水稻抗白葉枯病基因表現蛋白質之多白胺酸重復(LRR)的分布及胺基酸組成

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(1)台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 58(2):93–105 (2009). Xa 基因蛋白質 LRR 研究. 93. 水稻抗白葉枯病基因表現蛋白質之多白胺酸重複 (LRR) 1 的分布及胺基酸組成林奕承2 呂椿棠3 魏夢麗3 呂秀英4,5 摘. 要. 林奕承、呂椿棠、魏夢麗、呂秀英。2009。水稻抗白葉枯病基因表現蛋白質之多白胺酸重複 (LRR) 的分布及胺基酸組成。台灣農業研究 58:93–105。. 目前已知多白胺酸重複 (leucine-rich repeat, LRR) 為生物體抗病基因蛋白質序列上的特有序列，因此本研究針對水稻所有已定序之 Xa 基因，自 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 及 KOME (Knowledge-based Oryza Molecular Biological Encyclopedia) 公共資料庫內擷取出它們已知的 CDS (coding domain sequence) 與全長 cDNA 序列，將其轉譯的蛋白質序列利用 Pfam 蛋白質家族資料庫尋找出各 LRR 片段，發現僅在 Xa1、Xa21 及 Xa26 基因之表現蛋白質結構中發現 LRR 存在。進而利用生物資訊與統計方法，進行不同 Xa 基因蛋白質之 LRR 序列的分布及胺基酸組成之比較分析。結果顯示，Xa1 之 LRR 在蛋白質序列中鬆散分布於 NB-ARC (nucleotidebinding adaptor shared by APAF-1, R proteins, and CED-4) 區域序列之後，而 Xa21 及 Xa26 之 LRR 則密集分布在 NB-ARC 或 P-kinase (protein-kinase) 區域序列之前。Xa1 的蛋白質序列中靠近 NB-ARC 區域序列的前一、二個 LRR 似乎較遠離其他 LRR，但 Xa21 和 Xa26 的蛋白質之 LRR 區域結構並未有如此現象。三個 Xa 基因表現蛋白質之 LRR 序列的胺基酸組成皆以親水性胺基酸為最多且其中以白胺酸 (leucine) 出現頻率最高，其次為不帶電荷之絲胺酸 (serine)。Xa1 蛋白質之 LRR 在某些胺基酸的出現頻率相異於 Xa21 和 Xa26。這些結果有助於了解不同 Xa 基因間表現蛋白質中特有 LRR 序列的結構變異情形。關鍵詞︰水稻、Xa 基因、白葉枯病、多白胺酸重複、胺基酸組成及屬性。. 前. 言. 水稻白葉枯病 (rice bacterial blight) 是由黃單孢桿菌 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 1. 2. 3. 4. 5.. 引起的一種細菌性維管束病害，多發生於氣候溫暖、土壤肥沃之水田，尤其當植株受傷更易感染，故於颱風後發病較為嚴重，為世界性主要稻作病害之一。目前雖然已有藥劑針對此病. 行政院農業委員會農業試驗所研究報告第 2354 號。接受日期：98 年 6 月 26 日。私立朝陽科技大學生物技術研究所研究生。台灣台中縣霧峰鄉。本所作物組助理研究員。台灣台中縣霧峰鄉。本所技術服務組研究員兼組長。台灣台中縣霧峰鄉。通訊作者，電子郵件：iying@tari.gov.tw；傳真機：(04)23325176。.

(2) 94. 台灣農業研究. 害具有防治效果，但育成抗病品種為解決此病害最有效之方法 (Chang 1995)。而抗病性是由基因控制，因此日本、中國及國際水稻研究所 (IRRI) 等研究單位，皆已積極對水稻抗白葉枯病基因 (Xa) 展開研究。在 Oryzabase 資料庫 (http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/top.jsp, Kurata & Yamazaki 2006) 中現已登記命名 32 個 Xa 基因。其中已知完整序列的有 Xa1 (Yoshimura et al. 1996, 1998; The Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium 2003)、 xa5 (Petpisit et al. 1977)、Xa13 (Sanchez et al. 1999)、xa13 (Ogawa et al. 1987)、Xa21 (Song et al. 1995)、Xa26 (Sun et al. 2004; Sun et al. 2006) 及 Xa27 (Gu et al. 2005) 等七個基因。若能深入瞭解這些已定序之 Xa 基因的序列結構，將有利於水稻的分子育種及抗性機制之研究。植物抗病機制中，有兩套基因系統先後作用，一為抗病基因 (resistant gene, R gene)，二為防衛基因。R 基因能特異性的識別病原菌對應之無毒基因 (Avr) 的產物，兩者可直接或間接地相互作用而刺激植物的訊號傳遞系統，最後誘導出植物防衛基因的表達，使植物表現出抗病性，同時 R 基因能不斷進化，可對病原菌不斷突變所產生的生理小種產生抗性 (Wang et al. 2002)。植物 R 基因的表現蛋白質結構分為五類 (Baker et al. 1997)：(1) 含有核苷酸結合位置 (nucleotide binding sites, NBS) 的細胞質受體類蛋白 (cytoplasmic receptor-like proteins) 和多白胺酸重複 (leucine-rich repeat , LRR) 序列區域，簡稱為 NBS-LRR；(2) 絲胺酸-酥胺酸激酶 (serine-threonine kinase)；(3) 含有大量細胞質外 LRR 區域的穿膜受體 (transmembrane receptor)；(4) 含細胞外 LRR 區域之穿膜受體和細胞內絲胺酸- 酥胺酸激酶 (intracellualar serine-threonine kinase) 區域；及 (5) 其他。R 基因的發現，使水稻的抗病機制在分子層次研究上有了突破性的發展，且由於. 第 58 卷. 第2期. 水稻的 Xa 基因在演化上的保守性與差異性，揭示出 Xa 基因可能存在較複雜的分子機制 (Guo et al. 2005)。