國立臺灣大學生命科學院植物科學研究所 碩士論文
Institute of Plant Biology College of Life Science
National Taiwan University Master Thesis
植物青枯病菌致病基因RSc0411及murI之功能性研究 Functional studies of Ralstonia solanacearum novel
pathogenicity determinants RSc0411 and murI
楊文潔 Wen-Chien Yang
指導教授：鄭秋萍 博士 Advisor: Dr. Chiu-Ping Cheng
中華民國九十八年七月
July, 2009
謝誌
勤耕兩年，以汗水淚水澆灌實驗種子，在大家愛的滋潤下慢慢茁長，結出第 一顆青澀的論文果實，苦中帶甜，甜中含酸，箇中滋味，難以言喻。
本論文得以順利完成，首先誠摯感謝我的指導教授鄭秋萍老師，老師這兩年 不厭其煩的諄諄教誨使我得以成長，頻繁的討論與適時的建議讓我越來越清晰的 看見研究輪廓，了解探索未知需要熱忱活力與堅忍意志力。接著要感謝我的口試 委員翁淑芬老師、王肇芬老師及賴爾珉老師，謝謝老師們百忙中悉心審閱論文初 稿，提供專業的意見與指正，使本論文更加嚴謹。
謝謝鄭家的家人們，感謝玉梅學姐對我的關心，包容我的任性與慢半拍的後 知，與你比鄰而座真的很幸運，隨手就可以翻閱May 牌百科字典，比 Google 還 厲害喔。感謝安琪學長在我進度報告時常常給我適時的建議，你的模仿秀在我疲 累研究生活中注入一股活力。感謝小朱學姐對我實驗的教導及照顧，你是我永遠 的老大，我永遠敬愛你。感謝大好人培城學長及RT 高手永義學長一年多的照顧，
你們當兵後我們大家都很想念你們。感謝怡君學姊的教導，你對實驗的熱忱與細 心是我最佳的典範。感謝淑蓮學姊像個大姐姐一樣照顧著實驗室的家人，你真誠 的鼓勵像陽光般溫暖。感謝巧燕學姐在我寫論文時不時替我打氣加油，窩心的鼓 勵永銘吾心。感謝與我一起奮鬥兩年的同窗們，感謝千千這兩年的相伴，有你在 身邊，共同分享生活點滴，傾訴實驗辛酸，這些日子雖苦，但因你而甘，有你真 好，希望我們可以永遠互相鼓勵砥礪，不斷往前躍進。感謝同一實驗桌的趙丁丁，
你的趙式幽默雖然我常常笑不出來，但不影響我們以垃圾話構築的友誼。感謝阿 宅團長冠中，讓我見識到最流行的阿宅文化，我相信阿宅也有春天的，加油。感 謝實驗室的學弟妹們，季穎、宗霖、芸璐、雅婷，有你們的加入，讓我們實驗室 更有活力。
感謝隱身在台大各系所的大學同學們阿玫、酷兒、老張、老廖，雖然這兩年 我們聚少離多，但同是台大研究生的心情，讓我們相知相惜相憐，與你們聚會時 我都欣喜若狂，可以盡情一吐苦水抑或分享成功喜悅，有你們真好。感謝植科所 九樓所有的老師、學長姐與同學們，你們的協助與鼓勵，讓我獲益良多。感謝台 大紫竹林的土地公土地婆，每當我實驗不順遂時，總感覺您就在我身邊護佑著我，
讓我像吃顆定心丸似的有信心可以征服一切。
感謝我最親愛的家人，感謝奶奶的栽培與鼓勵，感謝在下雨時開車接送我的 姑姑，感謝爸爸每天不辭辛苦來捷運站接我，替我準備營養果汁，給我充足的活 力與滿滿的信心。感謝媽媽每天辛苦的替我準備愛心便當，在寒冬夜晚為我遞熱 湯，在炎夏深夜幫我備水果。我親愛家人的笑容與呵護備至的關懷，讓我無懼實 驗困難，以微笑全力迎接任何挑戰。
也許大家覺得我是實驗順遂的幸運兒。但我覺得我最幸運的是擁有支持我深 愛我的家人、關懷照顧學生的指導老師、一群關心我的學長姐及與我並肩而戰的 朋友們，我愛你們，在此以誠摯的心將此本論文獻給你們。
文潔 2009 七月 緘
中文摘要
由 Ralstonia solanacearum 所引起的青枯病 (又稱為細菌性萎凋病) 係一全球 重要之土壤傳播性維管束病害，但目前我們對於這個極為複雜且破壞力極強的病菌 的了解仍是十分有限。先前的研究已經篩選到致病力缺失之青枯病菌突變株群，在 其中兩個突變株中，跳躍子插入的基因分別為 RSc0411 與 RSc1956，本論文之研究 目標為深入探討其之確切功能。首先，LptC 係一廣泛存在細菌但功能未知的 DUF1239 蛋白家族之一員，目前研究推測在大腸桿菌中此蛋白可能參與脂多醣 (lipoplysaccharides 或 LPS)之生合成與運送。RSc0411 之預期蛋白產物係 DUF1239 成員。由目前研究之結果發現，青枯病菌 RSc0411 突變株之粗型脂多醣(R-LPS)合 成有缺失，其致病能力嚴重喪失，且游動力、生物膜(biofilm)形成能力及對番茄根 部 的 附 著 力 皆 有 明 顯 下 降 ， 且 無 法 誘 導 菸 草 產 生 過 敏 反 應(hypersensitive response)，而進一步的結果也驗證 RSc0411 突變後造成青枯病菌第三型分泌系統無 法被正常誘導。此外，雖然在許多革蘭氏陰性細菌中 lptC 相關的基因成員組合具 保守性，啟動子分析結果顯示在青枯病菌中之實際操縱子組成(operon organization) 與大腸桿菌並不同，且將其他革蘭氏陰性菌的 DUF1239 蛋白基因互補到 RSc0411 突變株後發現，只有親緣近序列相似度高的同源基因可以功能互補 RSc0411 之缺 失，推測可能是因為與 Ralstonia 屬親緣相近之細菌的 DUF1239 蛋白質已經演化出 具較類似之特別且新穎的功能，同時參與細菌R-LPS 之生合成和第三型分泌系統。
本論文第二部份的工作係研究 RSc1956 (murI)之功能，其預期蛋白產物係 glutamate racemase，負責將 L-glutamate 轉化為 D-glutamate，而 D-glutamate 是組成細菌細胞 壁肽聚醣的重要成分，可以保護細菌的細胞壁免受細胞的蛋白質酶攻擊。由目前之 研究結果發現，murI 突變雖然不會明顯影響生物膜形成、根部附著力和分解植物 細胞壁酵素之分泌，但是會造成致病能力嚴重喪失，且游動力明顯下降，而互補試 驗亦進一步證實此基因確實為青枯病之關鍵致病基因，且瞭解到其基因啟動子對於 有效地表現此基因之功能十分重要。藉由這些分子層面的試驗與分析，本研究得以
確認並深入探討新穎蛋白 RSc0411 與 RSc1956 確實是青枯病菌之關鍵致病基因，
且對於其相關分子機制有所領悟；希望藉由深入且全面性地了解青枯病菌的致病機 制、其主導基因、各訊息傳導途徑間之交互作用與調控，未來可以研擬破壞病菌感 染的管道，得以研發有效控制此嚴重病害的可能策略。
關鍵詞：青枯病菌、脂多醣、DUF1239 蛋白、LptC、第三型分泌系統、MurI
Abstract
Ralstonia solanacearum is a soil-borne bacterium infecting vascular system, causing lethal wilting symptoms on many economically important crops and resulting severe crop losses. Previously, we carried out transposon (Tn5) insertional mutant screens to identify genes involved in pathogenesis of R. solanacearum. Two mutants containing a transposon insertion in RSc0411 or RSc1956 (murI) were found to be avirulent both on tomato and Arabidopsis. The aims of this study are to further elucidate roles of these genes in bacterial pathogenesis and the molecular mechanisms involved.
Firstly, R. solanacearum RSc0411 is a homologue of E. coli lptC. LptC, a member of the novel protein family DUF1239, is suggested to be involved in E. coli lipopolysaccharides (LPS) transport into the outer membrane. Here we showed that RSc0411 mutant was defective in cell integrity and in rough LPS production. Notably, this mutant displayed defects in various pathogenesis-related properties and the induction of the type III secretion system was attenuated. The organization of DUF1239-related gene cluster is conserved among gram-negative bacteria, while sequence homology among orthologous genes in the cluster and those involved in LPS biogenesis varied according to phylogenetic relationships. Complementation tests revealed that only DUF1239 members in bacteria phylogenetically related to R.
solanacearum were functional to rescue the mutant’s defects, further suggesting certain specificity in the RSc0411-involved pathogenesis mechanism and LPS biogenesis machineries may have evolved. Collectively these results imply a novel and crucial role of RSc0411 in early pathogenesis and LPS biogenesis of R. solanacearum. Secondly, R.
solanacearum RSc1956 encodes glutamate racemase (MurI) protein. MurI catalyzes the conversion of L-glutamate to D-glutamate which is an essential component of peptidoglycans in bacterial cell walls. Here we showed that, although RSc1956 mutant
behaved similar to the wild-type strain in biofilm formation, root attachment and production of plant cell wall degrading enzymes, it was defective in swimming motility and avirulent in tomato plants. Complementation tests further confirmed the key role of RSc1956 in R. solanacearum pathogenesis and revealed the importance of its promoter in precisely expressing MurI function. Taken together, these detailed studies on RSc0411 and RSc1956 are expected to pave the way not only for elucidating mechanisms and determinants involved in R. solanacearum pathogenesis but also potentially establishing useful disease control means.
