未經冷馴化之草莓莖頂超低溫冷凍保存研究

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(1)台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 63(1):57–67 (2014) DOI: 10.6156/JTAR/2014.06301.05. 未經冷馴化之草莓莖頂超低溫冷凍保存研究 蕭翌柱 1,* 陳冠文 2 摘要 蕭翌柱、陳冠文。2014。未經冷馴化之草莓莖頂超低溫冷凍保存研究。台灣農業研究 63(1):57–67。 草莓 (Fragaria × ananassa Duch.) 屬於薔薇科 (Rosaceae) 多年生高價值經濟作物,並且有超過 70 個以上 的國家進行栽培與量產,因此進行種原的長期保存益顯重要。本試驗的主要目的,在於建立未經冷馴化草莓 (「桃園 1 號」) 最適宜的超低溫冷凍保存處理方法。培植體在尚未浸入液態氮前的預處理結果如下:(1) 莖頂 培植體 (1–2 mm3) 預培養於添加 0.3 M 蔗糖之 MS 基本鹽類培養基 14 d 後的平均存活率為 100%;(2) 將填充 溶液 (LS) 中的蔗糖濃度自 0.6 M 提升至 1.6 M 並且滲透壓保護 90 min,莖頂的平均存活率仍可達到 100%; 以及 (3) 使用植物玻璃質化溶液 2 (PVS2) 脫水 60 min 後之莖頂平均存活率達到 96.7% ± 4.7%,此百分比顯著 高於 PVS2 脫水 180 min (60.0% ± 14.1%) 和 240 min (46.7% ± 17.0%) 的處理組。經 PVS2 脫水後,每 10 顆含 莖頂的藻膠球及 0.3 mL 新鮮的 PVS2 被置入 1 個 2 mL 容量的抗凍管中,然後直接投進 -196℃的液態氮至少 保存 1 h,經液態氮凍存後的抗凍管,在 38℃恆溫水槽中迅速回溫 60 s,此種含有莖頂的藻膠球繼代培養 14 d 後的再生率可達到 80%。本研究各項試驗結果,將有助於建立及簡化草莓超低溫冷凍保存的程序。 關鍵詞:草莓、超低溫冷凍保存、填充溶液、滲透壓保護、植物玻璃質化溶液 2。. 前言 草 莓 (Fragaria × ananassa Duch.) 為 薔 薇科 (Rosaceae) 草莓屬 (Fragaria) 多年生草 本作物,原產於歐洲及南美洲等地區。其果實 由花托發育而成,外觀多呈心形或扇形,有淡 紅、 鮮 紅 及 桃 紅 等 色 澤, 味 道 酸 甜 可 口, 富 含維生素 C、水楊酸、檸檬酸及具有美白效用 的 韖 花 酸 (ellagic acid) 等 成 分, 因 一 些 商 業 品 種 的 果 實 具 有 獨 特 香 氣, 故 深 受 世 界 各 國 人 們 的 喜 愛。 目 前, 市 場 上 較 常 見 到 的 栽 培 種 草 莓 係 由 Fragaria chiloensis L. P. Mill. 和 Fragaria virginiana Duch. 2 個 原 生 種 自 然 雜 交育成,每年約有超過 70 個以上的國家進行 量產栽培,且全世界的田間總種植面積已達到 50,600 ha (Sakila et al. 2007)。 根 據 2012 年 行政院農業委員會農糧署統計指出,國內包含. * 1 2. 台北、新竹、苗栗、台中及南投等縣市的草莓 總栽培面積合計約有 576.9 ha,其中苗栗縣即 佔了 465.3 ha。若以單一鄉鎮進行比較時,又 以 大 湖 鄉 的 374.3 ha 為 最 大 栽 種 區 域, 栽 培 的品種係以「豐香」為主,估算大湖鄉的採收 量可達 15,000 kg ha -1。若以 1 kg 市價新台幣 500 元 計 算, 則 其 產 值 高 達 每 公 頃 7,500,000 元。由此可知,草莓在我國可歸類為高經濟價 值作物,故研究無病毒健康種苗繁殖及種原保 存技術也益顯重要。 近代由於自然環境遭到人為的濫墾破壞, 加上全球氣候持續暖化,年均溫逐年升高,致 使區域原生物種面臨極嚴峻的生存考驗,惟有 積極進行環境保護及作物遺傳資源保存與利 用,方能永續生產安全的糧食。以作物種原保 存 而 言, 世 界 各 作 物 種 原 中 心 採 用 的 保 存 制. 投稿日期:2013 年 11 月 15 日;接受日期:2014 年 1 月 22 日。 通訊作者:yjshiau@tari.gov.tw 農委會農業試驗所作物種原組副研究員。台灣 台中市。 農委會農業試驗所作物種原組研究助理。台灣 台中市。.

