Effect of the Submerged Fermentation Product of Antrodia camphorata Cultured Using Deep Ocean Water on the Prevention of Thioacetamide-induced Hepatic Cirrhosis

國立台東大學生命科學系 碩士論文

Department of Life Science National Taitung University Master Dissertation

探討利用深層海水培養牛樟菌液態發酵產物對預防硫代 乙醯胺誘發肝硬化之影響

Effect of the Submerged Fermentation Product of Antrodia camphorata Cultured Using Deep Ocean Water on the Prevention of Thioacetamide-induced Hepatic Cirrhosis

研究生：郭耀文 Student: Iau-Uen Kuo 指導教授：李俊霖 博士 Advisor: Chun-Lin Lee, Ph.D.

中華民國一○一年一月

January 2012

Abstract

Antrodia camphorata is a unique fungus in Taiwan, the fruit body of A.

camphorata often used as liver disease treatment. But the fruit body of Antrodia camphorata is difficult to be obtained, and also expensive, now submerged fermentation is usually used to culture the mycelia of A. camphorata. The deep ocean water (DOW) contains rich metals and trace elements (Ca²⁺, Mg²⁺, PO42-

, etc.) promoting the yeast growth or functional activity of Aspergillus. In this study, the fermentation study was divided into four phases; first we used different proportions of DOW (0%, 25%, 50%, 75%, and 100%) for the fermentation of A. camphorata, then measure the antioxidative ability and component of A. camphorata. The assessment of the targets included: biomass, free radical scavenging test, reductive ability determination, triterpenoids analysis, polysaccharides quantification, total polyphenols quantification, flavonoids quantification, etc. Second we added the extra major ions at a equal concentration with the (Mg²⁺, Na⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Fe^3-, K⁺) of DOW into ultra-pure water (UPW) medium for the culture of A. camphorata in order to understand the effect of ions on the production of the functional metabolites of A.

camphorata, and select the major ions stimulation the growth and metabolite production of A. camphorata. Third the ions and nitrogen source (yeast extract) with increasing concentrations was added into DOW medium in order to select the optimal concentration of target ions and yeast extract for the fermentation of A. camphorata.

Fourth the concentration of target ions and yeast extract were selected as the three factors of response surface methodology (RSM) to investigate the optimal condition for the fermentation of A. camphorata.On the result increasing the proportion of DOW water increased the biomass triterpenoids, polysaccharides, total polyphenols, and total flavoids. Antioxidative test showed that A. camphorata fermented using 100% DOW has better antioxidative ability, therefore, DOW effectively enhance the production of the functional metabolites of A. camphorata.Furthemore, Mg²⁺ and Zn²⁺

had more effect on enhancing the mycelia growth. The third stage results show that DOW medium including extra Mg²⁺ and yeast extract was able to enhance biomass, intracellular polysaccharide and extracellular polysaccharide content of A.

camphorata with dose dependent-response. Therefore, Mg²⁺, yeast extract and glucose were selected as the three factors of RSM for the study of optimal condition.

The statistic regressions of the target effectors had high R² value. The optimum conditions was selected according to overlapped plot, which the is 1.65 g/L Mg²⁺, 15.85 g/L yeast extract, and 4% glucose. In the evaluation for the prevention from Liver crossis, A. camphorata-fermentated product (DOW-AC-1X) cultured by DOW

prevented the weight loss induced by TAA, and had more effect on inhibiting the MDA and ROS generation than one dosage of ROW-AC. The western blot experiments show that the iNOS protein expressing of DOW-AC-1X and DOW-AC-2X are lower than that of ROW-AC-1X. The histologic H&E stain and collagen stain showed that DOW-AC-1X has a better ability to prevent the liver damage and crossis, and DOW-AC-2X has a more significant effect. The results showed that using DOW as culture water functional metabolite production and the liver protection of A. camphorata under the submerged fermentation.

Keyword: Antrodia camphorata, Deep ocean water, Response surface methodology, Hepatic Cirrhosis

縮寫表 (Abbreviations)

AC AAPH AST ALT α-SMA BCA DPPH DOW DDW ECM Gpx HSC iNOS PDA ROS ROW RSM SOD TAA TNF-α TBARS TCA TBA UPW

Antrodia camphorata

2,2-azobis 2-amidinopropane dihydrochloride Aspartate aminotransferase

Alanine transaminase α-smooth muscle actin Bicinchoninic acid

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy Deep ocean water

deuterium depleted water Extracellular matrix Gluthatione peroxidase Hepatic stellate cell

Inducible nitric oxide synthase Potato dextrose agar

Reactive oxygen species Reverse osmosis water

Response surface methodology

Superoxide dismutase Thioacetamide

Tumor necrosis factor-alpha

Thiobarbituric acid reactive substances Trichloracetic acid

Thiobarbituric acid Ultra-pure water

摘要

樟芝 (Antrodia camphorata) 為台灣特有之真菌，樟芝子實體常應用於治療 肝臟疾病，因樟芝子實體取得不易，且價格昂貴，目前常以液態發酵方式培養樟 芝菌絲體。深層海水中富含豐富的無機鹽與微量元素 (Ca²⁺、Mg²⁺、PO42-

等離 子)有促進酵母菌生長或麴菌的活性功能。本研究發酵分為 4 階段，第一階段利 用不同比例深層海水 (0%、25%、50%、75%、100%) 進行樟芝發酵，探討樟芝 抗氧化及成分之分析，評估項目 : 菌絲體乾重、清除自由基試驗、還原力測定、

三萜類分析、多醣定量、總多酚定量、總黃酮定量等試驗。第二階段以超純水培 養基中額外添加深層海水之等量主要離子 (Mg²⁺、Na⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、K⁺) 培 養樟芝，評估樟芝功效代謝物之差異，篩選出提升樟芝生長之主要離子。第三階 段利用深層海水培養基中額外添加不同濃度之離子及氮源 (yeast extract) 評估 樟芝發酵生長之影響，並篩選出適合培養樟芝之離子及氮源濃度。第四階段部分，

利用第三階段篩選出之離子及氮源濃度，探討反應曲面法之三因子，找出樟芝培 養之最適條件。第一階段結果顯示，提高深層海水比例能提高樟芝菌絲體乾重及 三萜類、多醣、總多酚與總黃酮含量，抗氧化試驗顯示，100% 深層海水發酵的 樟芝有較佳的抗氧化能力，因此提高深層海水比例能有效提升樟芝代謝物成分之 含量。第二階段結果發現，在超純水添加與深層海水中主要離子相當濃度之單一 離子，各離子皆能提升菌絲體生長，其中以 Mg²⁺ 及 Zn²⁺ 為效果較佳。第三階 段於 DOW 培養基中添加不同濃度之 Mg²⁺、Zn²⁺ 與氮源 (yeast extract)，結果 發現 Mg²⁺ 及 yeast extract 對提升樟芝菌絲體含量、胞內多醣及胞外多醣含量有 劑量效應關係，因此選定 Mg²⁺ 及 yeast extract 並搭配碳源 (glucose) 為反應曲 面法之三因子。三變數三層階之反應曲面法試驗經統計分析後，發現樟芝發酵在 RSM 中具較高的 R² 值，而在篩選最適條件之等高線圖結果顯示，培養基條件 是以 1.65 g/L Mg²⁺ 與 15.85 g/L yeast extract 及 4% glucose 為樟芝最適之培 養基條件。在第二階段預防肝損傷之動物試驗中，餵食以 DOW 培養樟芝發酵 產物 (DOW-AC-1X) 能減緩經 Thioacetamide (TAA) 誘導之體重降低，且能更 有效抑制 MDA 與 ROS 之生成，在 western blot 試驗中顯示 DOW-AC-1X 與 DOW-AC-2X 之 iNOS 表現量比 ROW-AC-1X 更低。在組織切片之 H&E 及 collagen 中，顯示 DOW-AC 較 ROW-AC 有更有效的減緩肝臟纖維化之能力，

兩倍劑量之 DOW-AC 有更顯著之效果，由以上結果得之 DOW 發酵能增加樟 芝菌絲體生長、功效成份生成及預防肝臟纖維化之保護能力。

關鍵字：樟芝、深層海水、反應曲面法、肝硬化

Abstract:

Antrodia camphorata is a unique fungus in Taiwan, the fruit body of Antrodia camphorata often used as liver disease treatment. But the fruit body of Antrodia camphorata is difficult to be obtained, and also expensive, now submerged fermentation is usually used to culture the mycelia of Antrodia camphorate. The deep ocean water (DOW) contains rich metals and trace elements (Ca²⁺, Mg²⁺, PO42-