Keywords: Ralstonia solanacearum、DUF1239、LptC、lipopolysaccharide、type III secretion system、MurI
常用名詞之縮寫與全名對照表
縮寫 全名
Amp Ampicilin BSA Bovine serum albumin
bp Base pair
CFU Colony formation unit
DEPC Diethylpyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid DMSO Dimethyl sulfoxide
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DPI Days post inoculation
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EPS Exopolysaccharide
EtBr Ethidium bromide
Gen Gentamycin
IM Inner membrane
IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside Kan Kanamycin
LPS Lipopolysacchride MOPS 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid
OD Optical density
OM Outer membrane ORF Open reading frame PCR Polymerase chain reaction
RNA Ribonucleic acid
rpm Rotation per minutes RT-PCR Reverse transcription- PCR
SA Salicylic acid
SDS Sodium dodecyl sulfate
SM1 Semi-selective medium TEM Transmission electron microscopy
Tet Tetracycline TTC 2,3,5-triphenyl- tetrazolium chloride Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethane
目次
口試委員會審定書... i
致謝... ii
中文摘要...iii
英文摘要... v
常用名詞之縮寫與全名對照表... vii
目 次 ...viii
表目次...xiii
圖目次... xiv
附錄目次... xvi
第一章 前言 ... 1
Ⅰ. 植物病原菌的致病策略 ... 1
. Ⅱ 植物病原菌的第三型分泌系統 ... 1
. Ⅲ 青枯病菌 (細菌萎凋病)... 3
Ⅳ. 青枯病菌之致病機制 ... 4
1.胞外多醣體 (exopolysaccharides, EPS)... 4
2.游動力、趨化性及趨氧性... 5
3.分解植物細胞壁的酵素 (plant cell wall degrading enzymes, CWDEs) ... 5
4.螯鐵蛋白 (siderophores)... 6
5.第三型分泌系統... 6
6.細菌脂多醣 (lipopolysaccharides 或簡稱 LPSs)... 7
7. PhcA 調控青枯病菌致病網... 7
Ⅴ. LPS 生合成與運送機制及 DUF1239 相關研究... 8
Ⅵ. murI 基因的相關研究... 9
Ⅶ 研究目標 ... 11
第二章 實驗材料與方法 ... 13
1.萃取青枯病菌 genomic DNA ... 13
3.選殖技術與程序 (Cloning and transformation in E. coli) ... 14
3-1.聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) ... 14
3-2.DNA 純化... 15
3-3.限制酶 (restriction enzyme) 的消化水解 (digestion)... 15
3-4.載體與基因之接合 (ligation)... 15
3-5.大腸桿菌勝任細胞的轉型作用 ... 15
4. 構築質體 ... 15
4-1.構築互補 ... 15
4-2.構築 lacZ transcriptional fusions... 16
5. 青枯病菌勝任細胞的製備與轉型作用 ... 16
5-1.青枯病菌勝任細胞的製備 ... 16
5-2.青枯病菌勝任細胞的轉型作用 ... 16
6. 製備 allelic mutants ... 17
7. RNA 表現的測定 ... 17
7-1.萃取青枯病菌的 RNA ... 17
7-2.甲醛電泳膠體製備 ... 18
7-3.反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR)... 18
7-4.即時定量 RT-RCR ... 18
8. 生理特性分析 ... 18
8-1.生長曲線 ... 18
8-2.點盤分析 ... 19
8-3.青枯病菌在植物體內增生能力分析 ... 19
8-4.逆境反應分析 ... 19
8-5.細菌碳源、氮源 (BiologTM) 和 API-Zym 酵素的分析... 19
8-6.穿透式電子顯微鏡 ... 20
9. 青枯病菌致病力相關能力之分析 ... 20
9-1.游動能力的測試 ... 20
9-2.番茄根部的附著力測試 ... 20
9-3.生物膜形成能力之分析 ... 21
9-4.胞外酵素 (Exoenzyme activity) 的分析... 21
9-5.菸草的反應測試 ... 21
9-6.番茄病原性測試 ... 22
10. 青枯病菌脂多醣的測定 ... 22
10-1.青枯病菌脂多醣的萃取 ... 22
10-2.一維電泳 (SDS-PAGE) 的製備... 23
10-3.青枯病菌脂多醣銀染分析 ... 23
11. β-galactosidase activity assay ... 23
第三章 結果 ... 25
Ⅰ. RSc0411 基因之功能分析 ... 25
1. 生物資訊分析 (bioinformatics)... 25
2. RSc0411 突變株之生理與生化特性分析... 25
2-1.生長曲線 ... 25
2-2.逆境反應分析 ... 25
2-3.API-Zym 酵素的分析 ... 26
2-4.細胞膜形態的觀察 ... 26
3. RSc0411 突變株致病力相關能力之分析... 26
3-1.細菌游動能力的測試 ... 26
3-2.番茄根部的附著力測試 ... 26
3-3.生物膜形成能力之分析 ... 27
3-4.胞外酵素的分析 ... 27
3-5.菸草的反應測試 ... 27
3-6.番茄病原性測試 ... 27
4. 驗證 RSc0411 基因功能... 28
4-1.構築 isogenic 突變株 ... 28
4-2.互補株的構築與分析 ... 28
5. 判定青枯病菌 RSc0409~RSc0413 之操縱子 (operon) 結構... 28
6. 青枯病菌脂多醣的測定... 29
7. 以比較生物資訊學探討 DUF1239 基因群及協助 LPS 運送相關蛋白群.. 29
8. 同源基因互補株的構築與分析... 30
9. RSc0411 參與第三型分泌系統 ... 31
10. 青枯病菌其他突變株的型態與致病能力分析... 32
Ⅱ. murI 基因之功能分析... 33
1. murI 突變株之生理與生化特性分析 ... 33
1-1.生長曲線 ... 33
1-2.逆境反應分析 ... 33
1-3.API-Zym 酵素與細菌碳、氮源 (BiologTM) 的的分析... 33
1-4.細胞膜形態的觀察 ... 33
2. murI 突變株致病力相關能力之分析 ... 33
2-1.青枯病菌早期致病因子之分析 ... 33
2-2.菸草的反應測試 ... 34
2-3.番茄病原性測試 ... 34
3. 驗證 murI 基因功能 ... 34
3-1.構築 isogenic 突變株 ... 34
3-2.互補株的構築與分析 ... 35
第四章 討論 ... 36
I. RSc0411 基因之功能探討... 36
1.DUF1239 蛋白是否為生長必需蛋白... 36
2.RSc0411 參與 LPS 生合成 ... 36
3.青枯病菌脂多醣對致病力相關因子之影響... 37
4.RSc0411 參與青枯病菌第三型分泌系統之調控 ... 39
5.Rastonia 親緣相近之 DUF1239 家族新穎功能探討... 40
6.青枯病菌第三型分泌系統與其它致病因子的關係... 42
7.青枯病菌與菸草之交互作用... 42
Ⅱ. murI 基因之功能探討... 44
1.MurI 蛋白是否為生長必需蛋白... 44
2.青枯病菌 MurI 在細胞型態與生理特性之功能... 45
3.青枯病菌 MurI 影響致病力分析... 46
4. murI 為青枯病菌之關鍵致病基因 ... 47
參考文獻...49
表目次
表一、青枯病菌 RSc0411 研究所使用的菌株與質體 ... 59
表二、青枯病菌野生株與 RSc0411 及 rfaF 突變株的特性比較... 62
表三、參與脂多醣生合成相關基因之序列比較... 64
表四、青枯病菌 murI 研究所使用的菌株與質體 ... 68
表五、青枯病菌野生株與 murI 突變株的特性比較總表 ... 69
圖目次
I、RSc0411 基因之功能分析... 71
圖一、青枯病菌野生型菌株Pss190 和其 RSc0411 突變株的生長曲線... 71
圖二、青枯病菌各個菌株在不同固體培養基下的生長情形... 72
圖三、野生型菌株和 RSc0411 突變株在菸草 N. benthamiana 內的增生 ... 73
圖四、穿透式電子顯微鏡觀察青枯病菌野生型菌株和 RSc0411 突變株細胞膜 型態... 74
圖五、青枯病菌野生型菌株和 RSc0411 突變株游動力 (swimming) 測試 ... 75
圖六、青枯病菌野生型菌株和 RSc0411 突變株游動力 (twitching) 測試 ... 76
圖七、青枯病菌野生型菌株和其各式互補株對番茄根部著附著力分析... 77
圖八、青枯病菌野生型菌株、RSc0411 突變株和互補株生物膜形成能力之 分析... 78
圖九、青枯病菌野生型菌株、RSc0411 突變株和互補株對菸草的反應分析 .... 79
圖十、青枯病菌野生型菌株、RSc0411 突變株及互補株番茄病原性測試 ... 80
圖十一、青枯病菌RSc0409~RSc0413 之操縱子 (operon) 結構... 81
圖十二、青枯病菌RSc0411 與大腸桿菌 LptC 胺基酸序列比對 ... 82
圖十三、利用銀染分析各式青枯病菌株之脂多醣生合成... 83
圖十四、比較各細菌中DUF1239 相關基因群之操縱子結構及基因成員 ... 84
圖十五、青枯病菌野生株與 RSc0411 突變株第三型分泌系統相關基因表現量 的測定... 85
圖十六、RSc0411 啟動子在不同菌株中的表現分析 ... 86
圖十七、青枯病菌野生株、RSc0411 突變株及其他膜完整性缺失突變株特性 分析... 87
Ⅱ、murI 基因之功能分析 ... 88
圖十八、青枯病菌野生型菌株和 murI 突變株生長速度比較 ... 88
圖十九、青枯病菌野生菌株和 murI 突變株在不同固體培養基下的生長情形 . 89 圖二十、青枯病菌野生型菌株和其 murI 突變株碳源 (BiologTM) 利用分析.... 90
圖二十一、穿透式電子顯微鏡觀察青枯病菌野生菌株和 murI 突變株細胞態 . 91 圖二十二、青枯病菌野生型菌株和 murI 突變株游動能力的測試 ... 92
圖二十三、青枯病菌野生型菌株和 murI 突變株游動力 (twitching) 測試... 93
圖二十四、青枯病菌野生型菌株和 murI 突變株番茄根部附著力與生物膜形 成能力分析... 94 圖二十五、青枯病菌野生菌株和 murI 突變株於菸草的反應 ... 95 圖二十六、青枯病菌野生菌株和 murI 突變株番茄病原性測試 ... 96 圖二十七、青枯病菌野生菌株、murI 突變株和其互補株游動力 (swimming)
測試... 97
附錄目次
附錄一、青枯病菌 RSc0411 研究所使用之引子 ... 98
附錄二、青枯病菌 murI 研究所使用之引子 ... 101
附錄三、利用生物資訊軟體分析DUF1239 蛋白家族 ... 102
附錄四、RSc0411 膜蛋白的預測 ... 103
附錄五、大腸桿菌LPS 的合成與運送及 LPS 運送突變株之表現型態分析 ... 104
附錄六、青枯病菌複雜的致病調控系統... 105
附錄七、實驗室前人測試野生型菌株Pss190 及其其突變株在番茄及阿拉伯芥 病原性... 106
附錄八、實驗室前人在Pss190 背景下互補 murI 突變株的病原性分析 ... 107
附錄九、本研究Pss4 背景下 murI 突變株進行不同長度的互補實驗 ... 108
附錄十、肽聚醣生合成路徑圖... 109
附錄十一、生物體內glutamate 的代謝路徑 ... 110
附錄十二、常用培養基配方... 111
第一章 前言 .
