奈米幾丁聚醣載體於細胞活性及穿透之研究 呂郁芬、?耀國
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摘 要
本研究目的分為兩大部分，第一部分探討不同分子量的幾丁聚醣鹽酸鹽的製備找出奈米懸浮微粒的形成最佳條件，並進行 特性分析；第二部分是以Caco-2 細胞作為體外試驗模式，評估幾丁聚醣鹽酸鹽奈米顆粒，對於細胞的毒性與穿透能力。結 果顯示，幾丁聚醣鹽酸鹽隨著超音波降解時間增加，其分子量變化由1,300 kDa下降至730及400 kDa，幾丁聚醣鹽酸鹽奈米 顆粒形成最適條件為pH值6.4，以TEM觀察其型態近似圓形顆粒，粒徑分佈介於50 nm至130 nm之間；將幾丁聚醣鹽酸鹽 奈米顆粒與Caco-2 增生和單層細胞進行活性試驗，發現幾丁聚醣鹽酸鹽奈米顆粒對於增生與單層細胞皆具有良好生長活性
，而穿透試驗證實奈米顆粒具促進Caco-2 單層細胞之緊密接合打開之能力，本研究證實幾丁聚醣鹽酸鹽奈米化具高安全性
，在於藥物傳輸之應用上具有發展潛力。
關鍵詞 : 幾丁聚醣鹽酸鹽 ; 超音波降解 ; 奈米顆粒 ; 細胞活性 ; 穿透能力 ; 幾丁聚醣 ; 安全性 ; 超音波 ; 鹽酸鹽 ; 分子量 目錄
目 錄 封面內頁 簽名頁 授權書 ...? 中文摘要 ...? 英文摘要 ...? 誌謝 ...? 目錄 ...? 圖目錄 ...? 表目錄 ...xii 第一章、研究目的...1 第二章、文獻回顧 ...2 2.1 幾丁聚醣及其衍生物簡介 ...2 2.1.1幾丁聚醣及其衍生 物結構 ...2 2.1.2幾丁聚醣鹽類之製備 ...3 2.1.3幾丁聚醣藥物載體之特性 ...4 2.2奈米顆粒簡介 ...7 2.2.1幾丁聚醣奈米顆粒製備 ...7 2.3 超音波特性 ...7 2.3.1超音波降解高分子之機制 ...9 2.3.2幾丁聚醣降 解反應之機制與位置 ....10 2.3.3影響超音波降解的因素 ...10 2.4口服藥物傳輸模式 ...12 2.4.1 Caco-2單層細胞 膜 ...13 2.4.2幾丁質類物質於腸道穿透之研究 ....15 2.4.3幾丁聚醣促進黏膜吸收機制 ...15 2.5 細胞毒性評
估...18 2.5.1細胞毒性試驗方法 ...18 2.5.2幾丁聚醣物質毒性評估之相關研究 ...20 第三章、材料與方法 ...22 3.1實驗架構 ...22 3.2實驗材料 ...23 3.2.1細胞株 ...23 3.2.2藥品 ...24 3.2.3耗材 ...25 3.2.4儀器設備 ...26 3.2.5培養基與試劑配製 ...27 3.3 研究 方法 ...29 3.3.1不同分子量之幾丁聚醣鹽酸鹽製備 ....29 3.3.3原料分析 ...30 3.4 幾丁聚醣鹽酸鹽懸 浮顆粒製備 ...34 3.4.1 幾丁聚醣鹽酸鹽懸浮顆粒分析 ...34 3.4.1.1紫外線/可見光光譜分析 ...34 3.4.1.2穿透式電子 顯微鏡分析 ...34 3.5 細胞毒性之研究 ...35 3.5.1細胞培養 ...35 3.5.2細胞復甦 ...35 3.5.3 繼代培養 ...36 3.5.4細胞凍存 ...37 3.5.5細胞計數 ...37 3.5.6 MTT分析 ...38 3.6 細胞穿透之研究 ...39 3.6.1 Caco-2 