(2) 58. 台灣農業研究 第 63 卷 第 1 期. 度 概 可 分 為 3 種 類 型:( 一) 原 生 地 現 地 保 存 (in situ conservation);(二) 將 種 原 移 植 至 適 當處所集中管理的離場保存 (ex situ conservation);以及 ( 三) 利用組織培養等技術進行種 原無性繁殖之離體保存 (in vitro conservation) (Engelmann 1991)。 對 於 大 多 數 田 間 作 物 而 言,篩選優良種子並在低溫與低濕下貯藏是保 存大量種原並使其能進行分贈或交換的最較 佳 方 式, 不 耐 低 溫 貯 藏 的 植 物 種 子 則 可 藉 由 收集花藥或花粉進行保存 (Bajaj 1978),或定 期將營養繁殖的子代移植於田間進行種原更 新。若以非種子型態保存且應用液態氮進行超 低 溫 冷 凍 保 存 (cryopreservation) 培 植 體 的 方 法, 則 歸 屬 於 前 述 第 三 種 類 型, 國 外 學 者 曾 撰文介紹草莓超低溫冷凍保存相關技術 (Reed & Hummer 1995)。植物超低溫冷凍保存技術 多將培植體先經過預培養、低溫冷馴化 (cold hardening)、應用滲透壓保護 (osmoprotection) 填充溶液 (loading solution; LS) 以及浸漬於植 物玻璃質化溶液 2 (plant vitrification solution 2; PVS2) 進行脫水 (dehydration) 等程序,再 將 莖 頂、 體 胚 或 芽 體 置 入 -196 ℃ 的 液 態 氮 中 長期保存。在此極度低溫下,植物器官或組織 的生理代謝已接近停止狀態,但仍舊保有生命 的 活 力, 待 將 其 取 出 並 迅 速 回 溫 及 再 生 培 養 後,即可誘導發育成為完整的植株 (Engelmann 2004)。前述方法具有減少保存種原耗用的土 地空間和人力成本的優點,也能避免外在環境 如溫度、降雨、日照、病害或蟲害等因子的干 擾 (Keller et al. 2006)。 參閱目前已發表的草莓種原超低溫冷凍保 存 研 究 論 文, 其 幼 嫩 苗 株 在 試 驗 過 程, 多 先 在 25℃、光照周期 16 h 的環境培養 14 d,再 於溫度 5℃、光照周期 8 h 的環境下低溫冷馴 化處理 20 d (Niino 2006);或是先在室溫、光 照 周 期 14 h 的 環 境 預 培 養 25–30 d, 再 移 至 10 ℃、 光 照 周 期 8 h 的 環 境 下 冷 馴 化 處 理 30 d,再執行後續的滲透壓保護及脫處理 (Hwang 2007),亦即完成整個研究的期程需時較長。 因此,本研究之主要目的,係有系統地探討未 經冷馴化草莓 (「桃園 1 號」) 莖頂的超低溫冷 凍保存技術,在幼嫩苗株未經低溫馴化培養且. 尚未置入液態氮的情形下,先運用含不同蔗糖 濃度的培養基進行預培養,再依序使用含不同 蔗糖濃度的 LS 和 PVS2 進行前處理,以檢測 對於莖頂培植體存活率之影響。最終,則是將 經過前處理的莖頂培植體置入液態氮中,且至 少保存 1 h 後取出,再進行最佳回溫時間之探 討。彙整本研究各項的試驗結果及累積相關實 務經驗,以期有助於簡化草莓超低溫冷凍保存 的程序,以及建立國家種原中心自有之作物超 低溫冷凍保存技術。. 材料與方法 供試材料來源 本試驗所使用的草莓「桃園 1 號」(Fragaria × ananassa Duch. cv. ‘Taoyuan No.1’) 種原係 取自農業試驗所作物種原組。草莓新生芽體先 以 75% 的乙醇溶液浸漬 30 s,再使用 0.5% 次 氯 酸 鈉 水 溶 液 消 毒 處 理 10 min, 最 後 在 無 菌 操作台內以無菌水清洗 3 次後切取莖頂部位, 並 接 種 培 養 於 含 有 MS (Murashige & Skoog 1962) 基本鹽類、0.2 mg L -1 6-benzylaminopurine (BAP)、0.1 M 蔗糖及 0.8% 洋菜粉之培養 基中 2 mo.,此後每隔 3–4 mo. 繼代培養 1 次。. 不同蔗糖濃度預培養對莖頂存活率之影響 在無菌操作台內將草莓組織培養苗從試管 中取出,並藉由解剖顯微鏡輔助切取 1–2 mm 3 莖 頂 作 為 供 試 培 植 體, 培 植 體 分 別 接 種 於 添 加 不 同 蔗 糖 濃 度 (0.1、0.2、0.3 及 0.4 M) 的 MS 固 體 培 養 基 中, 並 置 於 恆 溫 21 ℃、38–40 µmol m-2 s-1 光 合 成 光 子 流 量 密 度 (photosynthetic photon flux density; PPFD) 及光週期 14 h 的培養室預培養 14 d 後,調查莖頂培植體之 存活率。. LS 和 PVS2 前處理對莖頂培植體存活率 之影響 包埋 : 選取預培養於 MS 固體培養基 (含 0.3 M 蔗糖) 中 14 d 的小苗株,藉由解剖顯微 鏡 輔 助, 切 取 莖 頂 作 為 供 試 培 植 體, 在 使 用 LS 和 PVS2 浸 漬 之 前, 每 個 培 植 體 皆 先 進 行 包埋處理。包埋溶液配方分成 A、B 兩種,A.