已知 Xa1 為上述第一類 R 基因，蛋白質結構特徵屬 CC-NBS-LRR (coiled-coil-NBS-LRR) 類蛋白，其中 LRR 結構域是由 6 個高度保守的 93 個胺基酸的重複單元所組成；而 Xa21 和 Xa26 為第四類 R 基因，是一種膜蛋白，其特徵是包含一個胞外 LRR 結構域及一個穿膜區和胞內激酶域；至於 xa5、 xa13、Xa13 及 Xa27 之抗病防禦系統的生化途徑異於前四類 R 基因，其表現蛋白質結構尚未清楚，目前被歸於其他之第五類 R 基因 (Jones & Jones 1997; Yoshimura et al. 1998; Khush & Angeles 1999; Dangl & Jones 2001; Anjali & McCouch 2004; Gu et al. 2005; Sun et al. 2006)。許多 R 基因已被選殖出來並且定義其特性，發現在 R 基因的表現蛋白質結構上大多具有多白胺酸重複 (leucine-rich repeat, LRR) 序列的共同結構單元 (Dangl & Jones 2001)。已有很多研究顯示 LRR 與生物體的生長發育、抗蟲及抗病的表現有關 (Jones & Jones 1997; Zhang 1998)。LRR 具有多種的結構和功能表現，其結構區域主要傳導蛋白質與蛋白質之間的相互作用，而 LRR 的一級結構，由高度保守的 20–29 個胺基酸所組成，是由一個 α-helix (xaxx±a±±±±a±±x±±) 和一個 β-sheet (LxxLxLxxN/CxL) 通過 loop 環接形成一個非球形的馬蹄形分子結構 (附錄 1)，其中 x 為任何一種胺基酸，a 代表脂肪族胺基酸 (aliphatic amino acid)，± 表示該位置可能出現插入 (+) 或缺失 (-)，L 表示白胺酸 (leucine)、N 為天門冬胺酸 (aspartic acid)、C 為半胱胺酸 (cysteine) (Kobe & Deisenhofer 1995, 1996)。在水稻 Xa 基因蛋白質結構也發現與 LRR 有密切關係存在 (Song et al. 1995; Yoshimura et al. 1996; Baker et al. 1997; Song et al. 1997; Sun et al. 2004, 2006; Gu et al. 2005; Wang 2006)。.

(3) Xa 基因蛋白質 LRR 研究. 為了解不同 Xa 基因表現蛋白質之 LRR 序列區域結構的變異形式，因此本研究首先自網站上各公共資料庫蒐集 Xa 基因相關之蛋白質序列，從中找出 LRR 片段後，探討各 Xa 基因蛋白質序列中 LRR 的位置分布差異性及胺基酸偏好性。. 材料與方法 Xa 基因蛋白質序列的蒐集本研究首先根據 Oryzabase 資料庫內已定義的 7 個 Xa 基因 (Xa1、Xa5、Xa13、xa13、 Xa21、Xa26 及 Xa27) 的基因符號，到 NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, Yoshimura et al. 1998) 資料庫中搜尋及下載它們的編碼區序列 (coding domain sequence, CDS) 及蛋白質序列。如果在 NCBI 中尚未登錄有這些 Xa 基因的蛋白質序列，則再利用 BioEdit 生物資訊軟體 (Biological Sequence Alignment Editor for Win 95/98/NT/2K/XP, 7.0.5.2 版, http://www.mbio. ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html, Hall 2001)，將其 CDS 轉譯成蛋白質序列。接著，另從 KOME (Knowledge-based Oryza Molecular Biological Encyclopedia, http:// cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/, Kikuchi et al. 2003) 資料庫中，以水稻白葉枯病學名“Xanthomonas oryzae pv. oryzae”及其俗名“bacterial blight”進行交叉搜尋，經逐一檢視含此字義之序列登錄號 (accession no.)，再以此登錄號連結至 NCBI 資料庫，以找出 Xa 基因的全長互補 DNA (full length-complementary DNA, FL-cDNA) 及其經由最長讀取框架 (longest open reading frame, longest ORF) 所轉譯的蛋白質序列。最後將上述各 Xa 基因的蛋白質序列儲存成 FASTA 格式，以供進行後續各項分析。. Xa 基因蛋白質之 LRR 序列片段的搜尋及其分布. 95. Pfam (http://pfam.janelia.org/, Finn et al. 2006) 是利用 Swissprot 50.0 和 SP-TrEMBL 33.0 蛋白質序列資料庫內容，依據多序列排比 (multiple sequence alignment) 與隱匿馬可夫模型 (hidden Markov model, HMM) 所建構而成的蛋白質家族資料庫，儲存有關的蛋白質結構、多序列排比、蛋白質結構域 (protein structure domain) 等資訊，且能進行蛋白質結構預測。至 2008 年 7 月止，第 23 版的 Pfam 資料庫總共蒐集了 10,340 個蛋白質家族。於是本研究將所蒐集之 Xa 基因蛋白質序列，個別輸入 Pfam 網站查詢畫面，使用其內設的 Global & local (merged) 及 E-value = 1.0 二種條件進行查詢，以搜尋 Xa 基因蛋白質序列中的蛋白質結構域，藉此找出符合 LRR 結構的序列片段。然後，根據 Pfam 所顯示的 LRR 在蛋白質序列上的位置，利用 AutoCAD 繪圖軟體畫出其分布狀況，並將不同 Xa 基因結果並列，以比較不同 Xa 基因之蛋白質序列中各 LRR 片段的位置分布。. Xa 基因蛋白質之 LRR 序列的胺基酸組成分析胺基酸組成比例：由於所搜集的各 Xa 基因之蛋白質序列不只一條 (分別來自於 NCBI 和 KOME 資料庫)，因此首先計算不同 Xa 基因蛋白質各來源序列中 LRR 的胺基酸組成比例 (%)，進而求得各基因蛋白質之 LRR 的胺基酸組成之平均比例和變異，再利用 Excel 軟體繪製雷達圖來呈現各 Xa 基因間表現蛋白質之 LRR 的胺基酸組成差異性。胺基酸屬性含量：根據胺基酸的支鏈性質 (Mathews et al. 2000)，將 20 種胺基酸區分為極性 (polar) 與非極性 (non-polar)，即分別為親水性 (hydrophile) 與疏水性 (hydrophobic) 胺基酸。非極性胺基酸有丙胺酸 (alanine, Ala)、苯丙胺酸 (phenylalanine, Phe) 、異白胺酸 (isoleucine, Ile)、白胺酸 (leucine, Leu)、甲硫胺.