, etc.) promoting the yeast growth or functional activity of Aspergillus. In this study, the fermentation study was divided into four phases; first we used different proportions of DOW (0%, 25%, 50%, 75%, and 100%) for the fermentation of Antrodia camphorata, then measure the antioxidative ability and component of Antrodia camphorata. The assessment of the targets included: biomass, free radical scavenging test, reductive ability determination, triterpenoids analysis, polysaccharides quantification, total polyphenols quantification, flavonoids quantification, etc. Second we added the extra major ions at a equal concentration with the (Mg²⁺, Na⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, K⁺) of DOW into ultra-pure water (UPW) medium for the culture of Antrodia camphorata in order to understand the production of the functional metabolites of Antrodia camphorata, and select the major ions stimulation the growth and metabolite production of Antrodia camphorata. Third the ions and nitrogen source (yeast extract) with increasing concentrations into was added DOW medium in order to select the optimal concentration of target ions and yeast extract for the fermentation of Antrodia camphorata. Fourth the concentration of target ions and yeast extract were selected as the three factors of response surface methodology (RSM) to investigate the optimal condition for the fermentation of Antrodia camphorata.On the result increasing the proportion of DOW water increased the biomass triterpenoids, polysaccharides, total polyphenols, and total flavoids. Antioxidative test showed that Antrodia camphorate fermented using 100% DOW has better antioxidative ability, therefore, DOW effectively enhance the production of the functional metabolites of Antrodia camphorate.Furthemore, Mg²⁺ and Zn²⁺ had more effect on enhancing the mycelia growth. The third stage results show that DOW medium including Mg²⁺ and yeast extract was able to enhance biomass, intracellular polysaccharide and extracellular polysaccharide content of Antrodia camphorate with dose dependent-response.

Therefore, Mg²⁺, yeast extract and glucose were selected as the three factors of RSM for the study of optimal condition. The statistic regressions of the target effectors had high R² value. The optimum conditions was selected according to the overlapped plot, which is 1.65 g/L Mg²⁺, 15.85 g/L yeast extract, and 4% glucose. In the evaluation for the prevention from Liver crossis, Antrodia camphorate-fermentated product

(DOW-AC-1X) cultured by DOW prevented the weight loss induced by TAA, and had more effect on inhibiting the MDA and ROS generation than one dosage of ROW-AC. The western blot experiments show that the iNOS protein expressing of DOW-AC-1X and DOW-AC-2X are lower than that of ROW-AC-1X. The histologic H&E stain and collagen stain showed that DOW-AC-1X has a better ability to prevent the liver damage and crossis, and DOW-AC-2X has a more significant effect. The results showed that using DOW as culture water functional metabolite production increase the ability of the fermentation and the liver protection of Antrodia camphorate under the submerged fermentation.

Keyword: Antrodia camphorate, Deep ocean water, Response surface methodology, Hepatic Cirrhosis

目錄

縮寫表………I 中文摘要………II 英文摘要………IV 目錄………V

前言………1

第一章 文獻回顧………4

第一節 深層海水之介紹與保健功效………..4

第二節 樟芝介紹 ………9

第三節 肝硬化之介紹………18

第二章 實驗動機及目的與實驗架構………24

第一節 實驗動機及目的………24

第二節 實驗架構………25

第三章 實驗材料與方法………27

第一節 實驗材料………27

第二節 實驗方法………29

第四章 結果………42

第一節菌絲體生長及成份分析 ……… 42

第二節 培養基添加深層海水中主要離子對樟芝生長及成份之影響………48

第三節 深層海水培養基中額外添加不同濃度之 Mg²⁺、Zn²⁺ 與 yeast extract 對 樟芝生長及成份之影響………45

第五節 預防 TAA 誘發肝硬化動物試驗之影響………73

第 五章 討論……… …84

第六章 參考文獻...88

表次索引

表一、深層海水之成份分析………30

表二、三變數-三階層之中心旋轉組合設計………35

表三、大鼠各組試驗物質及餵食劑量………37

表四、利用深層海水與逆滲透水培養樟芝菌絲體成分之影響………43

表五、利用深層海水與逆滲透水培養樟芝發酵液成份之影響………44

表六、三變數三階層反應曲面實驗結果 ………57

表七、反應曲面試驗設計之變異數分析 ………60

表八、餵食樟芝菌絲體及發酵液對 TAA 誘發肝硬化之大鼠肝臟重量與體重增加 量之影響………75

表九、餵食樟芝菌絲體及發酵液對 TAA 誘發肝硬化之大鼠誘發前後之 AST 與 ALT 活性變化 ………78

圖次索引

圖二、樟芝菌絲形態………10

圖三、野生樟芝子實體………12

圖四、以太空包培養之樟芝………13

圖五、樟芝之椴木栽培………14

圖六、樟芝之液態發酵………15

圖七、TAA 經肝臟代謝所形成之 TASO2 所引起的肝損傷………20

圖八、TAA 所引起之肝臟自發性抗氧化系統防禦機制………22

圖九、實驗大綱架構圖………26

圖十、動物試驗日程………38

圖十一、不同比例之深層海水對樟芝菌絲體生產量及代謝成份差異之影響……45

圖十二、不同比例之深層海水對樟芝發酵液成份差異之影響………46

圖十三、不同比例之深層海水對樟芝抗氧化差異之影響………47

圖十四、深層海水與其主要離子對樟芝菌絲體生長之影響………49

圖十五、深層海水與其主要離子對樟芝胞內三萜類化合物含量之影響………50

圖十六、深層海水與其主要離子對樟芝胞內、胞外多醣及胞內 β-1,3 glucan 之影 響……… 51

圖十七、深層海水與其主要離子對樟芝胞內、胞外總多酚含量之影響 ………52

圖十八、於深層海水培養基中額外添加不同濃度之 Mg 離子對樟芝成份之影 響 ………53

圖十九、於深層海水培養基中額外添加不同濃度之 Zn 離子對樟芝成份之影響

………55 圖二十、於深層海水培養基中額外添加不同濃度之酵母萃取物對樟芝成份之影響

………56 圖二十一、三變數三階層之中心點旋轉組合之液態培養生長型態………62 圖二十二、深層海水之碳氮源及鎂離子添加對菌絲體生成量之反應曲面圖……63 圖二十三、Yeast extract、glucose 及 Mg²⁺ 對於深層海水培養之樟芝菌絲體中三 萜類生成量之反應曲面圖………64 圖二十四、Yeast extract、glucose 及 Mg²⁺ 對於深層海水培養之樟芝菌絲體及發 酵液多醣生成量之反應曲面圖………65 圖二十五、Yeast extract、glucose 及 Mg²⁺ 對於深層海水培養之樟芝菌絲體及發 酵液 β-1,3 glucan 生成量之反應曲面圖………67 圖二十六、Yeast extract、glucose 及 Mg²⁺ 對於深層海水培養之樟芝菌絲體及發 酵液總多酚生成量之反應曲面圖………68 圖二十七、Yeast extract、glucose 及 Mg²⁺ 對於深層海水培養之樟芝菌絲體及發 酵液總黃酮生成量之反應曲面圖………69 圖二十八、Yeast extract、glucose 及 Mg²⁺ 對於深層海水培養之樟芝菌絲體中三 萜類及 β-1,3 glucan 總含量之反應曲面圖………71 圖二十九、深層海水培養基中添加 Mg²⁺ 與 yeast extract 對菌絲體、胞內三萜 類及胞內 β-1,3 glucan 含量之等高線圖………72 圖三十、餵食樟芝菌絲體及發酵液對 TAA 誘發肝硬化之大鼠每週體重變化之影 響………74 圖三十一、餵食樟芝菌絲體及發酵液對 TAA 誘發肝硬化大鼠肝臟組織 MDA 含量之影響………76 圖三十二、餵食樟芝菌絲體及發酵液對 TAA 誘發肝硬化大鼠肝臟組織 ROS 含 量之影響………79 圖三十三、餵食樟芝菌絲體及發酵液對 TAA 誘發肝硬化大鼠肝 H&E 染色之影 響………80 圖三十四、餵食樟芝菌絲體及發酵液對 TAA 誘發肝硬化大鼠肝臟纖維化程度之影 響………82 圖三十五、餵食樟芝菌絲體及發酵液對 TAA 誘發肝硬化大鼠肝臟組織中iNOS 蛋

白表現量之影響………83

前言

肝損傷可分為酒精性肝損傷、病毒性肝損傷及化學 性肝損傷，初期肝損傷為細胞病變導致壞死，隨後引發 發炎反應，致使活化肝星狀細胞 (hepatic stellate cell, HSC) 轉變成肌纖維母細胞 (myofibroblast-like cell)，

