藉幾丁聚醣攜帶四環黴素製備新興牙周病生物醫 材之研究

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藉幾丁聚醣攜帶四環黴素製備新興牙周病生物醫 材之研究

學生：沈一慶 指導教授：汪光夏教授 傅

鍔教授

摘 要

隨著生醫材料的研究與發展，幾丁質這個在天然有機物當中含量僅次於 纖維素的多醣体，其重要性就更加受人矚目。而幾丁聚醣則是幾丁質去乙醯 化後所得之產物，兩者皆具有良好的生物相容性及生物可降解性，臨床上不 僅具有抗菌、止血、促進傷口癒合等特性，更是一個沒有毒性療效又好的牙 周再生材料。四環黴素由於具抑菌功能，並能促進纖維母細胞的附著，以及 抑制膠原蛋白的活性等功能，而且在牙齦溝液內較高濃度，因此常用於牙周 病的治療。本研究以經由三聚磷酸交聯後之幾丁聚醣與四環黴素海綿體於體 外釋放之期程及對細菌抑制之表現來探討臨床牙周疾病治療使用之可行性。

四種經過不同處理之幾丁聚醣海綿體為本實驗之主要材料，包含：1. 單 純幾丁聚醣海綿體為控制組；2. 經三聚磷酸交聯之幾丁聚醣海綿體(TPP)；

3. 未經三聚磷酸交聯之幾丁聚醣與四環黴素海綿體(TC)；及 4. 經三聚磷酸 交聯之幾丁聚醣與四環黴素海綿體(TPP+TC)。海綿體之重量、厚度、半徑 均予以測量，且均接受掃瞄電子顯微鏡(SEM)照相。以浸泡於蒸餾水中方式 測量海綿中四環黴素於體外釋放之期程，同時分別將體外釋放四環黴素後之 海綿體於細菌實驗室進行抑菌圈實驗。本研究結果顯示，經由三聚磷酸交聯

後之幾丁聚醣與四環黴素海綿體可延長藥物釋放時間至 11 天，同時依然具

有抑菌效果，而未經三聚磷酸交聯之幾丁聚醣與四環黴素海綿體雖然亦有延

長藥物釋放時間與抑菌效果，但於7 日內即崩解，其餘則均無藥物釋放時間

與抑菌效果，故而經本研究之結果，經由三聚磷酸交聯後之幾丁聚醣與四環 黴素海綿體可以進一步研究推廣至臨床使用。

關鍵詞：幾丁質、 幾丁聚醣、三聚磷酸交聯、藥物釋放、四環黴素、抑菌

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A Research on Developing a New Periodontal Bio-material by Carrying Tetracycline in Chitosan

Sponge

Student : E Chin Shen Advisor : Dr. Collin Wang Dr. Earl Fu

Abstract

Chitin is second only to cellulose as the most abundant natural biopolymer.

It is an important structural component of the exoskeleton of invertebrates and is a very stable polysaccharide. Chitosan is a derivative of chitin made by treating with hot strong alkali which results in abundant deacetylation of side chains.

Chitin and chitosan have various biological effects such as biocompatibility, biodegradability, non- toxicity, activation of host defense to prevent infection, acceleration of wound healing and so on. Tetracycline is one of the useful antimicrobial agents in periodontal therapy. The aim of this study was to design a tripolyphosphate-crosslinked chitosan sponge that slowly releases tetracycline, for future periodontal treatment applications.

Four chitosan sponges were prepared: control, tripolyphosphate-crosslinked (TPP), tetracycline-containing (TC), and TPP-crosslinked tetracycline-containing (TPP-TC) sponges. The control sponge was made by freezing and drying 2.5%

chitosan solution. The TPP sponge was made by immersing the chitosan sponge in 5% tripolyphosphate solution and air-drying it. The TC sponge was prepared by freezing and drying a mixture of chitosan and tetracycline. The TPP-TC sponge was made by immersing the TC sponge in 5% tripolyphosphate solution.

The sponges’ weights, thicknesses, and diameters were recorded and their surface microstructures were examined with scanning electron microscopy (SEM). The sponges were immersed in distilled water, and the amount of tetracycline released into solution was analyzed spectrophotometrically. The antimicrobial activities of the residual sponges were tested against Staphylococcus aureus and

Escherichia coli cultures.

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Under SEM, the topography of the scaffolds was intact after tetracycline was added, but increased surface irregularities were noted. In those sponges with tripolyphosphate, intensified folding of the scaffold surfaces was observed. The weights of the sponges increased after tripolyphosphate and tetracycline were added, but their thicknesses and diameters decreased after the sponges were crosslinked with tripolyphosphate. Tetracycline was detected in the solutions from TPP-TC sponges until day 11. On day 7, the tetracycline released from TC sponges was less than that released from TPP-TC sponges. Bacteria were inhibited by sponges containing tetracycline, but not by those without tetracycline. The inhibition effect of the TPP-TC sponges was detectable until day 11. Based on the present data, we conclude that the TPP-cross-linked chitosan sponge is suitable as a slow-release-device for tetracycline maintaining antimicrobial effects against the bacteria tested. Under the limitations of the study design, TPP-TC Chitosan sponge may be a suitable material for periodontal treatment applications.

keywords: chitin, chitosan, tetracycline, tripolyphosphate crosslinked, antimicrobial

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誌 謝

感謝恩師汪光夏教授及傅鍔教授於研究期間悉心的教誨與指導。 恩師 們豐富淵博的學識、嚴謹的治學方法、謙虛寬和的處世態度，不但使我在求 學及研究過程中受益良多，也是我成長學習的路上永遠的標竿。還有，修課 期間承蒙賀力行老師、馬恆老師在課業上的諄諄指導，特表誠摯的謝忱。同 時也要感謝聶鑫教授、張龍昌教授與王宜斌教授在百忙之中撥冗為我口試，

並提供寶貴的意見，使我能以更寬廣的角度來思考研究領域及方法，提昇本 研究結果的整體價值。 還要特別感謝萬能科技大學老師劉家盛博士在資料 處理技巧及方法上所給予的具體指導與協助。

最後，我要感謝父親對我的栽培與期勉，母親永不止息的關心與愛護，

以及全力支持我的妻、子，與其他親朋好友們，謝謝大家的鼓勵與提攜，讓 我得以順利完成學業，感恩!

