國立臺東大學生命科學系碩士論文

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國立臺東大學生命科學系碩士論文

Department of Life Science National Taitung University Master Thesis

指導教授 : 林志輝博士 Advisor: Chih-Hui Lin, Ph.D.

Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101 發酵條件與冷凍乾

燥保護劑探討

Studies of fermentation conditions and lyoprotectant for Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101

研究生 : 曾子芸撰 Graduate student: Tzu-Yun Tseng

中華民國一○七年一月

January, 2018

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I

致謝

想當初從大學畢業的我，帶著忐忑不安的心情踏上碩士這條路，這一路走來，

碰到許多問題與困境，所幸得到許多人的幫助，才能讓我順利完成碩士學業，在此要給你們最誠摯的祝福與感謝。

由於大學四年都沒有進實驗室，碩班剛進實驗室時，其實甚麼都要重頭學過，

很感謝林志輝教授在這段期間內的教導，無論是在實驗上或生活上，也很感謝老師總是巧手 DIY 製作出許多實驗小道具，讓我們在做實驗時能更方便省時。且於論文撰寫期間詳加批閱並給予建議，使本論文能一點一滴地完成。論文初成時，

承蒙口試委員潘子明教授、蔡宗佑教授及李俊霖教授的撥冗審閱、指正並提供許多寶貴的建議，使本論文更加完備，在此獻上學生最誠摯的感謝。

在台東大學這六年內碰到校區大遷徙、實驗儀器故障、系館淹水及停電等等的大大小小狀況，和大家一起度過許多時光，要特別感謝系辦的助理姊姊，在工讀期間給予我許多幫助及工讀機會，如果沒有進系辦工讀，我可能會變成邊緣人，

也不會選擇留下來繼續讀研究所。還有要感謝曾經在我實驗碰到困難的時候 (數菌數到要崩潰、凍乾機故障不給力) 和我一起討論並想辦法解決的學長姐、同學們和陪著我一起熬夜跑發酵的學妹蔡蔡及伊萱，那些日子每天都在學校 overnight，雖然辛苦但值得，最後是在口試告急時聽我焦慮抱怨的所有朋友及家人，給予我許多信心去面對這重大的考試。

最後恭喜自己畢業了，接下來的考驗才是重點，期許自己能帶著所學發揮所長，在新的挑戰中嶄露頭角。

曾子芸謹誌

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II

摘要

Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101 (NTU 101) 為具有多種功 效的保健食品素材，但目前尚未有發酵生產及後續冷凍乾燥添加保護劑影響儲存穩定性的相關研究。本研究以 2.0 L 發酵槽探討氧氣及 pH 值對於 NTU 101 生長動力學之影響。結果顯示經由 orifice sparger 通入 N₂ 進行培養可得較高細胞密度 ((2.36 ± 0.21)x10⁹CFU/mL) 及比生產率 ((1.97 ± 0.18)x10⁸CFU/mL/h)。而在控制 pH 6.0 下進行培養可得最高的比生長速率 (0.61 h^-1, p < 0.05)，並使得發酵時間縮短至 9 小時 (縮短 0.5625 倍)，10% (w/v) 豆漿粉 (豆寶 2) 作為替代性培養基以相同條件培養 NTU 101，其單位成本產率與 pH 6.0 組相比顯著提升 1.53 倍，能有效減少生產成本。本研究結果顯示 NTU 101 冷凍乾燥菌粉在室溫下經十二個月儲存後菌數下降至約 10⁶ CFU/g，不利於產品銷售，因此近一步探討添加冷凍乾燥保護劑對菌粉儲存穩定性的影響，結果顯示添加 10% skim milk、

10% trehalose 及 10% lactose 作為保護劑，於 40℃ 進行加速保存試驗 3 個月後活菌數分別為 (9.34 ± 4.43)x10⁶、(1.57 ± 1.16)x10⁶ 及 (2.18 ± 0.31)x10⁷ CFU/g DCW，與未添加保護劑相比分別提升 31.04、6.16 及 65.52 倍的存活率，有利於後續製程上的應用。以 RT-qPCR 分析 NTU 101 於氧化壓力、pH 值、冷、

熱及滲透壓逆境對於其逆境基因表現的影響，結果顯示通入 N₂ 培養會降低

DnaJ、DnaK、sHsp 和 GroES 的表現量，控制於最適 pH 會再進一步降低 DnaJ、

DnaK 及 GroES 的表現，顯示 NTU 101 的生長限制和這三個基因的表現量有 關。由於有氧環境、較高或較低 pH 值環境下表現 Csp、DnaJ、DnaK、sHsp 和 GroES 均參與蛋白質的摺疊修復機制，因此環境逆境造成的蛋白質錯誤折疊可 能是本實驗中主要限制 NTU101 生長的因素，未來可利用這些基因表現量作為其生理狀態的指標，進一步探討逆境處理與 NTU 101 存活能力間的關聯性。

關鍵字 : 乳酸菌、發酵、冷凍乾燥、冷凍乾燥保護劑、逆境基因

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III

Abstract

Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101 (NTU 101) is a health food material with a variety of effects. However, no studies have been made on fermentation and adding freeze-drying lyoprotectants effect of subsequent storage stability. In this study In this study, the effect of oxygen level or different pH value on the growth kinetics of NTU 101 was investigated in a 2.0 L fermentor. The results showed that culture the NTU 101 with N2 gas using an orifice sparger had the highest cell density ((2.36 ± 0.21)x10⁹CFU/mL) and specific productivity ((1.97 ± 0.18)x10⁸ CFU/mL/h). However, the highest specific growth rate (0.61 h^-1, p < 0.05) was achieved under the control of pH 6.0. The fermentation time was shortened to 9 hours (0.5625 times decrease), 10% (w/v) soybean milk powder as an alternative medium after under the same conditions culturing NTU 101, the unit cost increased 1.53 times comparing to pH 6.0 group, which effectively reduced the production cost. In the other study, the long-term stored in room temperature after 12 months, the result showed that count of NTU 101 freeze-drying powder down to 10⁶ CFU/g, that was not conducive to product sales. Therefore, the effect of adding lyoprotectants on the storage stability of freeze-drying powder was further investigated. The results showed that viable cells numbers of 10% skim milk, 10% trehalose and 10% lactose was (9.34

± 4.43)x10⁶, (1.57 ± 1.16)x10⁶ and (2.18 ± 0.31)x10⁷ CFU/g DCW, compared with control (no protective agent) increased 31.04, 6.16 and 65.52 times survival rate, respectively. It is conducive to apply on the subsequent manufacturing process. Using RT-qPCR analyzed the effect of oxidative stress, pH value, cold, heat and osmotic stress for NTU 101 stress gene expression. The results showed that culture with N₂ gas decreased the expression of DnaJ, DnaK, sHsp and GroES, then controlling the optimal pH would further reduce the expression of DnaJ, DnaK and GroES, indicating the growth restriction of NTU 101 is related to the expression of these three genes. Under aerobic, higher or lower pH conditions expressed Csp, DnaJ, DnaK, sHsp, and GroES are all involved in the protein folding repair mechanism, protein misfolding caused by environmental stress may be the main limiting factor for the growth of NTU101 in this study. In future, it could use of these gene expression as an indicator of NTU 101 physiological status and further explores the relevance of stress treatment to survival.

Keywords: lactic acid bacteria, fermentation, freeze-drying, lyoprotectants, stress gene

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IV

圖目錄

圖一、益生菌的健康益處。... 6

圖二、噴霧乾燥過程 (A) 噴霧乾燥機示意圖 (B) 乾燥過程中的不同階段，包含重要的加熱及脫水逆境。... 9

圖三、冷凍乾燥 (A) 冷凍乾燥機示意圖 (B) 冷凍乾燥的步驟及最重要的逆境因素簡述。... 12

圖四、真空乾燥機示意圖。... 13

圖五、流動床乾燥機示意圖。... 14

圖六、影響益生菌存活率的重要因素。... 16

圖七、乳酸菌修復受損大分子的主要機制示意圖。... 22

圖八、本研究使用之 2.0 L 發酵槽。 ... 31

圖九、兩種菌數計數方法之差異。... 40

圖十、 NTU 101 菌數檢量線。 ... 41

圖十一、以空氣通氣培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 之生長曲 線。... 42

圖十二、以 N2 通氣培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 之生長曲線。... 43

圖十三、以 N₂ 通氣培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 並控制於 pH 5.0 之生長曲線。... 45

圖十四、以 N2 通氣培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 並控制於 pH 6.0 之生長曲線。... 46

圖十五、以 N₂ 通氣培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 並控制於 pH 7.0 之生長曲線。... 47

圖十六、各發酵組別細胞外觀。... 48

圖十七、以 10% 豆漿粉 (豆寶 2) 培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 並通入 N₂ 控制發酵 pH 6.0 之生長曲線。 ... 49