此類細胞會大量分泌膠原纖維，長期推積而形成肝纖維 化 (fibrosis)，最後演變成肝硬化 (cirrhosis)，根據行政 院衛生署統計，98 年度慢性肝病及肝硬化，排行國內 十大死因之第八位。肝臟無痛覺神經，一旦肝臟長期受 到傷害、感染或發炎，可能會造成永久性的損傷，讓健 康細胞由功能不良的組織取代，如長期之大量之膠原生 成進而演化成膠原纖維，肝臟若受損的越嚴重時，就可 能導致轉變成肝硬化。

樟芝 (Antrodia camphorata) 只生長在台灣山區年 老的牛樟樹上，是台灣獨有的菇菌，樟芝又稱為樟菇、

牛樟菇、紅樟與樟內菇，僅生長在台灣特有的牛樟樹，

牛樟芝只生長在病倒的老牛樟樹，寄生於牛樟中空之內 壁上，是牛樟樹上唯一的木材腐杉菌，受感染的部分為 褐色，又稱褐腐菌，目前樟芝多醣研究出具有抗 B 型 肝炎活力效果 (Lee et al., 2002)，亦有研究指出樟芝多 醣能增強試驗動物的免疫力 (Lee et al., 2002)，使用樟 芝的水萃取物，除了能清除自由基外樟芝水萃取物能保 護 肝 臟 之 降 低 乙 醇 誘 導 細 胞 凋 亡 試 驗 (Hseu et al., 2002)。

深層海水位於 200 公尺以下，陽光照射不到，具 有不受到微生物或病原菌汙染條件，因此有清澈乾淨性 的特性，無機營養豐富性，深層海水優於表層海水主要 有礦物質豐富、細菌不易生存、終年恆溫與水質穩定等 特色 (王等，2003)，深層海水因為終年低溫的特質，

讓細菌不易生存，微生物汙染較少，且較不易陸水 (河

川、雨水)、大氣及生物性與化學性之汙染 (王等，2003)，

是較為乾淨的水源。清酒、醬油、味噌等發酵食品的製 造，其成份有 Mg

與 Ca

離子以及營養元素 P 離 子等三種主要元素，可增加酵母菌的繁殖 (久武陸夫，

2000)，Mg

離子能使釀酒酵母產量增加 (Graeme and Pollack, 1996; Nozaki et al., 1996)，磷酸鹽與硝酸鹽有助 於食用真菌的菌絲體生長速率，且有助於增加麴菌的生 長活性。利用深層海水發酵之紅麴山藥比逆滲透水發酵 之紅麴山藥在降血脂及體脂能力能更為顯著降低體重 增加量、總體脂率、脂肪細胞截面積及血清中的三酸甘 油酯與肝臟總膽固醇 (龔，2010; Lee et al., 2011)

樟芝本身具備抗氧化、抗發炎及保護肝臟等功效，

而深層海水能促進微生物生長與發酵作用，本研究目的 在探討深層海水發酵樟芝與逆滲透水發酵樟芝抗氧化 能力之差異與成份之影響，及評估深層海水培養樟芝是 否更具保護肝臟之能力。本研究利用不同比例深層海水 培養樟芝，評估深層海水對樟芝發酵之影響，並在超純 水中添加與 DOW 等量之單一離子以探討對樟芝之生 長與功效代謝物三萜類、β-1,3 glucan、多醣、多酚與 總黃酮等生成量之影響。進而利用篩選出之功效離子，

於深層海水培養基中額外添加，期望再提升深層海水樟 芝之菌體及功能代謝產物量，由以上試驗篩選出反應曲 面法之三因子，探討樟芝培養之最適條件。

樟 芝 發 酵 產 物 對 預 防 肝 硬 化 之 動 物 實 驗 以

ROW-AC 和 DOW-AC 比較護肝能力差異，在預防

TAA 誘發肝硬化之動物試驗中，探討 ROW-AC 與

DOW-AC 對改善 TAA 誘發大鼠肝損傷之能力，其中

進行肝臟組織切片染色，分為 H&E stain 及 collagen

stain 判斷肝臟受損與纖維化之情形，分析肝臟組織中

氧化發炎程度，藉由評估肝臟組織 MDA 生成量及其

各抗氧化酵素在肝臟中含量的多寡以比較 DOW-AC

及 ROW-AC 對 TAA 誘發肝硬化之改善效果。為深入

了解其作用機制，分析 α-SMA 蛋白質表現量以評估

肝臟細胞被活化成不正常分泌胞外基質狀態的多寡，

TNF- α 及 iNOS 表現分析評估肝臟發炎反應的程度，

綜合以上研究內容將有助於探討 DOW 發酵之樟芝是

否有更好的預防肝硬化之代謝產物生成及改善效果。

文獻回顧

第一節 深層海水之介紹與保健功效

一、 深層海水之介紹

深層海水位於 200 公尺以下，陽光照射不到，具有不受到微生物或 病原菌汙染條件，因此有清澈乾淨性的特性，無機營養豐富性，因為植 物性的浮游生物無法存活於此，所以氮、磷、矽、硝酸等無機營養鹽類 都無法被消耗，由於深層海水位在光線無法到達之深海處，水溫比表層 海水低，水溫變化幅度不大，故常年處於低溫狀態之情形非常穩定，而 我國海域深層海水水溫為 6 ~ 9℃，水壓高達 20 個大氣壓以上 (王等，

2003)，深層海水若將水分、鹽分與礦物質分離後，即可萃取出高量的礦 物質與微量元素；而礦物質包含鎂、鈣、鉀等，微量元素包含鋅、銅、

磷、硼、硒等高達九十多種。其中，硒因為日常生活中不易取得，一旦 人體中缺少了硒，則罹患糖尿病、心臟病與癌症機率則相對的增加。而 在深層海水中所含有的硒，對於缺乏硒的人體中，具有極大的助益 (王等，

2003)。

(一) 深層海水之特性：

有清澈乾淨性、無機營養豐富性、低溫安定性、微量礦物質等特性，

深層海水優於表層海水的主要因素有：礦物質豐富、細菌不易生存、終 年恆溫與水質穩定等特色 (王等，2003)，深層海水因為終年低溫的特質，

讓細菌不易生存，微生物汙染較少，且較不易陸水 (河川、雨水)、大氣 及生物性與化學性之汙染 (王等，2003)，是較為乾淨的水源。因為深層 海水位於表層海水 200 公尺以下，陽光照射不到，因而微生物無法生存，

因此留下大量的無機鹽類 (如圖一)，例如：氮、磷、矽、硝酸鹽等，可 利用這些豐富的無機鹽類，開發成較高經濟價值的產品。因為位於表層 海水 200 公尺以下，陽光照射不到，因此水溫起伏不大，根據調查，我 國海域深層海水的水溫為 6 ~ 9℃，水壓高於 20 個以上的大壓力 (王等，

2003)。經脫鹽後，能保留大量的礦物質，而這些礦物質包含鎂、鈣、鉀 等約有 90 餘種，其中有些微量礦物質是生物體很重要的元素或輔因子，

這是深層海水有豐富的微量礦物質特性。較於其他水源的污染性較低，

水分子團穩定，所以較其他水源較成熟。因深層海水不受陽光、環境或 其它因素而汙染，故水質極為穩定 (王等，2003)，深層海水的水資源高 達 1.30 × 10⁸ 噸，且深層海水可經循環再次利用。

圖一、深層海水示意圖 (陳等，2003)

Fig. 1. The schematic diagram of deep Deep ocean water.