沈一慶 謹識於中華科管所 中華民國96 年 8 月 30 日

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目 錄

摘 要... i

Abstract ... ii

誌 謝... iv

目 錄... v

圖目錄... vii

表目錄... viii

第一章 緒論... 1

1.1 研究動機與背景... 1

1.1.1 研究動機 ... 1

1.1.2 研究目的 ... 1

1.1.3 研究流程與章節說明 ... 2

第二章 文獻探討... 3

2.1 幾丁質與幾丁聚醣... 3

2.1.1 幾丁質與幾丁聚醣的製備 ... 4

2.1.2 幾丁聚醣在醫療方面的運用 ... 6

2.1.2.1 止血作用... 6

2.1.2.2 殺菌及抑菌功能... 7

2.1.2.3 創傷或皮膚移植等傷口之敷料... 8

2.1.2.4 組織再生功能:... 9

2.2 四環黴素...11

第三章 研究材料與方法... 16

3.1 實驗儀器與藥品試劑... 16

3.1.1 主要儀器及器材 ... 16

3.1.2 藥品試劑與套組 ... 17

3.2 實驗方法與步驟... 18

3.3 研究限制... 19

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第四章 研究結果... 20

4.1 幾丁聚醣與四環黴素海綿體之外觀... 20

4.2 掃瞄電子顯微鏡(SEM)之鏡相... 21

4.3 幾丁聚醣海綿體經不同化學處理之變化... 26

4.4 四環黴素從海綿體釋放之實驗結果... 28

4.5 幾丁聚醣海綿體之抗菌效果... 29

第五章 研究討論... 44

5.1 交聯與釋放能力... 44

5.2 抗生素與菌種... 45

5.3 幾丁聚醣之角色... 45

第六章 結論... 48

參考文獻... 49

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圖目錄

圖2.1 幾丁質、幾丁聚醣之化學構造... 4

圖2.2 幾丁質與幾丁聚醣的製造流程... 6

圖4.1 幾丁聚醣、四環黴素、三聚磷酸不同組合圖示... 20

圖4.2 掃瞄電子顯微鏡相片－純幾丁聚醣海綿體... 21

圖4.3 掃瞄電子顯微鏡相片－經三聚磷酸交聯之純幾丁聚醣海綿體... 22

圖4.4 掃瞄電子顯微鏡相片－含四環黴素之幾丁聚醣海綿體... 23

圖4.5 掃瞄電子顯微鏡相片－含四環黴素經三聚磷酸交聯之幾丁聚醣海綿 體... 24

圖4.6 不同海綿體掃瞄電子顯微鏡相片之比較... 25

圖4.7 不同組別海綿體之重量、半徑、厚度比較圖... 26

圖4.8 含四環黴素幾丁聚醣海綿體釋放天數及濃度比較圖... 29

圖4.9 第 0 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈... 32

圖4.10 第 1 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈... 33

圖4.11 第 3 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈... 34

圖4.12 第 5 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈... 35

圖4.13 第 7 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈... 36

圖4.14 第 9 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈... 37

圖4.15 第 11 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈... 38

圖4.16 純幾丁聚醣海綿體之抑菌圖（上：未經交聯，下：經交聯）... 39

圖4.17 第 1 天、第 3 天未經交聯含四環黴素幾丁聚醣海綿體... 40

圖4.18 第 5 天、第 7 天未經交聯含四環黴素幾丁聚醣海綿體... 41

圖4.19 不同組別幾丁聚醣海綿體之抑菌圈比較圖... 42

圖4.20 不同天數經交聯含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈比較圖... 43

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表目錄

表2.1 以四環徽素纖維治療對探測深度之改變（mm） ... 13

表2.2 各種局部投藥抗生素效能之比較... 15

表4.1 原始測量資料... 27

表4.2 含四環黴素幾丁聚醣海綿體之原始釋放資料... 28

表4.3 不同天數之含四環黴素幾丁聚醣海綿體抑菌圈之比較表... 31

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第一章 緒論

1.1 研究動機與背景

科技管理在現代已是管理學中極為重要的一門應用科學。所謂科技管 理，就是探索如何善加經營和運用科技的學問，同時是整合工程、管理、營 運、研發，理論與實務並重之跨領域科學。創新，是以科技為核心，以管理 為手段，來追求各種價值的無限提昇；醫學，因為與人的生命品質關係最為 直接，更是需要藉由科技的進步，持續不斷的從事創新。

1.1.1 研究動機

隨著生醫材料的研究與發展，幾丁質這個在天然有機物當中含量僅次於 纖維素的多醣体,其重要性就更加受人矚目，而幾丁聚醣則是幾丁質去乙醯化 後所得之產物，兩者皆具有良好的生物相容性及生物可降解性，臨床上不僅 具有抗菌、止血、促進傷口癒合等特性，更是一個沒有毒性療效又好的牙周 再生材料。四環黴素由於具抑菌功能，並能促進纖維母細胞的附著，以及抑 制膠原蛋白的活性等功能，而且在牙齦溝液內較高濃度，四環黴素纖維可長 時間緩慢在局部釋出穩定濃度以達到抑菌效果。對於成年型牙周炎病患，單 獨使用四環黴素纖維，或合併式療法的臨床效果，並不比機械式療法來得顯 著，若考慮抗生素之負面影響，並不建議以四環黴素纖維治療來取代機械式 療法。對於再發性或無法改善的牙周囊袋，則使用合併療法短期內可能會有 較顯著的效果，但長期則與單獨結石刮除及牙根整平治療並無多大差異。一 般治療前之探測深度愈深，治療效果愈佳。以局部給藥的療法，並無法完全 消滅口內所有致病菌，因為牙周囊袋可能受到存在於口腔內其他部位，如舌 背，頰黏膜，或其他病灶區細菌的二次感染(reinfection)。全口病灶區均放置 四環黴素纖維會較只放置局部病灶區(full mouth versus local approach)，臨床 效果較顯著。若所需治療的牙齒數較多時，因單顆牙四環黴素纖維放置便要 花5-10 分鐘，同時考慮二次感染可能性，建議考慮使用口服藥以減少診療時 間。少數報告指出合併式療法可以預防牙周組織破壤，進而延長疾病再度復 發的時間。因此常用於牙周病的治療。

1.1.2 研究目的

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本研究以經由三聚磷酸交聯後之幾丁聚醣與四環黴素海綿體於體外釋放 之期程及對細菌抑制之表現來探討其作為輔助治療臨床牙周疾病使用之可行 性。

1.1.3 研究流程與章節說明

一、文獻探討：於第二章中詳列本研究所參考之相關文獻，並探討其之間之 關連性，作為本實驗設計之參考。

二、實驗設計：於第三章中說明本研究所需之材料進行之方法與步驟。

三、研究結果：於第四章中將實驗結果分別整理並呈現重要之發現。

四、研究討論：於第五章中對本實驗重要之發現予以分析與討論。

五、結論：於第六章中具體總結本研究之意義與成果。

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第二章 文獻探討

2.1 幾丁質與幾丁聚醣

1799 年英國人 Hachett 將蝦.蟹.龍蝦等無脊椎動物外殼以酸處理後，發現 會產生膠狀黃色的軟骨物質，1823 年法國人 Odier 將金龜子的翅鞘經氫氧化 鉀處理後，得到相類似的物質，而將此物質命名為幾丁質Chitin (Chitin，此 字源自於希臘文Chiton，意思是鎧甲)。 1859 年 Rouget 發現幾丁質一旦置於

濃氫氧化鈉溶液中經加熱處理後，就可溶解於有機酸，產生之物質於 1894

年由Hoppe-Seyler 命名為幾丁聚醣(Chitosan)【1】。幾丁質是自然界中分佈極 為廣泛的一種多醣類，例如黴菌、酵母和蕈類等真菌類之細胞壁，動物中的 上角皮層組織(epithelium cuticle)，海洋無脊椎動物，昆蟲的外殼中均有它的 存在，是僅次於纖維素的生物資源。在這些含幾丁質的生物裡又以甲殼類的 幾丁質含量最高【16、41】。然而令人遺憾的是甲殼類的外殼除了少數有被利 用於生產蝦粉及蝦精等飼料之外，其餘大多丟棄且任其腐朽，如此不但造成 環境污染亦平白浪費此一貴重之水產資源。另外，將幾丁質所含之乙醯基去 除後(deacetylation)所得化合物即稱為幾丁聚醣，是一帶正電之聚合物。由於 幾丁聚醣帶正電的特性加上近年來多醣類之研究日益增廣，使幾丁聚醣被廣 泛的運用於醫學、健康食品、廢水處理等各方面;且其重要性日漸增加。

幾 丁 質 是 由 N- 乙 醯 葡 萄 醣 氨 (N-acetyl-D-glucosamine 或 2-autamido-2-deoxy-D-glucose)經由 β-1,4 醣甘鍵聚合成類似纖維素的高分子 直 鍊 狀 聚 合 物 【 41 、 61 】， 幾 丁 聚 醣 則 由 N- 乙 醯 葡 萄 醣 氨 (N-acetyl-D-glucosamine) 所構成，兩者間結構上之差異如下:

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Glucose-β-1,4- Glucose-β-1,4- Glucose

R R R

幾丁質(Chitin)：R=NHCOCH 幾丁聚醣(Chitosan)：R=NH2

圖2.1 幾丁質、幾丁聚醣之化學構造 資料來源：【1】

在自然界中，幾丁質與蛋白質及一些無機鹽(如碳酸鈣等)常結合成錯合 物，故需用化學方法以去除蛋白質與礦物質等雜質才可得到純正的幾丁質

【14】，而幾丁聚醣為幾丁質經去乙醯基後之重要衍生物。1925 年 Children 證實幾丁質為一含氮之化合物【16】，通常幾丁質的氮含量在 7%以上，而幾 丁聚醣的氮含量在7%以下【61、79】。幾丁質經由 X 光繞射之研究，依其雙 股螺旋以及對稱軸分子的排列方向可將其分為幾丁質α,β以及γ三種類型

【16、61】:α 型的幾丁質構造為斜方晶系，其兩股雙螺旋呈反向平行排列，

構型最緻密且質地較為堅硬，在自然界中屬最普遍的構型，大部份的昆蟲或 甲殼類(蝦,蟹)的幾丁質即屬此類。β型的幾丁質為一單斜幾丁質晶系，其二 股雙螺旋呈平行排列，此類幾丁質的組織較為鬆散易被Chitinase 所分解，如 烏賊中的軟骨即屬此類，β型幾丁質經六當量濃度之鹽酸處理可轉變為α型 的幾丁質。γ型的幾丁質則為α 型與β型的混合體，如藻類及真菌所含的幾 丁質即屬此類。

2.1.1 幾丁質與幾丁聚醣的製備

在幾丁質化學性質中，游離氨基是使幾丁質擁有許多重要功能特性的主 因，但由於海產廢棄物的來源種類，以及取得部位的不同，使幾丁質製備的 方法和條件也有所不同，但目的皆是為了去除碳酸鈣與蛋白質而得到純幾丁

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質，通常是使用稀鹼在室溫下來去除碳酸鈣，這是為了避免幾丁質發生強烈 的裂解，而酸處理的時間長短則需視所使用的稀酸濃度來決定。另外，利用 稀酸來去除蛋白質，在過程中要儘量避免去乙醯化的發生，因為蛋白質和幾 丁質之間具有較強共價鍵結合，所以在幾丁質的製備過程中蛋白質含量常會 隨之下降，而其鍵結型式多為乙醯型式(Amide type)，其中則以天門冬氨酸 (Aspartic Acid)或是天門醯酸(Asparagine)最多【13】。

幾丁質經過高濃度的熱鹼處理後(例如 40-50% NaOH) ，即可去掉乙醯 基而形成游離氨基，但處理條件不同，可得到不同去乙醯程度的幾丁聚醣，

通常去乙醯程度越高，則幾丁聚醣的分子量越低，那麼幾丁聚醣的活性就越 大，而影響去乙醯程度的因素有：1.使用鹼性液體的濃度；2.反應的時間；3.