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VII

圖十八、不同預處理對於 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 冷凍乾燥前後

菌數的影響。... 51

圖十九、發酵氧化條件對於 NTU 101 逆境基因表現量之影響。 ... 53

圖二十、 pH 值對於 NTU 101 逆境基因表現量之影響。 ... 54

圖二十一、逆境預處理對於 NTU 101 逆境基因表現量之影響。 ... 55

圖二十二、推測 NTU 101 於逆境下修復受損大分子的機制示意圖。 ... 60

圖二十三、復水溶液對於 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 冷凍乾燥菌粉 菌數的影響。... 65

圖二十四、 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 冷凍乾燥菌粉於室溫下儲存的 菌數變化。... 66

圖二十五、加速保存試驗保存三個月後的存活菌數。... 68

圖二十六、添加不同保護劑之 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 冷凍乾燥 菌粉之外觀。... 71

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VIII

表目錄

表一、商業應用的益生菌菌株... 4

表二、各種乾燥技術的主要特色概述... 8

表三、生產乳酸菌所使用的不同培養方式及培養基組成... 18

表四、過去研究中發酵條件對乳酸菌冷凍乾燥存活率的影響... 20

表五、前人研究中所使用的冷凍乾燥保護劑... 24

表六、 MRS 培養基成分 ... 30

表七、批次發酵條件... 32

表八、 Aerobic lactic acid bacteria broth (染劑) ... 34

表九、本研究使用之引子對... 38

表十、不同的發酵條件對於 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 生長的影 響... 50

表十一、本研究中逆境條件對於 NTU 101 逆境基因表現量之相關性 ... 56

表十二、本實驗使用之保護劑... 62

表十三、不同保護劑對於 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 凍乾菌粉於 40 ℃ 加速試驗過程中存活菌數之影響... 67

表十四、含有不同保護劑的 NTU 101 凍乾菌粉在儲存過程中含水量之變化... 69

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壹、前言

由於人類對於延長壽命、預防疾病及改善生活品質的需求增加，功能性食品領域研究及產品開發亦不斷地成長。益生菌及其生物活性成分因安全使用歷史悠久，被認為是有潛力的健康食品素材。益生菌的定義為當攝取適當量的活菌時，

可以為宿主帶來健康益處 (FAO/WHO 2002) 的微生物。前人的研究顯示益生菌對人體的健康益處包含減少腸胃道感染、降低血清膽固醇、抗菌活性 (如抑制幽門螺旋桿菌的感染)、提升免疫系統、改善乳糖代謝、抗致突變性、抗癌特性、

減輕大腸激躁症和異位性皮膚炎 (Shah 2007)，其中商業使用的益生菌又以乳酸 桿菌屬 (Lactobacillus) 及雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium) 為主。

乳酸菌產品的功效與所使用的菌株存活力相關，尤其是活菌的數量對於產品有效性是一關鍵 (Donnarumma et al. 2014)，一般乳酸菌產品規範為每公克/毫升需含 10⁶ CFU 的活菌數，因此開發有效的發酵策略以提高生質量 (biomass yield) 是益生菌生產製造的關鍵 (Donnarumma et al. 2014)。發酵條件包含培養基組成、

pH 值、溫度、dissolved oxygen tension (DOT) 及代謝產物，都對乳酸桿菌的生長有顯著的影響 (Dong et al. 2014)。當益生菌的生長過程中有氧氣存在時，由於其清除過氧化物系統的缺乏或不完整，活性氧化物 (reactive oxygen species，ROS) 像是超氧根離子 (O2-

)、氫氧自由基 (OH^-) 及過氧化氫 (H2O2) 會累積在細胞內最終導致細胞死亡，其中氧自由基會直接破壞細胞膜磷脂質及蛋白質，而細胞膜脂肪酸氧化更具毒性 (Vasiljevic & Shah 2008) 。

過去研究認為冷凍乾燥是一通用於細菌的乾燥技術，但冷凍及乾燥過程會造成表面蛋白、細胞壁及細胞膜損傷而導致細胞死亡。為了在冷凍期間保護細胞，

通常會添加保護劑，包含快速滲透細胞的化合物 (monovalent alcohols、amides 及 sulfoxides)、較慢滲透的化合物 (甘油及 triol compound) 及非滲透性化合物 (單醣、寡醣、多醣、多元醇、醣醇和蛋白質) (Hubalek 2003)。這些保護劑作用機制根據化合物的性質而有所不同，可滲透的保護劑使細胞膜更具可塑性，並與細胞內的水分子鍵結避免過度脫水和形成大型的冰晶。相反的非滲透性化合物吸附在細胞表面形成 viscous layer，使細胞部分的水排出，避免冰晶變大，並在細胞周圍維持非結晶的狀態。目前已知對乳酸菌具保護效果的保護劑包含脫脂牛奶或脫脂牛奶添加其他物質，例如 : 葡聚糖、牛血清蛋白、蔗糖、海藻糖、甘油、乳糖、麥芽糖、vitamin C、麩胺酸及麥芽糊精等等 (Saarela et al. 2005)。據 Lee 等人 (2016) 的研究結果顯示以 10% (w/v) 脫脂牛奶添加其他物質 (葡萄糖、蔗糖、

麥芽糊精、海藻醣、山梨醣醇及乳醣) 作為冷凍乾燥保護劑除了葡萄糖效果較差 外，其餘皆能提升 L. plantarum JH287 冷凍乾燥後的存活率 (與控制組相比約上 升兩倍)，而物質濃度則以 10% (w/v) 效果較佳。

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本研究以 2 L 發酵槽探討不同氧氣濃度及 pH 值對於 L. paracasei subsp.

paracasei NTU 101 (NTU 101) 生長動力學之影響。並在後續製程的冷凍乾燥前 添加 10% (w/v) 脫脂牛奶複合其他物質以提升 NTU101 菌粉在加速試驗的儲存過程的存活率。

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貳、文獻回顧

一、文獻回顧

1. 益生菌與乳酸菌定義

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益生菌 (Probiotics) 一詞最早是由 Lilly & Stillwell (1965) 所提出，其定義為一微生物產生的物質，能有利於另一微生物生長。Havenaar 等人 (1992) 將其定義為凡是可應用在人類或其它動物宿主，藉由改善並維持腸內微生物之平衡的有益活菌，無論是單一菌株或混合菌株，都可視為益生菌。現今最廣為接受的定義是 FAO/WHO 於 2002 年提出將益生菌定義為

「當給予適當數量的活菌時，能對宿主健康產生益處的特定微生物」

(FAO/WHO 2002)。

從上述益生菌的定義可歸納出 :

益生菌一詞僅用於含有活的微生物之產品 a.

需攝取足夠劑量的益生菌才能對健康發揮預期的效果 b.

目前主要益生菌菌屬包含乳酸桿菌屬 (Lactobacillus)、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium)、片球菌屬 (Pediococcus)、明串球菌屬 (Leuconostoc)、酵 母屬 (Saccharomyces)、腸球菌屬 (Enterococcus)、鏈球菌屬 (Streptococcus) 和芽孢桿菌屬等 (Bacillus) (Fijan，2014)。而在益生菌食品的商業使用上則 是以乳酸桿菌屬 (Lactobacillus) 及雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium) 為主 (表一)，這兩屬菌安全使用的歷史悠久且為公認安全(GRAS，generally recognized as safe)。

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表一、商業應用的益生菌菌株

List of commercial probiotic strains Table 1.

(Tripathi & Giri 2014)

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益生菌的健康益處 (2)

益生菌可透過維持正常的腸道菌相、抑制腸胃道病原菌、增強免疫系統、降低血清中膽固醇及血壓、呈現抗癌活性、改善營養元素的利用及提高食物的營養價值來促進宿主健康 (圖一) (Tripathi & Giri 2014)。

益生菌的應用 (3)

益生菌已應用於食品 (Roy 2005)、醫療 (Eutamene & Bueno 2007；

Madden & Hunter 2002)、農業和水產養殖業 (Balcazar et al. 2006)。2011 年時全球益生菌的需求達 279 億美元，預計在 2018 年達 449 億美元，年增長率為 7% (Nguyen et al. 2016)。

其中乳酸菌 (lactic acid bacteria) 已被用於乳製品、發酵蔬菜及發酵肉品等發酵食品上。其代謝產物主要作用為改善食物安全性及保存性、食物質地、食物香味和風味，同時也扮演功能性成分及改變食物營養價值的角色 (Nguyen et al. 2016)。近年消費者對於具有健康益處食品的需求迅速上升，促使食品工業致力開發乳酸菌發酵食品等功能性食品 (Guergoletto et al.