Ⅰ 植物病原菌的致病策略
植物病原細菌生存於不同環境，不只生活於植物體內、表面，也可伺機殘存 於土中、水中，一個成功的植物病原細菌必須正確的感應周遭環境的變化並準確 的調控其致病網。目前已知，在各個病原菌致病網中最重要機制包括有 quorum sensing (QS)、two-componet regulatory (2-CR)和 AraC-type regulators (Soto et al., 2006; Mole et al., 2007)；QS 可以藉由感應細菌族群大小而調控其毒力基因的表 現，通常 QS 的感應訊號為 N-acylhomoserine lactones (AHLs)，如: Pseudomonas syringae pv. tomato，但有些細菌可以感應其他分子，如 R. solanacearum 感應 3-hydroxypalmitic acid methyl ester (3-OH PAME)(Flavier et al., 1997)。在細菌族群 稀少時，QS 可以調控入侵寄主所需的毒力因子，如：游動力(swimming and twitching motility)、生物膜(biofilm)的形成和分泌破壞植物細胞壁的分解酵素，使之表現增 加，當族群數量較多時，QS 可以關閉早期致病毒力基因表現，活化後期致病基因 表現(Soto et al., 2006)。2-CR 是細菌感應外在環境變化而直接調控單一基因或一群 毒力相關基因的表現，使之可快速適應新環境，2-CR 系統通常包含一個 sensor protein kinase 和一個 response regulator，如：Agrobacterium tumefaciens 的 ChvG/ChvI 系統和 R. solanacearum 的 VsrA/VsrD 系統(Soto et al., 2006; Mole et al., 2007)。而 AraC-type regulators 可以調控病原菌的重要致病機制第三型分泌系統。
Ⅱ. 植物病原菌的第三型分泌系統
許多革蘭氏陰性細菌都有第三型分泌系統，目前植物病原菌 P. syringae、R.
solanacearum、Xanthomonas 屬和 Erwinia 屬皆有不少相關的研究，而在動物病原 菌 Salmonella enterica、Yersinia spp.、Escherichia coli 和 Shigella dysenteriae 中也有 深入的探討研究 (Hueck, 1998;Troisfontaines and Cornelis, 2005)。這些病原菌用第 三型分泌系統攻擊它們的寄主，細菌藉由channel 與宿主細胞膜結合之後，形成類 針管構造，將毒力蛋白(effector)注射入宿主的細胞質內造成宿主細胞的破壞(Tang
et al., 2006)。在動物病原菌中，此類針管構造稱之為 needle，而在植物病原菌中稱 之為Hrp pilus (hypersensitive response and pathogenicity pilus)，而 Hrp pilus 因需要 通過植物細胞壁長距離運輸毒力蛋白到寄主植物中，所以較 needle 長。病原菌的 第三型分泌系統可以抑制或破壞寄主的基本防禦，包括直接抑制防禦訊號的傳遞 (Shang et al., 2006; Vinatzer et al., 2006)、抑制 salicylic acid-dependent 防禦機制 (Jelenska et al., 2007)、影響乙烯生成(Cohn and Martin, 2005)或破壞細胞壁基本防禦 (Hauck et al., 2003)，進而入侵寄主組織獲取營養。除了病原菌外，植物或動物內 共生菌也有第三型分泌系統，如豆科植物根瘤菌 Rhizobium NGR234 可藉由第三型 分泌系統共同調控誘導根瘤的形成，促進共生作用(Marie et al., 2001)。
病原菌若遇到非寄主植物，則無法入侵植物獲取其營養；若病原菌遇到抗性 植物，會產生不相容反應(incompatible interaction)，病原菌產生的 Avr 蛋白 type III secreted effectors (T3SEs)會與植物的抗性蛋白(R protein)辨認，而誘導植物的抗病 防禦機制，使細菌入侵點附近的植物細胞壁增厚產生 callose，植物釋放過氧化物 引起入侵點附近細胞快速凋亡(programmed cell death)，以阻止病菌增生與傳播，這 種 強 烈 的 防 禦 反 應 稱 之 為 過 敏 性 反 應 (hypersensitive response ; HR)(Hammond-Kosack and Jones ,1996)，若病菌感染感病植株，病菌產生的 T3SEs 無法與植物的抗性蛋白辨認，不會誘導產生過敏性反應及植物的抗病反應，病菌 可以順利感染植株產生病徵(Stavrinides , 2008)。
第三型分泌系統由 hrp 基因所調控，大多數植物病原細菌的 hrp 基因存在於染 色體上，只有青枯病菌的 hrp 基因是位於一圈狀巨質體(megaplasmid) (He et al., 2004)。按照 hrp 基因調控、組成、同源性的不同，可將這群植物病原菌分做兩群，
第一群包括 P. syringae 和 Erwinia 屬，第二群包括 R. solanacearum 和 Xanthomonas 屬，這兩群 hrp 基因皆需植物細胞或在營養貧瘠培養基中添加特殊的碳源才可誘導 其表現(Buttner and Bonas ,2006)。不同病原菌的 hrp 调控基因有所不同，在 P.