(4) 96. 台灣農業研究. 酸 (methionine, Met)、脯胺酸 (proline, Pro)、纈胺酸 (valine, Val) 及色胺酸 (tryptophan, Trp)；極性胺基酸依其帶電與否，又分為帶正電荷 (positively charged) (即鹼性)、帶負電荷 (negatively charged) ( 即酸性 ) 與不帶電荷 (uncharged) (即中性)：不帶電荷胺基酸有胱胺酸 (cysteine, Cys)、甘胺酸 (glycine, Gly)、天冬醯胺酸 (asparagine, Asn) 、麩醯胺酸 (glutamine, Gln)、絲胺酸 (serine, Ser)、酥胺酸 (threonine, Thr) 及酪胺酸 (tyrosine, Tyr)，帶正電荷胺基酸有組胺酸 (histidine, His)、離胺酸 (lysine, Lys)、精胺酸 (arginine, Arg)，帶負電荷胺基酸有天冬胺酸 (aspartic acid, Asp) 及麩胺酸 (glutamic acid, Glu)。首先計算不同 Xa 基因蛋白質各來源序列之 LRR 的不同屬性胺基酸所佔比例和變異，然後進行其在基因間的差異顯著性測驗。. 結. 果. Xa 基因蛋白質序列的蒐集結果本研究透過 NCBI 搜尋到七個已被定序的 Xa 基因之相關資訊，整理如表 1，這些基因的來源包含有印度型水稻 (Oryza sativa indica caltivar-group)、日本型水稻 (japonica)、長花藥野生稻 (Oryza longistaminata)。目前在 NCBI 的 Xa1 有分別於 1999 及 2004 年登錄之位於第 4 及第 10 條染色體上的兩條序列，本研究各以 Xa1_1999 及 Xa1_2004 代號表示；xa5、xa13、 Xa13 及 Xa27 各一條序列，分別位於第 5、8、 8 及 6 條染色體上，其中 xa5 和 xa13 為隱性基因；Xa21 位於第 11 條染色體上，含 Xa21-A1、 Xa21-A2、Xa21-B、Xa21-C、Xa21-D、Xa21-E 及 Xa21-F 共七個基因家族；Xa26 也在第 11 條染色體上，含 Xa26-MRKa 、 Xa26-MRKb 、 Xa26-MRKc 及 Xa26-MRKd 四個基因家族，其 DNA 序列儲存在 NCBI 資料庫的登錄號皆為 DQ355952，但長度不同，本研究各以 Xa26-A、. 第 58 卷. 第2期. Xa26-B 、 Xa26-C 、 Xa26-D 簡稱之。由於 Xa21-A2、Xa21-C、Xa21-F 及 Xa26-D 在 NCBI 中尚未登錄有完整的蛋白質序列，故本研究另外利用 BioEdit 軟體將此四條 CDS 轉譯成蛋白質序列。除了 xa5、xa13、Xa13 及 Xa27 基因之蛋白質序列長度小於 500 外，其餘 Xa 基因之蛋白質序列介於 612–1820 間 (表 1)。接著，透過 KOME 連結至 NCBI 資料庫共搜尋到 11 條 FL-cDNA 序列，這些序列中皆含有 Xa 基因的蛋白質序列，相關資訊整理如表 2，Xa1、Xa21 及 Xa26 基因各找到 9、1 及 1 條序列，但沒有找到其他 Xa 基因之 FL-cDNA 序列。由於這些序列與表 1 序列所處的染色體位置不同，並分屬於不同染色體上 (表 2)，因此本研究根據它們所在的染色體代號來命名這些來源序列，若同一染色體上有二個以上不同序列，則再根據 NCBI 登錄號大小於染色體代號後加上不同小寫字母，例如 Xa1-2a、Xa1-2b 各代表 Xa1 基因在第 2 條染色體上的第一、二條 FL-cDNA 序列。其中 Xa1 基因的 Xa1-4a 和 Xa1-4b 與 NCBI 之 Xa1_1999 都位於第 4 條染色體上 (表 1、2)，利用 NCBI 的兩序列排比工具 blast2 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/ wblast2.cgi) 兩兩排比結果，發現 Xa1-4b 與 Xa1_1999 並不相似 (no significant similarity)，但 Xa1-4a 之 4–1101 bp 序列區域與 Xa1_1999 之 4312–5409 bp 範圍內的序列一致性比值 (identities) 高達 1035/1098 (94%)，此有待後續 Pfam 資料庫搜尋 LRR 結果，倘 LRR 位置分布一致時，才能確認它們是相同序列。這些 Xa 基因 FL-cDNA 序列的來源包含印度型及日本型水稻，其經由最長讀取框架轉譯的蛋白質序列之長度在 366–1575 之間 (表 2)。. Xa 基因蛋白質之 LRR 序列片段的搜尋結果及其分布情形將上述找到的 28 條不同 Xa 基因來源之蛋白質序列，透過 Pfam 資料庫搜尋結果，僅.