2010)。過去二十年全球市場已推出約 500 多種的益生菌產品，且仍持續增加中。

乳酸菌產品一般包含液態及乾燥型兩類，其中乾燥型具有儲藏期長、

體積小、易於保存和運送及攜帶方便等優點，因此成為主要的產品形式之一。

乳酸菌產品生產的限制 (4)

雖然乳酸菌產品已十分成熟，乳酸菌在加工過程中仍存在存活率波動的問題。由於乳酸菌對於環境變化敏感 (Nguyen et al. 2014)，下游加工操作過程可能會顯著降低其生存能力 (Lacroix & Yildirim 2007)，因此優良上工業乳酸菌菌株須在加工、儲存、處理、輸送及隨後的保存過程皆能維持菌數穩定 (Lacroix & Yildirim 2007；Santivarangkna et al. 2008)。乳酸菌產品在有效期限結束前 (一般為 6 個月至 1 年)，至少須維持每公克 10⁶ CFU 的活細胞，才能對健康產生益處 (FAO/WHO 2003)。在常溫下儲存的乾燥型乳酸菌產品，在儲存期間乳酸菌活菌數的顯著減少可能造成產品有效期限大幅縮短而使成本上升或是違反管理規範 (Nag & Das 2013)。

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圖一、益生菌的健康益處。

Health benefits of probiotics.

Figure 1.

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2. L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 (NTU 101) 特性

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NTU 101 是由國立臺灣大學潘子明教授研究室於新生兒糞便中分離出的菌株，為革蘭氏陽性菌、不具 catalase 且行兼性異質發酵 (facultatively heterofermentative) 之乳酸菌。NTU 101 在低 pH 值下具有良好的存活率，

對於高濃度膽汁也具耐受性 (Lin et al. 2004) NTU 101 及其發酵產物經由實驗證實能降低膽固醇與預防動脈粥狀硬化 (Chiu et al. 2006；Liu et al.

2011)、預防病原菌感染並能改善腸道菌相 (Lin et al. 2004) 及胃黏膜損傷 (Liu et al. 2009)，同時也具有免疫調節 (Tsai et al. 2010)、減緩過敏、改善骨質疏鬆症 (Chiang et al. 2012；Chiang & Pan 2012) 及抑制脂肪組織堆積 (Lee et al. 2013) 等功效。

3. 益生菌乾燥菌粉製備乾燥方法

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冷凍保存為長期保存發酵菌酛 (bacterial starter cultures) 的標準方法之一。然而從商業的角度來看，此方法有數個缺點，包含需要零下操作溫度，而使成本升高。此外冷凍及解凍也會導致細菌細胞的損傷 (Broeckx et al. 2016)。在影響乳酸菌長期保存穩定性的因子中，最重要的是保持在水分含量少的乾燥狀態 (Vesterlund et al. 2012)。目前主流乾燥技術包含噴霧乾燥 (spray drying)、冷凍乾燥 (freeze drying)、真空乾燥 (vacuum drying) 及流動床乾燥 (fluidized bed drying)。表二概述上述乾燥技術的主要特點，其中冷凍乾燥為目前最方便也最廣為使用的方法 (Broeckx et al. 2016)。

噴霧乾燥 a.

噴霧乾燥是一種快速且低成本的乾燥方法，可以生產出具有良好的流動性、固定的水含量、均勻形狀及粒度分布的球形乾燥粉末顆粒 (dry spherical powder particles) (Sosnik & Seremeta 2015；Vandenheuvel et al.

2013)。乾燥過程包含了四個階段 (圖二)，首先將液體饋料霧化成噴霧狀的液滴，接著霧化的噴霧與乾燥室中的熱氣流接觸。此步驟可以根據熱氣流與物料進入乾燥室的相對流向分為並流、逆流或混合流。由於益生菌是熱敏感生物，因此主要使用並流模式。在該模式中，最濕的液滴會與溫度最高的氣體接觸，而最乾燥的粉末顆粒與最低溫度的接觸，使熱風對於益生菌所帶來的損傷最小化。第三階段包括液滴的乾燥與顆粒的形成。最後將固體顆粒與乾燥空氣分離。通常較粗及較重的顆粒會在

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表二、各種乾燥技術的主要特色概述

Overview of the main characteristics of different drying techniques Table 2.

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(Broeckx et al. 2016)

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圖二、噴霧乾燥過程 (A) 噴霧乾燥機示意圖 (B) 乾燥過程中的不同階段，包含重要的加熱及脫水逆境。

The spray drying process. (A) A schematic overview of a spray dryer. (B) A Figure 2.

schematic overview of the different stages during the drying process with indication of the important heat and dehydration stresses. Black dots:

bacterial cells, w: water molecules.

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乾燥室底部藉由重力分離。而細緻的顆粒會經由旋風分離器及過濾袋來分離。在收集瓶中的粉末顆粒即為 ready-to-sell 或 ready-to-use (Masters 1991)。

噴霧乾燥形成乾燥顆粒需經過數個階段 (圖二 (B))，首先液滴與熱空氣接觸後水分開始蒸發，當液滴的表面達到飽和濃度時，乾燥速率恆定，此時顆粒的溫度則由濕球溫度來決定。一旦液滴表面脫離飽和狀態時，則開始降低乾燥速率進入第二乾燥期。當液滴脫水時，溶解或懸浮在饋料中物質開始結晶而形成殼 (crust)。在殼形成之後，蒸發速率取決於水分經由擴散作用穿過乾燥殼的速率，隨著蒸發作用的增加，殼將變得更厚且蒸發速率變得更慢。此時產物的溫度逐漸升高且趨近於乾燥空氣的溫度，在此最後階段最容易使益生菌細胞產生熱失活 (Golman &

Julklang 2013；Peighambardoust et al. 2011)。

噴霧乾燥相較於其他乾燥技術為一種快速、連續且經濟的方法 (Peighambardoust et al. 2011；Sosnik & Seremeta 2015)，可在相對短的時間內處理大量的培養液。其主要的優點是可以輕易地控制粉末的特性，

此外噴霧乾燥在放大設備、效益及循環時間上比較經濟。然而在乾燥過程中，益生菌細胞會遭受到不同的逆境，進而影響其生存能力。

在噴霧乾燥期間影響益生菌生存能力的關鍵逆境因素包含熱逆境、

脫水、剪切逆境、滲透壓逆境及氧化逆境。其中熱逆境及脫水被認為是導致益生菌失活及損失其生存能力的兩個主要機制 (Janning & in't Veld 1994；Perdana et al. 2013)。然而益生菌在噴霧乾燥期間失活的機制尚未研究明瞭，因為不僅在不同細菌屬和種之間存在差異，也可能具有菌株專一性。即使是相同菌株，根據其生長環境、條件或生長階段等等，對於逆境的耐受性也會不同 (Fu & Chen 2011)。

冷凍乾燥 b.

冷凍乾燥 (也稱為凍乾) 最廣為使用來去除益生菌水分的方法。冷凍乾燥可以分成三個步驟：冷凍、初級乾燥及次級乾燥。在冷凍期間，

冰晶的形成會造成益生菌細胞損傷，而其形成取決於冷凍的速率及溫度。

對益生菌而言較快的冷凍速率會形成較小的冰晶，可避免大規模的細胞損傷 (Fowler & Toner 2006)。不僅冰晶的形成對益生菌有害，當水結晶時剩餘未冷凍的部分同時濃縮剩餘溶液中的溶質，而導致化學及滲透損傷。在初級乾燥步驟中透過真空昇華去除冰，而在次級乾燥步驟中藉由去吸附作用 (desorption) 除去未冷凍水 (unfrozen water) (Maltesen &

van de Weert 2008)。由於水分在細胞完整性及穩定性中扮演重要的角色，

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乾燥時從細菌細胞移除鍵結的水分，將導致表面蛋白、細胞壁及細胞膜的損傷，使細胞功能出現障礙甚至死亡 (Castro et al. 1997) (圖三)。

雖然冷凍乾燥是一種廣泛用於乾燥益生菌的技術，但亦有幾個缺點。

凍乾為昂貴且費時的批次處理製程，且最後生產出乾燥的餅狀產物，需要額外的加工步驟來獲得均一的粉末顆粒 (Maltesen & van de Weert 2008；Santivarangkna et al. 2008)。此外在前人研究中注意到冷凍乾燥機內常存在著交叉汙染的風險 (Barbaree & Sanchez 1982)，因此當冷凍乾燥機交叉處理不同細菌菌種時要特別注意。

冷凍乾燥是一種具價值並廣為使用的技術，在提升益生菌存活率方面也有許多充分的研究，並有各種經實證的策略，包括添加保護劑、控制加工參數、在冷凍乾燥前預處理細菌樣品及改變益生菌的發酵條件。

真空乾燥 c.