(二) 深層海水之保健功效 ：

1. 預防心血管疾病：餵食深層海水可降低高膽固醇兔血清中的脂質含量，

防止血栓形成 (Yoshioka et al., 2003; Katsuda et al., 2008)。

2. 改善皮膚炎：攝取 DOW 能提高身體礦物質鉀之濃度，並能減少有毒 礦物質汞及鉛之含量，飲用 DOW 能改善過敏性皮膚炎 (Kimata et al., 2002)。DOW 具有降低患者血清中 IgE 與減少誘發發炎因子 IL-4、

IL-13 和 IL-18 之能力，然而攝取蒸餾水則無此功能 (Hataguchi et al., 2005)。

3. 預防糖尿病：近年來 DOW 在研究上開始被重視及應用於治療生活上 之疾病，DOW 探討抗肥胖及糖尿病於 ob/ob 小鼠的影響，動物隨機 分組每組六隻共分為兩組，分別利用自來水與硬度 1000 之 DOW 試 驗 84 天。試驗 84 天後發現 DOW 與 control 相較之下有 7% 體 重下降之變化，且 DOW 明顯比 control 顯著降低血清葡萄糖濃度 (35.4%)，結果顯示 DOW 能顯著的增加對餵食葡萄糖的耐受性程度。

DOW 也能降低血清中脂聯素含量、GLUT4 及 AMP 蛋白活化激酶，

綜合以上結果發現糖尿病與肥胖疾病能經由攝取 DOW 來達到調節 表現 糖尿病與肥胖疾病發生的機率，以上結果顯示長期攝取 DOW 有助於改善肥胖及預防糖尿病的可能性 (Hwang et al., 2009)。

4. 減少體脂肪：DOW 抑制 3T3-L1 脂肪細胞之分化作用在研究領域 3T3-L1 cell line 常被使用在體外脂肪細胞分化試驗，研究指出 DOW 能顯著降低脂質累積，並有劑量效應。DOW 硬度在 1000 時有最佳 抑制 3T3-L1 分化成脂肪細胞之能力，且對 DOW 細胞不具任何毒性，

DOW 能有效降低脂肪結合蛋白脂聯素 (adiponectin) 含量及減少 PPAR gamma 與 C/EBP alpha 之 mRNA 蛋白表現量，研究指出 DOW 能抑制脂肪結合蛋白表現且具減少肥胖作用，且能降低脂肪細 胞轉錄因子及脂肪細胞之特殊蛋白之表現 (Hwang and Kim, 2009;

Yoo et al., 2009)。

(三) 深層海水中微量元素之功能：

1. 鎂 (Magnesium, Mg)：各種酵素的活化，DNA、RNA、蛋白質合成 的元素，神經、骨骼、肌肉形成元素之一。

2. 鈣 (Calcium, Ca)：為骨骼結構肌肉、神經的功能元素，缺乏時可能 導致骨質疏 鬆症或軟骨症狀的發生。

3. 鐵 (Iron、Ferrum, Fe)：人體中運輸氧氣至各器官及造血最重要的元 素，缺乏鐵時會容易貧血、疲倦、易累，即是因為缺乏鐵質所導致 的血紅素的形成降低，造成貧血，使血液運送氧氣的能力下降，造 成的疲勞。

4. 鋅 (Zinc, Zn)：擁有合成 DNA 或 RNA 之重要功能，於細胞之分 裂扮演重要角色，也為身體成長、發育、傷口癒合重要元素。缺乏 時會生長遲緩、味覺降低、性器官發育不良、免疫力下降、傷口癒 合不良。

5. 錳 (Manganese, Mn)：關係著骨骼的形成與維持，是氧的活性基，

也影響新陳代謝與人體的成長。

6. 銅 (Cupric, Cu)：血紅素及一些結締組織形成的要素。缺乏銅會導致 貧血、神經系統失常、免疫失調、失去色素沈著性、結締組織不健 全。

7. 鉀 (Potassium, K)：神經系統的傳導、肌肉收縮的作用、調節體內酸 鹼值。缺乏鉀元素時可能心律不整、生長緩慢、骨肌麻痺。

8. 硒 (Selenium, Se)：是男性的精子合成時之重要元素；其功能有防癌、

防心臟病到抗氧化，且醫學上也發現硒和維生素 E 互助合作，可以 共同防止氧化所引起的疾、老化和組織硬化。缺少硒可能有罹患心 臟病的可能。

9. 鎳 (Nickel, Ni)：體內多種酵素的催化劑、細胞膜代謝的重要角色。

缺乏鎳會引起生殖機能降低、肝臟及腎臟機能降低、血紅蛋白減少。

10. 鉻 (Chromium, Cr)：胰島素重要輔助因子及元素，幫助葡萄糖代謝。

缺乏可能引起糖尿病、葡萄糖耐變性不良症狀。

11. 鉻 (Cobalt, Cr)：維生素 B12 的組成部分、促進核酸合成。

12. 鋰 (Lithium, Li)：有降低暴力攻擊及自殘傾向。缺乏可能發生抑鬱、

狂躁、自殺傾向及虐待行為。

13. 釩 (Vanadium, V)：促進骨骼與牙齒的形成、提高動物生育能力、促 進胰島素分泌、促進醣類代謝、降低血壓、降低膽固醇。缺乏釩時，

生長、骨骼及脂質代謝均受影響。

14. 碘 (Iodine, I)：人體中一半的碘素集中在甲狀腺，構成甲狀腺荷爾蒙。

人體缺乏碘時可能造成發育障害、知能血管、侏儒症、脈搏微弱、

身體水腫等現象。

15. 矽 (Silicone, Si)：矽參與多醣的代謝，與結締組織的彈性及結構有關，

為結締組織、皮膚及骨骼的生長所需。

16. 硼 (Boron, B)：促進骨骼合成、強化肌肉。缺少可能引起關節炎或 骨質舒鬆症發生之機率。

上述為人體所需之元素 (王，2003；阮等，2004；謝，2003；熊，2005；

劉等，2003；Swaine, 2000)，因深層海水脫鹽後，還保留大量的礦物元素，

因此是人體飲用，先前研究指出，飲用較高含量鎂離子與鈣離子之水份 可以降低腻血管疾病的死亡率，而且鎂離子與腻血管疾病有直接的關係 性，適量的攝取鎂離子能預防腻血管疾病的發生，且還有降低罹患高血 壓疾病的功能 (Laurant and Touyz, 2000; Champagne, 2008; Khan et al., 2010)。

(四) 深層海水於傳統發酵食品之微生物應用 ：

深層水應用在清酒、醬油、味噌等發酵食品的製造，其成份有 Mg²⁺

與 Ca²⁺ 離子以及營養元素 P 離子等三種主要元素，可增加酵母菌的繁 殖 (久武陸夫，2000)，Mg²⁺ 離子能使釀酒酵母產量增加 (Graeme and Pollack, 1996; Nozaki et al., 1996)，磷酸鹽與硝酸鹽有助於食用真菌的菌絲 體生長速率，且有助於增加麴的活性作用。因此，深層水釀造清酒時，

其酒精收穫量增加、雜味減少、香氣成份增加。製造醬油與味噌時，具 有促進總氮量、胺基酸及乳酸增加之功能。用以製造麵包，其膨脹率加 大、延展性持久，具有增加麵包柔軟度之功效。亦即適度的添加海洋深 層水，有助於提昇食品的品質 (黃，2003)。

(五) 深層海水於機能性微生物發酵生產及促進保健功效之相關研究：

1. 深層海水可控制高膽固醇兔血清中的脂質含量，例如總膽固醇與低密 度脂蛋白，而硬度 28、300 及 1200 之 DOW 隨著硬度提升有更好 的效果 (Yoshioka et al. 2003)。

2. 在高油飲食大鼠研究發現，深層海水發酵之紅麴山藥比 RO 水發酵之 紅麴山藥在降血脂及體脂能力上能更顯著降低體重變化量、總體脂率、

脂肪細胞截面積及血清中的三酸甘油酯與肝臟總膽固醇 (龔，2010;

Lee et al., 2011)。

3. 增加發酵代謝物方面，深層海水與逆滲透水發酵之紅麴，結果發現，

在 500 g 之紅麴山藥發酵規模中，深層海水添加量 80 mL、pH 3 ~ 4 能 提升 moanscin 與 ankaflavin 生成量，且能降低肝腎毒素 citrinin 含 量 (龔，2010)。

第二節 樟芝之介紹

一、 樟芝分類

樟芝 (Antrodia camphorata) 只生長在台灣山區年老的牛樟樹上，是 台灣獨有的菇菌，樟芝又稱為樟菇、牛樟菇、紅樟與樟內菇，僅生長在 台灣特有的牛樟樹，樟芝在學名上曾經有 4 次不同的名稱，最後吳等人 將 樟 芝 重 新 命 名 ， 在 分 類 上 樟 芝 屬 真 菌 界 (Fungi) 擔 子 菌 門 (Basidiomycota) 擔 子 菌 亞 門 (Basidiomycotina) 無 褶 菌 目 (Aphyllophorales) 多孔菌科 (Polyporaceae) 薄孔菌屬 (Antrodia) (Wu et al., 1997)。

二、 樟芝生長型態與特性

樟芝屬多年生菇菌，子實體無菌柄，外型與靈芝類的型態有很大的 不同，樟芝只生長於老齡的牛樟樹樹幹腐朽的心材內壁與枯死倒伏的牛 樟木陰暗潮濕的表面，牛樟樹為台灣獨有的常綠闊葉大喬木，主要分布 在台灣山區海拔 450 ~ 2000 公尺地區，生長最適時期在六月到十月，因 生長非常緩慢，所以要生產子實體是相當困難，非常耗費時間與成本。