溫度及反應的大氣組成；以及4.流動性等。

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無脊椎動物（蝦、蟹、龍蝦、昆蟲等）的外殼 Ø

切 碎 Ø

蛋白質分離工程 Õ NaOH(3-4%), 100°C, 2 小時 Ø

清 洗 Ø

去除礦物質 Õ HCL(濃) , 2 小時 Ø

清洗 脫水 Ø 幾 丁 質 Ø

去乙醯化 Õ NaOH(30%), 50°C, 1.5 小時 Ø

清洗 脫水 Ø 幾丁聚醣

圖2.2 幾丁質與幾丁聚醣的製造流程 資料來源：【2】

2.1.2 幾丁聚醣在醫療方面的運用 2.1.2.1 止血作用

早在1983 年 Dr. William G. Malette【49】等學者就已證實幾丁聚醣具有 止血的功能，作者們以狗為實驗動物模型，將狗的下腎主動脈(infrarenal aorta) 切開並在切開的實驗傷口上，以浸泡有幾丁聚醣成份的編織物(knitted)接合在 傷口兩側，對照組則是只含生理食鹽水的編織物，比較兩者的血液流失量，

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結果實驗組(含幾丁聚醣)所造成的血液流失量明顯較控制組(含生理食鹽水) 所造成的血液流失量要少。另外1991 年 Dr.Perry R. Klokkevold【38】等學者 用兔子為實驗動物模型，在兔子舌頭兩側創造出長 15mm 深 2mm 的傷口,並 以幾丁聚醣溶液(以 2mg/ml 的幾丁聚醣溶於 0.2%的醋酸溶液)為實驗組與只

含 0.2%的醋酸溶液作對照，比較兩者溶液在傷口上所造成的口內出血時間

(intraoral bleeding times)，全身性出血時間(systemic bleeding times)及全身性血 液凝固時間(systemic coagulation times)的不同，結果實驗組傷口內出血時間不 僅比對照組時間短，且根據實驗動物犧牲前的正常出血參數(normal bleeding parameters)，來評估其與實驗動物在手術前和手術後，全身性出血時間及血 液凝固時間三者間之差異，結果實驗組動物在全身性出血時間及血液凝固時 間均有比對照組動物出血時間短之現象。1992 年 Dr. Perry R. Klokkevold【39】

等學者為證實幾丁聚醣即使在血小板或凝血因子的功能有障礙之情況下，仍 然有相當好的能力去誘導血塊形成而達成止血之目的。作者仍用原來的動物 模型及實驗方法;只是先在實驗動物上，將血小板功能拮抗劑 Epoprostenol 以 400ng/kg/min 的速率透過幫浦(pump)持續注射在經麻醉的兔子上，讓兔子的 凝血功能發生障礙使出血時間延長，然後比較幾丁聚醣的止血功能是否受到 影響，結果發現含幾丁聚醣的實驗溶液不僅可有效降低口內外出血時間，且 實驗動物在注射 Epoprostenol 期間的血液凝固時間比注射前及注射後的血液 凝固時間要短。1997 年 S. Bhaskara Rao【72】等學者除了以各種試驗包括血 液凝集作用(hemagglutination test)，血液凝固作用(coagulation test)及血小板黏 著反應(platelet adhesion test)來證實幾丁聚醣的止血性質外，更就其安全性進 行各種動物的體內毒性試驗，結果顯示，幾丁聚醣在體內呈惰性狀態，不僅 不會造成全身性的急性毒性作用(systemic toxicity)，對皮膚或眼睛的刺激更沒 有任何的不良反應。由此可知，幾丁聚醣不僅是一個理想的無毒性生物聚合 體，更適用於手術過程中出血問題的緊急處理或局部止血處理製劑。

2.1.2.2 殺菌及抑菌功能

1999 年 Guo- Jane Tsai【83】等學者的研究報告中指出，幾丁聚醣主要的 抑菌機轉有二，一為幾丁聚醣因具有帶正電陽離子的特性，可和黴菌細胞表 面的陰離子結合，導至黴菌細胞膜的通透性改變,使黴菌細胞內蛋白質，紫外 線吸收物質及電解質滲漏而死亡；另一抑菌機轉則是幾丁聚醣可藉由甲殼素 酵素(chitinase)水解，使其分子量變小而穿透細菌的細胞核並且和細菌的 DNA

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相互反應，來抑制細菌的mRNA 合成達到抑菌的效果。 1979 年 Carolyn R.

Allen【3】等學者指出，幾丁聚醣因具有魚精蛋白(protamine)，左旋-離氨酸 (L- Lysine)及組織蛋白(histone)等帶有正價電荷的氨基酸，所以對於蕈類細胞 壁內不同的致病原生長有很好的抑制效果，但也由於這些帶正價電荷的氨基 酸很容易受到蛋白水解酵素(proteases)的分解，而使幾丁聚醣抑菌或殺菌的持 續性受到限制，且效果與製備的濃度有很大的相關性，對於這一點，在1990 年Riccardo Muzzarelli 【58】等學者就分別用定性和定量兩種不同的實驗方 法，分析幾丁聚醣抑菌或殺菌能力與濃度的關係，結果證實，幾丁聚醣除了 沙門式桿菌(Salmonella)外，對於絕大部份的革蘭式陽性細菌(Gram positive bacteria)與革蘭式陰性細菌(Gram negative bacteria)及念珠菌 (candidae)都有 相當好的抑菌及殺菌功能。因此，根據幾丁聚醣的抑菌或殺菌特性除了可運 用於食品的保存外，更可當作傷口之敷料來預防傷口的續發性感染(secondary infection)及減少疤痕的產生(scar formation)【58、80】。

2.1.2.3 創傷或皮膚移植等傷口之敷料

1999 年 C.A.Stone 及 H.Wright【80】的研究指出，以含幾丁聚醣的敷料 覆蓋於皮膚移植或燒傷、潰瘍甚至於遠端指節截肢的傷口上，其傷口之癒合 速 率 或 疤 痕 顏 色 的 恢 復 等 效 果 都 要 比 含 石 腊(paraffin) 、 矽 氧 聚 合 體 (silicone) ，或矽藻膠(alginate)等傳統敷料要好，作者以 20 位因外傷或燒傷 等因素需做皮膚移植的患者為對象，以傳統敷料及以含幾丁聚醣的敷料分別 覆蓋在患者的皮膚上，評估兩者效果之差異，結果含幾丁聚醣敷料傷口，其 癒合時間不僅較傳統敷料來得短，而且在組織學的變化上含幾丁聚醣敷料的 皮膚內，可見微血管和小的皮膚神經纖維，且此神經纖維已有早期神經支配 的趨向。除此之外，所有用含幾丁聚醣敷料的傷口在3 到 6 個月就完全癒合，

不僅不需要做第二次的皮膚移植手術(secondary grafting) ，也不會有肥大性 疤痕(hypertrophic scar) 的產生。1997 年 Kratz 【43】等學者認為在複雜的傷 口癒合過程中，細胞可藉成長因子(growth factor)以自泌(autocrine)或旁泌 (paracrine)方式來掌控此過程，而成長因子的調節與穩定和肝燐脂(heparin)的 治療濃度有很大的關係。因此學者證實只要幾丁聚醣能與肝燐脂結合變成一 複合體(complex)，就可藉肝燐脂來穩定及活化成長因子。臨床上由於幾丁聚 醣 具 有 相 當 良 好 的 生 物 相 容 性(biocompatibility) 【 80 】 及 生 物 可 降 解 性 (biodegradation)【43】，利用此一特性將幾丁聚醣包覆(coating)在肝燐脂外面，

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使肝燐脂的治療濃度(therapeutic concentrations)和治療時間能夠維持穩定及 延長，讓傷口癒合或上皮再形成(re-epithelialization)之效果更佳。由此可知，

幾丁聚醣敷料在傷口癒合期間不僅可當做一種屏障(barrier)【80】避免細菌的 侵犯及預防脫水，敷料移除時也不需浸泡和有疼痛感的產生，不但可用於整 型外科，亦可運用在牙齦美容手術如牙齦移植(gingival graft)、牙根覆蓋(root coverage)所需的皮膚移植等手術後之傷口覆蓋敷料。

2.1.2.4 組織再生功能:

幾丁聚醣可促進口腔傷口的癒合，基本上傷口的癒合過程可分為三個階 段【44】：發炎期(inflammatory stage)、纖維成型期(fibroplastic stage)及再塑型 期(remodeling stage)。而多形核細胞(polymorphonuclear cells)及巨噬細胞 (macrophage)的性質與數量在整個癒合過程裡扮演一個相當重要的角色

【67】。1994 年 Gianfranco Peluso【69】等學者認為，幾丁聚醣不僅可刺激傷 口上巨噬細胞和嗜中性球的活性，導致膠原蛋白的沉積和一氧化氮(Nitric oxide)的分泌，而且可促進多型核白血球的移動及其趨化性(chemotaxis)，以 加速傷口之癒合。1998 年 Yasuyuki Usami【84】等學者更進一步指出，幾丁 聚醣是傷口癒合的加速劑(accelerator)，作者們以犬科動物為實驗動物模型證 實，當幾丁聚醣和犬科動物的血清混合在一起，即可使多形核細胞的趨化因 子Leukotriene B4(LTB4)或 C5a 產生，使 PGE2(Prostaglandin E2)濃度增加，

並誘導花生烯油酸產物(arachidonic acid products)出現，讓巨噬細胞和多形核 細 胞 產 生 活 化(activation) 和 聚 集 (accumulation) 的 作 用 ， 以 對 抗 微 生 物 (microorganism)及造成組織的血管再生(angiogenesis)。 2000 年 Dr. Nurdan Ozmeric【67】等學者以狗為實驗對象，將幾丁聚醣配合抗氧化劑牛膽氨基酸 (taurine)置於狗上頷前庭骨缺損處，觀察其修補效果。結果發現配合牛膽氨基 酸及幾丁聚醣的實驗組，其在傷口癒合過程所需的巨噬細胞及嗜中性球數 量，不僅比只含幾丁聚醣的控制組多，而且在溶小體(lysosomes)及粒腺體 (mitochodria)的活性等細胞學變化上也比控制組明顯。綜合以上所述，如果少 了巨噬細胞與多型核白血球的移動，不僅會造成傷口癒合的延遲，而且會有 感染的可能【84】。而幾丁聚醣不僅可造成傷口上巨噬細胞和嗜中性球的量增 加【25】，而且可促進多型核白血球的趨化性，加速傷口之癒合【69】。而這 些作用一般認為對於牙周炎(periodontitis)所造成的組織破壞亦有組織修補之 功能【67】。

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1993 年 R.A.A.Muzzarelli【60】 等學者將幾丁聚醣運用於牙科手術治療 證實了幾丁聚醣可促進骨頭的再生( regenerative)及修復( repair)。作者以 10 個因智齒萌牙困難須拔除，或牙根尖發炎須作根尖切除術的病人為對象，並 將幾丁聚醣製成乾燥海綿狀的物質，經鈷-60γ射線處理後放入術後或拔牙之 傷口，並以傷口癒合過程中新形成物質的電子顯微鏡形態分析(morphology analysis)，配合 X 光片來佐證幾丁聚醣的功能。他們發現在手術後傷口窩洞 內，除了間葉骨母細胞(mesenchymal osteoblastic)外，並伴隨有膠原纖維素 (collagen bundle)及骨細胞(osteocyte)的形成。另外，在術後一個月的 X 光片 上可見大量的骨小樑結構(trabecular structure)分佈於傷口窩洞周邊，而手術六 個月後，整個窩洞已遍佈骨小樑結構，並且和周邊的骨組織相似。1994 年 R.A.A Muzzarelli【59】等學者認為，幾丁聚醣不僅可促進軟組織再生(soft tissue regeneration ) ，且可扮演一平台(scaffold)的角色，讓新生的組織或骨細胞附 著而加速骨傳導(osteoconduction) 【44、45、60】的發生。除此之外，作者 更進一步以羊為實驗動物模型，經由體內實驗證實，幾丁聚醣還具有軟骨內 骨 化(endochondral ossification) 及 直 接 促 進 膜 性 骨 誘 導 (direct membrous osteoinduction)【59】的功能。1996 年 Dr. Perry R Klokkevold【40】在體外的 實驗指出，幾丁聚醣具有加強骨起始細胞分化(osteoprogenitor differentiation ) 和方便骨形成的功能。它以幼鼠的頭頂分化出間葉組織幹細胞(mesenchymal stem cell)，並且將幹細胞和幾丁聚醣一起置於培養皿培養，同時觀察它對骨 起始細胞分化和骨發生(osteogenesis) 【44】的影響，且以量化比較兩組之差 異。實驗結果發現，含幾丁聚醣的實驗組在促進骨形成或骨基質鈣化(matrix calcified)的能力明顯優於對照組。另一方面，幾丁聚醣可和異體植入物質 (alloplastic material)，如 βeta-Tricalcium-Phosphate 或 Hydroxyapatite 等物質混 合成自我硬化(self-hardening)的化合物，藉此人工合成的化合物來扮演骨傳導 (osteoconduction)角色，促進骨母細胞(osteoblast)生長，達到骨恢復(bone regeneration)的目的。1972 年 Cutright【15】就證實 βeta-Tricalcium-Phosphate 因具有相當好的組織相容性，除了可促進骨再生(bone regenerative)及修復 外，在老鼠體內的實驗證實只要48 天即可被完全吸收。1989 年 M. Ito【29】

更以不同比例的氧化鈣(Calcium oxide)、氧化鋅(Zinc oxide)及 Hydroxyapatite 揉捏(kneaded)後放入幾丁聚醣溶液中，使其成為一硬化的糊劑(hardening paste) ， 來 觀 察 其 物 理 性 質 。 結 果 此 硬 化 糊 劑 因 受 氧 化 鈣 、 氧 化 鋅 及 Hydroxyapatite 的影響而呈中性酸鹼值，且有高抗壓強度及短硬化時間的性 質，而將這種人工合成的化合物當作骨頭替代物以彌補自體骨移植所造成的

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限制，像是骨量不足、缺陷及疼痛，此種組織工程(tissue engineering)【44、

45】做法已獲近代學者所認同。2000 年 Yong-Moo Lee94 及 Dr. Perry R Klokkevold【44、45】等學者更認為，幾丁聚醣的結構特性和氨基葡萄醣 (glycosaminoglycans)，尤其是透明酸(hyaluronic acid)非常相似，如果能將幾 丁聚醣和βeta-Tricalcium-Phosphate 混合成的化合物變成一個媒介(carrier) ， 並且和纖維母細胞成長因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)【45】或血小板衍 化的成長因子(Platelet – Derived – Growth – Factor, PDGF)【45】相結合，就可 讓 這 些 原 本 存 在 於 骨 小 樑(osseous trabecular) 的 成 長 因 子 有 絲 分 裂 活 性 (mitogenic activity)增加，讓骨組織或骨母細胞(osteoblast)有機化(organization) 刺激骨形成。總之，臨床上乾燥海綿狀之幾丁聚醣放置於術後之傷口並不會 造成腫脹(turgor)、疼痛(dolor)等副作用，在體內有相當好的生物降解性 (biodegradation)【43】與生物相容性(biocompatibility)【80】，它不但可促進周 邊血管的增生，而且可誘發骨起始細胞生長(osteoprogenitor)【60】，藉由骨傳 導作用(osteoconduction)【44、45、60】而達到骨再生(bone regenerative)及骨 修 復(bone repair) 之 目 的 ， 是 一 個 相 當 好 的 骨 頭 替 代 物 (bone substitute material)，可運用於無牙塉的擴張 (edentulous alveolar ridges augmentation)

【29】，牙周植體(peri-implant)周圍骨缺損及牙周骨缺陷(periodontal defects)

【29】之骨再生治療。

2.2 四環黴素

近年來很多証據均顯示牙周病的致病原因，是因牙周組織受到多種細菌 的感染，引發宿主的免疫反應，進而造成牙周組織破壞【85】。因此，一般牙 周病患在經過牙結石刮除及牙根整平的機械式療法減少菌量後，再配合良好 的口腔清潔習慣，牙周發炎的情形應可得到明顯的改善及控制。但臨床上卻 會遇到經機械式治療仍無法改善或再發病的牙周囊袋，而要使用抗菌性藥品 作為進一步殺菌或抑菌的輔助工具【25、87】。其中，牙齦下局部給藥方式，

因具有下列之優點：1. 到達患部並維持長時間的抑菌濃度；2. 沒有全身性的 投藥方式所引起的藥物副作用；3. 抗藥性菌種的產生較少見；以及 4. 無須 依賴病患的配合度【25】，因此常被應用於牙周病的治療；目前屬於局部投藥 之產品包括有，tetracycline fiber, metrondazole, chlorhexidine chip, minocycline dental gel, 及 doxycycline polymer 等供臨床上使用。