真空乾燥 (圖四) 近似於冷凍乾燥，主要區別在於樣品通過蒸發去除水分而不是昇華。在冷凍乾燥中樣品需先冷凍再去除水分，而在真空乾燥中樣品保持液體狀態。因此與冷凍乾燥相比，真空乾燥通常在更高的溫度和壓力下運行。相較於一般壓力低於 10 mbar 的冷凍乾燥，真空乾燥的典型壓力大於 10 mbar。雖然真空乾燥與冷凍乾燥相比在較高溫度下運行，但與噴霧乾燥相比溫度相對較低，因此在溫度 (冰凍/熱) 損傷方面是一種較溫和的加工方式，然而脫水逆境仍然造成益生菌嚴重的喪失生存能力。前人使用原子力顯微鏡 (atomic force microscopy) 及傅立葉轉換紅外線光譜 (fourier transform infrared spectroscopy) 分析真空乾燥後的細胞，可以觀察到細胞壁及細胞膜為主要的受損細胞部位 (Santivarangkna et al. 2007)。因此保護細胞膜成為增強細胞存活力的主要策略。然而關於使用此技術於乾燥、保存益生菌和脫水逆境方面的文獻，目前仍有限。

在真空乾燥過程中主要用來保護益生菌的策略包含添加保護劑或改變加工處理的參數。目前已知在真空乾燥前對細胞施以亞致死逆境的預處理，將可以增強益生菌的生存能力。

流動床乾燥 d.

流動床乾燥 (圖五) 是利用氣體 (具一定速度的空氣) 通過含固體顆粒之流動床，將顆粒懸浮在乾燥空氣中，進而乾燥水分。乾燥細胞相對較小 (大約幾 μm) 且隨著乾燥空氣被帶走，最終收集進入袋式過濾

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圖三、冷凍乾燥 (A) 冷凍乾燥機示意圖 (B) 冷凍乾燥的步驟及最重要的逆境因素簡述。

Freeze drying. (A) Schematic overview of a freeze dryer. (B) Simplified Figure 3.

overview of the process steps with indication of the most important stress factors.

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圖四、真空乾燥機示意圖。

Schematic overview of a vacuum dryer.

Figure 4.

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圖五、流動床乾燥機示意圖。

Schematic overview of a fluid bed dryer.

Figure 5.

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15

器中。流動床乾燥是一種重要的固定化技術，可以進一步減少益生菌製品殘留的水分含量。

流動床乾燥所需時間比冷凍乾燥少，但較噴霧乾燥長。比起噴霧乾燥，其在處理過程中使用較低溫度的乾燥空氣，使得熱失活損傷可以減至最低 (Barbosa-Cánovas & Uliano 2004)。當使用流動床乾燥時，益生菌必須與其他可以黏附的載體或基質粒子混合。最近的研究指出可使用酪蛋白、麥芽糊精、纖維素、乳糖或 NaCl 顆粒作為合適的載體顆粒 (Bensch et al. 2014；Mille et al. 2004)。通常在流動床乾燥機中先加入載體，然後使用噴嘴將細菌懸浮液霧化附著在載體上。或者也可以先藉由冷凍乾燥或噴霧乾燥獲得細菌顆粒，再以流動床乾燥形成膠囊化的保護殼，增強益生菌的存活能力 (Azim et al. 2012)。這種保護性膠囊可以由脂質、蛋白質、(多)醣類或其他塗覆材料組成，可視為菌體外的一層額外保護，以增強益生菌在長期儲存過程中的穩定性或生存能力。由於益生菌使用流動床乾燥機進行乾燥的可用性有限，因此可用的文獻很少。

然而大多數研究採用第一種方法，將細菌懸浮液噴上載體顆粒並進行乾燥。該技術最大的優點是較大的顆粒、受限制的內聚力，因而改善粉末的流動特性。流動床乾燥與其他乾燥技術類似，可透過添加保護劑、控制加工參數及乾燥前誘導的逆境反應來增強益生菌存活能力。

影響益生菌存活率的重要因素 (2)

益生菌產品的功效常取決於產品所含的活菌數，因此必須確保益生菌在製造過程及產品有效期限內都保有高存活率。在生產、加工和儲存過程中，影響食品中益生菌存活率的因素有很多 (圖六)，包含食品特性 (pH 值、

可滴定酸、溶氧量、水活性、鹽及糖或其他化學物質 (過氧化氫、細菌素、

人工香料及著色劑))、加工參數 (乾燥方法、熱處理、培養溫度、冷卻速率、

包裝材質、保存方法及生產製程的規模) 和微生物參數 (益生菌菌種及接種比例) (Tripathi & Giri 2014)。在冷凍乾燥及隨後儲存的過程中影響益生菌存活率的因素包含內在因子、生長因子、亞致死處理、乾燥保護劑、儲存和復水條件。

內在因子 a.

不同的物種在冷凍、乾燥及隨後儲存的過程中也經常呈現出不同的特性。Fonseca 等人 (2000) 的研究指出細菌細胞大小會影響在冷凍及 冷凍乾燥的存活率。腸球菌 (Enterococci，即小球型細胞) 比起乳酸桿 菌 (Lactobacilli，桿狀) 更具有耐受性，且在冷凍過程中由於細胞外形 成冰晶，造成細胞表面積越大，細胞膜的損傷就越高的趨勢。冷凍乾燥

(27)

16

圖六、影響益生菌存活率的重要因素。

Important factors affecting viability of probiotics.

Figure 6.

(28)

17

後的乳酸菌在後續儲存期間也有類似的趨勢 (Carvalho et al. 2003)。

同一物種中不同的菌株在乾燥及乾燥後儲存的過程中也可能表現出不同的特性。儘管這些菌株間的差異性較難以解釋，仍有些學者提出一些假設 : (i) 由於基因組成 (genetic constitution) 上的差異可能使得 Lactococcus lactis 菌株間有不同的表現型 (O'Callaghan & Condon 2000) (ii) 不同細胞壁及膜的組成，其磷脂質的凝固點差異可能導致菌株間的存活力差異 (Selmer-Olsen et al. 1999)。

生長因子 b.

定殖在人體腸道的微生物通常是厭氧或微需氧的，因此缺乏有效清除氧分子的機制，例如 catalases。因此當此類微生物暴露於氧氣環境下會使有毒的氧代謝物 (toxic oxygenic metabolites) 累積在細胞中，導致細胞因氧化損傷而死亡。通常將此種氧氣致死的影響稱為氧氣毒性 (oxygen toxicity) (Talwalkar & Kailasapathy 2004)。氧是一種強力的氧化劑，對於氧化還原電位 (oxidation reduction potential，ORP) 及乳酸菌在生產培養及儲存過程中的存活率有顯著的影響 (Ebel et al. 2011)，為了在製造過程中減低氧氣毒性，Ebel 等人 (2011) 在牛奶發酵中以通入不同氣體 (air、N₂及 N₂-H₂) 的方式改變氧化還原電位。結果顯示通入 氮氣能提升 Bifidobacterium bifidum 的儲存存活率。氧化還原電位代表 一個環境系統中接受 (還原) 或提供 (氧化) 電子的能力。氧化還原為正值時代表環境有助於氧化反應，反之當數值為負值時則為還原環境 (Larsen et al., 2015)，而當培養基 pH 值下降時會間接影響 ORP。另外前人的研究中顯示當乳酸菌從厭氧 (氮氣) 轉換到有氧 (氧氣) 或呼吸作用 (氧氣、exogenous haem 及 menaquinone) 時具生理上的優勢並影響某些菌種的代謝模式，但其質量及生長速率並無顯著增加，顯示在這些條件下生長能改善耐氧乳酸菌對於熱及氧化逆境的耐受性 (Zotta et al. 2017)。

一般實驗用於培養乳酸菌的複雜培養基在工業上不具經濟效益，其含有較昂貴的營養成分，例如酵母抽出物和 peptone 等，會導致發酵的成本上升 (Coghetto et al. 2016)，可達總生產成本的 30% (Hofvendahl

& Hahn-Hagerdal 2000) 。由於乳酸菌對營養需求較為嚴苛，因此需要豐富的培養基成分才能實現良好的生長，而在制定替代性培養基需考慮的因素包含成本、生產大量細胞的能力及簡單的細胞收集方法 (Dong et al. 2014)，表三為前人所用來培養乳酸菌所使用的策略 (Coghetto et al.

