行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

YC-1 誘導 RAW 264.7 巨噬細胞脂質分解之機制探討

計畫類別： 個別型計畫

計畫編號： NSC93-2320-B-038-038-

執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 臺北醫學大學解剖學科

計畫主持人： 陳金山 共同主持人： 李秉穎

報告類型： 精簡報告

處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 10 月 28 日

九十三年度國科會計畫 (NSC 93-2320-B-038-038) 結案報告

題目： YC-1 誘導 RAW 264.7 巨噬細胞脂質分解之機制探討

前言：

早期動脈硬化的其中一項主要特徵是堆積脂肪的巨噬細胞 [泡沫細胞 (foam cells)] 在內皮層 (intima) 形成脂肪斑 (fatty streak)。是故，探討泡沫細胞的 形成對了解動脈硬化的過程有一定程度的幫助。

YC-1 可經由活化 soluble guanylate cyclase (sGC) 而造成 cGMP 的形成增加 (Ko et al., 1994)。在大鼠的頸動脈中，YC-1 可經由刺激 cGMP 的生成而抑制 balloon injury 所誘導的內皮層增生 (Tulis et al., 2000)，而這種增生則部分導 因於巨噬泡沫細胞的形成，且最終會造成動脈硬化 (Ross 1993 & 1999)。另一 部分的研究則指出iNOS 出現在泡沫細胞，故 NO 在泡沫細胞的形成過程扮演 一定的角色 (Yang et al., 1994)。另外，在脂肪細胞中，由 cAMP 所誘導的脂質 分解亦須內源性的NO 參與其中 (Gaudiot et al., 2000)。最後，YC-1 又可以在 不影響cGMP 濃度的狀況下刺激內皮細胞的 NO 生成 (Wohlfart et al., 1999)。

由以上的結果我預期YC-1 應該可以促進巨噬泡沫細胞的脂質分解，至於這種 作用是否透過cGMP 或 NO 而達成亦會在本報告中加以呈現。

結果：

首先以60 M YC-1 處理 RAW 264.7 巨噬細胞一段時間，之後再收集細胞外 液分析其中的脂肪酸含量以代表細胞有無進行脂質分解。結果顯示，YC-1 可透 過time-dependent 的方式誘導細胞進行脂質的分解 (圖 1)。利用 Nile red 染 色法可見到經過60 M YC-1 處理 6 小時後的細胞之細胞質內已無脂肪滴 (圖 2)。對 YC-1 誘導脂質分解的機制研究結果顯示，YC-1 在處理巨噬細胞 10 分鐘

後並不會造成cGMP 產量的上升 (圖 3)，即便合併 60 M YC-1 和 30M SNP (後者為一種 sGC 的活化劑) 的作用亦不會導致 cGMP 的顯著增加 (圖 3)。以 120

M ODQ 抑制 sGC 的活性無法壓抑 YC-1 所誘導的脂質分解 (圖 4)。進一步支 持YC-1 透過和 cGMP 無關的路線刺激脂質分解的證據來自不論是以 30 M BAY (一種 sGC 的活化劑) 或是用 1 mM dbcGMP 處理細胞皆不會造成脂質分解的增 加 (圖 4)。最後，為了檢視 NO 是否參與脂質分解的過程，以 YC-1 和泡沫巨噬 細胞細胞作用6 小時後測定 NO 的含量。結果發現，YC-1 並不會促進 NO 含量 的增加 (圖 5)。綜合以上的結果，本計劃的結論是 YC-1 會透過和 cGMP 及 NO 皆無關的路線而刺激RAW 264.7 泡沫巨噬細胞的脂質分解。

討論：

雖然較早發現YC-1 抑制血小板聚集 (Ko et al., 1994) 及平滑肌收縮 (Yu et al., 1995; Mulsch et al., 1997) 的作用是透過活化 sGC 而增加 cGMP 的濃度，

但後來在許多細胞的研究卻發現YC-1 的作用會經由另一條和 cGMP 無關的路 線。舉例來說，YC-1 抑制嗜中性球的功能和 cGMP 無關，反而是經由和 cAMP 有關的方式達成 (Hwang et al., 2003)。另外，cGMP 亦不參與 YC-1 在肺部的 巨噬細胞中促進TNF-表現的過程—雖然其真正的機制並不清楚 (Hwang et al., 2003)。以上的結果皆證實 YC-1 的作用並非只透過活化 sGC 而造成 cGMP 的增 加。本計劃之結果亦支持這樣的現象。此外，由於YC-1 在 RAW 264.7 巨噬細 胞中會抑制lipoteichoic acid 所誘導的 iNOS 表現 (Hsiao et al., 2004)，且 NO 和脂肪細胞的脂質分解亦有密切的關係 (Gaudiot et al., 2000)，故本研究亦一 併探討YC-1 和 NO 之間的關係。但我的結果卻顯示 YC-1 在促進脂質分解時並 不會造成NO 產量的增加。事實上，個人之前的研究數據亦證實 NO 並不參與 泡沫巨噬細胞的脂質分解過程 (尚未發表)。