牙周炎是一種牙齒周圍牙齦囊袋中細菌引起的的發炎反應，最近治療策

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略之一即為使用全身或局部抗生素治療，使用全身抗生素治療常會引起一些 併發症，例如腸胃不適、嘔吐、泄肚等症狀【86】，因此，能將抗生素直接置 放於囊袋中作局部治療是較佳方式。局部使用抗生素治療之觀念始於四環黴 素纖維【21】，其可有效維持10 天【82】。四環黴素纖維經治療後可有效減低

細菌之數量，但一般在3 個月左右則會有恢復之趨勢，而且只是數量減少，

無法完全去除【7、23、47、50、55、57、90】。Mandell【50】特別指出，四 環黴素纖維在治潦局部年輕型牙周炎病患時，無法抑制Actinobacilus, 主要因 A. actinomycetemcomitans 會 入 侵 組 織 (invasion) ， 因 此 以 開 刀 合 併 口 服 doxycycline 治療最有效。Mombelli【55】証實在治療前 63%樣本中，有高達

＞106 colony forming unit/ml 之 P. gingixalis，治療後則下降至 9.4%，其中最 不易去除之位置為第二大臼齒遠心端。不過值得注意是在病人回診復發部 位，所分離到A. actinomycetemcomitans 之比率並不高，在 6 個月實驗中，出 現有附連喪失＞2mm 者，Bocterobes, Prevotellaintermedia, Campylobacter rectus 均有增加【90】。而造成細菌反應不佳主因，可能是來自口腔內其他部 位，如舌背、頰黏膜等其他病灶區細菌之再度聚居(re-colonization)的結果

【57、89】。至於是否有抗藥性細菌的產生，則就目前研究所知，四環黴素纖 維治療並未增加抗四環黴素細菌之數目或菌株，僅剛治療一個月有上升現 象，隨後便可回趨穩定【22、90】。其他如 chlorhexidine gluconate【37】、

metronidazole dental gel【65】等，這些慢性釋放材料都有不易固定、不易控 制釋放時間、不易置放於須要位置內等限制。因此，本研究希望發展出其他 處方，以延長釋放時間及於囊袋中維持長久。

四環黴素應用於牙周病的治療，除了因為具抑菌功能外，還具有促進纖 維母細胞的附著，以及抑制膠原蛋白的活性等功能，當用作處理牙根表面的 製劑時，對於牙周組織的修復或再生有所助益【74、75】。四環黴素纖維則是 一直徑0.5mm，具有彈性的單束纖維，在放置的 7 到 10 天內，可在牙齦溝液 中達到平均1590μg/ml 的濃度，足以產生抑菌效果，而在血清中呈現的濃度 卻小於 0.10mg/ml，不足以引起全身性的副作用。Ciancio【12】指出四環黴 素在牙齦組織的濃度是0.644mg/ml，且只能滲入上皮 1~20 以μm，通常無法 穿透上皮。

目前四環黴素纖維主要應用針對成年型牙周炎【19、20、27、73、81】。

或在維護期間復發病患【10、17、36、51、54、63、88】，至於使用在活躍破

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壞之局部年輕型牙周炎病患，則效果不佳【91】。至於是否適用於其他類型早

發型牙周炎病患(early-onset periodontitis)或植體周圍炎(peri-implantitis)，則並 沒有完整的臨床報告。

下列將四環黴素纖維於牙周囊袋內置放之效果以表列方式呈現：

表2.1 以四環徽素纖維治療對探測深度之改變（mm）

作者 人數 治療對象 TC

fiber

S/RP＋

TC S/RP 沒有治 療

研究 時間 Goodson et al. 10 AP 0.57 0.93 0.54 0.43 12 個

月 Heijl et al. 10 AP 1.98 2.15 1.78 - 60 天 Goodson et al. 107 AP 1.02 - 0.67 0.46 60 天 Newman et al. 105 M - 1.81 1.08 - 6 個月 Drisko et al. 116 AP

＜7mmPD 1.0 1.0 1.1 - 1 年

≧700mmPD 1.7 2.1 2.3 -

Vandekeukhoe 20 RP

All mean - 2.6 -

≧700mmPD - 3.2 1.0

Wong et .al 30 M - 1.38 0.92 - 6 個月

Mombelli et al. 19 AP 具有

P. gingivalis

F 1.74mm L:0.6mm

6 個月

TC fiber：四環徽素纖維；S/RP：結石除及牙根整平；AP：成年型牙周炎；

M：維護之周復發部位；RP：復發型牙周炎 F：全口放置；L：局部放置

資料來源：本研究整理

單獨使用四環黴素纖維(monotherapy)治療效果，依 Goodson 等人的實驗 指出，可以使探測流血(bleeding on probing)減少，探測深度減少以及臨床附 連增加，其效果與牙根整平之效果相當【20】。Drisko【17】則指出，使用於 探測深度較深區域，治療效果會比較明顯。

四環黴素纖維為輔助治潦之合併療法 (an adjunctive therapy)，Newman

14

【63】針對有在局部再發性牙周囊袋的回診病患，比較單一療法與合併療法 六個月的效果，指出合併療法有其輔助性的效果，尤其在減少探測深度較顯 著(1.81mm 比 1.08mm)，臨床附連增加為 1.56mm 比單獨治療之 1.08mm 為 高。Kerry【36】則同時注意到使用四環黴素纖維的病患，其探測流血的比例 由92%降至 37%，一般探測深度愈深愈佳。但在我們治療回診病人的復發性 的中等程度牙周囊袋，以split mouth 方式，隨機一側以機械式治療，另一側 採用合併療法，六個月的觀察發現兩種治療方式差異不大【36】。然而，

Vandekerckhove【88】則發現經合併治療之臨床反應，與單獨以機械方式處 理同一位置前後比較，則合併治療為佳。值得注意的是，必須所有患部均使 用纖維處理，以減少來自其他部位的細菌的二次感染，Mombelli【54】更證 實纖維放置全部病灶區相較於局部範圍使用，探測深度之減少分別為1.74mm 與0.88mm。至於長期療效，目前最長之觀察為針對回診復發病患之五年追蹤 報告，發現在五年後，其實對照組與實驗組，探測深度或臨床附連已無差別

【88】。

Michalowicz【51】則在成年型牙周炎病患中比較單獨使用四環黴素纖維 治療，機械式療法以及兩者合併治療法，一年後的臨床反應並沒有顯著的差 異。但是，在沒有支持性治療的情況下之回診病患，有用四環黴素纖維做輔

助性治療的病人，只有 4%有臨床附連喪失；只接受機械式療法的病人中，

卻有9%有臨床附連喪失的情形。因此綜合各報告結果，單使用機械式療法，

一般平均探測深度的減少約1.5mm，合併療法是 1.8mm，經機械式療法平均 臨床附連增加是0.9mm，合併療法是 1.3mm。

目前各種局部投藥抗生素產品，由於在牙齦溝內有不同濃度及滯留時 間，以及不同的實驗方法，如採用 split mouth 或 parallel 設計，monotherapy 或 combined therapy，成年型牙周炎或復發病患，均有所不同。因此，各 multi-center 報告雖有足夠數目之測試者，卻無法相互比較。不過依 Greenstein

【25】針對有多家實驗中心參與，實驗人數超過 100 位之研究作整理，四環 黴素纖維與 ch1orhexidine 在合併治療時，會較只有結石刮除及牙根整平為 佳，探測深度減少分別為 1.81mm 及 0.95mm，但與 minocycline gel 或 metronidazoe 合併治療則並沒有結石刮除及牙根整平獲得更佳之效果，而 doxycline polymer 單獨效果與結石刮除及牙根整平結果則相仿。Kinane 等學 者同時比較2%minocycline gel，25%四環黴素纖維，25%metronidazole ge1 這

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三種局部性抗生素，用於治療機械式療法無法改善的牙周囊袋，經六個月的 輔助性效果，結果顯示三種輔助性抗生素的合併療法都比機械式療法，無論 是探測深度的減少、臨床附連的增加、探測流血的減少等，均有較顯著的改 善；其中又以合併使用四環黴素纖維療法的效果最顯著，臨床改善在第三個 月的時候達最高值，而在第六個月有小幅度的下滑。造成三種藥物療效的差 別，主要與藥物停留在牙齦溝中時間與濃度差別有關。

表2.2 各種局部投藥抗生素效能之比較

商品名稱 牙齦溝液 處置時間（分鐘） 吸收時間 四環黴素纖維 Actisite 1500μg/ml 5-10 不吸收，置

放10 天 Metronidazole 軟

膏 Elyzol dental gel ＞1μg/ml ＜1 1 天 Chlorhexidine 薄

片 Perio Chip 150μg/ml ＜1 8 天

美滿黴素軟膏 Periocline Unknown ＜1 1 天 特林黴素單體 Atridox 420μg/ml ＜1 27 天 資料來源：本研究整理

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第三章 研究材料與方法

3.1 實驗儀器與藥品試劑

四環黴素是一種廣效的抗生素，可使用於全身及局部，尤其用於牙周病 之治療，故本研究採用為實驗標的。因為牙周致病菌極不易培養，而本研究 之主要目的是要瞭解經過處理後之含四環黴素生物醫材是否依然具有抑菌之 能力，故選用較易取得且可靠之兩種商品化細菌Staphylococcus aureus ACTT 25923 及 Escherichia coli ACTT 25922 作為實驗對象。