2016)。

(29)

18

表三、生產乳酸菌所使用的不同培養方式及培養基組成

Different approaches of cell cultivation and media formulation for the Table 3.

production of LAB

(Coghetto et al. 2016)

(30)

19

表四為前人研究中發酵條件對乳酸菌冷凍乾燥存活率的影響 (Velly et al. 2014)。目前已知發酵過程中 pH 值對於細菌抗冷凍及冷凍乾燥的耐受性有很大的影響 (Wang et al. 2005)。Lorca 及 de Valdez (2001) 的研究結果顯示 Lactobacillus acidophilus 在未控制發酵 pH 值 (最終 pH 4.5) 的狀態下，相較於控制發酵條件為 pH 6.0 的組別，

其產生更多抗冷凍、冷凍乾燥、乙醇及過氧化氫的穩定細胞。然而 Wang 等人 (2005) 研究 L. acidophilus 在不同生長 pH 值下的低溫耐受性，

結果顯示經 pH 逆境處理的細胞在冷凍及冷凍保存之後的存活率有增加的現象。這顯示發酵 pH 值可能影響低溫保護機制。這些結果可能與細胞的逆境蛋白合成增加有關，需要藉由蛋白質體學的分析做進一步的確認。

亞致死處理 c.

細菌透過代謝調控對其周遭環境的變化做出即刻反應，以提升存活率。防禦系統的抗性可分成兩種 : 第一種包含由亞致死劑量的化學或物理逆境所誘導的系統，使其可在相同物質的相同劑量下存活。第二種為泛用系統，其能使細胞在許多不同的環境逆境下生存，而不需要預先培養暴露於該種逆境。

微生物的訊息傳導系統負責細胞對於環境逆境的反應、控制涉及細胞防禦機制的基因表現。常見的調控機制涉及 sigma (σ) factors 的修飾以及 RNA polymerase 啟動子專一性的改變。

乳酸菌具有逆境感受系統 (stress sensing systems) 以應對各種逆境，

使其能夠承受惡劣的環境條件。逆境誘導能影響乳酸菌對抗逆境的耐受性。這些逆境包含冷休克 (cold shock)、滲透壓逆境 (osmotic stress)、

熱休克 (heat shock)、飢餓逆境 (starvation stress) 及酸休克 (acid shock)。

許多研究證實微生物可以透過誘導蛋白質或其他物質合成來適應環境逆境。逆境蛋白可以避免細胞膜酵素 (membrane-bound enzymes) 的變性，並且可能會影響膜本身的物理特性。

先前學者的研究結果指出逆境蛋白可能對於膜蛋白及脂質具有穩定作用。過去蛋白質體學分析研究中發現，益生菌於逆境時會增量表現許多功能性蛋白，包含 GroEL、ClpL1、Hsp family、DnaK、GrpE、DnaJ、

ClpS、ATPase family、CspA、NADH oxidase 及 NADH peroxidase (Desmond et al. 2004；Talwalkar & Kailasapathy 2003；Ventura et al. 2001)。

過去研究中提出 DnaK (Hsp70) 為一種有效重新折疊蛋白的細菌

(31)

20

表四、過去研究中發酵條件對乳酸菌冷凍乾燥存活率的影響

Overview of studies on the influence of fermentation conditions on the freeze-drying survival of LAB Table 4.

20

(Velly et al. 2014)

(32)

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chaperone 系統，該系統包含 DnaK、cochaperone (DnaJ) 及 nucleotide exchange factor (GrpE)。另一個重新折疊系統由 GroEL/GroES (Hsp60) chaperonin 所組成，包含 14-mer GroEL 蛋白及 heptameric cofactor GroES，在沒有 ATP 的情況下，GroEL/GroES 會形成大分子複合物 (將兩個七聚環堆疊在一起)，可以透過疏水性作用與未折疊蛋白結合並重新折疊 (Papadimitriou et al. 2016) (圖七)。

Prasad 等人 (2003) 的研究顯示藉由增量表現熱休克蛋白 (heat shock proteins，HSPs) 及合成糖解酵素 (glycolytic enzymes) 能改善細胞在乾燥儲存期間的穩定性。大多數 cold shock proteins (CSPs) 家族的蛋白能與 DNA 結合，進而穩定染色體的結構 (Chaikam & Karlson 2010)。有效誘導 HSPs 或 CSPs 可以提升益生菌在食品加工過程中的熱耐受性或冷凍乾燥過程中的存活率 (de Angelis et al. 2004)。

冷凍乾燥保護劑 d.

在細胞懸浮液中添加冷凍及凍乾保護劑 (cryo- and lyoprotectants) 是目前常用凍乾策略之一。冷凍保護劑是水溶性的化學物質，其能降低水的冰點。當冰晶形成時益生菌細胞會被壓縮在未結凍的一小部分。而添加冷凍保護劑可以擴大未結凍的部分，為益生菌提供更多空間，從而減少機械逆境或滲透壓逆境所導致的細胞損傷。相對的當水分去除時，

凍乾保護劑在乾燥的步驟中保護益生菌細胞。某些醣類 (蔗糖及海藻糖) 能同時扮演冷凍及凍乾保護劑的角色，其對於冷凍乾燥後的益生菌存活率有正面的影響 (Broeckx et al. 2016)。

凍乾保護劑影響冷凍乾燥益生菌的穩定性主要可分為兩種機制 (Arakawa et al. 2001；Imamura et al. 2001)，一為水分置換 (water substitution) : 凍乾保護劑在脫水狀態下會與蛋白或細胞膜形成氫鍵，而不是與水產生鍵結，因此即使在脫水狀態下也能夠維持細胞的偽水合結構 (pseudo-hydrate structure)。碳水化合物 (例如乳糖) 可作為凍乾保護劑並取代細胞膜上磷脂質親水端的氫鍵結合水 (hydrogen-bonded water)，進而達到保護的作用 (Leslie et al. 1995；Morgan et al. 2005；

Santivarangkna et al. 2008)。另一種機制是玻璃態過渡 (glass transition) : 凍乾保護劑會在乾燥過程中轉換成玻璃態 (非結晶)，成為一種具極高黏度的固體 (黏度 ≥ 10¹² Pa∙s)，而益生菌則被嵌入玻璃態的保護劑中並且固定住 (Teng et al. 2017)。此外碳水化合物於乾燥過程形成玻璃態可充當細菌的保護性介質，限制氧氣及水分交換 (Morgan et al. 2006)。

(33)

22

圖七、乳酸菌修復受損大分子的主要機制示意圖。

Schematic representation of the main molecular mechanisms repairing Figure 7.

damaged macromolecules in LAB.

(Papadimitriou et al. 2016)

(34)

23

目前常用的冷凍乾燥保護劑可歸類成醣類 (葡萄糖、蔗糖、乳糖、

海藻糖、果糖、麥芽糊精及菊糖）、糖醇 (木醣醇及山梨糖醇)、蛋白質

類化合物 (脫脂牛奶 (skim milk，SM) 、乳清蛋白及胎牛血清)、胺基酸 (sodium glutamate) 以及抗氧化劑 (vitamin C 及 vitamin E) 等等不同物質，用於改善微生物在冷凍乾燥和後續儲存過程中的存活率 (表五)。

(35)

24

表五、前人研究中所使用的冷凍乾燥保護劑

Overview of studies on the influence of lyoprotectant on the freeze-drying survival of micro-organisms Table 5.

Strain Parameters Lyoprotectant Storage condition Results Reference

L. paracasei subsp.

paracasei JCM 8130^T

frozen : -20℃ for 16 h freeze-drying : 70 Pa at -35℃

for 21 h, secondary drying: 70 Pa at -35 to 5℃ for 8 h

disaccharides (sucrose and trehalose), polymers (maltodextrin; MD and bovine serum albumin;

BSA), and their mixtures

37℃ for 4 weeks after freeze-drying : all lyoprotectant had 95-100% survival rate

during storage : disaccharide-BSA had higher survival rates

(Teng et al.

2017)

L. casei ATCC 393 frozen : -45℃

freeze-drying : 4x10^-2 mbar at -45℃ for 24 h

10% (w/v) of glucose, fructose, lactose, trehalose and glycerol in deionized water, as well as whey

ND All lyoprotectants increased viabilities (trehalose : 66.2% the highest viability)

(Dimitrellou et al. 2016)

L. plantarum JH287 frozen : -70℃ for 24 h freeze-drying : <0.05 mbar at -45℃ for 72 h

10% glucose; 5, 10, and 20% sucrose; 10%

maltodextrin; 10% trehalose; 5, 10, and 20%

sorbitol; 10% lactose [w/v]) and 10% skim milk

4℃ and 30℃ for 2 months

All lyoprotectants increased viability except glucose

during storage : sorbitol and sucrose survival rates : 77.71, 59.37% (4℃); 1.20, 0.29%

(30℃)

(Lee et al. 2016)

Cryptococcus laurentii

frozen : -20℃ overnight freeze-drying : 5 Pa at -47℃ for 24 h

final conc. 10% (w/v) sugar (glucose, galactose, sucrose, trehalose) and 5% (w/v) skimmed milk

25℃ and 4℃ under dark condition for 90 days

after freeze-drying : sugars + SM significantly increased viability.

during storage : sugars + SM had more than 50% (25℃) and 70% (4℃) viability

(Li & Tian 2007)

Lac. lactis CRL 1584, L. lactis CRL 1827, Lac. garvieae CRL

frozen : -20℃ overnight freeze-drying : 110 millitorr at -50℃ for 48 h

10% (w/v) of lactose, sucrose, skim milk, whey protein and in the combination of each other (5%, respectively)

after freeze-drying : sugars + SM significantly increased viability except L.

plantarum CRL 1606 with whey protein

(Montel Mendoza et al.