syringae 中，hrpR、hrpS 和 hrpL 是 hrp 基因主要的調控者，hrpR 和 hrpS 交互作用
後和sigmaδ54結合並活化 hrpL 的表現，hrpL 再調控下游其他 hrp 基因的表現，進 而影響毒力蛋白的產生(Tang et al., 2006)。在 X. campestris. pv. vesicatoria 中，hrpG 和 hrpX 是 hrp 基因主要的調控者，hrpG 活化 hrpX 和 hrpA 的轉錄並且 hrpX 隨之 活化其他 hrp 基因的轉錄(Tang et al., 2006)。
Ⅲ. 青枯病 (bacterial wilt，細菌萎凋病)
由 R. solanacearum 所引起的青枯病 (又稱為細菌性萎凋病) 係一全球重要之 土壤傳播性維管束病害，此病原細菌可以在土壤中長期殘存，危害之作物範圍涵 括五十幾屬，超過200 種作物，在熱帶及亞熱帶發生尤其嚴重(Hayward 1991; Denny 2006)，而且此病害現已擴展到溫帶地區 (Kim et al., 2003)。在自然的感染過程中，
青枯病菌自番茄的根部二次根突破點或根尖進入植物體，進行大量繁殖，並更深 入植物輸送水份的木質部 (Vasse et al., 1995)。接著，菌體進行系統性的遽增，並 伴隨著大量胞外多醣體的產生，導致維管束阻塞，寄主植物因而萎凋死亡，青枯 病菌則在潮濕的環境條件下，可以在潰倒的植物組織內存活 (Buddenhagen and Kelman, 1964)。
青枯病菌係革蘭氏陰性好氧之桿菌，屬於 β–proteobacteria 菌群，根據各種生 化、分子及代謝特性，青枯病菌可以被歸為四個phylotypes、五個 biovars、五個 races 及許多strains (Denny, 2006)。感染番茄的青枯病第一生理小種 (race 1) 在基因型 及毒力上之差異性皆非常高且複雜 (Jaunet and Wang, 1999)，而番茄抗病品種在不 同地區及針對不同菌株的抗病穩定性亦有差異(Chellemi et al., 1994; Lopes et al., 1994; Hanson et al., 1998)，這些事實均顯示青枯病菌的多元化與青枯病的複雜性。
青枯病菌的基因組共約 5.8 Mbp，包含一個圈狀之染色體及一個圈狀巨質體 (megaplasmid)。近來，分離自番茄且具廣寄主性的 strain GMI1000 (phylotype I, biovar 3, race 1)基因組已經被定序完畢(Salanoubat et al., 2002)，此外，另有屬於不 同 biovars 及 races 的 strains IPO1609 、Molk2 (C. Boucher NCBI web)及 strain UW551 (Gabriel et al., 2006)的基因組序列初稿(genome drafts)也已經被完成。Molk2
(phylotype II, biovar 1, race 2) 係熱帶且寄主範圍僅限於香蕉屬 (Musa sp.) 的菌 株，IPO1609 (phylotype II, biovar 2, race 3) 係熱帶且寄主範圍僅限於番茄與馬鈴薯 的菌株，而UW551 (phylotype II, biovar 2, race 3) 則是源自於天竺葵的熱帶菌株 (Garbriel et al., 2006)。
Salanoubat 等人(2002)分析 GMI1000 基因組時發現，其染色體及巨質體皆有 mosaic structure，顯示青枯病菌常由水平基因移轉取得外來基因；此外，發現基因 體中跳躍因子 (mobile/transposable elements)常與異常高的 G+C content 的區域相繫 著，因此可能在青枯病菌基因組的演化上扮演重要的角色，由於這些跳躍因子的 存在，可促進基因序列的獲取、失去或改變，使得青枯病菌基因組及其表現型具 高度複雜性，例如青枯病菌具有眾多biovars 與極廣之寄主範圍。
Ⅳ. 青枯病菌之致病機制
由於青枯病菌具有眾多上述之獨特特性，因此已成為研究革蘭氏陰性植物病 原菌群中的代表性菌種，對其病原性、毒力、環境適應性、寄主專一性、演化及 生態等均有進行研究。為了成功地感染寄主植物，青枯病菌自土壤侵入植物，並 深入植物維管束的過程中，必需突破各種難關，這包括了細菌成功游動到寄主的 根部、在植物根的吸附並佔據、形成抵抗環境逆境的生物膜、獲得養分、大量增 殖、移動於植物細胞間隙、侵入並佔據植物的木質部、避開或擊破寄主防禦機制 等等(Denny ,2006)，所以，青枯病菌必需有效地產生各個感染步驟所需之不同基因 產物。目前，人們對於青枯病菌的整體致病機制已有一些初步的了解 (Schell ,2000;
Genin and Boucher ,2004)，目前已知的毒力因子(virulence factor)分述如下：
1. 胞外多醣體 (exopolysaccharides, EPS)
酸性的胞外多醣體EPSI 是阻塞寄主植物維管束的主要毒力因子，其主要是由 多醣體、蛋白質、核酸和脂質組成。若EPSI 突變缺失則無法對寄主造成系統性感 染；將EPSI 突變株自根部澆灌感染番茄寄主，發現此突變株只能侵入根部並在莖 基部造成低量的纏據，但無法自莖部往上移動，即使直接自莖部穿刺接種也無法
對番茄造成萎凋致死現象；利用水耕栽培的番茄測試其毒力，發現EPSI 突變株亦 無法移動到木質部(Saile et al., 1997；Araud-Razou et al., 1998)。
2. 游動力、趨化性及趨氧性
在自然環境中，青枯病菌需成功游到寄主植物根部才可順利感染寄主，在這 個過程中細菌的游動力(swimming motility)、趨化性(chemotatic)和趨氧性(aerotaxis) 是非常重要的。青枯病菌具有鞭毛可以在水中游動，無法產生鞭毛的突變株(fliC) 自番茄根部接種有致病力下降的現象，但若直接用莖部穿刺感染番茄，則其致病 力與野生株相似(Tans-Kersten et al., 2001)，所以推測一旦細菌進入植物後，鞭毛對 於病原性不是很重要。青枯病菌可以感應並趨向最適當的生活環境(營養及氧氣充 足的地方)，稱之為趨化性和趨氧性。青枯病菌可以感應並趨向寄主根部所釋出的 分泌物，目前研究發現青枯病菌趨化性突變株自番茄根部感染會造成其致病力下 降，趨化性是感染寄主植物中所需的早期致病因子(Denny 2006)。青枯病菌的趨氧 性可以使其快速的到達植物根部，以感染植株，目前研究發現青枯病菌趨氧性接 受蛋白Aer1、Aer2 突變會降低生物膜形成能力，並延遲番茄萎凋的現象(Yao and Allen, 2007)。
不管是植物或動物病原細菌，成功吸附到寄主表面的能力是非常重要的，在 革蘭氏陰性菌中這個吸附的結構稱之為線毛(pili)或纖毛(fimbriae)。許多細菌會藉 由type 4 pili 在固體表面移動，稱之為 twitching motility (Strom and Lory, 1993)。在 青枯病菌中，type 4 pili 突變株不管是利用根部澆灌或直接注入到番茄體內都觀察 到 致 病 力 下 降(Kang et al., 2002) ， 並 且 此 突 變 株 會 在 液 體 培 養 時 ， 聚 集 (autoaggregation)和生物膜形成的能力下降，並且無法吸附佔據(attachment)到番茄 根部。
3. 分解植物細胞壁的酵素(plant cell wall degrading enzymes, CWDEs)
植物細胞壁為植物天然的屏障，可以隔絕病原菌，因此有些植物病原菌(如:
青枯病菌)為了成功感染寄主，可以分泌破壞植物細胞壁的酵素，青枯病菌的細胞
壁分解酵素目前已知有六種：β-1,4-endoglucanase (Egl)、exoglucanase (ChbA)、
endopolygalacturonase (PehA or PglA)、exopolygalacturonases (PehB and PehC)和 pectin methylesterase (Pme)。若將 PehA、PehB、PehC、Pme 單獨移除並不會在番 茄觀察到致病力下降，但 Egl 或 ChbA 的破壞則會造成延遲發病的現象(Gonzalez and Allen., 2003; Liu et al., 2005)。這些分解酵素皆由 type II protein secretion system (T2SS)運送到外膜，T2SS 會誘導植物的防禦反應，而植物的防禦會被 T3SS 所抑 制(Liu et al., 2005)。
4. 螯鐵蛋白(siderophores)
許多細菌都會產生螯鐵蛋白以獲取鐵離子，有些植物病原細菌需要
iron-acquisition system才有致病力。在青枯病菌中的螯鐵蛋白為schizokinen，可以 產生polycarboxylate螯鐵蛋白，稱之為 staphyloferrin B (Bhatt and Denny, 2004)。目 前研究已知番茄木質部中有充足的鐵離子來抑制病原菌iron-acquisition system，青 枯病菌 staphyloferrin B 缺失並不影響其在番茄之致病力。
5. 第三型分泌系統
在 R. solanacearum 中，PrhA 蛋白產物是細菌外膜蛋白分子，可感應植物訊號，
進行一連串的調控，首先調控膜蛋白 PrhR，再由 PrhR 調控轉錄因子 PrhI，PrhI 調控轉錄因子PrhJ，prhJ 基因與轉錄因子 Lux/JphA 家族同源，PrhJ 調控轉錄調控 因子 hrpG，hrpG 是第三型分泌系統的主要調控者，hrpG 可藉由調控 hrpB (HrpB-dependent HrpG regulon)進而調控下游 20 多個 hrp 基因(Aldon et al., 2000 ;Cunnac et al., 2004; Valls et al., 2006)，進而影響 70 多個毒力蛋白的表現 (Cunnac et al., 2004; Angot et al., 2006)，如製造分泌管道的基因 hrpY 和被分泌胞外 的毒力蛋白PopA 與 PopC，而被 hrpB 調控的基因大多有一個序列保守的啟動子區 域 hrpⅡ box (Cunnac et al., 2004) 。 HrpG 也 可 以 藉 由 非 HrpB 的 調 控 路 徑 (HrpB-independent HrpG regulon)去影響其他致病因子的表現，如分解植物細胞壁 的酵素(plant cell wall degradation enzymes)、植物性荷爾蒙(phytohormone)乙烯和植