樟芝味道極苦，子實體形狀呈板狀、馬蹄狀、鐘乳石狀或塔狀，表面佈 滿菌孔，週邊形狀常為放射反捲狀，貼附在木材表面向四周擴展生長，

呈半圓或不規則狀無柄，子實體新鮮時呈現橘紅色，日曬後呈現橘黃色，

老熟後的顏色呈桔色，厚實的子實體可大至 20 × 30 cm，超過 5 kg，但 需要很長的生長時間 (臧，1990)。樟芝生長以有性生殖為主，由擔子生 長形成菌絲 (如圖二)，這些菌絲由先端細胞分裂增值並與鄰近之菌絲形 成雙核細胞，雙核細胞分裂後會形成鉤狀的型態與其它菌絲體連接，當 生長至一定程度便能形成子實體。牛樟芝只生長在病倒的老牛樟樹，寄 生於牛樟中空之內壁上，是牛樟樹上唯一的木材腐杉菌，受感染的部分 為褐色，又稱褐腐菌，樹樟樹本身有驅蟲之效用，樟芝卻能生長其中，

所以被原住民當為珍品，原住民在食用過樟芝煮液後，有良好改善肝病 之效，且之於解酒功效極佳，民間所流傳的療效有袪風行氣、化瘀活血、

解毒消腫、肝硬化、肝癌、抗腫瘤之功效 (臧，1990)。

三、 價值與菌種特性

牛樟芝在台灣，因牛樟芝的數量稀少，因此價格一直居高不下，牛樟 芝有藥用真菌之稱，是高價值的真菌，因此在將樟芝分類上有好幾次的

圖二、樟芝菌絲形態 (Wu et al.,1997)

Fig 1-2 Morphology of Antrodia camphorata mycelium.

A. Generative hyphae (生殖菌絲) B. Skeletal hyphae (骨架菌絲) C. Cylindrical (似囊狀體) D. Basidia (擔子)

E. Basidiospores (擔孢子) Scale bars=10 μm

定位，一般在形態上可觀察有無段生孢子的存在 (Chang and Chou, 1995)，

樟芝目前鑑定上為薄層菌屬，具段生孢子。在分子鑑定上，以 18S ribosome RNA 與 internal transcribed spacer 結合 5.8S ribosome RNA 基 因序列作為分類的依據，並檢測 superoxide dismutase (SOD) 的活性作為 菌種鑑定的依據 (白，2003)。

四、 牛樟芝培養

樟芝子實體的生長非常緩慢，故產量稀少，價格昂貴，而且通常販 賣牛樟芝的商家都會宣稱野生牛樟芝比椴木培養、太空包培養、液態發 酵的有效成分來的高，所以一般民眾偏好野生牛樟芝，但目前生技公司 為了壓低成本，大多以液態發酵為主，各種發酵差異如下：

(一) 野生樟芝：生長時間五個月以上至三年不等，生長時間長，三萜類 含量較高，多醣量較低，價格昂貴且不易取得 (圖三)。

(二) 太空包培養：生長時間較短，約二至三個月，菌絲分布於太空包內，

無子實體產生，生長時間高於液態發酵，且耗費時間成本 (圖四)。

(三) 固態發酵 (Solid-state fermentation)：利用牛樟樹或一般樟樹培養，

大部分以樟樹切割之橫切面進行樟芝接菌，放置於陰涼暗處進行培養，

此方式的樟芝培養需要數個月，且需要樟樹的樹木來源，相當耗費時間 與成本。也有業者向林務局購買樟樹，將原本已經感染的樟芝椴木放置 於陰涼暗處培養，可將培養較完整的樟芝取下部分，之後繼續讓樟芝培 養，數月或一至三年在取下，可一直持續培養 (圖五)。

(四) 液態發酵 (Submerged fermentation)：液態發酵為大部分生技產業使 用的培養方式，液態發酵具備許多優點，發酵條件容易控制，例如：培 養液、pH 值、溫度、通氣量、轉速、饋料，尤其液態發酵時間短，且能 以公噸為單位之發酵槽進行大量生產，能得到較多菌絲體與發酵液，此 發酵之多醣類含量較高，且價格較便宜，一般民眾接受度較高 (圖六)。

五、樟芝活性成分

目前有許多研究樟芝的活性成分，發現樟芝富含許多複雜的成分和 生理活性成分，分別有：多醣體 (polysaccharides，β-1,3-葡聚醣)、三萜

圖三、野生樟芝子實體 (張等，1999)

Figure. 3. Fruiting body of wild Antrodia camphorata

圖四、以太空包培養之樟芝 (李，2006)

Figure. 4. Antrodia camphorata cultured by space package

圖五、樟芝之椴木栽培

Figure. 5. Basswood cultivation of Antrodia camphorata

圖六、樟芝菌絲體之液態發酵

Figure. 6. Liquid fermentation of Antrodia camphorata mycelium

類化合物 (triterpenoids)、超氧歧化酶、腺苷 (adenosine)、蛋白質、維生 素 (如：菸鹼酸)、類固醇、胺基酸、凝集素、木質素、核酸等 (Chang and Chou, 1995)。

(一) 多醣體：

樟芝發酵液體中的多醣體以葡萄糖、木糖、甘露糖為主體，約在 110 kDa 上下，而菌絲體水之多醣，約為 760 kDa 上下，有許多研究指出 β-1,3-葡聚醣具生理活性。β-1,3-葡聚醣為水溶性無法被人體消化系統之酵 素切割，是一種膳食纖維，目前有許多研究顯示 β-1,3-葡聚醣具有增強免 疫系統 (呂，2002)。此外，β-1,3-glucan 不僅在於人體有提升免疫能力，

還能增加斑枯病小麥抵抗病原菌之能力 (Shetty et al., 2009)，β-1,3-葡聚醣 在近年來陸續被研究指出具有抗腫瘤活力 (anti-tumor activity)，因而常被 認為是多醣中具有活性的醣類分子 (Mizuno et al., 1995)。

(二) 三萜類：

大部分樟芝的三萜類，在野生的子實體含量為最高，樟芝三萜類化合 物研究中，發現以 ergostane 為骨架的三萜類有 antcin A、antcin B、antcin C、antcin E、antcin F、methyl antcinates G、methyl antcinates H，以及以 lanostane 為骨架的三萜類化合物 (Cherng et al., 1995；Cherng, 1996)。在 樟芝子實體的研究中，以三種 ergostane 的化合物 zhankuic acid A、

zhankuic acid B、zhankuic acid C，而菌絲體發現五種三萜類化合物，

zhankuic acid D、zhankuic acid E、1-5-a-acetyl-dehydro-sulphurenic acid、

dehydroeburicoic acid、dehydrosulphurenic acid，而且 zhankuic acid A、

zhankuic acid C 對 P388 淋巴癌細胞有抑制生長效果與毒殺作用 (Chen and Yang, 1995)。

(三) 超氧歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD)

SOD 是一種抗氧化酵素能使降低細胞的損壞率，它除去最常見的超 氧化物 (superoxide)，SOD 也協助身體利用鋅、銅、錳。隨著年紀漸增，

當自由基的含量增多。SOD的主要作用為催化氧化還原反應，將體內的 超氧化物陰離子轉變為氧 (O2) 及過氧化氫 (H2O2) 反應式如下：

(四) 腺苷 (adenosine)

腺苷是核苷的一種，由核糖 (呋喃核糖) 與腺嘌呤的一部分組成，中 間由 β-N9- glycosidic bond 連接，研究指出腺苷保護作用在於激活 A1、

A2A、A2B、A3，其中甘酸 A2A 腺苷受體 A2AAR 是主要調節抗發炎 反應作用 (Milne and Palmer, 2011)。

六、 樟芝之生理活性與保健功效

(一) 護肝作用

目前樟芝多醣研究出具有抗 B 型肝炎效果 (Lee et al., 2002)，亦有 研究指出樟芝多醣能增強試驗動物的免疫力 (Lee et al., 2002)，使用樟芝 的水萃取物，除了能清除自由基外，其他研究採用體外試驗，發現樟芝 菌絲水萃取物，具有保護人類紅血球免於受到氧化傷害的能力，減少溶 血現象，亦可減少自由基 2,2-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 對造成內皮細胞的死亡 (Hseu et al., 2002)。此外樟芝水萃取物能 保護肝臟之乙醇誘導細胞凋亡試驗。

(二) 抗氧化功能

樟芝萃取物與發酵液具有清除自由基的能力，具抗氧化的能力，且 能抑制脂質過氧化的效果 (Song and Yen, 2002)，樟芝子實體與菌絲體之 甲醇萃取物表現於對捕捉 DPPH 自由基、減緩脂質過氧化、超氧陰離子、