2014)

24

(36)

25

ND : not detected.

1828 and L.

plantarum CRL 1606

storage at 25℃ : milk + lactose had higher survival rates except for L. plantarum CRL 1606

L. reuteri CICC6226 frozen : -70℃ for 4 h

freeze-drying : 4 Pa at -50℃ for 48 h

15% (w/v) sucrose, 5%, 10% (w/v) trehalose, and 10% (w/v) reconstituted skimmed milk (RSM)

ND All lyoprotectants increased survival rate up to 60-90%, the higher were 10% RSM 95.98% ± 6.69% and 10% trehalose 93.20% ± 10.73%

(Li et al. 2011)

L. bulgaricus frozen : -40℃ for 12-24 h freeze-drying : 24 h

NaHCO3, MgSO4, sodium ascorbate and sodium glutamate

ND NaHCO3, MgSO4, sodium ascorbate, sodium glutamate conc. of 0.8%, 0.5%, 4.5%, 0.3% to survival rate 70.6%, 76.4%, 86.8% and 21.2%, respectively

(Chen et al.

2013)

L. bulgaricus frozen : -40℃ for 12-24 h freeze-drying : 6.93 Pa at -51℃

for 24 h

5%, 10%, 15%, 20%, 25% sucrose, lactose, skim milk, yeast and vitamin B2, respectively

ND sucrose, lactose, skim milk, yeast and vitamin B2 of 25%, 20%, 25%, 20% and 25% to survival rate 24.5%, 35.6%, 64.4%, 62.2%, and 16.3%, respectively

(Chen et al.

2013)

L. paracasei subsp.

tolerance

frozen : -70℃

freeze-drying : 24 h

combination of skim milk (6% w/v) , trehalose (0, 4, 8% w/v) and sodium ascorbate (0, 2, 4%

w/v)

6% skim milk+8% trehalose+4% sodium ascorbate for freeze-drying, storage at 4℃

and 23℃ has 82%, 76%, 37% higher survival rate, respectively

(Jalali et al.

2012)

25

(37)

26

儲存條件 a.

包裝材質的種類及儲存的環境 (儲存溫度、粉末的含水量、相對濕度、氧氣含量及接觸光線等等 ) 對菌粉的存活率有顯著的影響 (Mattila-Sandholma et al. 2002)。菌粉在儲存期間的存活率是取決於其含水量，而含水量在儲存期間又受相對濕度影響 (Poddar et al. 2014)。因此益生菌菌粉應儲存在真空下、維持低水活性並以避光保存 (Carvalho et al. 2004)。

復水條件 b.

復水條件 (溫度、復水溶液的體積及復水時間)、復水溶液中物質的物理特性以及復水溶液的滲透壓、pH 值及營養能量，皆能顯著地影響益生菌恢復至 viable state 的速率 (Carvalho et al. 2004)，從而影響到存活率。

復水溫度是影響冷凍乾燥及噴霧乾燥益生菌細胞恢復的關鍵因素。

對於嗜熱生物而言最適溫度介於 30-37℃ 之間，而嗜中溫菌則介於 22-30℃，但不管在任何情況下的復水溫度都不能超過 40℃ (Tripathi &

Giri 2014)。

(38)

27

二、研究動機與目的

L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 及其發酵產物已被證實具有包 括調節膽固醇與血壓、預防病原菌感染，並能改善腸道菌相及腸黏膜損傷，

同時具有免疫調節、減緩過敏、改善骨質疏鬆症及抑制脂肪組織堆積等功效 (Chiang & Pan 2012)，為多功效的保健食品素材。乳酸菌冷凍乾燥菌粉於室溫保存時細胞保存不易，使得菌數減少，進而導致銷售成本增加。目前尚未有研究探討 NTU 101 發酵條件、冷凍乾燥前的逆境預處理及冷凍乾燥時添加保護劑，對於菌粉在室溫保存下對於其長期儲存存活率的影響。

本研究探討不同的氧氣含量、替代性培養基及 pH 值條件下 NTU 101 之生長動力學，並測試不同的逆境預處理(冷休克 5℃ 6 小時、滲透壓逆境 0.6% NaCl 和熱休克 50℃ 15 分鐘) 對於逆境相關基因表現量的影響。冷凍乾燥部分測試添加脫脂牛奶與醣類 (海藻糖、葡萄糖、乳糖及蔗糖)、聚合物 (麥芽糊精、菊糖) 以及抗氧化劑 (vitamin C 及 vitamin E) 混合作為冷凍乾燥保護劑，並探討其與 NTU 101 共同冷凍乾燥後的乾燥菌粉，在 40℃ 加速試驗的儲存過程中菌數與含水量的變化。希望藉由發酵條件及凍乾保護劑的探討，提升 NTU 101 發酵效率並增加其凍乾菌粉的產品競爭力。

(39)

28

三、研究架構

(40)

29

參、NTU 101 發酵生產條件的探討

一、材料與方法

1. 試驗菌株

本研究所使用的乳酸菌株 Lactobacillus subsp. paracasei NTU 101，係由 國立臺灣大學潘子明教授研究室提供 (Lin et al. 2004)。

2. 菌種活化與保存

乳酸菌株 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 使用 Lactobacilli MRS Broth (Difco) 培養基 (表六)，於 37℃ 下活化 18 小時後，以 MRS agar 四區劃線，分離單一菌落，每兩天以 MRS agar 繼代一次。

接著挑取單一菌落接種至 10 mL MRS 繼代兩次，再取二次繼代菌液接種 5% 至 85 mL MRS 培養基，於 37℃ 培養箱培養 18 小時，即為種培養。

菌種保存則是取二次繼代菌液與 50% (w/w) 甘油以 1:1 比例混合後置入菌保管中，保存於 -80℃ 冰箱。

3. 批次發酵

pH meter 及 ORP meter 校正 (1)

將 pH sensor 連接至 pH 分析儀後，依序以 pH = 7 及 pH = 4 校正液進行校正，並記錄其斜率。ORP sensor 連接至 ORP 分析儀後使用短路校正，用一跳線將 ORP 主機 GLASS 及 REF 短路，然後調整 ORP 主機 ZERO 旋鈕，使 ORP 主機顯示幕為 0000 mV 即可。

培養基製備、操作及培養條件 (2)

在 2.0 L 發酵槽 (圖八) 中加入 1.7 L 培養基及 0.17 mL 消泡劑，待電極校正完畢後，將 pH sensor、ORP sensor、orifice sparger (OS) 及平翼渦輪 (disc turbine) 組裝至發酵槽內，以 121℃ 滅菌 30 分鐘，並在滅菌釜靜置冷卻到發酵前兩小時取出。

(41)

30

表六、MRS 培養基成分

Composition of MRS medium Table 6.

(42)

31

圖八、本研究使用之 2.0 L 發酵槽。

The 2.0 L fermentor of this study. (A) Sampling port. (B) Gas exthaust. (C) Figure 8.

Condenser. (D) pH meter. (E) Disc turbine. (F) Orifice sparger. (G) ORP meter. (H) Peristaltic pump. (I) Inoculation port. (J) Paperless recorder. (K) Stirr speed control. (L) Air flow meter. (M) Temperature controller. (N) Gas inlet.

(43)

32

表七、批次發酵條件

Conditions of batch fermentation.

Table 7.