(3) 59. 草莓莖頂超低溫冷凍保存. 溶 液 包 含 已 去 除 CaCl 2 的 MS 基 本 鹽 類、2% 藻膠與 0.4 M 蔗糖等成分;B 溶液則含有 MS 基本鹽類、0.4 M 蔗糖和 0.1 M CaCl 2 等成分。 包埋程序係以微量吸管吸取 A 溶液後,再以 1 個莖頂培植體定量使用 0.18 mL 的方式,將其 一 併 滴 入 B 溶 液 中 進 行 滴 定 包 埋, 在 25 ℃下 靜置 5 min 後,即可凝固形成直徑約 4 mm 且 包埋單一莖頂培植體的藻膠球。 不同 LS 滲透壓處理對莖頂培植體存活率 之 影 響: 將 包 埋 有 單 一 培 植 體 的 藻 膠 球 分 別 自 B 溶液中取出,並放入鋪有濾紙的玻璃培養 皿吸除多餘的溶液,再將其置入 2 mL 容量之 抗凍管中,每 1 支抗凍管置入 10 個藻膠球, 且依不同處理試驗需求,分別在抗凍管中個別 加入含不同蔗糖濃度的 LS 進行滲透壓保護 90 min,LS 配方含有 MS 基本鹽類、2 M 甘油及 不 同 濃 度 (0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和 1.6 M) 的蔗糖。各處理組在浸漬後,先以微量吸管將 LS 吸 出, 再 依 序 使 用 含 1.0、0.4 和 0.2 M 蔗 糖濃度的 MS 培養液各浸漬清洗 10 min,以逐 步降低藻膠球中的蔗糖含量。最後,利用濾紙 將藻膠球上殘留之溶液吸乾,置於 MS 固體培 養基中培養 14 d,觀察及比較各處理組培植體 的存活率。 不同 PVS2 脫水處理時間對莖頂培植體存 活率之影響:取包埋單一莖頂培植體且經 LS (含 1.6 M 蔗糖) 滲壓保護處理 90 min 的藻膠 球作為供試材料,分別將其置入 2 mL 容量之 抗凍管中,每 1 支抗凍管置入 10 個藻膠球, 且 在 抗 凍 管 中 個 別 加 入 PVS2 浸 漬 及 脫 水 處 理,PVS2 溶液主要含有 MS 基本鹽類、0.4 M 蔗 糖、30% 甘 油、15% 乙 二 醇 (ethylene glycol) 和 15% 二 甲 基 亞 碸 (dimethyl-sulfoxide; DMSO),pH 值 為 5.8; 進 行 浸 漬 脫 水 時 間 分 為 60、120、180 及 240 min, 脫 水 處 理 完 成 後,先以微量吸管將 PVS2 吸出,再依序使用 含 1.2、1.0、0.4 和 0.2 M 蔗 糖 濃 度 的 MS 培 養液各浸漬清洗 10 min。最後,利用濾紙將藻 膠球上殘留之溶液吸乾,置於 MS 固體培養基 中培養 14 d,觀察及比較各處理組培植體的存 活率。. 抗凍管內不同 PVS2 體積與凍存後回溫 時間對莖頂培植體再生率的影響 取 包 埋 單 一 莖 頂 培 植 體 且 依 序 經 LS (含 1.6 M 蔗糖) 滲壓保護處理 90 min 和 PVS2 浸 漬脫水 60 min 的藻膠球作為供試材料,將其 置入 2 mL 容量之抗凍管中,每 1 支抗凍管置 入 10 個藻膠球,再分別於不同的抗凍管內加 入 不 同 體 積 (0.3、0.5 及 1.0 mL) 的 PVS2 抗 凍液。最後,直接浸入液態氮中超低溫冷凍保 存 1 h,再將上述三種不同 PVS2 體積之處理 組 迅 速 置 入 38 ℃ 恆 溫 水 槽 中, 個 別 進 行 不 同 回溫時間 (60、90 及 120 s) 對於草莓 (「台農 1 號」) 莖頂培植體再生率的影響試驗。各處理 組回溫完成後,先以微量吸管將 PVS2 吸出, 再 依 序 使 用 含 1.2、1.0、0.4 和 0.2 M 蔗 糖 濃 度的 MS 培養液各浸漬清洗 10 min,最後,利 用濾紙將藻膠球上殘留之溶液吸乾,置於含有 MS 基 本 鹽 類、0.2 mg L -1 BA、0.1 M 蔗 糖 及 0.8% 洋菜粉之再生培養基中培養 14 d,調查 和比較各處理組莖頂培植體的再生率。. 試驗統計分析 以 上 試 驗 每 一 處 理 皆 重 複 3 次, 每 1 重 複使用 10 個培植體,獲得的數據資料計算其 算 術 平 均 值 及 標 準 差 (standard error; SE), 並以 SAS 統計軟體進行變方分析 (analysis of variance; ANOVA),在 5% 顯著性水準下以最 小顯著差異性測驗 (least significant difference test; LSD test) 檢定各處理間差異的顯著性。. 結果 不同蔗糖濃度預培養對莖頂存活率之影響 草莓組織培養苗從試管中取出並切取莖頂 作為供試材料,分別預培養於含 0.1、0.2、0.3 和 0.4 M 蔗 糖 濃 度 的 MS 固 體 培 養 基 14 d, 經 統 計 分 析 結 果 顯 示, 培 養 於 前 三 項 處 理 組 的莖頂培植體存活率皆達到 100% (圖 1),顯 著 高 於 含 0.4 M 蔗 糖 濃 度 之 處 理 組 (86.7% ± 9.4%)。.