螯合鐵離子之能力及減少共軛雙烯鍵形成等，具有很好的抗氧化能力 (黃，

2000)。

(三) 抗發炎作用

樟芝子實體中的 zhankuic acid 能減少血液嗜中性球 (neutrophils) 釋放活性氧物質 reactive oxygen species (ROS) 及抑制細胞表面黏著分子 Mac-1 (CD11b/CD18) 之表現，具抗發炎的效果 (Shen et al., 2004)，在研 究中證實從樟芝分離出 aca I、aca II、aca III 等三種免疫調節蛋白可以調 節小鼠淋巴細胞增生與分泌 IFN-γ，能刺激巨噬細胞 RAW 264.7 產生 TNF-α 與 NO (曹，2003)。

(四)

樟芝之甲醇萃取液，有抑制腫瘤細胞生長，在人類肝癌細胞 HepG2 中發現樟芝抑制生長且毒殺腫瘤細胞，食品工業研究發現樟芝胞外與胞

內成份皆有抑制肝癌、胃癌及乳癌 (陳等，2001)。研究發現，樟芝子實 體分離出的三種成分皆有抗癌效果，分別為 Zhankuic acid A、B 及 C (楊，

1991)，又以 Zhankuic acid A 與 C 對淋巴癌細胞 P-388 有毒殺效果 (Chen et al., 1995)。研究指出 Antcin A 具有抑制老鼠血癌 (P-388 murine 1eukemia) 細 胞 毒 素 之 活 性 ， antcin B 具 有 抗 副 交 感 神 經 作 用 (anticholinergic) 及抗血清素 (antiserotonin) 活性 (Cherng et al., 1995)，由 樟芝分離出的 dehyhroeburicoic acid 具抗發炎作用，能抑制腻部神經纖維 膠母細胞瘤，能使細胞瘤壞死或凋亡 (Deng et al., 2009)。

第三節 肝硬化之介紹

肝臟是人體最大且功能最複雜之代謝器官。具有儲存、分解及代謝 功能，在代謝中具有重要作用，為人體的解毒場所。肝臟能合成許多凝 血因子，參與血液凝固與造血過程。肝臟無痛覺神經，當肝臟受損時，

一般人並不會感受到異常而疏於防範，這也是造成肝病之主要因素。肝 功能若損傷時，會引起代謝功能障礙，並鏈鎖反應且影響其他臟器功能，

嚴重則危及生命。依據行政院衛生署統計，98 年度慢性肝病及肝硬化，

排行國內十大死因之第八位。肝臟為人體最大代謝器官，肝臟若長期受 到傷害、感染或發炎，可能會造成永久性的損傷，讓健康細胞由功能不 良的組織取代，如長期之大量之膠原生成進而演化成膠原纖維，肝受損 的越嚴重時，就成了肝硬化。正常的血液經過硬化的肝臟時，因為受到 損傷的膠原纖維阻礙，無法順利運行，導致身體機能降低。因肝臟有很 強的代謝與再生功能，一般在檢查上不容易察覺異狀，肝硬化的原因可 能由病毒所引起、酒精性或化學性所造成的肝損傷 (Sun and Karin, 2008)，

而 台 灣 以 病 毒 性 肝 炎 最 常 見 (B 型 肝 炎 ) ， 天 門 冬 氨 酸 氨 基 轉 移 酶 (aspartate aminotransferase, AST) 和丙胺酸轉移酶 (alanine transaminase, ALT) 常被當作肝損傷指標，但 AST 及 ALT 數值上升，只能說明肝臟 發炎，並不能代表肝纖維化或肝硬化之指標 (Nakajima et al., 1998)。

一、 肝硬化早期在臨床上之症狀：

(1) 食欲不振：由於肝硬化所導致的胃腸充血，消化系統不正常運作所影 響。

(2) 體重減輕：因食欲降低，進食不足，腸胃道消化與吸收困難，因而體 重減輕。

(3) 疲倦乏力：肝臟受損或膽汁排泄不順時，影響神經、肌肉的正常生理

功能。

(4) 面色晦暗黝黑：肝功能減退，致使黑色素增加而造成的現象。

(5) 出血異常：因肝功能衰退造成凝血酶原和其他凝血因子之合成下降，

導致血液凝固時間延長。

二、 肝硬化形成時之分子作用

抗肝硬化的可能作用主要是：保護肝細胞，抑制炎症損傷、抑制 collagen 合成，促進 collagen 降解，並有研究指出 α 肌動蛋白 (α-smooth muscle actin, α-SMA) 細胞都具有分泌 collagen 的功能 (Rockey et al., 1992) 以大鼠進行實驗發現，正常情況下靜態的肝星狀細胞 (hepatic stellate cell, HSC)，並不會造成 α-SMA 的表現，但被活化的 HSC 則會 表現出 α-SMA (Knittel et al., 1999)，有學者發現 HSC 經細胞培養會隨著 十天而增加，進而提升α-SMA 之表現量 (Schmitt et al., 1991)，所以肝臟 損傷其間 HSC 被活化，進而轉變為肝纖維母細胞，同時表現 α-SMA 的 活力 (Rockey et al., 1992)。

三、 以硫代乙醯胺 (Thioacetamide, TAA) 誘發之肝硬化動物模式 TAA 之分子量為 75.13 ，分子式為 C2H5NS，型態為結晶狀，可溶 於水及酒精，TAA 在 20℃ 水中溶解度為 100 g/L。TAA 在化學定性分 析試驗中常用來取代 H2S，在工業上做為有機溶劑使用，在橡膠製造做 為硬化之觸媒劑。TAA 在早期被發現具肝毒性 (Fitzhugh and Nelson, 1948)。

許多研究指出， TAA 會造成損傷的機制與氧化壓力 (oxidative Stress)有關，因為 TAA 會導致脂質過氧化 (Moller and Dargel, 1984;

Bruck et al., 2002)。TAA 在體內會與功能酶氧化系統 (mixed function oxidese system) 產生 TAA-S-dioxide (Chieli and Malvaldi, 1984)，圖七為 肝臟中 TAA 所產生之具破壞肝臟複合物，TAA 經由 cytorhrome P450 monooxygenases 氧化作用成高活性物質 TAA sulfoxide (TAASO) 及 TAA-S,S-dioxide (TAASO2) (Chilakapati et al., 2005)，此物質會與酵素或細 胞內的大分子產生共價結合 (Hunter et al., 1977; Porter and Neal, 1978;

Porter et al., 1979)，使細胞功能喪失，進而使細胞死亡或凋亡與造成氧化 壓力 (Bruck et al., 2002)，由於氧化壓力的影響，造成 HSC 的型態轉變 成似肌纖維母細胞(myofibroblast-like cell)，HSC 此類細胞在一般染色下

圖七、經肝臟代謝形成 TASO2 引起之肝損傷 (Chilakapati et al., 2005)。

Figure. 7. Liver damage caused by TASO2 formed by TAA during hepatic metabolism

是觀察不到的，若 HSC 細胞受到外來物刺激而活化成 α-SMA，即可以 用 組 織 免 疫 染 色 將 其 染 出 ， 這 類 的 HSC 會 分 泌 大 量 的 膠 原 纖 維 (collagen) 與細胞外基質 (extracellular matrix, ECM)，而肝纖維化 (liver fibrosis) 是因為堆積過多 ECM 所造成的纖維傷疤，因肝臟結構產生異 常 變 化 導 致 肝細 胞 衍生 小 節 管 ， 導致 形 成肝 硬 化 (hepatic cirrhosis) (Wirkowska and Paczek, 2011 )。

四、 預防肝損傷之策略：

抗氧化系統在人體扮演非常重要的角色，可以預防自由基的連鎖破 壞，還可有延緩衰老的作用，目前很多肝損傷之研究皆說明抗氧化系統 對於保護肝臟有非常大的作用，有研究指出提升抗氧化系統 catalase 的 活性可能有抑制 HSC 細胞被活化的作用 (Toyama et al., 2004)，圖八為 TAA 在肝臟之 ROS 產生活性氧，經由 SOD 作用形成 H2O2 後與 catalase 及 gluthatione peroxidase 產生無毒性之 H2O + O2，減少 H2O2

含量進而使星狀細胞活性及肝纖維化 (Takeshi et al., 2004)，經由 TAA 誘導所產生的 ROS 會經由各個抗氧化酵素作用後，使之形成無害物質，

若抗氧化酶含量降低，有可能導致自由基而形成氧化壓力 (Oxidative stress)，當氧化壓力過高會造成抗氧化系統失去帄衡，致使無法清除自由 基進而造成肝損傷 (Sanz et al., 2002)。有研究指出榖胱甘肽 (glutathione) 能清除體內的 ROS 自由基，進而降低 MDA 生成量與 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 及 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) 在肝臟組織 明顯的下降 (Kwak et al., 2010)，超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)，以大鼠 2、6、12、18、30 月齡進行肝損傷試驗，研究指出 2 週 齡大鼠比 30 週齡大鼠體內抗氧化酵素 SOD 與 GSH 和 明顯較多，結 果發現 在中、低月齡大鼠肝臟保護能力與體內抗氧化系統有密切關係 (Sanz et al., 2002; Yogalakshmi et al., 2010)。