(44)

33

發酵槽取出後，先行穩定運轉兩小時至培養所需條件 (發酵溫度 37℃、

冷凝水浴槽溫度 15℃ 及轉速為 150 rpm，並依照表七調整通入氣體及控制 pH 值)。

以 5% (v/v) 比例將 NTU 101 種菌接入槽內並於 37℃ 進行發酵培養，以接種時為第 0 小時，每小時取樣一次，以微量盤式分析儀測定吸光值 (OD₅₉₅ nm)，並記錄過程中 pH 值及 ORP 的變化，當 NTU 101 生長達穩定期前期，即為發酵終點。

以替代性培養基進行發酵 (3)

本研究室先前以牛奶、豆漿粉 (豆寶 2，Ming Chyi Biotechnology Ltd., Yunlin, Taiwan) (成分如附錄一)、糖蜜與酵母抽出物組合探討 NTU 101 食品級培養基，經實驗結果顯示以 10% (w/v) 豆漿粉 (豆寶 2) 進行培養可以得到與 MRS 培養基相近的細胞密度 (10% 豆漿粉 (豆寶 2) : (2.10 ± 0.31) x 10⁹ CFU/mL ; MRS : (4.09 ± 0.23) x 10⁹ CFU/mL)，但與 MRS 相比其生產成本減少將近 100 倍，因此本研究中進一步以 10% 豆漿粉 (豆寶 2) 作為替代性培養基探討對於 NTU 101 生長的影響，除了將稀釋溶液換成 0.1% (w/v) peptone water 外，其餘步驟與 MRS 培養相同。

菌數計數 (4)

分別以 3M™ Petrifilm™ Aerobic Count Plate 與平板計數 (MRS agar plate) 比較兩者之間計數的差異，根據製造商說明書使用 3M™ Petrifilm™

Aerobic Count Plate 計算菌數。於發酵終點時，取 1 mL 發酵菌液，以無菌水做 10 倍序列稀釋，取 500 μL 稀釋液加至裝有 4.5 mL 染劑 (表八) 的 5 mL 無菌離心管，取 1 mL 混合液至 Petrifilm (3M) 上，並以壓板塗佈均勻，放入密封箱中 (含厭氧包) 於 37℃ 培養箱培養 48 - 72 小時後計算菌落數 (介於 30 - 300 CFU)，菌數以 CFU/g DCW 表示。

菌數檢量線 (5)

以 50 mL MRS 接種 5 % (v/v) 隔夜培養菌液，於 37℃ 培養 18 小時後，取 NTU 101 菌液以無菌水進行 2 倍序列稀釋，並測其吸光值與菌數，將結果繪製成菌數與 OD₅₉₅ 之檢量線，顯示 OD 值變化能代表 NTU 101 生長菌數之變化。

測定菌體乾重 (6)

(45)

34

表八、Aerobic lactic acid bacteria broth (染劑) Aerobic lactic acid bacteria broth Table 8.

(46)

35

於發酵終點時取 5 mL 發酵菌液並以 6,000 ×g 離心 10 分鐘，去除上清液並以無菌 PBS buffer 清洗菌體一次，放入 40℃ 烘箱直到菌體完全乾燥後取出秤重。

細胞外觀 (7)

將發酵終點菌液以無菌水稀釋十倍後，使用光學顯微鏡 (DM2500) 觀察其細胞大小並拍攝照片，後續利用 ImageJ 軟體計算細胞大小。

生長曲線及比生長速率 (8)

以 GraphPad Prism 6 軟體繪製 NTU 101 之生長曲線，比生長速率 (specific growth rate，μmax) 為 4-6 小時間之直線斜率。

4. 逆境處理

冷逆境 (cold stress) (1)

根據 NTU 101 的生長曲線將第 7 小時 (OD595 為 1.5) 及第 18 小時 (OD595 為 3.2) 分別視為對數生長期中期及穩定生長期前期。以修改過的 Song 等人 (2014) 的研究方法進行冷逆境處理，細胞於 37℃ 培養至穩定期，將細胞懸浮液置於 5℃ 水浴槽 6 小時，而後以 6,000 ×g 離心 10 分鐘、收集細胞，並以無菌 PBS buffer 清洗菌體一次，將處理前後的細胞保存於 -80℃ 冰箱。

滲透壓逆境 (osmotic stress) (2)

根據 Nag & Das (2013) 的研究方法進行，誘導細胞的滲透壓逆境是在細胞生長至對數期中期 (7 小時) 時，添加適當量的 NaCl，使培養基的最終滲透壓濃度為 0.6 M NaCl。並於 37℃ 持續培養至穩定期前期，接著以 6,000 ×g 離心 10 分鐘，並以無菌 PBS buffer 清洗菌體一次，將細胞保存於 -80℃ 冰箱。

熱逆境 (heat stress) (3)

以修改過的 Nag & Das (2013) 的研究方法進行熱逆境處理，細胞於 37℃ 培養穩定期前期 (18 小時) 後，將細胞懸浮液置於 50℃ 水浴槽加熱 15 分鐘，而後將懸浮液立即冷卻至室溫 (約 22℃)。接著以 6,000 ×g 離心 10 分鐘，並以無菌 PBS buffer 清洗菌體一次，將細胞保存於 -80℃

冰箱。

(47)

36

5. 逆境相關基因之表現量分析抽取總 RNA

(1)

將不同發酵條件培養及不同逆境處理的 NTU 101 菌體保存至 -80℃

冰箱，並依照製造商的說明書使用 RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 抽取總 RNA。步驟簡述如下，取出冷凍菌體待稍微回融後加入 700 μL RLT buffer，

震盪 5-10 秒，將懸浮液轉至含有鋯珠 (25-50 mg，OPS Diagnostics, LLC) 的 2 mL tube 中，以 vortex 震盪 5 分鐘破壞細胞，接著以 12,000 ×g 離心 10 秒，將上清液移至新的 1.5 mL eppendrof，並加入等體積的 70% 酒精混合。取 700 μL 裂解液至 spin column，接著以 12,000 ×g 離心 20 秒，

丟棄下層液體 (若裂解液體積大於 700 μL 則重複此步驟)。再加入 700 μL RW1 buffer 至 spin column，以 12,000 ×g 離心 20 秒，丟棄下層液體，

再以 500 μL RPE buffer 重複上面步驟離心 20 秒及 2 分鐘，更換 collection tube 後再以 12,000 ×g 離心 1 分鐘。最後將 spin column 移至 1.5 mL tube，並加入 50 μL RNase-free water 以 12,000 ×g 離心 1 分鐘沖提出 RNA 樣品，將樣品保存於 -80℃ 冰箱。

RNA 品質確認及濃度測定 (2)

RNA 樣品測定 OD260、OD280、OD230 及 OD270，RNA 濃度由 OD260

推算 :

RNA concentration (μg

mL) =(OD_{260) ×}(dilution factor) × (44 μg RNA/mL) RNA 的品質由 OD260、OD280、OD230 與 OD270 判定，OD260/OD280 須介於 1.8 ~ 2.1 之間、OD260/OD230 須 > 1.2 及 OD260/OD270 須 > 1.8。RNA 樣品以 DEPC-H2O 將濃度調整至 1 μg/μL 後保存於 -80℃ 冰箱備用。

製備 cDNA (3)

以 reverse transcriptase PCR 製備 cDNA，取 random primer (50 pmol)、

1 μL dNTPs (10 mM) 及 2 μg 總 RNA，加入 DEPC-H2O 使總體積為 12 μL，並於 65℃ 加熱 5 分鐘後立刻於冰上冷卻再進行離心。再於上述反應液加入以下試劑：5 X First-stand buffer (4 μL)、0.1 M DTT (2 μL)、1 μL RNase inhibitor 及 1 μL HiScript I Reverse Transcriptase，總體積為 20 μL。

PT-PCR 條件為 30℃ 反應 10 分鐘、42℃ 反應 60 分鐘，接著以 70℃

反應 15 分鐘，反應結束後將 cDNA 保存於 -80℃ 冰箱中。

RT-PCR 分析條件 (4)

(48)

37

使用 Geneious 軟體針對 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 基因 體序列預測 cold/heat/osmotic stress - induced 的功能性基因設計本實驗所使用的引子對並以代號表示 (如表九)。

RT-PCR 的反應條件為：即時定量 PCR 使用 SYBR Green PCR Master Mix 試劑 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，引子濃度為 200 nM，總反應體積為 20 μL。反應條件為先進行 95℃ 10 分鐘，再以 95℃ 30 秒及 60℃ 1 分鐘為一循環，共進行 35 個循環。每個基因的即時定量 PCR 反應均為三重覆，樣品的 ΔCt 值 (SΔCt) 是計算功能性基因，其 Ct 值在 shock - induced 前後間的差別。rpoD 基因 (Song et al. 2014) 的 ΔCt 值被視為對 照的 ΔCt 值 (CΔCt)。樣品及控制組間的相對基因表現量透過此公式計算：

2−(SΔCt − CΔCt)

(Song et al. 2014)。

6. 統計分析

所有實驗皆進行三重複，實驗結果以平均值 ± 標準差 (mean ± SD) 表示。

實驗數據利用 SPSS 之單因子變異數分析 (One-way ANOVA) 進行統計分析，

以 Duncan’s Multiple Range Test 作組間差異性比較，p < 0.05 具有顯著差異。

(49)

38

表九、本研究使用之引子對

Primer sets used in this study Table 9.