(4) 60. 台灣農業研究 第 63 卷 第 1 期. ( 桃園1號」) 莖頂培植體存活率。 圖 1. 不同 MS 培養基 (蔗糖濃度:0.1、0.2、0.3 及 0.4 M) 預培養 14 d 之草莓 「 Fig. 1. The survival rates of strawberry (Fragaria × ananassa Duch. cv. ‘Taoyuan No.1’) shoot tip explants precultured on different MS media (sucrose concentrations: 0.1, 0.2, 0.3, and 0.4 M) for 14 d. Vertical bars indicate standard error (n = 3).. 不同 LS 滲壓處理對莖頂培植體存活率 之影響 將包埋有單一莖頂培植體的藻膠球分別置 入 2 mL 容量之抗凍管,並在各抗凍管中個別 加入含不同蔗糖濃度 (0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 及 1.6 M) 的 LS 溶 液 進 行 滲 透 壓 保 護 處 理 90 min,再置於 MS 固體培養基培養 14 d。試驗 結果顯示,莖頂培植體不論是使用含有 0.6 M 蔗糖濃度的處理組 (代號 LS 0.6 M) 或是添加 量 達 到 1.6 M 的 處 理 組 (代 號 LS 1.6 M), 調 查其試驗後之存活率皆為 100% (圖 2)。. PVS2 脫水處理對莖頂培植體存活率之 影響 將包埋有單一莖頂培植體且經 LS (含 1.6 M 蔗糖) 滲壓保護處理 90 min 的藻膠球置入 2. 抗凍管內不同 PVS2 體積與凍存後回溫 時間對莖頂培植體再生率的影響 將包埋有單一莖頂培植體且經 LS (含 1.6 M 蔗糖) 滲壓保護處理 90 min 和 PVS2 浸漬脫 水 60 min 後的藻膠球置入 2 mL 容量之抗凍管 中, 以 -196 ℃ 液 態 氮 進 行 凍 存 之 前, 於 抗 凍 管 內 先 加 入 PVS2 抗 凍 液 0.3 mL 且 凍 存 後 迅 速回溫 60 s (代號 RW60s) 的處理組,其培養 14 d 後之平均再生率最高達到 80% (表 1),顯 著高於加入 0.5 mL (63.3% ± 4.7%) 或 1.0 mL (60.0% ± 0.0%) PVS2 之處理組,且此種培植 體經培養 6 mo. 後,已發育成為根系強健的苗 株 (圖 4);若比較回溫時間 90 s (代號 RW90s) 或 120 s (代號 RW120s) 的各個處理組,則抗 凍管內不論是加入 0.3、0.5 或 1.0 mL 新鮮的 PVS2 抗凍液,其莖頂培植體平均再生率僅分 別為 53.3–70.0% 及 46.7–60.0% (表 1)。. mL 容量抗凍管中,再加入 PVS2 進行浸漬脫 水 60 min 的 處 理 組, 其 培 養 於 MS 固 體 培 養. 討論. 基 14 d 後 之 存 活 率 最 佳 為 96.7% ± 4.7% (圖 3),高於浸漬脫水 120 min 者 (73.3% ± 4.7%),. 自從 1976 年 Seibert 首度將康乃馨莖頂組 織應用超低溫技術予以保存迄今,此一技術已 被廣泛應用於更多的植物種類 (Bajaj 1991)。 在日本學者編撰有關其國內植物細胞和器官超. 也顯著優於浸漬脫水時間達 180 min (60.0% ± 14.1%) 及 240 min (46.7% ± 17.0%) 的處理組。.

(5) 草莓莖頂超低溫冷凍保存. 61. 圖 2. 不同填充溶液 (LS) 浸漬 90 min 再培養 14 d 後之草莓 (「桃 園 1 號」) 莖頂培植體。 (A) LS 0.6 M;(B) LS 0.8 M;(C) LS 1.0 M;(D) LS 1.2 M;(E) LS 1.4 M;(F) LS 1.6 M。 (比例尺 = 1 mm) Fig. 2. The shoot tip explants of strawberry (Fragaria × ananassa Duch. cv. ‘Taoyuan No.1’) after immerged in different loading solutions (LS) for 90 min and then cultured for 14 d. (A) LS 0.6 M; (B) LS 0.8 M; (C) LS 1.0 M; (D) LS 1.2 M; (E) LS 1.4 M; (F) LS 1.6 M. (Scale bar = 1 mm). 低溫冷凍保存進展的研究專書中,也列舉了包 含草莓、甘藷、龍膽、百合、星辰花、柿子、 梨、櫻桃、柑桔和櫻花等多種草本及木本類植 物 (Niino et al. 2006)。 植 物 種 原 之 莖 頂、 器 官或組織運用超低溫冷凍技術進行保存所需的 空間較之田間保存小,故為無性繁殖作物長期 貯存以維持種原和基因性狀穩定的適當選擇。 但在培植體玻璃質化且浸入液態氮前,必須先 藉 助 較 高 濃 度 的 含 糖 溶 液、LS 和 PVS2 等 預 處 理, 以 達 到 滲 透 壓 保 護 和 脫 水 的 效 果; 另 在解凍回溫過程中,也需儘量縮短時間並設法 降低細胞間隙產生冰晶造成傷害,或是避免嚴. 重脫水導致原生質膜遭到破壞,以致於喪失正 常的生理機能。上述各項處理程序,被認為是 影響玻璃化冷凍保存技術成功與否的主要因子 (Thomashow 1999; Ashworth & Pearce 2002; Hirai & Sakai 2003)。 此外,利用適度的低溫環境進行苗株之冷 馴化 培 養, 則 有 助 於 提 高 超 低 溫 冷 凍 保 存 後 培植體的存活率與植株再生率 (Chang & Reed 2000)。Hwang (2007) 研究以玻璃化法超低溫 冷 凍 保 存 草 莓 種 原 時, 即 先 將 瓶 苗 置 於 10 ℃ 低 溫 冷 馴 化 30 d, 再 切 取 莖 頂 分 生 組 織 進 行 試 驗, 最 終 得 到 85% 以 上 的 培 植 體 存 活 率。.