(5) Xa21. Xa21. Xa21. Xa21. Xa26. Xa26. Xa26. Xa26. Xa27. Xa21-C. Xa21-D. Xa21-E. Xa21-F. Xa26-A. Xa26-B. Xa26-C. Xa26-D. Xa27. x. y. 6. 11. 11. 11. 11. 11. 11. 11. 11. 11. 11. 11. 8. 8. 5. 10. 2005. 2006. 2006. 2006. 2006. 2005. 1997. 1997. 1998. 1995. 1998. 1997. 2006. 2006. 2004. 2004. Gene length Location 5910 113..5521. CDS y. AY986491. DQ355952. DQ355952. DQ355952. DQ355952. U72728. U72724. U72726. U72723. U37133. U72727. 19639 15118..17720, 17827..18201 13341 2367..4205. 3921 1..2677,3521..3921. 5940 2151..4764,4872..5248. Oryza sativa(indica cultivar-group) receptor 9424 2819..5260 kinase-like protein gene Oryza longistaminata receptor-like kinase protein, 7204 1683..4352,5147..5547 pseudogene sequence Oryza sativa (indica cultivar-group) receptor kinase 3401 14225..17135, MRKa 17240..17625 Oryza sativa (indica cultivar-group) bacterial blight 3631 21725..24659, resistance protein Xa26 24765..25141 Oryza sativa (indica cultivar-group) receptor kinase 3456 34496..34911, MRKc 35026..37951 Oryza sativa (indica cultivar-group) cultivar Minghui 11396 2021..3423,9305..10839, 63 receptor kinase pseudogene 13028..13416 Oryza sativa (indica cultivar-group) Xa27 gene, 2393 1590..1931 Xa27-IR24 allele. Oryza longistaminata receptor kinase-like protein, pseudogene sequence Oryza sativa (indica cultivar-group)receptor kinase-like protein gene Oryza longistaminata receptor kinase-like protein gene, pseudogene Oryza longistaminata receptor kinase-like protein. 4206 1..4206 NM_194685 Oryza sativa (japonica cultivar-group)putative bacterial blight resistance protein Xa1-like protein, mRNA AY643716 Oryza sativa (indica cultivar-group)1 ranscripttion factor 318 1..318 IIA gamma subunit (TFIIAy) mRNA, partial cds. DQ421394 Oryza sativa (indica cultivar-group) cultivar IRBB13 924 1..924 disease resistant allele xa13 (xa13) gene, complete cds. DQ421395 Oryza sativa (indica cultivar-group) cultivar IR64 924 1..924 disease resistant allele XA13 (Xa13) gene, complete cds. U72725 Oryza longistaminata receptor kinase-like protein gene 8416 4771..7384,7676..8052. Source: Oryzabase and NCBI databases, searched from Feb. 29, 2008. CDS: coding domain sequence. Protein sequence translated from CDS using BioEdit software.. Xa21. Xa21-B. z. Xa21. Xa13. Xa13. Xa21. xa13. xa13. Xa21-A1. xa5. xa5. Xa21-A2. Xa1. Xa1_2004. Gene Chr. Submitted Accession Label symbol no. year no. in NCBI Definition Xa1_1999 Xa1 4 1999 AB002266 Oryza sativa (indica cultivar-group) mRNA for Xa1. 表 1. 已知序列之水稻 Xa 基因相關資訊 Table 1. Information of rice Xa genes with known sequences z. 342. 3327. 3342. 3312. 3297. 3071. 2442. 1839. 2978. 3078. 2991. 2991. 924. 924. 318. 4206. Length 5409. 97. AAY54163. -. ABD36513. ABD36512. ABD36511. -. AAB82756. AAB82753. -. AAC49123. -. AAB82755. ABD78943. ABD78942. AAV53715. NP_919667. 113. 1108 x. 1113. 1103. 1098. 1023 x. 813. 612. 991 x. 1025. 996 x. 996. 307. 307. 106. 1401. Protein sequence Accession no. Length BAA25068 1802. Xa 基因蛋白質 LRR 研究. Xa 基因蛋白質 LRR 研究 97.

(6) 台灣農業研究. 第2期. cDNA length. Longest ORF y PIR (by BLASTX). Length. Amino acid analysis. 4511 1190..4294 bacterial 1034 blight-resistance protein Xa1-rice Xa1-2b 3642 701..2644 bacterial 647 blight-resistance protein Xa1-rice Xa1-4a 1873 413..1513 bacterial 366 blight-resistance protein Xa1-rice Xa1-4b 4 AK241237 Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic OSJN00106 Oryza sativa genomic DNA, 2943 254..2866 bacterial 870 DNA, chromosome 4, complete sequence chromosome 4, BAC clone: OSJNBb0060E08, blight-resistance protein complete sequence. Xa1-rice Xa1-6 6 AK100253 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic 2552 202..1392 bacterial 396 clone:J023061C20, full insert sequence DNA, chromosome 6, PAC clone:P0621D05. blight-resistance protein Xa1-rice Xa1-8a 8 AK066438 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic 3385 218..2998 bacterial 926 clone:J013067B14, full insert sequence DNA, chromosome 8, BAC clone: OJ1212_C09. blight-resistance protein Xa1-rice Xa1-8b 8 AK121298 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic 5161 158..4885 bacterial 1575 clone:J023110L09, full insert sequence DNA, chromosome 8, PAC clone:P0024C06. blight-resistance protein Xa1-rice Xa1-11 11 AK106715 Oryza sativa genomic DNA, chromosome 4, Oryza