五、 肝臟保護劑水飛薊素 (Silymarin) 之作用機制：

水飛薊素，又稱為乳薊素，主要成分為 silybum marianum 植物上的 乳汁，在兩千多年以前，西方國家已將水飛薊素用於治療肝臟疾病，且 有研究指出，服用高劑量的 silymarin，毒性並不高 (Ferenci et al., 1989)，

所以被當作藥草使用是很安全的。目前 silymarin 被廣泛使用治療肝病，

是治療肝臟疾病的主要成分之一。Silymarin 在細胞實驗被證實，能降低 抗氧化物質榖胱甘肽 Glutathione (GSH) 的消耗 (Miguez et al., 1994) 和

圖八、TAA 引起之肝臟自發性抗氧化系統防禦機制 (Takeshi et al., 2004)。

Figure. 8. Defense mechanisms of liver spontaneous antioxidative system induced by TAA

降低大鼠肝臟 HSC 活化所產生的活性氧 O^2- 與一氧化氮 (Nitric oxide, NO) 自由基 (Dehmlow et al., 1996) 及抑制免疫細胞分泌促炎因子之細 胞激素 (Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α) (Saliou et al., 1998; Manna et al., 1999)。Silymarin 具抗氧化能力，能清除自由基並減少身體內抗氧化 酵素之消耗，且能增加肝細胞合成，具有穩定肝細胞之作用 (Saliou et al., 1998) ， 有 研 究 指 出 在 四 氯 化 碳 誘 導 所 誘 導 的 肝 損 傷 及 氧 化 壓 力，

silymarin 能降低肝臟之受損 (Shaker et al., 2011)。有研究指出，每天給予 silymarin 50 mg/kg 餵食膽道阻圔之大鼠 6 ~ 8 週，具有降低肝臟膠原蛋 白脂含量，顯示 silymarin 有抗肝臟纖維化與肝硬化的能力 (Boigk et al., 1997)。silymarin 的作用大概分為以下五種：

1. 抗氧化作用 (antioxidation) 和抑制脂質過氧化 (anti-lipid peroxidation) (Kuriakose and Kurup, 2010)。

2. 穩定細胞膜，調控細胞膜上的通道以阻止有毒物質入侵細胞。

3. 促進蛋白質合成，修補受損之肝細胞。

4. 抗纖維化，能抑制 HSC 的活化 (Shaker et al., 2011)。

5. 抗發炎作用 (Wagoner et al., 2011)。

第二章 實驗動機及目的與實驗架構 第一節 實驗動機及目的

根據行政院衛生署統計，98 年度慢性肝病及肝硬化，排行國內十大 死因之第八位。肝臟無痛覺神經，一旦肝臟長期受到傷害、感染或發炎，

可能會造成永久性的損傷，讓健康細胞由功能不良的組織取代，如長期 之大量之膠原生成進而演化成膠原纖維，肝臟若受損的越嚴重時，不及 早治療，可能轉變成肝硬化的可能。

樟芝是台灣獨有的菇菌，樟芝又稱為樟菇、牛樟菇、紅樟與樟內菇，

僅生長在台灣特有的牛樟，樟芝屬多年生菇菌，子實體無菌柄。樟芝中 含有 β-1,3-葡聚醣，目前有許多研究顯示 β-1,3-葡聚醣具有增強免疫系統 (呂，2002)。 β-1,3-Glucan 在近年來陸續被研究指出具有抗腫瘤活力 (Mizuno et al., 1995)，且樟芝具護肝能力，發酵液有非常好的抗氧化能力 且有抑制脂質過氧化能力 (Song and Yen, 2002)，樟芝水萃取物能有效保 護肝臟之乙醇誘導細胞凋亡試驗 (Hseu et al., 2002)。樟芝萃取物能降低 ROS 的產生及抑制 TNF-α 與 NO 的產生 (曹，2003)。

深層海水是位於 200 公尺以下，深層海水有豐富的微量礦物質特性、

而這些礦物質包含鎂、鈣、鉀等約有 90 餘種，其中有些微量礦物質是 生物體很重要的元素或輔因子其中 Mg²⁺ 與 Ca²⁺ 離子以及營養元素 P 離子等三種主要元素，可增加酵母菌的繁殖 (Graeme and Pollack, 1996;

Nozaki et al., 1996)，而在製造醬油與味噌時，具有促進總氮量、胺基酸及 乳酸增加之功能。用以製造麵包，其膨脹率加大、延展性持久，具有增 加麵包柔軟度之功效，有助於提昇食品的品質 (黃，2003)，由以上研究 發現，深層海水有助於發酵作用，若應用在樟芝液態發酵中，可能助於 菌絲體的增加和抗氧化能力與成分之提升。

綜合以上各成分之優勢，其中樟芝本身具備抗氧化、抗發炎及保護 肝臟等功效，而深層海水能促進微生物生長與發酵作用，若使用深層海 水發酵樟芝與逆滲透水發酵樟芝做抗氧化、成分及保健功效之差異性評 估，可以判別深層海水是否有助於樟芝生長及增加代謝產物及提升保護 肝臟之保健功效。

第二節 實驗架構

圖 九 為研究計畫大綱 ，實驗設計主要比較以 ROW 培養之樟芝 (ROW-AC) 及 DOW 培養之樟芝 (DOW-AC) 之功效代謝成分差異及預 防 TAA 誘發肝硬化之差異，實驗分為 2 大項，分別為樟芝發酵試驗及 動物試驗，發酵分為 4 階段，第一階段：利用不同比例 DOW (0%、25%、

50%、75%、100%) 對探討樟芝生長之影響，評估其抗氧化能力與功效成 份分析之差異，在抗氧化能力試驗中檢測不同濃度 DOW 培養之樟芝的 DPPH 自由基清除能力及還原力，並進一步在功效成份分析試驗中檢測 胞內多醣、胞外多醣、總多酚、總黃酮、三萜類及 β-1,3-glucan；第二階 段：探討超純水中添加深層海水與其主要離子 (Mg²⁺、Na⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、 Fe^2-、K⁺) 對樟芝生長及其功效成份之影響，並找出較具影響力之離子，

進行第三階段發酵；深層海水中額外添加之以第二階段篩選出之離子，

不同濃度之離子及 yeast extract 對樟芝發酵生長之影響，檢測其功效成 份差異，篩選出樟芝發酵所需之離子濃度及 yeast extract 濃度；第四階 段：利用第三階段篩選出之離子、yeast extract 與 glucose，以反應曲面 法探討最適培養條件。動物實驗方面則以 ROW-AC 和 DOW-AC 比較 護肝能力差異，在預防 TAA 誘發肝硬化之動物試驗中，探討 ROW-AC 與 DOW-AC 對改善 TAA 誘發大鼠肝損傷之能力，其中進行肝臟組織 切片染色，分為 H&E stain 及 collagen stain 判斷肝臟受損與纖維化之情 形，分析肝臟組織中 氧化發炎程度，藉由評估肝臟組織 MDA 生成量及 其各抗氧化酵素在肝臟中含量的多寡以比較 DOW-AC 及 ROW-AC 對 TAA 誘發肝硬化之改善效果。為深入了解其作用機制，分析 α-SMA 蛋 白質表現量以評估肝臟細胞被活化成不正常分泌胞外基質狀態的多寡，

TNF- α 及 iNOS 表現分析評估肝臟發炎反應的程度，綜合以上研究內容 將有助於探討 DOW 發酵之樟芝是否有更好的預防肝硬化之代謝產物生 成及改善效果。

圖九、研究計畫大綱 Fig. 9. Outline of proposal projects

比較ROW-AC及DOW-AC抗氧化 能力及功效成份之差異 功效成份分析： 胞內多醣、 胞外多醣、 總多酚、 總黃酮、 三萜類、 β-1,3-glucan

抗氧化能力試驗： 自由基清除能力 DPPH 還原力 最適發酵條件

利用不同比例DOW(0%、25%、 50%、75%、100%)培養樟芝 超純水培養基中額外添加等量DOW 單一主要離子培養樟芝 深層海水培養基中額外添加不同濃度 之離子及氮源對樟芝培養之影響