(6) 62. 台灣農業研究 第 63 卷 第 1 期. 圖 3. 植物玻璃質化溶液 2 (PVS2) 處理不同時間 (60、120、180 及 240 min) 後的草莓 (「桃園 1 號」) 莖頂培 植體存活率。 Fig. 3. The survival rates of strawberry (Fragaria × ananassa Duch. cv. ‘Taoyuan No.1’) shoot tip explants after treated with Plant Vitrification Solution 2 (PVS2) for different time period (60, 120, 180, and 240 min). Vertical bars indicate standard error (n = 3). 表 1. 凍存管中不同植物玻璃質化溶液 2 (PVS2) 體積與液態氮凍存 1 h 後之回溫時間對於草莓 (「桃園 1 號」) 莖頂培植體再生率的影響。 Table 1. Effects of different volumes of Plant Vitrification Solution 2 (PVS2) on cryotube and rewarming time on the regeneration rate of strawberry (Fragaria × ananassa Duch. cv. ‘Taoyuan No.1’) shoot tip explants after immerged into liquid nitrogen for 1 hz. PVS2 volume/. Shoot tip explants regeneration rate (%) y. RW90s. RW120s. 0.3. 80.0 ± 0.0 ax. 70.0 ± 21.6 a. 60.0 ± 14.1 a. 0.5. 63.3 ± 4.7 b. 56.7 ± 4.7 a. 56.7 ± 9.4 a. 1.0. 60.0 ± 0.0 b. 53.3 ± 9.4 a. 46.7 ± 12.5 a. Cryotube (mL). RW60s. z. The shoot tip explants were precultured on MS medium for 14 d, and then pretreated with LS 1.6 M for 90 min and PVS2 for 60 min before immerged into LN (-196℃). MS medium: MS basal salts + 102.6 g L-1 sucrose + 0.8% Difco agar, pH = 5.8. LS 1.6 M: MS basal salts + 184.18 g L-1 glycerol + 547.2 g L-1 sucrose, pH = 5.8. PVS2: MS basal salts + 136.8 g L-1 sucrose + 30% glycerol + 15% ethylene glycol + 15% dimethyl-sufoxide, pH = 5.8. y RW60s: cryotubes with shoot tip explants were rapidly rewarming in a water bath at 38℃ for 60 s. x Means followed by the same letter in the same column are not significantly different at 5% level by Fisher’s protected least significance difference (LSD) test (n = 3).. Hirai et al. (1998) 則是先將草莓苗株置於 23℃. 為供試材料,經預培養於含 0.3 M 蔗糖濃度的. 的環境培育 28 d,再移至 4℃環境冷馴化培養. MS 固體培養基 14 d 後的存活率達到 100% (圖. 3. 7–14 d, 最 後 切 取 1 mm 的 莖 頂 組 織, 預 培. 1),顯著高於含 0.4 M 蔗糖濃度處理組之存活. 養於含 1/2 MS 基本鹽類和 0.3 M 蔗糖的固體. 率 (86.7% ± 9.4%)。顯示草莓苗株在適應高張. 培 養 基 16 h 後, 才 開 始 作 為 供 試 之 材 料。 本. 溶液培養時,培養基中添加的蔗糖濃度可適度. 試驗則是將未經冷馴化培養的草莓苗株自試管. 提高到 0.3 M,此也與 Hirai et al. (1998) 以及. 取出,在解剖顯微鏡輔助下,直接切取莖頂作. Niino et al. (2003) 所發表的處理程序相符合。.