sativa genomic DNA, chromosome 4, 2202 46..1200 bacterial 384 BAC clone: OSJNBb0085C12, complete BAC clone: OSJNBb0085C12, complete blight-resistance protein sequence. sequence. Xa1 - rice Xa1-12 12 AK065947 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA Oryza sativa chromosome 12, . BAC 4851 473..4288 bacterial 1271 clone:J013047A22, full insert sequence OSJNBa0035B12 of library OSJNBa from blight-resistance protein chromosome 12 of cultivar Nipponbare of ssp. Xa1-rice japonica of Oryza sativa (rice), complete sequence. Xa21-1 1 AK072480 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic 3828 1250..3343 protein kinase Xa21 (EC 697 2.7.1.-) A1, receptor clone:J023126F05, full insert sequence DNA, chromosome 1, PAC clone:P0431H09. type-long-staminate rice Xa26-11 11 AK241618 Oryza sativa (japonica cultivar-group) AY364476 Oryza sativa (indica cultivar-group) 3617 45..1760 protein kinase Xa21 (EC 571 chromosome 11 clone OSJNBa0004O15 map bacterial blight resistance protein (Xa26) gene, 2.7.1.-) A1, receptor near R3342S, complete sequence complete cds. type - long-staminate rice z Source: KOME databases, searched from Feb. 29, 2008. y ORF: open reading frame.. Label. Xa1-2a. 第 58 卷. Genome annotation (from GenBank hit) Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 2, BAC clone: OSJNBa0011J03. 2 AK242786 Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic AP004084 Oryza sativa (japonica DNA, chromosome 2, complete sequence cultivar-group) genomic DNA, chromosome 2, BAC clone: OJ1217_F02. 4 AK105096 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA – clone:001-100-B05, full insert sequence. Nucleotide analysis. GenBank hit (by BLASTN) 2 AK073576 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA clone:J033046M12, full insert sequence. Chr. Accession no. no.. 表 2. 水稻 Xa 基因全長 cDNA 序列相關資訊 Table 2. Information of rice Xa genes with full-length cDNA sequence z. 98 98 台灣農業研究第 58 卷第2期.

(7) Xa 基因蛋白質 LRR 研究. Xa1、Xa21、Xa26 三個基因找到 LRR 序列區域，而 xa5、Xa13、xa13、Xa27 則完全沒有。根據 Pfam 資料庫搜尋結果，整理出 Xa1、 Xa21、Xa26 基因各來源序列之 LRR 的數量及其在蛋白質序列上的位置，如圖 1 所示。由於 Xa1-4a 與 Xa1_1999 經 blast2 排比結果. 99. 相似度很高 (如前節所述)，而在圖 1 也發現兩者的 LRR 分布完全相同，因此確認 Xa1-4a 應是 Xa1_1999 的部份片段，即屬相同序列。於是 Xa1-4a 序列在後續統計分析時將不予納入，亦即本研究用以分析的 Xa1、Xa21 及 Xa26 三個基因的來源序列分別有 10、8 及 4 條。. 圖 1. Xa 蛋白質序列之 LRR 位置分布圖。▍: LRR。. Fig. 1. Distribution of leucine-rich repeat (LRR) in the protein sequences of rice Xa genes. ▍: LRR..

(8) 100. 台灣農業研究. 第 58 卷. 第2期. Xa 基因蛋白質之 LRR 序列的胺基酸組成分析結果. 在這些來源序列中，可發現 Xa1 在蛋白質序列上的 LRR 數量都較少 (4–12 條)，而 Xa21 與 Xa26 的 LRR 數量則相對較多 (除 Xa21-F 僅有 4 條外)，在 11–26 條之間 (圖 1)。三個 Xa 基因的 LRR 序列之平均長度相近，約 23–24 個胺基酸，其中雖然 Xa1 之 LRR 的長度變異性較大，範圍在 11–33 個胺基酸之間，但出現頻率最多的 LRR 長度也是 24 個胺基酸，與其他兩個 Xa 基因表現蛋白質之 LRR 長度相當 (表 3)。三個 Xa 基因蛋白質之 LRR 的分布有很大的差異：Xa1 之 LRR 在蛋白質序列上的分布較疏鬆分散 (圖 1)，其間距的變異程度甚大，最大距離可達 289 個胺基酸，但最短距離僅 1 個胺基酸，平均距離為 55.6 ± 63.7 個胺基酸 (表 3)；而 Xa21 與 Xa26 之 LRR 在蛋白質序列中的分布則緊密集中 (圖 1)，平均距離分別為 3.0 ± 4.4 及 2.6 ± 2.8 個胺基酸，該兩基因之 LRR 序列的間距差異不大 (表 3)。此外，Xa1 之 LRR 片段大多位於 NB-ARC (nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1, R proteins, and CED-4) 區域序列之後，而 Xa21 與 Xa26 之 LRR 則在 NB-ARC 或 P-kinase (protein-kinase) 區域序列之前 (圖 1)。Xa1 的蛋白質序列中靠近 NB-ARC 區域序列的前一個或兩個 LRR 似乎遠離於其他 LRR，但 Xa21 和 Xa26 的蛋白質之 LRR 區域結構並未有如此現象 (圖 1)。. 各 Xa 基因蛋白質之 LRR 序列的胺基酸組成，如圖 2 所示，可明顯看出皆以 Leu 含量最多且 Ser 次之，但 Cys、Glu、Lys 和 Pro 所佔比例以 Xa1 較 Xa21 及 Xa26 稍多，而 Gly、Ile 和 Asn 所佔比例以 Xa1 少於 Xa21 及 Xa26。顯著性測驗結果，LRR 序列之疏水性胺基酸以比較各 Xa 基因蛋白質之 LRR 序列的胺基酸屬性含量，顯示皆以親水性之不帶電胺基酸最多，其次是疏水性胺基酸 (圖 3)。由於各屬性胺基酸的含量均符合常態分布，因此經統計 Xa21 和 Xa26 顯著多於 Xa1，而不帶電胺基酸以 Xa1 和 Xa26 顯著較 Xa21 多，帶正電與帶負電胺基酸則以 Xa1 顯著多於 Xa21 和 Xa26。. 討. 論. 檢視表 1 與表 2 之序列的定義內容，表 1 皆為已被定序完成的 Xa 基因，而表 2 則屬於 FL-cDNA 序列且當中皆含有與 Xa 基因有關的蛋白質序列，唯目前尚查無文獻以確認這些有相同基因符號但位於不同染色體之序列，是否屬於同一個基因。由於已知 Xa 基因中存在 R 基因結構，本研究也於 11 條 FL-cDNA 序列中發現含有此種結構，因此將這些序列合併以擴大分析之序列內容，希望能從中更瞭解與 Xa 基因有關的抗病性序列結構。. 表 3. Xa 基因之蛋白質序列之 LRR 的長度與間距 Table 3. Length and distance of leucine-rich repeat (LRR) in protein sequences of rice Xa genes Length z. Gene. Mean ± sd. Xa1. 23.6 ± 3.0. Xa21. 23.0 ± 1.2. Xa26. 23.0 ± 0.8. 18. z y. Minimum. Distance Maximum. Mode. 11. 33. 17. 29 24. y. Mean ± sd. Minimum. Maximum. Mode. 24. 55.6 ± 63.7. 1. 289. 2. 23. 3.0 ± 4.4. 2. 32. 2. 23. 2.6 ± 2.8. 2. 27. 2. sd: standard deviation. mode: the value that occurs the most frequently in a data set..