cell單層膜之培養 ...39 3.6.2 Millicell-ERS之準備 ...41 3.6.3 Transepithlial electrical resistance ...42 3.6.4 Trypen bule存活率試驗 ...43 第四章、結果與討論 ...44 4.1不同分子量之幾丁聚醣鹽酸鹽製備 ...44 4.1.1原料分析 ...45 4.2幾丁聚醣鹽酸鹽懸浮顆 粒製備 ...52 4.2.1幾丁聚醣鹽酸鹽懸浮顆粒製備及分光探討...52 4.2.2 穿透式電子顯微鏡分析
...55 4.3 細胞毒性之研究 ...59 4.3.1 Caco-2 細胞培養之觀察 ...59 4.3.2 MTT 分析 ...61 4.4 細胞穿透之研究 ...65 4.4.1 TEER分析 ...65 4.4.2 Trypan bule 細胞存活率分析 ...69 第五章、結論 ...71 參考文獻
...73 圖目錄 圖2.1幾丁聚醣鹽類之化學結構 ...3 圖2.2幾丁聚醣與幾丁聚醣鹽 類之製備流程圖 ...5 圖2.3腸上皮細胞穿透模式類型 ...13 圖2..4共焦顯微鏡掃描不同培養天 數Caco-2單層膜 ...14 圖2.5 MTT反應機制 ...20 圖3.1實驗架構圖 ...22 圖3.2奧氏瓦黏度計 ...31 圖3.3細胞培養流程圖 ...36 圖3.4 示意Caco-2單層細胞分 化於transwell instert系統...40 圖3.5 細胞電阻測定儀 ...42 圖4.1不同超音波降解時間對極現黏度之關係 圖 ...46 圖4.2幾丁聚醣鹽酸鹽A之濃度對黏度關係圖 ...47 圖4.3幾丁聚醣鹽酸鹽B之濃度對黏度關係圖 ...48 圖4.4幾丁聚醣鹽酸鹽C之濃度對黏度關係圖 ...49 圖4.5幾丁聚醣鹽酸鹽水溶液於不同pH之觀察 ...53 圖4.6幾丁聚醣鹽酸鹽懸浮顆粒之最適pH值 ...54 圖4.7穿透式電子顯微鏡分析不同分子量之幾丁聚 醣鹽酸鹽懸浮顆粒層膜 ...56 圖4.8幾丁聚醣鹽酸鹽A、B及C之粒徑分佈圖 ...58 圖4.9 Caco-2細胞經培養18天過程 之觀察 ...60 圖4.10 Caco-2增生細胞與不同濃度的幾丁聚醣鹽酸鹽培養之MTT分析 ...63 圖4.11 Caco-2單層細胞 與不同濃度的幾丁聚醣鹽酸鹽培養之MTT分析...64 圖4.12幾丁聚醣鹽酸鹽懸浮溶液對於單層膜電阻值之影響...67 圖4.13幾丁聚醣鹽酸鹽奈米懸浮溶液對於單層膜電阻值單層膜 ...68 圖 4.14 以trypan bule染色經TEER穿透試驗的Caco-2 單層膜...68 表目錄 表2.1幾丁聚醣奈米微粒製備之相關研究 ...8 表2.2幾丁聚醣物質對Caco-2 monolayer 電阻值之
評估...16 表2.3以MTT法評估幾丁聚醣物質之細胞存活率 ...21 表3.1人類大腸癌細胞株的說明書 ...23 表3.2不同離子強度下黏度常數a、K、R2值 ...32 表4.1不同超音波降解時間處理及所得去乙醯度 ...50 表4.2三種 幾丁聚醣鹽酸鹽之分子量及去乙醯度 ...51 表4.3不同分子量幾丁聚醣鹽酸鹽粒徑統計表 ...57
參考文獻
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