(7) 草莓莖頂超低溫冷凍保存. 63. 圖 4. 莖頂以液態氮超低溫冷凍保存 1 h,再回復生長及繼代培養 6 mo. 後的草莓 (「桃園 1 號」) 苗株。( 比例 尺 = 1 cm) Fig. 4. The plantlet of strawberry (Fragaria × ananassa Duch. cv. ‘Taoyuan No.1’) after shoot tip cryopreserved in liquid nitrogen for 1 h and then recovered by growth and subculture for 6 mo. (Scale bar = 1 cm). 另在本項試驗過程中,同時觀察到莖頂培植體 預培養於含 0.1 M 較低蔗糖濃度的 MS 固體培 養基 7 d 後,培植體第 1 片新葉已完全展開且 第 2 片葉也開始生長,至於其他處理組 (含蔗 糖濃度 0.2、0.3 和 0.4 M) 之第 1 片新葉此時 才開始生長,顯示含較高蔗糖濃度的培養基可 能會延緩草莓莖頂的生長速率 (資料未列出)。 日本學者 Matsumoto et al. (1998) 研究指 出,植物組織在 PVS2 脫水及浸入液態氮冷凍 保存前,若先以 LS 浸漬處理,可使細胞質壁 分離 (plasmlysis) 並避免冰晶形成破壞細胞膜 結構。此外,含有高濃度蔗糖的 LS 也能滲透 填充於細胞膜間隙及穩定組織結構,從而提高 超 低 溫 冷 凍 保 存 後 之 培 植 體 存 活 率。Hiral & Sakai (2003) 也 曾 報 導 使 用 含 不 同 蔗 糖 濃 度 (0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 及 1.8 M) 的 LS 進行甘藷藻膠球滲透壓保護處理 3 h,結果 LS 添加 1.6 M 蔗糖濃度的處理組,其萌生新芽的 比率最高達到 80% 以上。Hiral & Sakai (1999) 在未經 4℃冷馴化培養的馬鈴薯腋芽滲透壓保 護試驗中,使用含 0.6 M 蔗糖濃度的 LS 浸漬 處 理 90 min, 調 查 其 存 活 及 萌 芽 比 率 也 達 到. 70% 以上。本試驗則是將包埋有單一莖頂培植 體的藻膠球置入抗凍管,並個別加入含不同蔗 糖濃度的 LS 溶液進行滲透壓保護處理 90 min 後,即置於 MS 固體培養基培養 14 d,各處理 組之莖頂培植體存活率皆為 100% 且發育良好 (圖 2),顯示上述供試培植體對於 LS 中添加蔗 糖的耐受濃度也可以高達 1.6 M。此一結果雖 然與 Hwang (2007) 及 Niino (2006) 僅使用含 0.4 M 蔗糖濃度的 LS 溶液浸漬草莓培植體 20 min 或 60 min 之 處 理 方 法 與 時 間 不 盡 相 同, 不過,本試驗獲得的滲透壓保護條件,可作為 後續 PVS2 脫水處理及提高培植體存活率之參 考。 植物幼嫩分生組織在尚未直接置入 -196℃ 液 態 氮 冷 凍 保 存 前, 除 上 述 先 以 LS 滲 透 壓 保 護 外, 尚 需 經 適 度 的 脫 水 處 理 以 提 高 未 來 使用 38–40℃溫水回溫後之存活率和植株再生 率, 一 般 常 用 的 方 法 有 藻 膠 包 埋 脫 水 法 (encapsulation-dehydration) (Scottez et al. 1992) 或 是 藻 膠 包 埋 玻 璃 質 化 法 (encapsulationvitrification) (Wang et al. 2005)。以藻膠包埋 玻璃質化法為例,在脫水及冷凍過程中,為保.

(8) 64. 台灣農業研究 第 63 卷 第 1 期. 護 植 物 細 胞 活 力 並 避 免 冰 晶 產 生, 學 者 會 使 用 PVS2 作為冷凍保護劑進行浸漬處理。由於 其 組 成 分 中 除 了 1/2 MS 基 本 鹽 類、0.4 M 蔗 糖、30% (w/v) glycerol 和 15% (w/v) ethylene glycerol 外, 還 添 加 有 15% (w/v) DMSO, 故 為一種具有高滲透壓及輕微細胞毒性的溶液 (Sakai et al. 1990)。因此,依據冷馴化培養時 間、植物的種類以及組織部位之不同,適當調 整浸漬脫水處理的時間,方能增加培植體本身 的抗凍能力且不致於過度傷害細胞活力 (Volk et al. 2006)。 例 如, 將 人 參 不 定 根 先 在 21℃ 暗 培 養 12 d 後, 切 取 3–4 mm 長 度 的 培 植 體 並以 LS 處理 15 min,再以 PVS2 脫水處理 15 min,可獲得 90% 以上的存活率;但 PVS2 脫 水 處 理 時 間 如 超 過 15 min, 則 不 利 於 新 根 系 之生成 (Oh et al. 2009)。百合莖頂分生組織經 0℃環境下冷馴化培養 30 d,再使用含有 0.3 M 蔗 糖 濃 度 的 LS 滲 壓 處 理 20 min 後, 不 論 是 以 PVS2 在 0℃下 浸 漬 130 min 或 是 在 25℃下 浸 漬 脫 水 20 min, 其 新 芽 萌 生 比 率 皆 可 達 到 90% (Matsumoto et al. 1995)。Hwang (2007) 在進行草莓玻璃質化試驗時,先以 10℃低溫冷 馴化 30 d,續以含 0.4 M 蔗糖濃度之 LS 處理 20 min 後, 再 將 莖 頂 培 植 體 浸 漬 於 PVS2 脫 水 150 min,結果仍有 97% 存活率。本試驗則 是將未經冷馴化的草莓莖頂包埋形成藻膠球, 再經 LS (含 1.6 M 蔗糖) 滲壓保護處理 90 min 後,置入 PVS2 中浸漬脫水 60 min,此種培植 體經培養於 MS 固體培養基 14 d 後之存活率, 最 高 達 到 96.7% ± 4.7% (圖 3)。 若 浸 漬 脫 水 超過 120 min,則莖頂培植體之存活率急速降 低,此與前述 Hwang (2007) 的試驗結果不盡 相同,其原因可能是本試驗之供試材料未經低 溫冷馴化培養且使用之 LS 蔗糖含量較高,當 滲透壓保護處理時間較長時,部份培植體已顯 現過度脫水的現象。 經查閱數篇有關草莓超低溫冷凍保存的國 內、外研究論文,尚未有探討培植體以液態氮 超低溫冷凍保存前,抗凍管內加入 PVS2 抗凍 劑的體積及凍存後回溫時間對於培植體再生率 的 影 響。 例 如,Hwang (2007) 在 其 研 究 論 文 中僅提到草莓頂芽在浸入液態氮前,於抗凍管. 內加入 0.5 mL 的新鮮 PVS2 抗凍劑,當凍存 1 wk 後取出,在 40℃恆溫水槽中迅速回溫 30 s。 Niino et al. (2003) 的研究也僅敘述其在抗凍 管內加入的 PVS2 抗凍劑體積為 0.5 mL,凍存 1 d 後在 35℃恆溫水槽中迅速回溫,但未提及 回溫設定的時間。