(9) Xa 基因蛋白質 LRR 研究. 已知 Xa1 屬於第一類 R 基因 (Dangl & Jones 2001)，其基因產物的結構為 CC-NBSLRR 類蛋白，不同於其他 NB-LRR 抗病蛋白質的結構特徵 (Jones & Jones 1997)。Xa21 與 Xa26 同屬於第四類 R 基因 (Dangl & Jones 2001)，它的基因產物是一種膜蛋白，其特徵是包含一個胞外 LRR 結構域及一個穿膜區和胞內激酶域 (Jones & Jones 1997)。從本研究結果發現，在 Xa1、Xa21 和 Xa26 的蛋白質之 LRR 結構域中每一個 LRR 的長度未必相等，最多由 23–24 個胺基酸所組成，而 Xa1 的 LRR 長度之變異性遠大於 Xa21 和 Xa26。此外，第一類 R 基因的 Xa1 之 LRR 在蛋白質序列中的分布呈現疏鬆分散，而 Xa21 和 Xa26 的蛋白質之 LRR 則分布緊密集中；同時也發現，Xa1 的蛋白質之 LRR 片段大多位於 NB-ARC 區域序列之後，而 Xa21 與 Xa26 的蛋白質之 LRR 則在 NB-ARC 或 P-kinase 區域序列之前；Xa1 在其蛋白質序列中靠近 NB-ARC 區域序列的 LRR 明顯遠離其他 LRR，但在 Xa21 和 Xa26 的蛋白質序列上並無發現此現象。由此顯示，就 LRR 序列的長度及位置分布而言，不同 R 基因類別的 Xa 基因存在相當的差異性，而同一 R 基因類別的 Xa21 和 Xa26 則無明顯差異，此等發現有助於初步了解這些已定序 Xa 基因間特有 LRR 序列之結構的變異情形。根據 Belkhadir et al. (2004) 的研究推測，胞內 LRR 結構域的不同位置 LRR 可能具有不同的功能；靠近胺基端 (N-terminal) 的 LRR 可能具有與胞內因子互相作用而刺激調節的功能，而位於羧酸端 (C-terminal) 的 LRR 可能參與與病原蛋白的識別。因此未來值得針對特定位置的 LRR 之結構特性再深入研究。蛋白質的一級構造是蛋白質最終構成的根本，各級構造的訊息都決定於胺基酸的序列，即蛋白質摺疊所含之訊息揭示在其胺基酸殘基的線性序列中 (Shi et al. 2005) ，而胺基酸的分. 101. 圖 2. Xa 基因蛋白質序列之 LRR 的胺基酸組成差異的雷達圖。 Fig. 2. Polar plots showing the compositional differences among amino acids of leucine-rich repeat (LRR) in protein sequences of rice Xa1 (top), Xa21 (middle) and Xa26 (bottom) genes..

(10) 102. 台灣農業研究. 第 58 卷. 第2期. 圖 3. Xa 基因蛋白質序列之 LRR 的胺基酸屬性含量。數值以平均值±標準差表達。各平均值上示以相同字母者為 5%水準下經 LSD 測驗未達顯著差異。 Fig. 3. Contents of amino acid attributes of leucine-rich repeat (LRR) in protein sequences of rice Xa1, Xa21 and Xa26 genes. Data are expressed as mean ± standard deviation. Means within each attribute followed by the same letters among genes are not significantly different at 5% level by LSD test.. 類和序列中應含有蛋白質二級結構的訊息 (Wang & Wang 1999)。三個 Xa 基因之蛋白質序列 LRR 皆以親水性胺基酸含量較多且其中以 Leu 出現頻率最高，這是因為它們皆屬於 LRR 序列區域結構 (Song et al. 1995; Yoshimura et al. 1998; Sun et al. 2006)。由於 Xa21 和 Xa26 的抗病機制中含有細胞外 LRR 區域之穿膜受體和細胞內絲胺酸-酥胺酸激酶區域 (Song et al. 1995; Sun et al. 2006)，因此發現這兩個 Xa 基因之蛋白質 LRR 序列中不帶電之疏水性胺基酸的 Ser 也較多，而 Xa1 也含有多量的 Ser。20 種胺基酸出現在 LRR 序列中之頻率，僅 Xa1 的 Cys、Glu、Lys 和 Pro 所佔比例較 Xa21 和 Xa26 稍多，而 Xa1 的 Gly、Ile 和 Asn 所佔比例較 Xa21 和 Xa26 為少。由此得知，分屬於不同類別 R 基因的 Xa 之表現蛋白質. LRR 序列的胺基酸組成有其特定的偏好模式。蛋白質中的胺基酸組成隱藏著許多訊息，其胺基酸之同義密碼子特性會因不同物種或物種內不同基因而異，因此蛋白質的胺基酸密碼子之偏好性分析亦成為生物資訊研究的重要探討領域。未來將繼續針對這些 Xa 基因之 LRR 序列的密碼子偏好性、高頻密碼子確定及一致序列尋找等相關課題，深入探討，以釐清不同 Xa 基因在其表現蛋白質之 LRR 序列區域結構的差異性。. 誌. 謝. 本研究承蒙行政院農業委員會農業生物技術國家型科技計畫 [計畫編號：94 農科-5.2.1農 -C1(8)] 及國家科學委員會 ( 計畫編號： NSC95-2317-B-055-004) 補助經費，特致謝忱。.