38

(50)

39

二、結果

1. 不同計數方法的比較

比較 3M™ Petrifilm™ Aerobic Count Plate 與平板計數 (MRS agar plate) 兩者之間對於 NTU 101 計數的差異，發現兩者無顯著差異 (p > 0.05) (圖九)，

而 petrifilm 計數相較於平板計數而言，在操作上較簡單及省時，因此後續實驗皆以 petrifilm 進行計數。

2. 菌數-OD 檢量線

以 OD595 為 X 軸，菌數為 Y 軸繪製檢量線，方程式為 : Y = 8.556 × 10⁸

× X + 6.809 × 10⁷，R² = 0.9967，由此可知 OD595 與菌數具相關性，於發酵過程中能以 OD595 表示 NTU 101 之生長狀況 (圖十)。

3. 不同氧氣條件下 NTU 101 之生長特性

乳酸菌的生產培養是以獲得高產量及高活性菌體為最終目的。因此在培養過程中，要提供菌株良好的增殖條件，同時考慮後續製程中能否使其具有較強的抗冷凍及抗乾燥能力。本研究藉由通入兩種氣體 (空氣或 N2) 探討 NTU 101 之生長動力學，根據其最終發酵終點之菌數 (CFU/g DCW)、生產率 (CFU/mL/h)、比生長速率 (μmax、(h^-1)) 及菌體乾重 (g/L DCW) 得出較佳的培養條件，圖十一及圖十二分別為以 2 L 發酵槽通入空氣 (通氣量 0.59 v/vm) 或 N2 (通氣量 0.059 v/vm) 培養 NTU 101 之生長曲線。

當通入空氣時，無論有無使用 OS，NTU 101 生長至穩定期約需 15-16 小時，而其 OD₅₉₅ 分別為 3.05 ± 0.12 及 3.43 ± 0.13 (p < 0.05)，表示通入空氣且不使用 OS 有較高的 OD₅₉₅。發酵過程中 ORP 在延滯期會先緩慢上升，當細胞生長進入對數期時，ORP 數值會稍微下降再持續上升，分別達到 88 mV 及 75 mV。兩者在發酵過程中皆因乳酸菌生長產生的乳酸堆積，使得 pH 值由 5.4-5.6 下降至 3.7 左右 (圖十一)。

當通入 N2 時，可以發現使用 OS 能縮短發酵時間至 12 小時，而不使用 OS 則約 16 小時達發酵終點，OD595 分別為 2.93 ± 0.05 及 3.38 ± 0.06 (p

< 0.05)，顯示出將氣體通入液體內 (使用 OS) 能縮短發酵時間，但不使用 OS 則有較高的 OD595。也因為通入 N2 的關係使得 ORP 在延滯期大幅下降 (-341 mV 及 -346 mV)，在對數生長期時往回提升至 -294 mV 及 -292 mV，

一直到發酵終點前則無太大的變化。而 pH 值與使用 air 進行發酵的結果並無太大差異，由 5.6 下降至 3.7 左右 (圖十二)。

(51)

40

圖九、兩種菌數計數方法之差異。

The difference between the two count methods. The data are presented as Figure 9.

the means ± SD (n=3).

(52)

41

圖十、NTU 101 菌數檢量線。

Calibration curve of cell count.

Figure 10.

Y = 8.556 × 10⁸ × X + 6.809 × 10⁷ R² = 0.9967

(53)

42

圖十一、以空氣通氣培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 之生長曲線。

The growth curve of L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 with air Figure 11.

sparging (A) with orifice sparger (OS) or (B) without OS. Open triangle, pH; open square, ORP; solid circle, OD₅₉₅.

(54)

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圖十二、以 N2 通氣培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 之生長曲線。

The growth curve of cultured the L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 Figure 12.

with N₂ sparging (A) with orifice sparger (OS) or (B) without OS. Open triangle, pH; Open square, ORP; solid circle, OD₅₉₅.

(55)

44

4. 不同 pH 值下 NTU 101 之生長特性

根據上述結果可以知道當 NTU 101 於厭氣環境下的生長速率較快，能減少發酵成本 (發酵時間縮短 0.75 倍)，因此後續使用 N2 及 OS 進行發酵，

探討 pH 值對於 NTU 101 生長動力學的影響。由圖十三-十五可以得知在控制 pH 的條件下 NTU 101 的發酵時間與 N2 OS 組相比並無太大差異 (約 9-10 小時)，但在發酵終點的 OD595 與 N2 OS 相比皆顯著上升 (p < 0.05) (pH 5.0 = 4.15 ± 0.12、pH 6.0 = 4.16 ± 0.06 及 pH 7.0 = 3.63 ± 0.30)。

由表十可知 NTU 101 於 pH 6.0 的環境下其比生長速率最高，達 0.61 ± 0.02 h^-1 (p < 0.05)，且菌數 (3.70 ± 0.40x10¹² CFU/g DCW)、生產率 (1.56 ± 0.17x10⁹ CFU/mL/h) 及菌體乾重 (3.80 ± 0.16 g/L) 也比其他組別來的高，另外也發現當 NTU 101 以 N₂ 及 OS 進行培養時，其細胞體積較小，但是在 pH 7.0 時細胞大小差異很大 (最大為 13.33 μm；最小為 1.97 μm) (圖十六)。

5. 以替代性培養基培養 NTU 101 之生長特性

根據上述實驗顯示以 MRS 培養 NTU 101 的最佳條件為通入 N₂ (通氣量 0.059 v/vm)、使用 OS 並控 pH 6.0，因此後續使用相同條件而將培養基更換成 10% (w/v) 豆漿粉 (豆寶 2) 進行實驗，結果顯示發酵 12 小時能達穩定期前期，菌數為 1.39 ± 0.10x10⁹ CFU/mL，ORP 與先前實驗相同在對數期時先下降再上升，但與其他組別不同的是在進入穩定期前 ORP 才大幅下降 (圖十七)，而將結果換算成單位成本產率為 7.06 ± 1.46x10¹⁰ CFU/NTD，顯著高於其他組別，與 pH 6 (4.62 ± 0.50x10¹⁰CFU/NTD) 組別相比提升 1.53 倍。

6. 以逆境處理對於 NTU 101 冷凍乾燥前後存活率之影響

為探討 NTU 101 在培養過程中施以逆境對於其逆境蛋白表現量增加對於後續冷凍乾燥的影響，本實驗以冷逆境 (5℃、6 小時) 、熱逆境 (50℃、15 分鐘) 及滲透壓逆境 (最終濃度 0.6 M NaCl) 預處理 NTU 101，並與控制組相比觀察冷凍乾燥前後菌數的差異。由圖十八可以得知當 NTU 101 逆境預處理後對其生長並無顯著的影響，凍乾前菌數皆可達 10¹¹ CFU/g DCW，控制組、冷、

熱休克及滲透壓逆境凍乾後菌數分別為 5.41 ± 1.03x10¹¹、4.94 ± 0.44x10¹¹、4.88

± 0.44x10¹¹ 及 5.59 ± 1.92x10¹¹ CFU/g DCW，存活率為 86.3%、74.4%、64.3%

及 75.0%。

(56)

45

圖十三、以 N2 通氣培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 並控制於 pH 5.0 之生長曲線。

Effects of pH state (pH = 5.0) on the growth of L. paracasei subsp.

Figure 13.

paracasei NTU 101 with N₂ sparging and orifice sparger. Open triangle, pH; Open square, ORP; solid circle, OD₅₉₅.

(57)

46

圖十四、以 N2 通氣培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 並控制於 pH 6.0 之生長曲線。

Figure 14.

(58)

47

圖十五、以 N2 通氣培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 並控制於 pH 7.0 之生長曲線。

Figure 15.

(59)

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圖十六、各發酵組別細胞外觀。

Cell morphologies under various fermentation conditions. Scale bar, 2 μm.

Figure 16.

OS: orifice sparger

(A) air OS (B) air

(C) N2 OS (D) N2

(E) pH 5.0 (F) pH 6.0

(G) pH 7.0

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圖十七、以 10% 豆漿粉 (豆寶 2) 培養 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 並通入 N2 控制發酵 pH 6.0 之生長曲線。

Effects of pH state (pH = 6.0) on the 10% soy bean powder growth of L.

Figure 17.

paracasei subsp. paracasei NTU 101 with N₂ sparging and orifice sparger.

Open triangle, pH; Open square, ORP; solid circle, CFU/mL.

(61)

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表十、不同的發酵條件對於 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 生長的影響

Different

fermentation

condition affect growth of

L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 Table 10.

The data are presented as the means ± SD (n=3). Means followed by the same letter within each column do not differ significantly from each other (Duncan's multiple range test, p < 0.05). OS: orifice sparger.

50

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圖十八、不同預處理對於 L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 冷凍乾燥前後 菌數的影響。

Effects of pretreatment on viable cell count of lyophilized L. paracasei Figure 18.

subsp. paracasei NTU 101. The data are presented as the means ± SD (n=3).

國立臺東大學生命科學系 碩士論文