在前期研究中學者採用之四環黴素濃度從5 至 100mg/ml，浸濕於膠原纖 維膜內作為藥物釋放之用【56、94】，本研究經過反覆多次測試後，決定採採 用10mg/ml 為濃度，以達到最佳之成型效果。

四種經過不同處理之幾丁聚醣海綿體為本實驗之主要材料。海綿體之重 量、厚度、半徑均予以測量，且均接受掃瞄電子顯微鏡(SEM)照相。以浸泡 於蒸餾水中方式測量海綿中四環黴素於體外釋放之期程，同時分別將體外釋 放四環黴素後之海綿體於細菌實驗室進行抑菌圈實驗。

3.1.1 主要儀器及器材

1. 超高速離心機 (Allegra^TM 21R Centrifuge, Beckman Coulter) 2. 微量離心機 (Sigma 3K18)

3. 酸鹼度計 (Microcomputer pH/mV/TEMP METER 6171 ) 4. CO2細胞培養箱 (CO2 Water-Jacketed Incubator, NUAIR^TM) 5. 倒立顯微鏡 (IX71, OLYMPUS)

6. 溫度循環控制機 (GeneAmp®-9700, Applied Biosystems) 7. 超低溫冷凍冰箱 (-80℃Refrigerator, NUAIR^TM)

8. 紫外光光譜儀 (Lamba 40 UV/VIS Spectrometer, Perkin Elmer,

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Norwalk, CT, USA)

9. THERMOSTREPTOPHOTOMETER, Rochester, NY, USA 10. 透析膜：宏昇、Taipei, R.O.C.

11. 8mm 玻片(cover glasses)：Deckglaser, FR, Germany 12. 戴玻片：鑫普企業有限公司, Taipei, R.O.C.

13. 15、50ml 離心管(centrifuge tube)：Corning, MA, U.S.A.

14. 75cm ²培養盒(75cm ² cell culture flask)：Nunc, E. U.

15. 10、25ml 塑膠吸管：Nunc, E. U.

16. 24 孔培養盤(24well plate)：Nunc, E.U.

17. 恆溫水浴槽(water bath)：NAPCO201, Taipei, R.O.C.

18. 電腦分析軟體(Win-IR ver 3.01)：Bio-Rad, CA, U.S.A.

19. 200 mech 篩網: 宏昇, Taipei, R.O.C.

20. 抽氣櫃 (Hood)：造鑫, Taipei, R.O.C.

21. 無菌操作台 (Laminar air flow)：造鑫 Taipei, R.O.C.

22. 37 度恆溫箱：NUAIRE, MN, U.S.A.

23. 掃描式電子顯微鏡：HITACHI S-3500N, Tokyo, Japan 24. 倒立相位差光學顯微鏡：Olympus, Tokyo, Japan 25. 數據分析：CHEM-LAB 中文版 2.0 及界面卡 26. 打碇組 : 瑞伯, Taipei, R.O.C.

27. 酵素免疫分析儀 : DYNEY MRXII, DC, U.S.A.

3.1.2 藥品試劑與套組

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1. Chitosan (Primex Ingredients AS, Avaldenes, Norway) 2. Vitamin C (MERCK, Darmsatadt, Germany)

3. Tetracycline (SINPHAR, Taipei, Taiwan, ROC)

4. Tripolyphosphate (ACROS ORGANICS, Morris Plains, NJ, USA) 5. Coating agent (ION SUPTTER E-1010, Hitachi Japan)

6. Staphylococcus aureus ACTT 25923 (Sancordan Co., Taipei,Taiwan, ROC)

7. Escherichia coli ACTT 25922 (Sancordan Co., Taipei,Taiwan, ROC)

8. Tetracycline Disc (Sensi-Disc^TM , Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)

9. LEUCOGNOST、Acetic acid、Methanol、Vitamin C 、NaOH、

100% alcohols、KBr、NaN3、磷酸緩衝生理鹽水 (PBS, NaCl、

KCl、Na2HPO4 7H2O、KH2PO4)（Merck, FR, Germany）

3.2 實驗方法與步驟

選取分子量450,000 去乙醯度> 90%之幾丁聚醣為本實驗之主要材料，四 種經過不同處理之幾丁聚醣海綿體，包含：1. 單純幾丁聚醣海綿體為控制 組；2. 經三聚磷酸交聯之幾丁聚醣海綿體(TPP)；3. 未經三聚磷酸交聯之幾 丁聚醣與四環黴素海綿體(TC)；及 4. 經三聚磷酸交聯之幾丁聚醣與四環黴素 海綿體(TPP+TC)為研究主體。

先將四環黴素250mg 溶於 10cc 1% Vitamin C 中經攪拌均勻並過濾後吸 取10cc 加入 0.5mg 之幾丁聚醣，置入模型內經冷凍、乾燥程序，將成型之海 綿體分成兩組，一組浸於5%三聚磷酸中 30 分鐘，進行交聯，另一組則不交 聯，控制組則依同樣成份及過程但不含四環黴素，亦分成兩組，製成之海綿

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體分別測量重量、厚度、半徑並予以記錄，同時四組均接受掃瞄電子顯微鏡 (SEM)照相。

此外，以浸泡於蒸餾水中方式分別於 0,1,3,5,7,9,11 天時用分光光度計 (Streptophotometer)測量海綿中四環黴素於體外釋放之程度予以記錄並統計 分析。同時分別將體外釋放四環黴素後之海綿體處理乾燥後，於細菌實驗室 進行兩種不菌種之抑菌圈實驗，將其結果予以記錄並分析。

3.3 研究限制

本研究所選用之菌種為細菌實驗室中常採用之標準菌種，而非牙周病之 致病菌，故僅能以現有之結果表現以幾丁聚醣攜帶四環黴素有慢性釋放之能 力，及推斷其可能為治療牙周病之輔助工具。

20

第四章 研究結果

4.1 幾丁聚醣與四環黴素海綿體之外觀

冷凍乾燥後之幾丁聚醣海綿體，不論是否含有四環黴素，一旦經三聚磷 酸交聯後，由下圖可以看出在外觀上明顯有收縮的現象(右上及右下)。

幾丁聚醣 幾丁聚醣+三聚磷酸

幾丁聚醣+四環黴素 幾丁聚醣+四環黴素+三聚磷酸

圖4.1 幾丁聚醣、四環黴素、三聚磷酸不同組合圖示 資料來源：本研究整理

21

4.2 掃瞄電子顯微鏡(SEM)之鏡相

在掃瞄電子顯微鏡下，分別以 50X、100X、500X 及 1000X 拍攝不同組 別之幾丁聚醣海綿體。圖4.2 為純幾丁聚醣海綿體之 SEM 相片，圖 4.3 為經 三聚磷酸交聯之純幾丁聚醣海綿體之SEM 相片，圖 4.4 為含四環黴素之幾丁 聚醣海綿體之SEM 相片，圖 4.5 為經三聚磷酸交聯之含四環黴素之幾丁聚醣 海綿體之SEM 相片。將前述之不同組別之 SEM 相片加以比較，則在純幾丁 聚醣海綿體之SEM 相片中很清楚的看到孔洞架構(圖 4.6 A & E)，當幾丁聚醣 與四環黴素混合後之海綿體，其結構在SEM 相片中顯示不規則及有放射狀薄 片(圖 4.6 B & F)，一旦經過三聚磷酸交聯後，不論是否含有四環黴素之幾丁 聚醣海綿體均有表面結構皺摺之情形，但唯有含四環黴素之幾丁聚醣海綿體 有不規則表面(圖 4.6 C-D & G-H)。

