)
氧化態低密度脂蛋白誘導 JNK 蛋白磷酸 化的增加
ASK1 引起細胞的死亡過程中，會經 由活化JNK 而誘導細胞的死亡。接下來我 們將測試ox-LDL 誘導 JNK 的活化是否經 由JNK 磷酸化而來。老鼠腦部內皮細胞加 入ox-LDL (50 µg/ml) 刺激，發現在 2 分 鐘 JNK 有明顯的被磷酸化，且在 30 分鐘 的時候達到最大(圖十二)。
(圖十二)
ASK1 DN 抑制氧化態低密度脂蛋白誘導 JNK 的活化
為了進一步確定 ASK1 參與 ox-LDL 誘導 JNK 活化的訊號傳遞過程中，給予
ASK1 DN 是否可以抑制 ox-LDL 誘導 JNK 的磷酸化。老鼠腦內皮細胞先轉染 ASK1 DN (0.5 µg) 24 小時，再加入 ox-LDL (50 µg/ml) 刺激 10 分鐘後，發現 ASK1 DN 明 顯抑制ox-LDL 誘導 JNK 的磷酸化，於是 推測 ox-LDL 在老鼠腦內皮細胞中所誘導 的細胞凋亡是經由 ASK1 活化 JNK 而來 (圖十三)。
(圖十三)
curcumin 抑制氧化態低密度脂蛋白誘導 腦部內皮細胞凋亡
接下來為了探討 AP-1 是否參與在 ox-LDL 的過程中，老鼠腦內皮細胞先給 予 curcumin (AP-1 抑制劑)，隨後給予 ox-LDL (50 µg/ml) 刺激 24 小時，發現 curcumin 可以明顯抑制 ox-LDL 降低腦內 皮細胞存活率的現象(圖十四)。
(圖十四)
氧化態低密度脂蛋白誘導 AP-1 對 DNA 結 合能力的增加
接下來將探討ASK1 引起的死亡過程 中，是否會經由增加轉錄因子 AP-1 的活 性而誘導細胞的死亡。我們利用細胞核蛋
白質萃取及電泳遷移分析 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA )，在腦內皮細 胞中，給予氧化態低密度脂蛋白 (ox-LDL, 50 µg/ml)依時間相關曲線增加 AP-1 對 DNA 結合的活性(圖十五)。
(圖十五)
氧化態低密度脂蛋白誘導 Bim 蛋白表現 量增加
為 進 一 步 了 解 Bim 是 否 參 與 在 ox-LDL 誘導腦內皮細胞的死亡。我們以 西方點墨法分析三種 Bim 蛋白異構型 (isoform)的表現量。老鼠腦部內皮細胞加 入ox-LDL (50 µg/ml) 刺激不同時間呈現 時間相關曲線增加，發現在1 小時 Bim 蛋 白 S 異構型的表現量有明顯增加，且在 2 小時達到最大。而 EL 與 L 異構型則無明 顯的變化(圖十六)。
(圖十六)
氧化態低密度脂蛋白誘導 Bim promoter luciferase 的活性增加
為了直接偵測Bim活化的情形，我們 轉 染pGL3-Basic-Bim promoter luciferase 24 小時，隨後投以ox-LDL 不同濃度刺激
6 小時，發現不同濃度呈現濃度相關曲線 增 加 ， 在 10µg/ml 時 Bim promoter luciferase活性有明顯增加，在 20µg/ml 達到最大值(圖十七)。
(圖十七) 討論(含結論與建議)
經由此計劃的完成，將有助於了解氧 化態低密度脂蛋白引發腦部內皮細胞凋亡 的機轉及血腦障蔽破壞進而增加中風疾病 罹患之機會之相關性。並可更進一步釐清 ASK1 在氧化態低密度脂蛋白的作用中所 扮演的角色。在本年度的研究中，我們探 討ASK1、JNK 及 AP-1 參與在腦內皮細胞 的死亡。未來我們也將詳細探討ASK1 的 活性會受何種磷酸分解酶或蛋白激酶所調 控，以及所誘導出的ASK1 活性增加又會 與其胺基酸殘基特定位置上的磷酸化程度 之間的相關性，最後引起大腦內皮細胞凋 亡及血腦障蔽破壞的現象。希望藉此研究 能夠在血脂過高或是具有動脈粥狀硬化病 人中引發中風疾病的治療上提供一個新方 向。
五、參考文獻
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