物生長素(auxin) (Valls et al., 2006)。目前已知青枯病菌的 hrp 基因是非常重要的致 病因子，若 hrp 基因突變，會影響其 Hrp pilus 的組成，降低病菌從根部感染植株 的能力，減低其對感病植株的致病力，並且對於抗性植株失去形成過敏性反應的 能力(Aldon et al., 2000 ; Vasse et al., 2000)。
6. 細菌脂多醣 (lipopolysaccharides 或簡稱 LPSs)
LPS 可以保護細菌免受胞外毒物的傷害，例如 LPS 可以保護病原菌免受寄主 釋放的抗生物質所毒害，緩和寄主的防禦反應，使得病原菌得以生存並在寄主體 內生長繁殖(Dow et al., 2000; Newman et al., 2007)。因此 LPS 在病原菌與寄主交互 作用中會影響許多致病因子的表現，包括影響生物膜的形成和病原菌附著寄主的 能力。所以，一旦LPS biogenesis 產生變化，將影響病原細菌與寄主的交互關係，
而使得病原菌的毒性和寄主感染範圍改變，或影響寄主的防禦反應(Kao and Sequeira, 1991; Thomsen et al., 2003)。雖然植物經事先處理細菌 LPS 後可以誘發植 物 對 抗 後 續 病 原 菌 侵 染 之 防 禦 反 應 是 首 先 在 青 枯 病 菌 中 發 現(Graham et al., 1977)，多年來，在青枯菌 LPS 的研究多著重在其種類與組成份分析(Whatley et al., 1980; Baker et al., 1984; Varbanets et al., 2003)，對其 LPS 的生合成、代謝及運送相 關分子機制及其關鍵基因卻極不了解，目前有限的報導也僅指出 ops cluster 和 rfaF 基因與LPS 合成有關(Titarenko et al., 1997)，並已知減少 LPS 生合成會降低對寄主 植物的致病力(Titarenko et al., 1997)。
7. PhcA 調控青枯病菌致病網
青枯病菌的致病網是以 PhcA 為中心去調控所有青枯病菌的致病因子(見附錄 六)。PhcA 可以直接或間接正調控 EPS I 的產生、DNA 的自然轉移(natural transformation)、acyl-homoserine lactone quorum sensing system (Schell, 2000; Kang et al., 2002)。並且可以負調控 PehA、PehB 的產生、staphyloferrin B 的產生、type 4 pili 的產生進而影響到twitching motility 和生物膜的形成、swimming motility、HrpG 所 調控的T3SS。在入侵植物早期病菌數量少，不會大量產生胞外胞醣體，此時病原
菌需要游動力(swimming、twitching motility)成功吸附植物根部，再利用分泌分解 植物細胞壁酵素和第三型分泌系統進入植物組織內，細菌成功進入植物組織內後 便可大量增生，當細菌濃度到達一定數量後，3-OH PAME 誘導 PhcA 的活化，此 時PhcA 便會抑制之前細菌產生的毒力因子，並活化下游轉錄因子 XpsR，XpsR 和 VsrC、VsrB 複合體作用後，可以活化 eps transcription，產生青枯病菌最重要的致 病因子EPS I，促使細菌大量產生胞外多醣體阻塞維管束(Garg et al., 2000; Genin et al., 2005)。
Ⅴ、LPS 生合成與運送機制及 DUF1239 相關研究
革蘭氏陰性細菌的外膜是天然的屏障，可以有效地保護細菌免受毒性物(如抗 生素和化學物質)的傷害，使得細菌可以在各種環境中存活，甚至得以在不利的環 境中生存。LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的重要組成物，使其外膜結構得以完整(Bos et al., 2007)。LPS 組成主要可以分成三部分，分別是疏水性膜脂質 A (hydrophobic membrane-anchored lipid A moiety)、核心多醣(short core oligosaccharide)和多變異的 O-抗原多醣鏈(distal and most variable O-antigen polysaccharide chain)，其中若 LPS 缺少O-antigen 稱之為粗型脂多醣(rough LPS 或簡稱 R-LPS)，若含有完整的三個組 成分之 LPS 則稱之為平滑型脂多醣(smooth LPS 或簡稱 S-LPS)(Newman et al., 2007)。目前研究得知，LPS 在細胞質或內膜(inner membrane)進行合成與組成，再 運送至外膜。LPS 的合成與組成機制在人類病原菌大腸桿菌 Escherichia coli 中已 大致研究透徹，但是，LPS 被運送到外膜的相關機制則未解。一直到最近，方得 以自幾項最新報告中稍加拼湊而得知 (附錄五)，LPS 的運送應該是由六個細胞質 或細胞膜蛋白所共同協助完成(Sperandeo et al., 2007; Ma et al., 2008; Sperandeo et al., 2008; Tran et al., 2008; Narita and Tokuda, 2009)，目前已經將這些蛋白質重新命 名為LptA, LptB, LptC, LptD, LptE, LptF, LptG；然而，目前除了得知 LptA 蛋白可 與LPS 直接結合，而 LptB 可以和 LptF、LptG、LptC 結合形成 LptBFG 或 LptBCFG，
組成ABC tranaporter 外(Narita and Tokuda, 2009)，這些蛋白質的功能機制及其之間
的交互作用關係則尚未研究透徹。
DUF1239 基因家族的產物是一大約 190 個胺基酸大小的未知蛋白質，目前只 有在大腸桿菌 E. coli 中的 LptC (之前命名 YrbK)有所研究，由近年的研究可知 E.
coli LptC 蛋白為膜蛋白並參與 LPS 的生合成與運送(Sperandeo et al., 2006 and 2008)。本研究欲了解在青枯病菌中的同源基因 RSc0411 是否也是參與 LPS 的生合 成與運送，以及在致病力上扮演的角色。
Ⅵ、murI 基因的相關研究
MurI 蛋白為 glutamate racemase，可以將 L-glutamate 催化轉變成 D-glutamate，
而D-glutamate 是組成細菌細胞壁肽聚醣的重要成分，可以保護細菌的細胞壁免受 細胞的蛋白質酶攻擊，尤其革蘭氏陽性菌細胞壁有一層較厚的肽聚醣層，因此需 要更多的D-glutamate。但若細菌形成過量的 D-glutamate 則會造成自身毒害，所以 維持細菌中glutamate 的代謝與平衡是非常重要的(Ho et al., 1995)。MurI 蛋白質的 結構在細菌中可以dimer 形式存在(如: Helicobacter pylori)，或是以 monomer 形式 存在(如:E. coli)。目前 glutamate racemase 酵素相關的研究大多專注於測定酵素的 活性與其蛋白質結構分析，及其DNA gyrase inhibitor 的活性研究。目前已知 murI 基因被跳躍子插壞後，會影響青枯病菌對番茄和阿拉伯芥的致病力(Lin et al., 2008)，但是 murI 基因在致病力所扮演的角色仍然未知，這也是本篇論文欲探討的 重要主題。
許多的革蘭氏陽性菌(尤其是 Bacillus 屬)和一種古生菌 Natrialba 及一種真核微 生物 Cnidaria 可以形成 Poly-γ-glutamate (PGA)，由 D-glutamate 和 L-glutamate 組 成的 PGA 可以幫助細菌在高鹽環境中生存，也影響細菌毒力因子(Candela and Fouet, 2006)。若 glutamate 量減少，則細菌的 PGA 較少，會造成其生物膜的形成 下降，但不會影響其生長能力及游動力(swimming motility) (Chagneau and Saier 2004)。D-glutamate 和 L-glutamate 是細菌生存的必需胺基酸，它們參與細菌正常 生理代謝、細胞分裂和細胞壁的組成。D-glutamate 的生合成可由兩種路徑產生，