50X 100X

500X 1000X

圖4.2 掃瞄電子顯微鏡相片－純幾丁聚醣海綿體 資料來源：本研究整理

22

50X 100X

500X 1000X

圖4.3 掃瞄電子顯微鏡相片－經三聚磷酸交聯之純幾丁聚醣海綿體 資料來源：本研究整理

23

50X 100X

500X 1000X

圖4.4 掃瞄電子顯微鏡相片－含四環黴素之幾丁聚醣海綿體 資料來源：本研究整理

24

50X 100X

500X 1000X

圖4.5 掃瞄電子顯微鏡相片－含四環黴素經三聚磷酸交聯之幾丁聚醣海綿體 資料來源：本研究整理

25

圖4.6 不同海綿體掃瞄電子顯微鏡相片之比較 資料來源：本研究整理

D 經三聚磷酸交聯之含四 環黴素幾丁聚醣海綿體 C 經三聚磷酸交聯之純

幾丁聚醣海綿體

E 純幾丁聚醣海綿體 ^{F 含四環黴素之幾}

丁聚醣海綿體

G 經三聚磷酸交聯之純 幾丁聚醣海綿體

H 經三聚磷酸交聯之含四 環黴素幾丁聚醣海綿體

A 純幾丁聚醣海綿體 ^{B 含四環黴素之幾}

丁聚醣海綿體

26

4.3 幾丁聚醣海綿體經不同化學處理之變化

幾丁聚醣海綿體因加入四環黴素及三聚磷酸而有重量增加情形(圖 4.7 A)，厚度亦因加入四環黴素而增加，但是，不論何種海綿體當浸泡三聚磷酸 後其厚度及半徑均降低(圖 4.7 B–C)。

Cont TC TPP TC-TPP

Weight (gram)

0.00 0.02 0.04 0.06

Cont TC TPP TC-TPP

Dimeter (centimeter)

0.0 0.4 0.8 1.2 1.6

Groups

Cont TC TPP TC-TPP

Thickness (millimeter)

0.0 0.4 0.8 1.2

a

b b

c

a a

b c

a b

c d

圖4.7 不同組別海綿體之重量、半徑、厚度比較圖 資料來源：本研究整理

A

B

C

27

表4.1 原始測量資料

資料來源：本研究整理 純幾丁聚

醣海綿體

經三聚磷酸交聯之純 幾丁聚醣海綿體

含四環黴素之幾 丁聚醣海綿體

經三聚磷酸交聯之含四 環黴素幾丁聚醣海綿體

重量 0.035 0.046 0.046 0.056

0.034 0.044 0.039 0.052

0.033 0.041 0.04 0.054

0.036 0.042 0.046 0.058

0.035 0.043 0.041 0.05

直徑 1.5 0.6 1.4 0.5

1.4 0.7 1.4 0.5

1.4 0.5 1.39 0.5

1.4 0.6 1.4 0.5

1.4 0.6 1.4 0.5

厚度 0.5 0.2 1 0.3

0.5 0.3 1 0.31

0.5 0.2 0.99 0.3

0.5 0.19 1.02 0.2

0.5 0.2 1.01 0.4

28

4.4 四環黴素從海綿體釋放之實驗結果

含有四環黴素之幾丁聚醣海綿體且經三聚磷酸交聯之四環黴素釋放，經 由分光光度計測量，結果發現其釋放濃度可延長至 11 天；其中第 5 天及 11 天之濃度比第 1 天及 3 天高且具有統計意義，其最高濃度出現在第 9 天(圖 4.8)。但含有四環黴素之幾丁聚醣海綿體未經三聚磷酸交聯之四環黴素釋放 最高濃度出現在第5 天，且其於第 7 天下降，比經三聚磷酸交聯含有四環黴 素之幾丁聚醣海綿體之四環黴素釋放低的有統計意義(P = 0.06)。

表4.2 含四環黴素幾丁聚醣海綿體之原始釋放資料

天數 數目

2.192 2.251 2.257 2.230 2.295 2.277 2.128 2.114 2.245 2.166

2.152 2.199 2.221 2.245 2.296 2.205 2.077 2.150 2.157 2.077

2.120 2.141 2.265 2.311 2.307 2.202 2.106 2.166 2.215 2.225

2.025 2.186 2.220 2.307 2.267 2.288 2.114 2.167 2.363 2.210

2.126 2.157 2.240 2.247 2.291 2.243 2.108 2.149 2.250 2.267

2.123 2.187 2.241 2.268 2.291 2.243 2.107 2.149 2.246 2.189

5

平均

1 3

1

2

3

4

含四環黴素經交聯幾丁聚醣海綿體 含四環黴素幾丁聚醣海綿體

1 3 5 7

5 7 9 11

資料來源：本研究整理

29 Days

1 3 5 7 9 11

OD Value

0.00 0.50 2.10 2.15 2.20 2.25 2.30

2.35 TC group

TC-TPP group

a

a, b

c

b, c p=0.06

A

A

B

B

B

B

圖4.8 含四環黴素幾丁聚醣海綿體釋放天數及濃度比較圖 資料來源：本研究整理

4.5 幾丁聚醣海綿體之抗菌效果

經釋放四環黴素後之海綿體，依不同之天數，經乾燥後分別將其置入兩 種不同的細菌培養皿中，觀察其抑菌圈的變化。經三聚磷酸交聯之含四環黴 素之幾丁聚醣海綿體，於第 0 天時之抑菌圈(圖 4.9)，第 1 天時之抑菌圈(圖 4.10)，第 3 天時之抑菌圈(圖 4.11)，第 5 天時之抑菌圈(圖 4.12)，第 7 天時之 抑菌圈(圖 4.13)，第 9 天時之抑菌圈(圖 4.14)，第 11 天時之抑菌圈(圖 4.15)；

純幾丁聚醣海綿體與經三聚磷酸交聯之純幾丁聚醣海綿體均無抑菌圈效果 (圖 4.16)；未經三聚磷酸交聯之含四環黴素之幾丁聚醣海綿體，第 1、3 天時 之抑菌圈(圖 4.17)，第 5、7 天時之抑菌圈(圖 4.18)。純幾丁聚醣海綿體與經 三聚磷酸交聯之純幾丁聚醣海綿體均無抑菌圈效果(圖 4.19，左)，凡含有四

30

環黴素之幾丁聚醣海綿體，不論是否經三聚磷酸交聯均符合標準抑菌圈效果 (圖 4.19，右)，雖然第 11 天之抑菌圈效果比第 0 天小但經三聚磷酸交聯後之 四環黴素之幾丁聚醣海綿體可維持有效抗菌效果至11 天(圖 4.20，右) (表 4.3)。

31

表4.3 不同天數之含四環黴素幾丁聚醣海綿體抑菌圈之比較表

- ：未測試

DI：已崩解之海綿體

* ：每個時間的間隔中間都同時測試兩組海綿體 資料來源：本研究整理

非交聯海綿體 交聯海綿體 對照組 純幾丁聚醣 含四環黴素

幾丁聚醣 純幾丁聚醣 含四環黴素幾丁 聚醣*

Staphylococcus aureus ACTT 25923

第 0 天 24 0 45 0 35, 32

第 1 天 25 - 31 - 29, 28

第 3 天 25 - 31 - 32, 31

第 5 天 25 - 41 - 27, 30

第 7 天 25 - 25 - 27, 32

第 9 天 25 - DI - 27, 32

第11 天 24 - DI- - 27, 28

Escherichia coli ACTT 25922

第 0 天 20 0 - 0 30, 30

第 1 天 20 - - - 27, 27

第 3 天 21 - - - 18, 27

第 5 天 20 - - - 22, 26

第 7 天 20 - - - 23, 24

第 9 天 19 - - - 19, 23

第11 天 19 - - - 17, 22

32

第 0 天 (E. Coli)

第 0 天 (SA)

圖4.9 第 0 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈 資料來源：本研究整理

33

第 1 天 (E. Coli)

第 1 天 (SA)

圖4.10 第 1 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈 資料來源：本研究整理

34

第 3 天 (E. Coli)

第 3 天 (SA)

圖4.11 第 3 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈 資料來源：本研究整理

35

第 5 天 (E. Coli)

第 5 天 (SA)

圖4.12 第 5 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈 資料來源：本研究整理

36

第 7 天 (E. Coli)

第 7 天 (SA)

圖4.13 第 7 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈 資料來源：本研究整理

37

第 9 天 (E. Coli)

第 9 天 (SA)

圖4.14 第 9 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈 資料來源：本研究整理

38

第 11 天 (E. Coli)

第 11 天 (SA)

圖4.15 第 11 天時含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈 資料來源：本研究整理

39

圖4.16 純幾丁聚醣海綿體之抑菌圖（上：未經交聯，下：經交聯）

資料來源：本研究整理

40

第 1 天

第 3 天

圖4.17 第 1 天、第 3 天未經交聯含四環黴素幾丁聚醣海綿體 資料來源：本研究整理

41

第 5 天

第 7 天 (End)