(11) Xa 基因蛋白質 LRR 研究. 引用文獻 (Literature cited) Anjali, S. I. and S. R. McCouch. 2004. The rice bacterial blight resistance gene xa5 encodes a novel form of disease resistance. Mol. Plant-Microbe Interact. 17:1348–1354. Baker, B., P. Zambryski, B. Staskawicz, and S. P. Dinesh-Kumar. 1997. Signaling in plant-microbe interactions. Science 276:726–733. Belkhadir, Y., R. Subramaniam, and J. L. Dangl. 2004. Plant disease resistance protein signaling: NBS-LRR proteins and their partners. Curr. Opin. Plant Biol. 7:391–399. Chang, S. J. 1995. Physiological and Genetical Studies on Bacterial Blight (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) Resistance in Rice (Oryza sativa L.). Doctor Dissertation. Graduate Institute of Agronary. NCHU. Taichung. 172 pp. (in Chinese with English abstract). 103. Mizuno, S. Yokomizo, J. Niikura, R. Ikeda, J. Ishibiki, M. Kawamata, A. Yoshimura, J. Miura, T. Kusumegi, M. Oka, R. Ryu, M. Ueda, K. Matsubara, J. Kawai, P. Carninci, J. Adachi, K. Aizawa, T. Arakawa, S. Fukuda, A. Hara, W. Hashidume, N. Hayatsu, K. Imotani, Y. Ishii, M. Itoh, I. Kagawa, S. Kondo, H. Konno, A. Miyazaki, N. Osato, Y. Ota, R. Saito, D. Sasaki, K. Sato, K. Shibata, A. Shinagawa, T. Shiraki, M. Yoshino, and Y. Hayashizaki. 2003. Collection, mapping, and annotation of over 28000 cDNA clones from japonica rice. Science 301:376–379. Kobe, B. and J. Deisenhofer. 1995. Proteins with leucine-rich repeats. Curr. Opin. Struct. Biol. 5:409–416. Kurata, N. and Y. Yamazaki. 2006. Oryzabase. An integrated biological and genome information database for rice. Plant Physiol. 140:12–17.. Dangl, J. L. and J. D. Jones. 2001. Plant pathogens and integrated defense responses to infection. Nature 411:826–833.. Mathews, C. K., K. E. van Holde, K. G. Ahern. 2000. Biochemistry. 3rd ed.. Addison-Wesley Inc., USA. 1200 pp.. Finn, R. D., J. Mistry, B. Schuster-Böckler, S. Griffiths-Jones, V. Hollich, T. Lassmann, S. Moxon, M. Marshall, A. Khanna, R. Durbin, S. R. Eddy, Erik L. L. Sonnhammer, and A. Bateman. 2006. Pfam: clans, web tools and services. Nucleic Acids Res. 34:D247–251.. Ogawa, T., L. Lin, R. E. Tabien, and G. S. Khush. 1987. A new recessive gene for resistance to bacterial blight of rice. Rice Genet. Newsl. 4:98–100.. Gu, K., B. Yang, D. Tian, L. Wu, D. Wang, C. Sreekala, F. Yang, Z. Chu, G. L. Wang, F. F. White, and Z. Yin. 2005. R gene expression induced by a type-III effector triggers disease resistance in rice. Nature 435:1122–1125.. Sanchez, A. C., L. L. Ilag, D. Yang, D. S. Brar, F. Ausubel, G. S. Khush, M. Yano, T. Sasaki, Z. Li, and N. Huang. 1999. Genetic and physical mapping of xa13, a recessive bacterial blight resistance gene in rice. Theor. Apple. Genet. 98:1022–1028.. Hall, T. 2001. BioEdit Version 5.0.6. North Carolina State Univ. 192 pp.. Shi, X. H., X. R. Liu, L. Luo, W. B. Liu, and J. Xu. 2005. A research of amino acid order based on amino acid classification. J. Biomath. 20:491–495.. Jones, D. A. and J. D. G. Jones. 1997. The role of leucine-rich repeat proteins in plant defences. Adv. Bot. Res. 24:89–167. Khush, G. S. and E. R. Angles. 1999. A new gene for resistance to race 6 of bacterial blight in rice, Oryzae satival L. Rice Genet. Newslet. 16:92–93. Kikuchi, S., K. Satoh, T. Nagata, N. Kawagashira, K. Doi, N. Kishimoto, J. Yazaki, M. Ishikawa, H. Yamada, H. Ooka, I. Hotta, K. Kojima, T. Namiki, E. Ohneda, W. Yahagi, K. Suzuki, C. J. Li, K. Ohtsuki, T. Shishiki, Y. Otomo, K. Murakami, Y. Iida, S. Sugano, T. Fujimura, Y. Suzuki, Y. Tsunoda, T. Kurosaki, T. Kodama, H. Masuda, M. Kobayashi, Q. Xie, M. Lu, R. Narikawa, A. Sugiyama, K.. Petpisit, V., G. S. Khush, and H. E. Kauffman. 1977. Inheritance of resistance to bacterial blight in rice. Crop Sci. 17:551–564.. Song, W. Y., G. L. Wang, L. L. Chen, H. S. Kim, L. Y. Pi, T. Holsten, J. Gardner, B. Wang, W. X. Zhai, L. H. Zhu, C. Frauquet, and P. Ronald. 1995. A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science 270:1804–1806. Song, W. Y., L. Y. Pi, G. L. Wang, J. Gardner, T. Holsten, and P. C. Ronald. 1997. Evolution of the rice Xa21 disease resistance gene family. Plant Cell 9: 1279–1287. Sun, X. H., T. G. Lu, S. R. Jia, and D. F. Huang. 2004. Bioinformatics analysis of the LRR-NBS gene family in rice. Sci. Agric. Sinica 37:1–7..