其一是由D-amino acid transaminase 催化 D-alanine 和 α-ketoglutarate 轉氨基後產生 D-glutamate，其二是由 glutamate racemase 直接催化 L-glutamate 形成 D-glutamate (Pucci et al., 1995; Fotheringham et al., 1998)。由目前的研究顯示有些細菌只找到一 種可以形成D-glutamate 的酵素，如在 E. coli、Lactobacillus 和 Pediococcus 屬中只 有glutamate racemase 酵素，但有些細菌如 Staphylococcus spp. 和 Bacillus sphaericus 同時有此兩種酵素在催化形成D-glutamate (Pucci et al., 1995; Fotheringham et al., 1998) 。 在 E. coli 中 ， glutamate racemase 的 活 性 是 由 肽 聚 醣 前 趨 物 UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanine (UDP-MurNAc-L-Ala) 所 調 控 ， MurI 需 要 UDP-MurNAc-L-Ala 活化才可以將 L-glutamate 催化成 D-glutamate (Doublet et al., 1994)，UDP-MurNAc-L-Ala 可以辨認 E. coli 中 N 端的 21 個胺基酸(其他革蘭氏陽 性菌中無此21 個胺基酸)並活化其酵素(Ho et al., 1995)。由研究顯示細菌的 MurI 若為 dimer 結構，則不須 UDP-MurNAc-L-Ala 活化即可有活性(Lundqvist etal., 2007)。細菌細胞壁肽聚醣的生合成需經過許多步驟。在大腸桿菌中 D-glutamate 是肽聚醣結構中一個特別的成分，其添加到 UDP-MurNAc-L-Ala 中後，經由酵素 MurD 催化形成 UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu，再經由酵素 MurE 和 MurF 催化形成 UDP-MurNAc-pentapeptide，最後形成肽聚醣(附錄十) (Doublet et al., 1994)。在大腸 桿菌中若 murI 條件突變，可發現其細胞分裂受到影響，而有細胞成絲狀延長的現 象。若過量表現 MurI 則會造成核酸分離異常和細胞的增生被抑制(Baliko and Venetianer , 1993)。
目前研究顯示glutamate racemase 不只參與 glutamate 的代謝，也同時為 DNA gyrase inhibitor，參與細胞分裂時 DNA processing。DNA gyrase (DNA topoisomerase II)為 DNA processing 中最重要酵素之一，利用消耗 ATP 催化 negative supercoiling DNA 和催化 DNAs decatenation。目前已知的 DNA processing 蛋白(如: GyrI)幾乎皆 有序列保守的DNA-binding motifs，但 MurI 卻沒有 DNA-binding motifs (Ashiuchi et al., 2002)。原核生物的 DNA gyrase 可以被許多的抗生素辨認結合，這些抗生素抑
制子主要可以分為三群，第一群抑制子(如:coumarins 和 cyclothialidines)主要干擾 ATP 的水解而抑制 supercoiling 的活性，第二群抑制子(如:合成的 quinolones)可以 干擾酵素和 DNA 的共價中間產物形成，最近發現第三群抑制子(如: E. coli 的 GyrI、Mycobacterium sp.的 MfpA 及 M. tuberculosis 的 MurI)是利用干擾 DNA gyrase 和DNA 結合而成功抑制 DNA gyrase (Ashiuchi et al., 2002; Sengupta et al., 2006)，
其中 M. tuberculosis 的 MurI 可以結合到 DNA gyrase (有兩個 GyrA 和兩個 GyrB) 的 GyrA 構造中，使其無法再和 DNA 結合，而成功抑制其活性(Sengupta et al., 2006)，維持細菌體內的平衡。在大腸桿菌中的 glutamate racemase 需要肽聚醣前趨 物UDP-MurNAc-L-Ala 調控才有 DNA gyrase 抑制子的活性(Ashiuchi et al., 2002)。
Glutamate racemase 與其他的胺基酸 racemase 不同，此酵素不需任何的輔酶(如:
pyridoxal-phosphate; PLP)，並且與其他的胺基酸 racemase 沒有序列相似的區段，
比起其他需要輔酶PLP 的胺基酸 racemase 此酵素的催化能力較低(Yoshimura et al., 1993)。比較不同生物中 glutamate racemase 的序列同源基因，發現除了在微生物 外，在其他不需要合成肽聚醣的生物如:植物、人類也都有此基因，但此基因產物 失去glutamate racemase 的功能(Ashiuchi et al., 2002)。但在最近的研究報導中指 出，人類癌症中有glutamate racemase 同源基因大量表現，造成細胞分裂時有不正 常的DNA 複製產生(Ashiuchi et al., 2002)，相信未來有許多研究將找尋 glutamate racemase 的相似物，以調控 DNA topoisomerases，以期可以做為癌症藥物。
Ⅶ、研究目標
雖然目前關於青枯病菌之致病機制已有一些初步的資訊，但我們對於這個極 為複雜且破壞力極強的病菌的了解仍是十分有限。由於青枯病菌之寄主範圍極 廣，如果能夠更深入且全面性地了解此破壞力極強之病菌的致病機制、其主導基 因、各訊息傳導途徑間之交互作用與調控，我們便可依據所獲資訊，積極研擬破 壞病菌感染的管道，得以研發有效控制此嚴重病害的可能策略。本實驗室先前利 用跳躍子(Tn5)策略篩選致病力降低的青枯病菌突變株(Lin et al., 2008)，其中兩株
突變株在番茄和阿拉伯芥的致病力都大大降低，而在其基因體中因Tn5 插入而被 影響的基因，便可能是參與青枯病菌致病力之關鍵基因。經序列比對分析發現，
被Tn5 插入者為未知功能之基因 RSc0411（其基因產物被分類於 DUF1239 基因家 族中）與 RSc1956 (murI)，本研究目的為探討這兩個青枯病菌新穎致病關鍵基因在 致病力及其他功能上扮演之具體角色及其參與的致病途徑。本研究先由目前已知 的青枯病菌所需的致病能力 (如：游動能力，生物膜的形成能力，EPS 的產生，分 泌破壞植物細胞壁的酵素系統type II secretion system，Hrp 製造的第三型分泌系統 等)先作分析，再依每個基因可能參與的致病機制更深一步去研究其扮演的角色及 功能。
第二章 實驗材料與方法
本論文所使用之菌株及質體請見表一、四，實驗所設計之引子序列請見附錄一、
二，實驗材料部分(培養基、實驗試劑及溶液、藥品之成分配方)見附錄。本研究所 使用的青枯病菌皆為從-80℃冰箱劃菌到 TTC 培養基上(如果為本實驗所構築之菌 株，則需添加抗生素，詳見表一、四)，在 28℃的培養箱培養兩天之菌株。本研究 所使用的植物為青枯病感病品系番茄 (Solanum esculentum) L390，菸草 Nicotiana tabacum Wisconsin 38 (W38) 和 Nicotiana benthamiana。
在第一部分 RSc0411 研究中所用的野生型菌株為存在於台灣本土番茄中所分 離 出 的 Pss190 菌 種 ， RSc0411 突 變 株 為 其 利 用 EZ::TN™ ＜ KAN-2 ＞ Tnp Transposome™ kit (Epicentre)所製作產生的。而第二部分 murI 研究中所用的野生型 菌株為存在於台灣本土番茄中所分離出的 Pss4 菌種。murI 突變株為其利用 Transposome TM kit (Epicentre)在 Pss190 背景下所製作產生，之後再利用 DNA 自 然轉型法所構築的Pss4 isogenic 突變株。
1. 萃取青枯病菌 genomic DNA
取單一菌落至523 液態培養基，於 28℃震盪培養 12-16 小時，隔天將菌液以 13000 rpm 離心 1 分鐘，去除上清液，加入 200 µL 的 lysis buffer，混合均勻，再加 入66 µL NaCl，混合均勻，以 13000 rpm 離心 10 分鐘，將上清液移到新的微量離 心管，加入一倍體積的chloroform，輕搖混和均勻後，以 13000 rpm 離心 10 分鐘，
取出水層的溶液至另一個微量離心管，並加入2.5 倍體積 100% 酒精使之沉澱，離 心2 分鐘，去除上清液，再以 500 µL 75% 的酒精洗一次後，自然乾燥後，加入 20 µL 無菌去離子水溶解離心物，再加入 2 µL 的 RNase A (20 µg/mL)，置於 37 15℃ 分鐘後，將萃取的青枯病菌genomic DNA 存放於-20℃備用。
2. 製備 plasmid DNA
一微量離心管取1.5 mL 菌液，以 13000 rpm 離心 5 分鐘後，去上清液，加 100 µL solutionΙ，混合均勻，再加入 200 µL sulution (Ⅱ 要現配) ，輕輕混合均勻，再加
入150 µL sulutionⅢ，輕輕混合均勻後，以 13000 rpm 離心 10 分鐘後，取上清液至 新的微量離心管，加入4℃等體積的 phenol/chioroform/isoamylalcohol (25:24:1)，PCI 分兩層，上為水層，下為有機層，取下層的PCI 混合均勻，以 13000 rpm 離心 10 分鐘後，取上清液至新的微量離心管，加等體積的isopropanol 和 1/10 體積的 3M NaOAc (PH6.5)，混合均勻後，靜置於-20 30℃ 分鐘後，以13000 rpm 離心 5 分鐘 去上清液，以500 µL 75% 的酒精清洗一次後，自然乾燥後，加入 20 µL 無菌去離 子水溶解離心物，再加入2 µL 的 RNase A (20 µg/mL)，置於 37 15℃ 分鐘後，將 萃取的plasmid DNA 存放於-20℃備用。
3. 選殖技術與程序 (Cloning and transformation in E. coli) 3-1 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)
PCR 試劑是利用 Taq polymerase 配合 10X Taq polymerase buffer 進行實驗。依 下表分別加入反應物，先以 94 denature ℃ 5 分鐘後，再以 94 denature 30℃ 秒；55 ℃ annealing 30 秒 (此步驟依照每對 primer 之 melting temperature 不同而加以增減)，
72 elongation (1 kb℃ 大小的目標基因約1 分鐘，此步驟時間依照 PCR product 的大 小有所不同)，通常進行 30 次循環。
進行聚合酶連鎖反應所需準備的藥品如下:
Stock Volume Final conc.