篩選試驗 利用篩選出之三因子進行反應區面法 試驗

樟芝發酵試驗 比較ROW-AC及DOW-AC預防TAA誘發 肝硬化效果之差異 探討樟芝發酵物在TAA誘導大鼠肝損傷模式 護肝能力之影響 組織染色： H&E Stain, Collagen stain

抗氧化發炎 能力分析： TBARS GPX GRD TNF-α iNOS

肝硬化危險 因子分析： α-SMA

肝硬化動試驗 篩選試驗

探討DOW對樟芝發酵生產及預防肝硬化之效果

第三章 實驗材料與方法 第一節 實驗材料

一、

1. 純水製造機 (Water storage Tank RO-1070) (REVER SE OSMOSIS, Taiwan)

2. 真空減壓濃縮機 (Rotary Vacuum Evaporator) (EYELA N-1000V, USA) 3. 恆 溫 振 盪 培 養 箱 (Vertical shaker incubator) (LM-570RD, YIHDER

Scilab

Technology Co. Ltd., Jhonghe, Taiwan)

3. 殺菌釜 (Autoclave) (Model ss-320, Tomy Co., Tokyo, Japan)

4. 離 心 機 (Centrifuge) (Sorvall Legend Micro 17R, Thermo Fisher Scientific Inc.,

Germany)

5. 無 菌 操 作 台 (Laminar Flow Horizontal Type) (Kansin Co., Taipei, Taiwan)

6. 酵素免疫分析儀 (Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA) (sunrise, Tecan USA)

7. 水浴恆溫槽 (Water bath) (FirstTek scientific, Taipei, Taiwan) 8. 分光光度計 (Spectrophotometer) (U-1900, HITACHI, Japan) 9. 滅菌釜 (Autoclave) (Model SS-320, Tomy, Japan)

10. 均質機 (Homogenizer) (Model PRO 200, PRO Scientific Inc, USA) 11. 恒溫水浴槽 (SHAKING BATH) (B206-T2 FIRSTEK, Taiwan) 12. 二氧化碳之濕式培養箱 (Decontamination CO2 Incubator) (Model

RCO3000TABB, Revco Techologiey, USA)

13. 酸鹼測定器 (pH Meter) (MP220, METTLER TOLEDO, UK)

14. 高速冷凍離心機 (Micro high speed refrigerated centrifuge) (HIMAC CR22E,

HITACHI, Japan)

15. 熱風烘箱 (DK63, Yamato, Japan)

16. 酵素免疫分析儀 (Sunrise, TECAN, USA) 17. 倒立式顯微鏡 (BI-500, MOTICAN, USA)

18. 數位相機 (Motic 1000 1.3M PTX01 USB 2.0, Motic, Hong Kong)

二、標準品

1. Gallic acid (Scharlau, Tehran)

2. Rutin (KOCH-LIGHT LIMITED, South Africa)

三、一般試藥

1. 95% 酒精購自台灣公賣局

2. 1,1,3,3-Tetramethoxypropane (TMP) 購自 Sigma Chemical Co, (St. Louis, MO, USA)

3. Thiobarbituric acid (TBA) 購自 Sigma Chemical Co, (St. Louis, MO, USA)

4. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 購 自Sigma

Chemical Co, (St. Louis, MO, USA)

5. Dimethylsulfoxide (DMSO) 購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)

6. α,α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl free radical (DPPH) 購自Sigma Chemical Co.

(St. Louis, MO, USA)

7. HCl 購自 Merck Co. (Darmstadat, Germay)

8. Hematoxylin 購自 Merck Co.（Darmstadat, Germany 9. H2SO4 購自 Merck Co.（Darmstadat, Germany）

10. NaCl 購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 11. NaOH 購自 Merck Co.（Darmstadat, Germany）

12. Nitro blue tetrazolium (NBT) 購自 Merck Co.（Darmstadat, Germany）

13. Trichloroacetic acid 購自 Merck Co.（Darmstadat, Germany）

14. Trypan blue solution 購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 15. Trypsin-EDTA, (1X), liquid 購自 Gibco BRL Co.（Grand Island, NY, USA）

16. Xylene 購自 Merck Co.（Darmstadat, Germany）

四、其他

(一) 深層海水購自台灣海洋深層水股份有限公司 (Hualien, Taiwan) 第 2AAA0002246 批號。

本研究使用之深層海水為原水經透析處理，本研究室過去已進行成 份分析，其成份分析結果如表一中 (Lee et al., 2010)。在深層海水鎂、鈉、

鉀、鈣、硼、鍶、氟、硫、溴、氯等為主要元素，本研究之深層海水中 的鈉、鎂、鈣、鉀離子的濃度分別為 7.71 mg/L、20.65 mg/L、5.02 mg/L 與 0.22 mg/L。在鹽類中，檢測出硫酸根離子 (SO32+

) 與磷酸根離子 (PO42+

) 的濃度分別是 51.86 mg/L 與 0.0023 μg/L。而硼離子、鐵離子及 氟化物的濃度則分別為 0.37 mg/L、0.0062 mg/L 與 0.11 mg/L。

(二)

本實驗使用生物資源保存及研究中心 (Bioresource Collection and Reoceanrch Center) 之 Antrodia camphorata BCRC 35396 樟芝菌株，適合 在 (Potato dextrose agar, PDA) 培養基上生長。

第二節 實驗方法

一、 樟芝培養及萃取

(一) 培養基成分

樟芝菌株活化與保存用之培養基

(二) 種菌之培養

取用帄板培養基中培養四週之菌體，挖取約 1×1 cm 大小之菌塊，

成分 含量

Potato dextrose broth 24 g

Agar 15 g

Distilled water 1000 mL

成分 含量 Potato dextrose broth 24 g Glucose

pH

20 g 5.6 Distilled water 1000 mL

表一、深層海水之成份分析 (Lee et al., 2011)

Table . 1. The analysis of elements of deep ocean water.

Elements concentration

Mg 20.65 mg/L

Na 7.71 mg/L

K 0.22 mg/L

Ca 5.02 mg/L

Zn 0.019 mg/L

Al 2.77 μg/L

Sulfate (SO₄) 51.86 mg/L

B 0.37 mg/L

PO₄ (as P) 0.0023 mg/L

Fe 0.0062 mg/L

Ba ＜2.42 μg/L

Cr ＜0.17 μg/L

Se ＜1.13 μg/L

Pb ＜0.53 μg/L

Hg ＜0.017 μg/L

Ag ＜0.5 μg/L

Cu ＜18 μg/L

Sb ＜1.11 μg/L

Tl ＜0.45 μg/L

Be ＜0.068 μg/L

Fluoride 0.11 mg/L Nitrate (as N) ＜0.1 mg/L

Chloramines ＜0.021 mg/L

Chlorine ND

接種至含 100 mL 種菌培養基之 500-mL Hinton flask 中，於 28℃，轉 速為 100 rpm 培養 14 天。

(三) 放大培養

使用含 7000 mL 培養液之 10-L 發酵罐，於 28℃ 水浴槽中以通氣 培養 (0.71 v/v/m) 18 天。

(四) 樟芝發酵液之製備

使用 filter paper (Whatman No. 1) 和布式漏斗抽氣過濾樟芝發酵液，

將菌絲體分離後於 50℃ 乾燥 overnight、發酵液於 4℃ 避光保存。

(五) 樟芝菌絲體萃取

將乾燥後之樟芝菌絲體添加液態氮磨成粉末，取 1 g 樟芝菌絲體加 入 10 mL 95% ethanol 於 150 rpm 震盪萃取 6 hr ，使用 filter paper 過 濾雜質，再將其酒精萃取液放置抽風櫃室溫乾燥，使用酒精回溶備用，

進行後續分析。

二、 樟芝抗氧化能力分析

( 一 ) 清 除 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 自 由 基 能 力 之 測 定 (Shimada et al., 1992)

油脂在自氧化的過程中會產生自由基而造成油脂酸敗，常見的抗氧 化物藉由提供氫 (hydrogen doner) 來清除脂質過氧化物自由基 (peroxyl radical) 進而達到抑制氧化鏈鎖反應之進行，在抗氧化的研究上通常使用 化學合成自由基複合物之 DPPH 來評估抗氧化的供氫能力。DPPH 之甲 醇或乙醇溶液在 517 nm 下會有較高的吸收波峰，但是被抗氧化劑 (AH) 還原時則吸光值降低，因此在 517 nm 的吸光值愈低即表示抗氧化劑的 供氫能力愈強。

DPPH · + AH → DPPH ： H + A · (violet) (decolorized) 實驗步驟 ：

取 1 ml 的樣品，加入 3 ml 新鮮配製的 0.1 mM DPPH 乙醇溶液，振 盪混合均勻，於室溫下靜置 30 min 後，使用分光光度計檢測 517 nm 之