(12) 104. 台灣農業研究. Sun, X., Y. Cao, and S. Wang. 2006. Point mutations with positive selection were a major force during the evolution of a receptor-kinase resistance gene family of rice. Plant Physiol. 140:998–1008. The Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium. 2003. In-depth view of structure, activity, and evolution of rice chromosome 10. Science 300:1566–1569. Wang, J. and W. Wang. 1999. A computational approach to simplifying the protein folding alphabet. Nat. Struc. Biol. 6:1033–1038. Wang, A. J., C. X. Zhu, and F. J. Wen. 2002. Molecular biology of the resistance to blight disease in rice. J. Shandong Agric. Univ. (Nat. Sci.) 33:101–106. (in Chinese with English abstract) Yamazaki, Y. and P. Jaiswal. 2005. Biological ontologies in rice databases. An introduction to the activities. 第 58 卷. 第2期. in Gramene and Oryzabase. Plant Cell Physiol. 46:63–68. Yoshimura, S., Y. Umehara, N. Kurata, Y. Nagamura, T. Sasaki, Y. Minobe, and N. Iwata. 1996. Identification of a YAC clone carrying the Xa-1 allele, a bacterial blight-resistance gene in rice. Theor. Appl. Genet. 93:117–122. Yoshimura, S., U. Yamanouchi, Y. Katayose, S. Toki, Z. X. Wang, I. Kono, N. Kurta, M. Yano, N. Iwata, and T. Sasaki. 1998. Expression of Xa1, a bacterial blight-resistance gene in rice, is induced by bacterial inoculation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:1663–1668. Zhang, X. 1998. Leucine-rich repeat receptor-like kinases in plants. Plant Mol. Biol. Rep. 16:301–311. (in Chinese with English abstract). 附錄 1. LRR 結構之帶狀圖 (Kobe & Deisenhofer 1996)。 Appendix 1. A diagram showing ribbon structure of the leucine-rich repeat (LRR) (Kobe & Deisenhofer 1996)..

(13) Xa 基因蛋白質 LRR 研究. 105. Leucine-rich Repeat (LRR) Distribution and Amino Acid Composition in Protein Sequences of Genes with Resistance to Bacterial Blight (Xanthomonas oryzae) of Rice 1 Yi-Chen Lin2, Chun-Tang Lu3, Meng-Li Wei3, and Hsiu-Ying Lu4,5 Abstract Lin, Y. C., C. T. Lu, M. L. Wei, and H. Y. Lu. 2009. Leucine-rich repeat (LRR) distribution and amino acid composition in protein sequences of genes with resistance to bacterial blight (Xanthomonas oryzae) of rice. J. Taiwan Agric. Res. 58:93–105.. Since leucine-rich repeat (LRR) is known as a domain of protein specific to disease resistance genes, it is used to study the genes of rice with resistance to bacterial blight caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae. The CDS (coding domain sequence) and full-length cDNA sequences of the completely sequenced genes were obtained through the access from public databases of NCBI (National Center for Biotechnology Information) and KOME (Knowledge-based Oryza Molecular Biological Encyclopedia) and they were used to identify each LRR fragment in translated protein sequences through Pfam protein families database. Results showed that only Xa1, Xa21 and Xa26 genes were found to possess LRRs in their protein sequences. When bioinformatics and statistical methods were used for further comparative analysis of distribution and amino acid composition for these LRRs among Xa protein sequences, LRRs of Xa1 were loosely located after NB-ARC (nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1, R proteins, and CED-4) in the protein sequences, whereas LRRs of Xa21 and Xa26 were densely located before NB-ARC or P-kinase (protein-kinase). It appeared that the first one or two LRRs of the gene Xa1 proteins in proximity to NB-ARC were distant from the other LRRs, but no similar phenomenon was observed within the protein sequences of the Xa21 and Xa26 genes. The LRRs of these three Xa genes mainly consisted of hydrophilic amino acids, with the highest frequency for leucine, followed by neutral serine. The LRRs of Xa1 protein sequences had different frequencies for some amino acids compared to LRRs of Xa21 and Xa26. These findings are useful in understanding of the structural variation of LRRs in protein sequences among Xa genes with resistance to bacterial blight of rice. Key words: Rice, Xa genes, Bacterial blight, Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Leucine-rich repeat, Amino acids.. 1. Contribution No.2354 from Taiwan Agricultural Research Institute (TARI), Council of Agriculture. Accepted: June 26, 2009. 2. Graduate Student, Graduate Institute of Biotechnology, Chaoyang University of Technology, Wufeng, Taichung, Taiwan ROC. 3. Assistant Researcher, Crop Science Division, TARI, Wufeng, Taichung, Taiwan, ROC. 4. Senior Researcher and Director, Technical Service Division, TARI, Wufeng, Taichung, Taiwan, ROC. 5. Corresponding author, e-mail: iying@tari.gov.tw; Fax: (04)23325176..

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