2.5 mM dNTP 2 µL 0.25 mM
10X PCR buffer 2 µL 1X
DMSO 2 µL 10%
10 mM primer (Fwd) 1 µL 1 mM
10 mM primer (Rev) 1 µL 1 mM
Template x µL
Taq polymerase (2 U/µL) 0.2 µL Distilled H2O (11.7-x) µL
Total 20 µL 3-2 DNA 純化
將 PCR product 利用 Gel/PCR DNA fragments extraction kits (gene maker) 做 純化。在PCR product 中加入等體積之 binding buffer 和 10 µL Silica Matrix，混合 均勻後，以13000 rpm 離心 1 分鐘，將上清液去之 (只留下約 20 µL 之上清液)，將 下層的Silica Matrix 放入 spin column 中，再以 13000 rpm 離心 1 分鐘，加入 wash buffer (含 ethanol)，以 13000 rpm 離心 5 分鐘，徹底清除 column 中的 wash buffer，
加入無菌的無菌去離子水回溶column 上的 DNA，再以 13000 rpm 離心 3 分鐘後，
即可得到純化之DNA 產物。
3-3 限制酶 (restriction enzyme) 的消化水解 (digestion)
各取約 5 µg 載體 (vector) 與純化過後的目標基因 PCR 產物，加入 0.5 µL 的限 制酵素，10X NEBuffer 2 µL，補無菌去離子水至最終體積 20 µL，在37℃下反應 2 小時。
3-4 載體與基因之接合 (ligation)
Insertion DNA (目標基因) 與載體以 3:1 進行混合，加入 10x ligation buffer 1 µL 與T4 DNA ligase 0.5 µL，補無菌去離子水至最終體積為 10 µL，置於 16℃水浴槽 16 小時。
3-5 大腸桿菌勝任細胞的轉型作用
取5 µL 接合作用後之質體 DNA 與 50 µL 大腸桿菌勝任細胞混合，置於冰上 30 分鐘，放入 42℃水浴槽 45 秒，再置於冰上 3 分鐘後，加入 900 µL SOC medium 混合吸出菌液，注入微量離心管中，於37℃下震盪培養 1 小時。以低速離心 1 分 鐘，吸去上清液，混合剩餘的液體與細胞沉澱。將混合好的菌液塗佈於具篩選力 的LB 固體培養基，於 37℃下隔夜培養 16 個小時。
4. 構築質體 4-1 構築互補
利用low copy 的載體 pUFR047 (抗 Amp、Gen) 來為本實驗中跳躍子插壞的 突變株構築互補株，murI 突變株的互補構築是在 Pss4 background，RSc0411 突變 株的互補構築是在Pss190 background，此外，RSc0411 突變株也進行其他細菌的同 源基因 (ortholog) 互補，包括 Cupriavidus taiwanensis (Ct)、Ralstonia metallidurans (Rme)、 Ralstonia eutropha H16 (Reu)、Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)、Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc)、Escherichia coli (E coli)，所有進 行互補實驗的引子都列在附錄一、二。
4-2 構築 lacZ transcriptional fusions
利用medium copy 的載體 pCZ962 (含有一個 promoterless lacZ reporter gene，
抗 Tet)，將目標基因 start codon 往前推 500 bp，來構築 lacZ transcriptional fusions 以進行promoter activity 實驗分析，本實驗都是利用青枯病菌 Pss190 的 genomic DNA 構築。此實驗所使用的引子都列在附錄一、二。
5. 青枯病菌勝任細胞的製備與轉型作用 5-1 青枯病菌勝任細胞的製備
挑單一菌落培養於523 液體培養基，28℃下 200 rpm 震盪培養 16 小時。取 1 mL OD600 ＝1 的菌液放入 100 mL 523 液體培養基中，於 28 200 rpm ℃ 震盪培養至菌 液到達約OD600 ＝0.5 的濃度，即可開始製備勝任細胞。將菌液倒入離心管中，以 6500 rpm 4℃離心 10 分鐘，吸去上清液，以 20 mL 冰的無菌去離子水沖散細胞沉 澱，再以6500 rpm 4℃離心 10 分鐘。吸去上清液，以 10 mL 冰的無菌去離子水沖 散細胞沉澱，再以6500 rpm 4℃離心 10 分鐘。吸去上清液，加入 5 mL 冰的 10%
glycerol 沖散細胞沉澱，以 6500 rpm 4 ℃ 離心20 分鐘。吸去上清液，加入 1.5 mL 冰的10% glycerol 沖散細胞沉澱，分裝 150 µL 至無菌微量離心管中，並快速置於 液態氮中，再存於-80℃冰箱，以備進行轉型作用。整個製備過程皆需於 4℃及冰 上操作，且過程宜快速精準。
5-2 青枯病菌勝任細胞的轉型作用
取2 µL 質體 DNA 和 150 µL 青枯病菌勝任細胞置於 1.5 mL 微量離心管中，
並充分混合，吸出置於細胞電穿孔小管中，通以2.5 KV 的電流。以 1 mL 523 液體 培養基混合吸出菌液，注入微量離心管中，置於28℃下震盪培養 3 小時，再將菌 液塗盤於具篩選力的固體培養基上，置於28℃下培養兩到三天。
6. 製備 allelic mutants
將青枯病菌 ( Pss4、Pss1308 ) 利用 MP 液體培養基在 28℃下 200 rpm 震盪培 養兩天。取40 µL 的菌液和 5 µL 的 genomic DNA 充分混合均勻，點盤於 BG 固體 培養基 (不須添加 glucose) 上，置於 28℃下培養兩天，利用無菌去離子水將培養 基上之菌清洗下來，放入微量離心管中，低速離心後，去除上清液，混合剩餘的 液體與細胞沉澱。將混合好的菌液塗佈於具篩選力的TTC 固體培養基 (抗 Kan)，
於28℃下培養兩天。
7. RNA 表現的測定
7-1 萃取青枯病菌的 RNA (使用 RNeasy Mini Kit, Invitrogen)
挑單一青枯病菌菌落放入加20mM glutamate 的 MP 液體培養基(Boucher et al., 1985)，在 28℃下 200 rpm 震盪培養，直至菌液濃度到達 OD600＝0.8，取 1.5 mL 的 菌液至微量離心管，加入5% 的 STOP solution (95% ethanol、5% phenol)，在 4℃
下以6000 rpm 離心 10 分鐘，去上清液，加入 200 µL TE buffer 和 2 µL的lysozyme (0.1 mg/µL)，充分混合均勻後，靜置 5 分鐘，加入 700 µL RLT buffer (含 7 µL β-mercaptoethanol)，充分混合均勻後，以 13000 rpm 離心 5 分鐘，將上清液小心移 至新的微量離心管，再加入 500 µL 的 100% ethanol，輕搖混合後，將其移至 QIAshredder spin column，以 13000 rpm 離心 1 分鐘，加入 350 µL RW1 buffer 到 column，再以 13000 rpm 離心 1 分鐘，然後小心的在 column 上加入 70 µL的RDD buffer 和 10 µL 的 DNAse，靜置 1hr 後，加入 350 µL 的 RW1 buffer 清洗 RNeasy spin column，以 13000 rpm 離心 1 分鐘後，加入 500 µL RPE buffer 清洗兩次，離心後 去除RPE buffer，再以 13000 rpm 離心 2 分鐘去除 column 中殘餘的酒精，將清洗
後的RNeasy spin column 置入新的微量離心管，加入 20 µL DEPC 水，以 13000 rpm 離心1 分鐘，即可得青枯病菌 RNA 樣本。
7-2 甲醛電泳膠體製備 (1% formaldehyde gel)
取1 g 的 agarose 加入 37 mL 無菌去離子水，微波加熱使之完全溶解後，待冷 卻至70-80℃，加入 5 mL 的 10x MOPS 及 8 mL 的 37%甲酫混合均勻後倒入模具中，
插入齒梳後待冷卻凝固備用。取1-2 µL total RNA，2 µL 10x MOPS，3 µL 的 37%
甲酫，10 µL 的 formamide 及 1 µL 的 EtBr (10 mg/mL)，混合後於 75℃加熱 10 分鐘，
在冰上急速冷卻後，以微量吸管將total RNA 樣品注入膠體中，以電壓 70-80 伏特 進行電泳跑膠。
7-3 反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR)
本實驗使用的試藥組為 Promega kit。利用總核糖核酸中的 mRNA 後面帶有 poly A tail，而用 Oligo (dT)15當作引子合成cDNA。製備方式如下，取 1 µg 的 RNA，
加入2 µL 的 dNTP mix (10 mM)、1 µL 的 Random primer(0.5 µg/µL) 、2 µL 的 10x reverse transcription buffer、4 µL 的 MgCl2 (25 mM)、0.4 µL 的 AMV reverse transcriptase (15U/µL)及 0.4 µL recombinant RNasin ribonuclease inhibitor，最後補水 至總體積20 µL 後，置於 42 /1.5℃ 小時，再將整個反應95℃，加熱 5 分鐘，之後 置於冰上5 分鐘，停止反應，補 DEPC 水至總體積 100 µL，將 cDNA 冰-20℃備用。
7-4 即時定量 RT-RCR
使用Bio-Rad Real-Time PCR Detection Systems，cDNA 取 5 µL (約 500
ng/µL )，9 µL SYBR Green Supermix，0.5 µL 的 forward primer (10 µM) ，0.5 µL 的 reverse primer (10 µM)，補無菌去離子水至總體積為 18 µL，混合均勻後放入 Real-Time PCR Detection 反應器中進行反應，再經 iQ5 軟體分析。
8. 生理特性分析 8-1 生長曲線
挑單一菌落到523 液體培養基 200 rpm 震盪培養 16 小時，利用分光光度計
(HITACHIU-3200) 測量其吸光值 OD600，取100 µL 的 OD600＝0.3 (菌量大約為 3×108 CFU/mL) 菌液到 523 或 M9 液體培養基 100 mL 中，於 28℃轉速 200 rpm 的培養 箱中震盪培養，每十二小時取1 mL 的菌液出來測量其吸光值 OD600並記錄之。