Hirai et al. (1998) 則是以草 莓走莖莖頂作為試驗材料,其在抗凍管內加入 的 PVS2 抗凍劑體積為 1 mL,凍存後在 38℃ 恆溫水槽中迅速回溫。本試驗的結果顯示,未 經冷馴化的草莓莖頂包埋成藻膠球且經前處理 後,置入 2 mL 容量之抗凍管中,在以 -196℃ 液 態 氮 凍 存 前, 只 需 於 抗 凍 管 內 加 入 0.3 mL 體積的 PVS2 抗凍劑且在凍存後回溫 60–90 s, 其培養 14 d 後之平均再生率可達到 70–80% (表 1),也優於其他用量的處理組。且此種培植體 經繼代培養 6 mo. 後,可以發育成強健的苗株 (圖 4)。因此,本研究應可提供試驗過程中減 少 PVS2 抗凍液用量之參考。 綜合上述各項試驗結果,可以繪製未經冷 馴化之草莓莖頂超低溫冷凍保存之簡易操作流 程 (圖 5)。亦即自田間採得草莓材料後,先建 立 無 菌 組 織 培 養 苗, 在 未 經 4–10℃低 溫 冷 馴 化情形下,可直接將已去除葉片的短縮莖段接 種於含 0.3 M 蔗糖濃度的 MS 固體培養基,並 置於溫度 21℃、38–40 µmol m-2 s -1 PPFD 和光 週 期 為 14 h 的 環 境 預 培 養 14 d, 再 切 取 1–2 mm 3 之莖頂分生組織作為超低溫冷凍保存的材 料。經過包埋程序成為含有單一莖頂培植體的 藻膠球,在尚未置入液態氮之前,先使用含 1.6 M 蔗 糖 濃 度 的 LS 滲 透 壓 保 護 90 min, 再 以 PVS2 浸漬脫水 60 min,最後才浸漬於 -196℃ 液態氮中長期冷凍保存。上述簡化操作流程的 完成,不但省卻以低溫冷馴化所需的時間及節 省 空 調 電 力 等 能 源 損 耗, 試 驗 過 程 也 減 少 了 PVS2 抗凍液的用量,故本研究應有助於建構 國家種原中心自有作物超低溫冷凍保存技術並 簡化草莓超低溫冷凍保存的程序。. 誌謝 本試驗承行政院農業委員會科技計畫經費 補助 (101 農科 -9.2.3- 農 -C5),植物超低溫冷 凍保存技術則承蒙日本農業生物資源研究所.

(9) 65. 草莓莖頂超低溫冷凍保存. 圖 5. 草莓 (「桃園 1 號」) 莖頂培植體超低溫冷凍保存之流程圖。 Fig. 5. Flow chart of the cryopreservation method of strawberry (Fragaria × ananassa Duch. cv. ‘Taoyuan No.1’) shoot tip explants.. Takao Niino 博 士 及 島 根 大 學 Toshikazu Matsumoto 博士指導,特此一併申謝。. 引用文獻 Ashworth, E. N. and R. S. Pearce. 2002. Extracellular freezing in leaves of freezing-sensitive species. Planta 214:798–805. Bajaj, Y. P. S. 1978. Effect of super-low temperatures on excised anthers and pollen embryos of Atropa, Nicotiana and Petunia. Phytomorphology 28:171–176. Bajaj, Y. P. S. 1991. Storage and cryopreservation of in vitro cultures. p.361–381. in: Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 17. High-tech and micropropagation I. (Bajaj, Y. P. S., ed.) Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 555 pp. Chang, Y. and B. M. Reed. 2000. Extended alternating-temperature cold acclimation and duration improve pear shoot cryopreservation. Cryobiology 40:311–322. Engelmann, F. 1991. In vitro conservation of tropical plant. germplasm– A review. Euphytica 57:227–243. Engelmann, F. 2004. Plant cryopreservation: Progress and prospects. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 40:427–433. Hirai, D. and A. Sakai. 1999. Cryopreservation of in vitrogrown meristems of potato (Solanum tuberosum L.) by encapsulation-vitrification. Potato Res. 42:153–160. Hirai, D. and A. Sakai. 2003. Simplified cryopreservation of sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.] by optimizing conditions for osmoprotection. Plant Cell Rep. 21:961–966. Hirai, D., K. Shirai, S. Shirai, and A. Sakai. 1998. Cryopreservation of in vitro-grown meristems of strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) by encapsulation-vitrification. Euphytica 101:109–115. Hwang, K. Y. 2007. Investigation of the Protocol on the Cryopreservation of Strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) Treated by Vitrification. Master thesis, Department of Life Science, National Chung Hsing University. Taichung, Taiwan. 55 pp. (in Chinese with English abstract).