本研究最早發現YC-1 會刺激泡沫細胞的脂質分解，這對了解動脈硬化過程中 泡沫細胞所扮演的角色有了初步的認識與幫助。雖然如此，但YC-1 的真正作用

機制仍需進一步的研究。個人94 年度所通過的計畫 (NSC 94-2320-B-038 -020) 即在探討 YC-1 是否透過鈣離子而造成脂質分解，並已獲致初步的成果。

參考文獻

Gaudiot N, Ribière C, Jaubert AM, and Giudicelli Y. (2000). Endogenous nitric oxide is implicated in the regulation of lipolysis through antioxidant-related effect. Am J. Physiol. Cell. Physiol. 279:

C1603-C1610.

Hsiao G, Huang HY, Fong TH, Shen MY, Lin Ch, Teng CM, and Sheu JR.

(2004). Inhibitory mechanisms of YC-1 and PMC in the induction of iNOS expression by lipoteichoic acid in RAW 264.7 macrophages.

Biochem. Pharmacol. 67: 1411-1419.

Hwang TL, Hung HW, Kao SH, Teng CM, Wu, CC, and Cheng SJS. (2003).

Soluble guanylyl cyclase activator YC-1 inhibits human neutrophil functions through a cGMP-independent but cAMP-dependent pathway.

Mol. Pharmacol. 64: 1419-1427.

Hwang TL, Wu CC, Guh JH, and Teng, CM. (2003). Potentiation of tumor necrosis factor-expression by YC-1 in alveolar macrophages through a cyclic GMP-independent pathway. Biochem. Pharmacol. 66: 149-156.

Ko FN, Wu CC, Kuo SC, Lee FY, and Teng CM. (1994). YC-1, a novel activator of platelet guanylate cyclase. Blood. 84: 4226-4233.

Mülsch A, Bauersachs J, Schäfer A, Stasch JP, Kast, R, and Busse R.

(1997). Effect of YC-1, an NO-independent, superoxide-sensitive stimulator of soluble guanylyl cyclase, on smooth muscle responsiveness to nitrovasodilators. Br. J. Pharmacol. 120: 681-689.

Ross R. (1993). The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s, Nature 362: 801-809.

Ross R. (1999). Atherosclerosis—an inflammatory disease. New Engl.J.

Med. 340: 115- 126.

Tulis DA, durante W, Peyton KJ, Chapman GB, Evans AJ, and Schafer AI.

(2000). YC-1, a benyl indazole derivative, stimulates vascular cGMP and inhibits neointima formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279:

646-652.

Wohlfart P, Malinski T, Ruetten H, Schindler U, Linz W, Schoenafinger K, STRObel H, and Wiemer G. (1999). Release of nitric oxide from endothelial cells stimulated by YC-1, an activator of soluble guanylyl

cyclase.Br. J. Pharmacol. 128: 1316-1322.

Yang X, Cai B, Sciacca RR, and Cannon PJ. (1994). Inhibition of inducible nitric oxide synthase in macrophages by oxidized low-density lipoproteins.Circ. Res. 74: 318-328.

Yu SM, Cheng ZJ, Guh JH, Lee, FY, and Kuo SC (1995). Mechanism of anti-proliferation caused by YC-1, an indazole derivative, in cultured rat A10 vascular smooth-muscle cells.Biochem. J. 306: 787-792.

圖片

圖1. YC-1 透過 time-dependent 的方式促進脂質分解。

0 2 4 6 (h)

ExtracellularFreeFattyAcid(mM/mgprotein)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

YC-1 (60 M)

*

* (*, p<0.05)

圖2. YC-1 處理泡沫細胞 6 小時後以 Nile red 染色的結果。YC-1 處理後的細胞 內已無脂肪滴。

圖3. sGC 的活化劑 (BAY) 和抑制劑 (ODQ) 並不影響 YC-1 促進脂質分解的作 用。

Extracellularfreefattyacid (mM/104cells)

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025

BAY dbcGMP ODQ YC-1 YC-1 + ODQ

_

圖4. YC-1 單獨或合併 SNP 的作用皆不會引起 cGMP 濃度的增加。

Control YC-1 YC-1+SNP

%ofControl

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

圖5. 以 YC-1 處理細胞並不會造成 NO 產量的增加。

OA Mag YC-1 LPS

NitriteProduction(M/mgprotein)

0 200 400 600 800