圖4.18 第 5 天、第 7 天未經交聯含四環黴素幾丁聚醣海綿體 資料來源：本研究整理

42

圖4.19 不同組別幾丁聚醣海綿體之抑菌圈比較圖 資料來源：本研究整理

＊ ＊

＊

＊ 未經交聯之純幾丁聚醣海綿體

經交聯之純幾丁聚醣海綿體 經交聯之含四環黴素幾丁聚醣海綿體

未經交聯之含四環黴素幾丁聚醣海綿體

43

圖4.20 不同天數經交聯含四環黴素幾丁聚醣海綿體之抑菌圈比較圖 資料來源：本研究整理

＊ ＊

＊ ＊

第 0 天 第 11 天

Esch erichia coli S taphylococcus aur eus

44

第五章 研究討論

5.1 交聯與釋放能力

本研究結果顯示，經三聚磷酸交聯含有四環黴素之幾丁聚醣海綿體具有 平穩釋放四環黴素之能力。曾經有研究報告指出注射用含有米諾四環素之使

用藻酸鹽為核心之幾丁聚醣包圍之結構微小球可以延長釋放抗生素至 7 天

【68】。本實驗中以含有四環黴素之幾丁聚醣結構架體亦可延長釋放抗生素至 7 天，尤其經三聚磷酸交聯後之含有四環黴素之幾丁聚醣結構架體更可延長 釋放抗生素至11 天。在控制組單純幾丁聚醣海綿體之掃瞄電子顯微鏡(SEM) 相片中很清楚的看到孔洞架構(圖 4.6 A & E)，當幾丁聚醣與四環黴素混合後 之海綿體，其結構在掃瞄電子顯微鏡(SEM)相片中顯示不規則及有放射狀薄 片(圖 4.6 B & F)，一旦經過三聚磷酸交聯後，不論是否含有四環黴素之幾丁 聚醣海綿體均有表面結構皺摺之情形，但唯有含四環黴素之幾丁聚醣海綿體 有不規則表面(圖 4.6 C & G)【11】。

曾有研究顯示，兩週全身或局部慢性釋放給四環黴素作牙周治療比單一 劑量更有消滅牙周囊袋中之牙周病致病菌【18】。因此，延長抗生素釋放是對 於牙周疾病治療有臨床意義的。本研究中，經三聚磷酸交聯後之含有四環黴

素之幾丁聚醣結構架體可釋放四環黴素至11 天，而未經三聚磷酸交聯後之含

有四環黴素之幾丁聚醣結構架體只能釋放四環黴素至7 天。這表示本研究所

設計之三聚磷酸交聯法所製備之生物醫材在延長抗生素釋放方面有實質的效 果，具有廣為應用的潛能。

本研究採用三聚磷酸為交聯劑是因為其為多陰離子可與幾丁聚醣之陽離 子結合形成電子力量聚合【34、35】，實際上許多研究均將幾丁聚醣溶液滴入 三聚磷酸溶液中形成微小球以作為潛在之臨床藥物使用【5、8、9、76、77】。

因為幾丁聚醣與三聚磷酸形成鍵節後，降低分子間之空間，使四環黴素釋放 更加困難，而延長釋放抗生素之時間以達目的。換言之，含四環黴素之幾丁

聚醣海綿體未經三聚磷酸交聯，於第9 天即崩解，是因為四環黴素為酸性，

在蒸餾水中慢慢溶出酸，使蒸餾水呈弱酸性，進而溶解幾丁聚醣海綿體。然 而，經三聚磷酸交聯之含四環黴素之幾丁聚醣海綿體能慢性釋放之確實機轉 在本研究中並不能確定。

45

根據許多文獻報告，戊二醛是臨床最常用之交聯劑，例如使用人工心臟 瓣膜製作【62、66】，甚至於有文獻報告使用於牙周再生術中膠原蛋白質膜之 製造【48】。最近，更有許多研究報告顯示利用戊二醛為交聯劑使幾丁聚醣成 為許多藥物控制釋放之攜帶者【30、31、32】。但亦有報告指出戊二醛為有毒 物質，慢性釋出會對生物體有害，因此，建議勿使用於生技材料製程中【64、

78】，然而選擇無毒性又具生物相容性適合用於生物醫學之交聯劑成為重要的 選擇因素。最近幾年來，運用與幾丁聚醣反電荷互相吸引方式製作微小球作 為持續穩定釋放藥物之載體，尤其是運用於氨基酸類、蛋白質類藥物之運輸，

因其製程簡易故吸引許多學者投入研究【46、71】。因此，這種可逆電子作用 形成物理交聯之物質(如三聚磷酸)被用來取代化學交聯物質(如戊二醛)，以避 免產生一些不樂意的併發症。這也就是本研究不採用戊二醛作為交聯劑的原 因。

5.2 抗生素與菌種

四環黴素是一種廣效的抗生素，可使用於全身及局部，尤其用於牙周病 之治療，故本研究採用為實驗標的。四環黴素對許多常見之細菌有效，尤其 是 Prevotella intermedia 和 Porphyromonas gingivalis【6、24、52】。因為牙周 致病菌極不易培養，而本研究之主要目的即在表現經過處理後之材料依然具 有抑菌之能力，故選用易於取得且可靠之兩種商品化細菌 Staphylococcus

aureus ACTT 25923 及 Escherichia coli ACTT 25922 作為實驗對象。

在前期研究中學者採用之四環黴素濃度從5 至 100mg/ml，浸濕於膠原纖 維膜內作為藥物釋放之用【56、94】，本研究採用 10mg/ml 為濃度之原因，

係由於經過不同濃度之測試後，發現以10mg/ml 在與幾丁聚醣混合後之黏稠 度之冷凍乾燥之成型效果最佳。

我們的研究結果顯示經三聚磷酸交聯後之四環黴素之幾丁聚醣海綿體可

維持有效抗菌效果至11 天，但對於牙周病致病菌是否有相同效果仍須進一步

研究。

5.3 幾丁聚醣之角色

幾丁質及其衍生物(如幾丁聚醣)在醫學上的研究顯示有許多的功能，例 如，增強免疫能力、抑制腫瘤、降低膽固醇等；而其在醫材上的應用主要有

46

以下的作用【68】：

一、穩定藥物中的成份

幾丁聚醣具有正電荷可以與藥物中帶負電荷游離脂肪交互作用成乳 劑狀，在這種狀態下的幾丁聚醣與脂肪能形成聚合物(co-polymer)有效的 保護脂肪功能性，以避免藥物中脂肪在高溫滅菌過程中遭到破壞。

二、促進藥物的吸收

研究顯示一些不易被吸收的藥物如atenolol 與幾丁聚醣混合後，經實 驗證明幾丁聚醣可以提升 atenolol 被腸道細胞(Caco-2)的吸收率達 10 到 15 倍。

三、延緩或控制藥物的溶解速度

有些藥物是水溶性或是遇到酸隨即溶解，使得這些藥物無法達到小 腸被吸收而喪失其功效，因此延緩或控制藥物的溶解速率是相當的重 要。經過處理過的幾丁聚醣以不同比例與高水溶性的藥物混合做成錠片 後能有效的延長其溶解時間。

四、幫助藥物送達目的器官

幾丁聚醣具有疏水基與親水基兩種官能基，使得幾丁聚醣能與紫杉 醇(taxol)形成小於 100 nm 的小顆粒膠粒(micelle)，經實驗發現這種形式的 紫杉醇更能有效地送達腫瘤部位，而且與幾丁聚醣混合紫杉醇對腫瘤細 胞的抑制能力較游離態紫杉醇的功效好。

曾有研究指出幾丁聚醣有抑菌的功能，其抑菌機轉有二:一為幾丁聚醣因 具有帶正電陽離子的特性，可和黴菌細胞表面的陰離子結合，導至黴菌細胞 膜的通透性改變,使黴菌細胞內蛋白質，紫外線吸收物質及電解質滲漏而死 亡。 另一抑菌機轉則是幾丁聚醣可藉由甲殼素酵素(chitinase)水解，使其分

子量變小而穿透細菌的細胞核並且和細菌的 DNA 相互反應，來抑制細菌的

mRNA 合成達到抑菌的效果。本研究中發現不論是否交聯的幾丁聚醣海綿底 體，對本實驗所採用之兩種常見之標準細菌均無抑菌效果，唯其真正原因仍

47

有待進一步研究。

本研究中之幾丁聚醣海綿體是立體的構造，雖因經交聯後產生不規則及 表面皺摺之情況，但仍顯示可攜帶並穩定釋放抗生素，且由SEM 觀察到其所 呈現之立體架構，如以往研究所指出的【4、26、28、33、42、44、53、92、

93】，應有利於細胞接觸及生長。

48

第六章 結論

經三聚磷酸交聯後之含有四環黴素之幾丁聚醣結構架體可穩定持續釋放

四環黴素至11 天。因此，我們認為，以含有四環黴素之幾丁聚醣海綿體經三

聚磷酸交聯後可以作為牙周炎治療之材料，總結其特點如下：

一、具生物相容性，可被人體吸收

二、可有效的攜帶及穩定的釋放藥物，並有較長的釋放時間 三、抑菌效果明顯

四、立體架構有利於組織再生工程 五、預期具有臨床操作簡易性 六、具創新性及廣泛應用之潛力

唯其應用於醫療之實際效果，仍有待更進一步之生物體研究。如前述本 研究之限制所言，後續研究應以不同模式之幾丁聚醣、不同濃度之四環黴素、

不同之抗生素及針對牙周致病菌為研究標的。