8-2 點盤分析
挑單一菌落至523 液體培養基，於 28℃以 200 rpm 震盪培養 16 小時，利用分 光光度計 (HITACHIU-3200) 測量其吸光值 OD600，首先將菌液調到 OD600＝0.3 (3×108 CFU/mL)，再做一系列的系列稀釋，取 10µL 濃度分別為 3×105、3×104、 3×103 CFU/mL 的菌液點在 CPG、CPG+0.01％SDS、M9、SM1 固體培養基上，放在 28℃
的培養箱養兩天，拍照觀察其生長是否有異。
8-3 青枯病菌在植物體內增生能力分析
挑單一菌落至523 液體培養基，於 28℃以 200 rpm 震盪培養 16 小時，利用分 光光度計 (HITACHIU-3200) 測量其吸光值 OD600，將菌液調到OD600＝0.3，以針 筒打入菸草 Nicotiana benthamiana (Nb) 的葉肉組織中，在菌液進入植物組織後的 0hr 和 24hr 分別以打洞器取含菌液植物組織，將待測植株組織放入封口袋中秤重，
加入1mL 的無菌水，將植株磨碎，取 100µL 的組織液出來，作連續十倍稀釋，再 將不同倍數的稀釋液各取10µL 點盤於 TTC+kanamycin 或 SM1 固體培養基上，兩 天後數其菌落數，並回推其在植物中的菌量。
8-4 逆境反應分析 Stress response (Branch et al., 1965)
挑單一菌落養在523 液體培養基，於 28℃以 200 rpm 震盪培養 16 小時，利用 分光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值 OD600，將菌液調到濃度OD600＝0.3。
將待測的逆境化學物(如：過氧化氫、抗生素 polymycin B)加入 523 營養豐富或 MP 營養貧瘠液體培養基中，再做一系列的兩倍系列稀釋，各取含有不同濃度化學物 的523 或 MP 液體培養基 2 mL 放入試管中，並保留一管未加任何化學物之純液體 培養基當做對照組，將50 µL OD600＝0.3 之菌液加入各試管中，於 28℃轉速 200 rpm 的培養箱中震盪培養，523 培養基於 16 小時後取出，MP 培養基於 30 小時後取出，
菌液利用分光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值 OD600，並紀錄比較之。
8-5 細菌碳源、氮源 (BiologTM) 和API-Zym酵素的分析
挑單一菌落培養在TTC固體培養基上，放在28℃的培養箱培養一天，用 BiologTM 商業套組中所附的培養液GN Inoculating Fluid (Biolog catalog # 72101)
將次培養之菌洗下，並分別取150 µL OD600＝0.3的含菌培養液加入GN2 MicroPlate (Biolog catalog # 1101)的每一個孔洞中，放在28℃的培養箱養一天，利用ELISA reader (Beckman Culter AD340)測量其吸光值OD570，紀錄其菌液濃度，以分析此菌 的碳源利用。APIZym酵素測試是使用商業套組(bioMerieux Vitek, St Louis, MO, USA)來進行實驗，首先取OD600＝1的菌液加入APIZym kit的待測酵素孔洞中，靜 置培養於28 4hr℃ 後，再待測孔洞中滴一滴A試劑，再滴一滴B試劑，靜置30分鐘，
照相記錄其顏色變化。
8-6 穿透式電子顯微鏡
挑單一菌落培養在TTC 固體培養基上 16 小時，用無菌去離子水將培養基上的 菌清洗下來，取10 µL 的菌液滴在 carbon-coated copper grid (100-200 目) 靜置 40 秒，以無菌濾紙吸去菌液，再滴10 µL 的 1% phosphotungstenic acid 靜置 30 秒，
以無菌濾紙吸去phosphotungstenic acid，靜置一段時間待 carbon-coated copper grid 乾燥後，即可用穿透式電子顯微鏡(Hitachi H-7650)觀察青枯病菌的細胞型態。
9. 青枯病菌致病力相關能力之分析
9-1 游動能力的測試【Swimming motility (Liu et al., 2005) and Twitching motility】
挑單一菌落培養在TTC 固體培養基上 16 小時，用無菌去離子水將培養基上的 菌洗下來，利用分光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值 OD600，取1 µL OD600 ＝ 1 的菌液滴在 0.3％的洋菜膠培養基上(含 1% 的 tryptone)，放於 28℃的培養箱中培 養48 小時，拍照並記錄其 swimming motility 游動半徑。挑單一菌落培養在 CP 固 體培養基(1% peptone,0.1% casein hydrolysate,0.5% glucose)上，在培養 18、24、28 小時時利用解剖顯微鏡觀察其單一菌落的twitching motility 型態。
9-2 番茄根部的附著力測試 (Jofre et al., 2004)
將感病品種L390 的番茄種子放入無菌水中，以轉速 80 rpm 震盪兩天，再將 發根的番茄種子移到鋪有一層3M 濾紙的 15 公分培養盤上，加少許無菌去離子水 保持種子濕潤，並且外套一層鋁箔紙，置於暗室培養兩天。取於28 200 rpm℃ 震 盪培養16 小時的菌液，利用分光光度計 (HITACHIU-3200) 測量其吸光值 OD600，
取400 µL OD600＝0.3 的菌液稀釋一百倍，將稀釋後 40 mL 的菌液倒入直徑 16 公分 的培養皿中，取上述五株四天大的番茄幼苗放入含菌液的培養皿中，培養在28℃
轉速50 rpm 下四小時。將每株番茄的根部切取兩公分，放入 30 mL 0.88% 氯化鈉 溶液中，以轉速200 rpm 清洗番茄幼根 30 秒，再將根放入 1 mL 的 0.88% 氯化鈉 溶液中，震盪20 秒混和均勻，分別稀釋十倍、一百倍後，取 50 µL 塗在 TTC 或 SM1 固體培養基上，兩天後計算其菌落數。
9-3 生物膜形成能力之分析
挑單一菌落至523 液體培養基 200 rpm 震盪培養 16 小時，利用分光光度計 (HITACHIU-3200) 測量其吸光值 OD600，取20 µL OD600＝0.1 的菌液到每個孔洞 含有180 µL BG 液體培養基的 96 孔盤中，靜置於 28℃的培養箱一天。然後將其孔 中的菌液混和均勻，利用ELISA reader (Beckman Culter AD340) 測量其吸光值 OD570，紀錄其菌液濃度。再將孔內的菌液吸出，加入200 µL 的無菌水將孔壁洗過，
再加入200 µL 1％的結晶紫染色十分鐘，吸出結晶紫後，用 200 µL 的無菌水將孔 壁洗過，再加入200 µL 1％ SDS 充分混和均勻，將管壁上結晶紫染的生物膜洗下，
利用ELISA reader (Beckman Culter AD340)測量其吸光值 OD570，紀錄其生物膜形 成能力。
9-4 胞外酵素 (Exoenzyme activity) 的分析 (Liu et al., 2005; Valls et al., 2006) 挑單一菌落至523液體培養基，於28℃以200 rpm震盪培養16小時，利用分光光 度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值OD600，取1 µL OD600＝1 的菌液分別點在含有 不同胞外酵素的固體培養基上，放在28℃的培養箱養兩天。兩天後將培養基取出 作染色分析，加入2 N HCl 去分析分別含有胞外酵素pectin methylesterase (Pme)和 polygalactouronase (Peh)的培養基，計算酵素分解暈環的半徑大小。至於分析含有 胞外酵素endoglucanase (Egl)的培養基，首先先加入可以蓋過整個培養基面積的 0.1% 剛果紅溶液，靜置15分鐘後將溶液倒出，再加入1 M的氯化鈉溶液，數分鐘 酵素分解暈環出現後，倒出溶液，計算酵素分解暈環的半徑大小。
9-5 菸草的反應測試
挑單一菌落至523 液體培養基，於 28℃以 200 rpm 震盪培養 16 小時，利用分
光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值值 OD600，將菌液調到濃度OD600＝0.3。
將菌液以針筒打入菸草Wisconsin 38 (W38)的葉肉組織中，24 小時後，觀察其反應 並照相紀錄之。本實驗也將菌液以針筒打入菸草 N. benthamiana 的葉肉組織中，並 於24、72 小時觀察其反應並照相紀錄之。
9-6 番茄病原性測試 (Jaunet and Wang, 1999)
所用來測試的番茄品系是青枯病菌感病品種(Solanum esculentum) L390，首先 先將番茄泡水放在轉速80 rpm 震盪器上兩天，使其種子發芽，再移到兩英吋花盆 中生長，於12 小時光照 25℃，12 小時黑暗 20℃培養，等番茄三週大後，即可用 來測試青枯病的致病力，每次實驗中每一青枯病菌使用六棵番茄作測試。
挑單一菌落至523 液體培養基，於 28℃轉速 200 rpm 的培養箱中震盪培養 16 小時後，取200 µL 的菌液均勻塗於 523 固體培養基上，放在 28℃的培養箱養一天，
用無菌水將培養基上的菌液洗下，利用分光光度計(HITACHIU-3200)測量其吸光值 OD600，將菌液調到濃度OD600＝0.3。每棵番茄澆灌 20 mL 濃度 OD600＝0.3 的菌液，
放入溫度26℃的生長箱七日，紀綠其萎凋指數，萎凋指數共分 0 到 5 級，第 0 級 即毫無病徵，第1 級即一片葉子萎凋，第 2 級即兩到三片葉子萎凋，第 3 級即除 了頂葉沒有萎凋外其他葉子皆萎凋，第 4 級即整棵植物萎凋，第 5 級即植物已經 腰折乾枯死亡。
除了紀錄萎凋指數外，我們亦計算植株內真正的細菌含量，我們將測距離子 葉上下 1 公分處的組織，上部稱為莖部，下部稱為基部，除此我們亦測植株的根 部菌量，我們也將其根部分為上下兩部份，將待測植株組織放入封口袋中秤重，
加入1mL 的無菌水，將植株磨碎，取 100 µL 的組織液出來，作連續十倍稀釋，再 將不同倍數的稀釋液各取10 µL 點盤於 TTC+Kan 或 SM1 固體培養基上，兩天後數 其菌落數，並回推其在植物中的菌量。
10. 青枯病菌脂多醣的測定
10-1 青枯病菌脂多醣的萃取(Titareuko et al., 1997)
從挑單一菌落至 523 液體培養基，於 28℃以 200 rpm 震盪培養 16 小時，取 200µL 的菌液均勻塗於 TTC 固體培養基上，放在 28℃的培養箱養一天，用無菌水 將 培 養 基 上 的 菌 液 清 洗 下 ，利 用 分 光 光 度 計(HITACHIU-3200)測量其吸光值 OD600，將菌液調到濃度OD600＝0.4，取 1.5 mL 到微量離心管，以轉速 13000 rpm 離