(10) 66. 台灣農業研究 第 63 卷 第 1 期. Keller, E. R., A. Senula, S. Leunufna, and M. Grübe. 2006. Slow growth storage and cryopreservation–tools to facilitate germplasm maintenance of vegetatively propagated crops in living plant collections. Intl. J. Refrig. 29:411–417. Matsumoto, T., A. Sakai, and K. Yamada. 1995. Cryopreservation of in vitro-grown apical meristems of lily by vitrification. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 41:237–241. Matsumoto, T., A. Sakai, and Y. Nako. 1998. A novel preculturing for enhancing the survival of in vitro-grown meristems of wasabi (Wasabia japonica) cooled to -196℃ by vitrification. Cryo. Lett. 19:27–36.. Reed, B. M. and K. E. Hummer. 1995. Conservation of germplasm of strawberry (Fragaria species). p.354– 370. in: Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 32. Cryopreservation of Plant Germplasm. I. (Bajaj, Y. P. S., ed.) Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 514 pp. Sakai, A., S. Kobayashi, and I. Oiyama. 1990. Cryopreservation of nucellar cells of navel orange (Citrus sinensis Osb. Var. brasiliensis Tanaka) by vitrification. Plant Cell Rep. 9:30–33.. Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473–497.. Sakila, S., M. B. Ahmed, U. K. Roy, M. K. Biswas, R. Karim, M. A. Razvy, M. Hossain, R. Islam, and A. Hoque. 2007. Micropropagation of strawberry (Fragaria × ananassa Duch.): A newly introduced crop in Bangladesh. American-Eurasian J. Sci. Res. 2:151–154.. Niino, T. 2006. Strawberry shoot tips culture (vitrification). p.53–54. in: Cryopreservation of Plant Cell and Organs. (Niino, T., H. Dai, M. Toshikazu, and T. Daisuke, eds.). National Institute of Agrobiological Sciences. Ibaraki. 208 pp. (in Japanese). Scottez, C., E. Chevreau, N. Godard, Y. Arnaud, M. Duron, and J. Dereuddre. 1992. Cryopreservation of cold-acclimated shoot tips of pear in vitro cultures after encapsulation-dehydration. Cryobiology 29:691–700.. Niino, T., D. Tanaka, S. Ichikawa, J. Takano, S. Ivette, K. Shirata, and M. Uemura. 2003. Cryopreservation of in vitro-grown apical shoot tips of strawberry by vitrification. Plant Biotech. 20:75–80.. Thomashow, M. F. 1999. Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50:571–599.. Niino, T., H. Dai, M. Toshikazu, and T. Daisuke. 2006. Cryopreservation of Plant Cell and Organs. National Institute of Agrobiological Sciences. Ibaraki. 208 pp. (in Japanese) Oh, S. Y., C. H. Wu, E. Popova, E. J. Hahn, and K. Y. Paek. 2009. Cryopreservation of Panax ginseng adventitious roots. J. Plant Biol. 52:348–354.. Volk, G. M., J. L. Harris, and K. E. Rotindo. 2006. Survival of mint shoot tips after exposure to cryoprotectant solution components. Cryobiology 52:305–308. Wang, Q. C., J. Laamanen, M. Uosukainen, and J. P. T. Valkonen. 2005. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of raspberry (Rubus idaeus L.) by encapsulation-vitrification and encapsulation-dehydration. Plant Cell Rep. 24:280–288..

(11) 草莓莖頂超低溫冷凍保存. Study on the Cryopreservation of Non-cold Hardening Fragaria × ananassa Duch. Shoot Tips Yih-Juh Shiau1,* and Guan-Wen Chen2. Abstract Shiau, Y. J. and G. W. Chen. 2014. Study on the cryopreservation of non-cold hardening Fragaria × ananassa Duch. shoot tips. J. Taiwan Agric. Res. 63(1):57–67.. Strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) is a high economic value perennial crop. It belongs to the Rosaceae family and is distributed in more than 70 countries. Therefore, the research on long-term storage of germplasm is important. The major objective of this study was to establish an optimum cryopreservation method of non-cold hardening Fragaria × ananassa Duch. cv. ‘Taoyuan No.1’. The results obtained on pretreatment of explants prior to plunge into liquid nitrogen (LN) were as follows: (1) The survival rate of shoot tips (1–2 mm3) was 100% when explants precultured on MS basal medium supplemented with 0.3 M sucrose for 14 d. (2) To increase sucrose levels from 0.6 M to 1.6 M in loading solution (LS) and then osmoprotected for 90 min, the survival rate of shoot tips remained 100%. (3) Survival rate of shoot tips achieved 96.7% ± 4.7% when treated with Plant Vitrification Solution 2 (PVS2) dehydration for 60 min. This percentage was significantly higher than treatments of PVS2 dehydration for 180 min (60.0% ± 14.1%) and 240 min (46.7% ± 17.0%). After PVS2 dehydration treatment, 10 shoot tip beads with 0.3 mL fresh PVS2 were transferred to a 2 mL cryotube and then plunged directly into LN for at least 1 h. After storage in LN, cryotubes were rapidly rewarmed in a water bath at 38℃ for 30 s. The final average regeneration rate of shoot tip beads (80%) was achieved after subcultured for 14 d. These research results appear promising for establishing and simplifying cryopreservation procedure of strawberry. Key words: Fragaria × ananassa Duch., Cryopreservation, Loading solution, Osmoprotection, Plant Vitrification Solution 2.. Received: November 15, 2013; Accepted: January 22, 2014. * Corresponding author, email: yjshiau@tari.gov.tw 1 Associate Research Fellow, Plant Germplasm Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 2 Research Assistant, Plant Germplasm Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC.. 67.

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參考文獻

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